Name: Workflow z wykorzystaniem kriogenicznego mikroskopu fluorescencyjnego, elektronowo-jonowego do ukierunkowanego frezowania komórek (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-10-17T13:50:00.000+00:00
Duration: 8 min 29 s
Description: Poznaj metodę kriogenicznego mikroskopu fluorescencyjnego z FIB-SEM do precyzyjnego frezowania komórek. Technika ta umożliwia zachowanie fluorescencyjnie znakowanych struktur w lamelach dla tomografii kriogenicznej.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Chcielibyśmy podziękować członkom Delmic za pomoc w rozwoju workflow obrazowania. P.D.D. był częściowo wspierany przez stypendium Panofsky w SLAC National Accelerator Laboratory w ramach programu badawczo-rozwojowego Departamentu Energii w ramach kontraktu DE-AC02-76SF00515 oraz przez Departament Energii, Biuro Nauki, Biuro Badań Biologicznych i Środowiskowych, na podstawie umowy nr DE-AC02-76SF00515 FWP 100883. Prace te były częściowo wspierane przez granty AI127401 od National Institutes of Health dla G.J.J. J.J. J.W. został wsparty grantem 2021-234593 od Chan Zuckerberg Initiative DAF, funduszu doradczego Silicon Valley Community Foundation.

UWAGA: System trójkobiegowy używany tutaj to spersonalizowany komponent obrazowania fluorescencyjnego kriogenicznego zintegrowany z komercyjnie dostępnym, dwuwiązkowym systemem FIB-SEM. Zasada i kolejność operacji mogą być ogólnie dostosowane do przyszłych implementacji trójkobiegielnych.
1. Przygotowanie
<ol>
	<li>Schłodzić system do temperatury kriogenicznej. Monitoruj temperaturę za pomocą dwóch czujników: jednego umieszczonego na stopniu próbkowym, a drugiego wewnątrz komory. Utrzymuj etap próbki około 20 °C cieplejszy niż komora (np. stopień ~-170 °C, komora ~-190 °C), aby zminimalizować nagromadzenie się lodu na próbce. Proces chłodzenia zazwyczaj trwa około 1,5 godziny.</li>
</ol>
2. Ładowanie próbki
<ol>
	<li>Do ręcznego chłodzenia stacji transferowej używaj ciekłego azotu, gdy temperatura systemu zbliża się do temperatury kriogenicznej (około -167,5 °C). Temperatura systemu jest wyświetlana w lewym górnym rogu oprogramowania do mikroskopii świetlnej.</li>
	<li>Załaduj jedną przypiętą Autosiatkę do kasety próbkowej przeznaczonej do systemu kriogenicznej mikroskopii świetlnej. Kaseta składa się z klejonego pokrywa pokrywowego i dystansu, z Autogridem umieszczonym pomiędzy nimi. Zamknij kasetę, dokręcając śrubę pierścieniową, a następnie włóż ją do szczeliny na stacji transferowej34.</li>
	<li>Podłącz stację transferową do systemu i użyj kamery w wewnętrznej komorze, aby naprowadzić kasetę próbkową na scenę próbkową.</li>
</ol>
3. System wtrysku gazu (GIS) do powlekania próbek
<ol>
	<li>Otwórz oprogramowanie do sterowania mikroskopią świetlną i przesuń etap próbki z pozycji Ładowanie do Powłoki .</li>
	<li>Włóż igłę GIS za pomocą oprogramowania sterującego FIB-SEM, klikając ikonę Snowflake. W sterowaniu GIS wybierz opcję wkładania igły GIS.</li>
	<li>Pozwól na osadzanie GIS przez 30 sekund, otwierając przepływ gazu. UWAGA: Czas ten waha się od 20 sekund do 1 minuty w zależności od typu próbki. Celem tego etapu jest odpowiednia ochrona próbki podczas kolejnego procesu mielenia FIB.</li>
	<li>Chując iglicę GIS, przesuń etap próbki z powrotem do zdefiniowanej pozycji ładowania .</li>
</ol>
4. Wyrównanie systemu trójwiązkowego
UWAGA: Ta część jest adaptacją Wang39.
