Workflow z wykorzystaniem kriogenicznego mikroskopu fluorescencyjnego, elektronowo-jonowego do ukierunkowanego frezowania komórek

Moje badania rozwijają metody mikroskopii optycznej mające na celu zachowanie cech komórkowych w kriogenicznych lamellach podczas skupionego mielenia wiązek jonowych, umożliwiając szczegółową analizę za pomocą kriogenicznej tomografii elektronowej w celu odkrycia rodzimej organizacji biologicznej. Mikroskopia optyczna została zintegrowana z systemami CryoFIB-SEM, ale rzadko w tej samej pozycji co FIB. Wymaga to stosowania metod wytycznych opartych na rejestracji, aby zachować fluorescencyjne oznakowane cele w końcowej lamelli.

Na początek ręcznie schładz stację transferową za pomocą ciekłego azotu, gdy stopień osiągnie temperaturę kriogeniczną. Załaduj jedną przyciętą autosiatkę do kasety próbkowej zaprojektowanej dla systemu kriogenicznej mikroskopii świetlnej. Upewnij się, że autokrata jest umieszczona pomiędzy klejoną pokrywą a dystansem.

Dokręć śrubę pierścieniową, aby zamknąć kasetę i włóż ją do szczeliny na stacji transferowej. Podłącz stację transferową do systemu kriogenicznej mikroskopii świetlnej. Użyj kamery komorowej wewnętrznej, aby poprowadzić kasetę próbkową na scenę próbkową.

W oprogramowaniu do mikroskopii świetlnej przesuwaj etap próbki z pozycji ładowania do zdefiniowanej pozycji trzech wiązek. W oprogramowaniu FIB-SEM ustaw powiększenie na 100X i kliknij w okienko w lewym górnym rogu. W zakładce wyrównania w oprogramowaniu mikroskopii świetlnej kliknij Z i wybierz funkcję Play, aby uzyskać atlas SEM siatki.

Zidentyfikuj kwadratowy obszar z uszkodzoną folią węglową i kliknij dwukrotnie, aby przenieść próbkę do tego miejsca. Powrót do interfejsu oprogramowania. Aktywuj FIB i zrób obraz.

Reguluj powiększenie za pomocą menu rozwijanego w lewym górnym rogu. Naciśnij Play, aby wyświetlić obraz FIB. Następnie ustaw rozmiar kroku za pomocą drążka suwaka.

Teraz kliknij Z i Z, aby dostosować pozycję etapu Z, aż pozioma linia obecna na obrazach jonów i elektronów będzie wyrównana z tą samą cechą. Wybierz zakładkę SEM w oprogramowaniu do mikroskopii świetlnej. Użyj przycisków X i Y, aby wyrównać wspólną cechę między obrazami SEM a jonami.

Teraz włącz mikroskop fluorescencyjny. Wybierz zakładkę FLM, ustaw warunki obrazowania światła odbitego i wybierz Play. Następnie wyrównaj obraz światła odbitego z obrazem SEM.

Przybliż obraz i kliknij opcję prostokąta, aby zdefiniować wzór frezowania wiązki jonowej. Naciśnij Start wzorowania na Wyświetlaczu 2, aby frezować mały wzór za pomocą skupionej wiązki jonowej. Potwierdź, że wzór frezowany jest widoczny zarówno w ostrym wiązce jonów, jak i w mikroskopie fluorescencyjnym.

W oprogramowaniu do mikroskopii świetlnej przejdź do zakładki Lokalizacja i aktywuj odpowiednie warunki do ustawienia kanałów fluorescencjących. Przypisz każdemu fluoroforowi osobny kanał i dodaj dodatkowy kanał dla brightfield. Dostosuj moc diody LED i czas naświetlania dla każdego kanału fluorescencyjnego, aby zidentyfikować interesujący obiekt.

Gdy parametry są zadowalające, należy uzyskać wstępnie frezujący fluorescencjonujący stos z, przechodząc przez kierunek osiowy. Następnie zaznacz cel jako obszar zainteresowania. Przełącz się na oprogramowanie FIB-SEM i narysuj lamellę w interesującym się obszarze.