<ol>
	<li>W oprogramowaniu mikroskopii świetlnej przesuwaj etap próbki z pozycji ładowania do zdefiniowanej pozycji 3-wiązki .</li>
	<li>W oprogramowaniu FIB-SEM kliknij w okno w lewym górnym rogu i ustaw powiększenie SEM na 100x.</li>
	<li>W zakładce Alignment w oprogramowaniu mikroskopii świetlnej kliknij funkcję Widok, aby pobrać atlas siatki SEM. Ten obraz atlasu wykorzystuje wcześniej ustalone parametry.</li>
	<li>Zidentyfikuj kwadratowy obszar z uszkodzoną folią węglową i kliknij dwa razy, aby przenieść etap próbki w to miejsce.</li>
	<li>Wracam do oprogramowania sterującego FIB-SEM i ustawiam SEM na większe powiększenie , aby skupić się na wybranym obszarze kwadratowym, wyśrodkowanym w polu widzenia.</li>
	<li>Powtarzaj kroki 4.4 i 4.5 według potrzeby, aż SEM skoncentruje się na wyraźnym wzorze, takim jak ostra krawędź pękniętej folii węglowej.</li>
	<li>Włącz mikroskop fluorescencyjny i dostosuj współrzędne x, y, z, aby pasowały do widoku SEM.</li>
	<li>Na przykład wyfrezuj mały wzór za pomocą FIB, na przykład mały prostokąt lub koło.</li>
	<li>Potwierdź, że wzór jest widoczny zarówno w ujęciu z mikroskopu FIB, jak i fluorescencyjnego. Jeśli to konieczne, dostosuj wyrównanie, stosując kroki 4.3-4.7, jeśli to konieczne. UWAGA: Ustawienie i rejestracja mikroskopów optycznych i jonowych są zakończone.</li>
</ol>
5. Lokalizacja i frezowanie celów
UWAGA: Ta część jest adaptacją Wang39.
<ol>
	<li>Przejdź do zakładki Lokalizacja w oprogramowaniu do mikroskopii świetlnej i ustaw kanały fluorescencyjne, aktywując odpowiednie warunki wzbudzania i filtrowania. Przypisz każdemu fluoroforowi osobny kanał i dodaj dodatkowy kanał dla światła przepuszczonego (lub jasnego pola).</li>
	<li>Zidentyfikuj interesujący obiekt, dostrojąc moc LED i czas naświetlania dla każdego kanału fluorescencyjnego. Dla porównania, podczas obrazowania SiR-tubuliny używaj ekspozycji 1,2 s przy stałym ustawieniu mocy diody LED 30 mW. UWAGA: Parametry mogą się różnić w zależności od fluoroforów. Natężenie optyczne powinno pozostać poniżej ~25-50 W/cm2 w próbce. Większa intensywność może skutkować znacznym nagrzewaniem i devitryfikacją próbki37,40.</li>
	<li>Po spełnieniu parametrów należy uzyskać wstępnie frezujący fluorescencyjną warstwę Z, która przechodzi przez kierunek osiowy. Następnie oznacz cel jako zwrot z inwestycji.</li>
	<li>Przełącz się na oprogramowanie FIB-SEM, aby narysować lamellę przy ROI.</li>
	<li>Wykonaj surowe frezowanie, aby usunąć masę materiału około 3 μm powyżej i poniżej ROI. Jednocześnie podczas mielenia należy mieć włączony mikroskop fluorescencyjny, aby monitorować ewentualny spadek sygnału fluorescencyjnego.</li>
	<li>Rozcieńcz zwrot z inwestycji do ~2 μm w trybie przekroju czyszczącego.</li>
	<li>Otwórz zestaw narzędzi interferometrycznych oparty na Pythonie na terminalu, aby monitorować sygnał fluorescencjonalny podczas przerzedzania lamelli (https://github.com/pdahlb/trico_softwaresuite)36.</li>
	<li>Przy kolejnym frezowaniu i polerowaniu należy stosować jedno z dwóch opisanych poniżej podejścia w krokach 5.9 lub 5.10, aby precyzyjnie frezować na podstawie wymiarów wybranych tarcz.<ol>
		<li>Zasięg osiowy celu > 300 nm UWAGA: Tutaj zastosujemy półdestrukcyjne podejście do bezpośredniego mielenia.<ol>
			<li>W interfejsie Python-GUI wybierz obiekt zainteresowania na mikrografie fluorescencyjnej. Oprogramowanie automatycznie zacznie wyznaczać jasność w zależności od czasu przy każdej nowej klatce.</li>
			<li>Monitoruj intensywność fluorescencji za pomocą zestawu narzędzi Python. Zmiełek w trybie czyszczenia przekroju od dołu, aby usunąć wszelkie pozostałe materiały z folii nośnej, jeśli to możliwe. UWAGA: Po usunięciu folii nośnej należy zaobserwować wzrost fluorescencji.</li>