Wykonuj surowe frezowanie, aby usunąć masę materiału, jednocześnie utrzymując włączony mikroskop fluorescencyjny do monitorowania zmian sygnału. Otwórz zestaw narzędzi interferometrycznych oparty na Pythonie na terminalu, aby monitorować sygnał fluorescencjonalny podczas przerzedzania lamelli. Rozcieńcz zwrot z inwestycji do około dwóch mikrometrów w trybie przekroju czyszczącego.

Dla celu o zasięgu osiowym przekraczającym 300 nanometrów, w interfejsie graficznym Pythona wybierz cel na mikrografie fluorescencyjnej. Oprogramowanie automatycznie zaczyna wyświetlać jasność w zależności od czasu przy każdej nowej klatce. Monitoruj intensywność fluorescencji za pomocą zestawu narzędzi Python.

Zmiełuj próbkę w trybie czyszczenia przekroju, aby usunąć pozostałą warstwę podtrzymującą poniżej interesującego obszaru. Obserwuj nagłe spadki intensywności fluorescencji jako sygnały zmiany kierunku frezowania. Jeśli podczas frezowania od dołu do góry zauważymy gwałtowny spadek, zatrzymaj się i zacznij frezować od góry w dół.

Po zakończeniu frezowania od góry do dołu finalizuj lamellę, frezując od dołu do góry w trybie przekroju czyszczącego aż do osiągnięcia pożądanej grubości. Następnie wykonaj obraz fluorescencyjny lameli po przeróbce. Przenieś próbkę do CryoTEM.

Załaduj obraz fluorescencji wielokanałowej po frezowaniu oraz obraz projekcji CryoTEM do niestandardowego oprogramowania transformacji projektowej do rejestracji regionów zainteresowania. Teraz wybierz od ośmiu do dziesięciu par punktów odniesienia widocznych zarówno na obrazach mikroskopii fluorescencyjnej, jak i elektronowej, aby obliczyć transformację projektywną. Użyj nałożonego obrazu jako wskazówki do wyboru obszaru obrazowania.

Następnie wybierz odpowiednie parametry powiększenia i akwizycji dla serii pochylenia, w zależności od rozmiaru struktury celu i pożądanej rozdzielczości. Zróżnicowane komórki makrofagów oznaczone SiR-Tubuliną wykazywały pojedynczy jasny fluorescencjonujący punkt o średnicy około jednego mikrometra, odpowiadający MTOC, wraz z włóknopodobnymi strukturami promieniującymi w kierunku obwodów komórki, zgodnymi z siecią mikrotubul. Gdy próbka była mielona do grubości około 800 nanometrów, pojedynczy fluorescencjonujący punkt MTOC rozdzielił się na dwie wyraźne kropki, każda o średnicy około 700 nanometrów.

Intensywność fluorescencji wzrosła po usunięciu niefluorescencyjnego materiału objętego i powłoki wsporczej, a następnie gwałtownie spadła, gdy lamella została dalej przerzedzona z dwóch mikrometrów do poniżej 200 nanometrów. Skorelowana kriogeniczna fluorescencja i mikroskopia elektronowa umożliwiały precyzyjne celowanie struktur podczas frezowania. Rekonstruowane tomogramy i modele segmentowane ujawniają, że centriole składają się z trójek mikrotubul.

W przypadkach, gdy w końcowej lameli zachowano tylko jedną fluorescencyjną plamkę, w odpowiadającym tomogramie wizualizowano pojedynczy centriol. Dokładność fluorescencji opartej na millimillingu jest ograniczona przez podejścia rejestracyjne, które często cierpią na ograniczenia rozdzielczości dyfrakcyjne, niedopasowania współczynnika załamania oraz ruch indukowany przez milling. Jednoczesna mikroskopia optyczna i frezowanie FIB eliminują błędy rejestracji, zamiast tego wykorzystując sprzężenie zwrotne w czasie rzeczywistym z mikroskopii fluorescencyjnej do kierowania procesem frezowania.

Pozwala to uniknąć błędów wynikających z limitu dyfrakcyjnego i niedopasowania współczynników załamania, umożliwiając precyzyjne mielenie zachowujące fluorescencjonalnie oznakowane struktury do tomografii krioelektronowej w końcowej lameli. Nasze badania umożliwiają dostrzeganie struktur komórkowych, które wcześniej trudno było bezpośrednio zobrazować za pomocą cryoET, rzucając światło na mechanizmy molekularne stojące za szerokim spektrum kluczowych mikromolekularnych maszyn.