			<li>Użyj szybkich spadków intensywności fluorescencji — wskazujących na utratę materiału fluorescencyjnego — jako sygnału, kiedy zmienić kierunek frezowania. Na przykład, jeśli frezujesz od dołu do góry i zaobserwuje się gwałtowny spadek fluorescencji, przestań mieleczenie i przełącz się na frezowanie od góry w dół. UWAGA: Jeśli konstrukcja zostanie usunięta zbyt szybko, zmniejsz prąd frezowania w oprogramowaniu FIB-SEM, aby spowolnić usuwanie celu.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Zasięg osiowy celu ≤ 300 nm UWAGA: Tutaj użyjemy efektu interferometrycznego do kierowania frezowaniem36.<ol>
			<li>W interfejsie Python-GUI wybierz obiekt zainteresowania na mikrografie fluorescencyjnej. Oprogramowanie automatycznie zacznie wyznaczać jasność w zależności od czasu przy każdej nowej klatce.</li>
			<li>Zacznij od frezowania od góry do dołu przez cel testowy. Monitoruj kontrast prążków tuż przed przejściem przez cel przez intensywność fluorescencji. Cel fluorescencyjny jest stale dopasowywany do dwuwymiarowego Gaussa, a dopasowanie to służy do uzyskania całkowitej intensywności, która jest następnie wykreślana.</li>
			<li>Po przejściu celu dopasuj oscylacje w ścieżce intensywności do następującej funkcji modelu za pomocą interfejsu Pythona: 
			<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/68238/68239eq1.jpg" style="margin: auto;" /> Gdzie A to amplituda oscylacji, λ długość fali wzbudzenia, k to wyraz tłumiący reprezentujący długość koherencji źródła światła, czynnik fazowy Φ, a d to odległość do obiektu przechwytu. Z celu testowego wszystkie składniki można przewidzieć w rozsądnych granicach, tak że odległość d, jest jedyną wolną zmienną używaną do wskazania użytkownikowi, gdzie znajduje się obiekt fluorescencjonujący względem jego frezowania. Zobacz Sica i in. po więcej szczegółów36. UWAGA: Dla kolejnych celów zestaw narzędzi dopasowuje ścieżkę intensywności tą samą funkcją modelu i oszacuje, gdzie zatrzymać frezowanie od góry w dół. Wszystkie złączki wykonywane są jednocześnie z frezowaniem. Celem jest zatrzymanie frezowania, gdy cel leży na głębokości równej połowie pożądanej grubości lameli poniżej górnej powierzchni.</li>
			<li>Po zakończeniu frezowania odgórnego do dołu finalizuj lamelę, frezując od dołu do góry w trybie przekroju czyszczącego aż do osiągnięcia pożądanej grubości.</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Zrób zdjęcie fluorescencji po frezowaniu.</li>
</ol>
6. Mikroskopia świetlna korelacja i kolekcja serii tilt
<ol>
	<li>Po przeniesieniu próbki do CryoTEM pobierz atlasowy przegląd siatki o prędkości 182x, aby zapewnić wystarczające pokrycie całej siatki.</li>
	<li>Przy odpowiednim pośrednim powiększeniu od 6 500x do 11 000x pobierz serię montażowych zdjęć ostatniej lamelli pod kątem 0°.</li>
	<li>Przeczytaj post frezowanie wielokanałowych obrazów fluorescencyjnych oraz obraz projekcji z kroku 6.2 do niestandardowego oprogramowania do transformacji rzutowej do rejestracji zwrotu z inwestycji (https://github.com/pdahlb/CLEM_software_suite.git).</li>
	<li>Wybierz łącznie 8-10 par punktów odniesienia, aby precyzyjnie obliczyć transformację obrazu rzutowego. UWAGA: Te punkty mogą być oczywistymi cechami (np. krawędziami lameli, widocznym zanieczyszczeniem lodem lub otwartymi otworami w siatce), które występują zarówno w mikroskopii optycznej w jasnym polu, jak i w mikroskopii elektronowej.</li>
</ol>
7. Kolekcja serii przechyleń o wysokim powiększeniu
<ol>
	<li>Wykorzystaj ten nałożony obraz z mikroskopii fluorescencyjnej i transmisyjnej jako punkt odniesienia, aby użytkownicy mogli wybrać obszar obrazowania mieszczący się w granicach rozmiaru klatki kamery do zbierania serii z dużą powiększeniem tilt.</li>
	<li>Wybierz powiększenie i parametry serii przechylenia w zależności od zagadnienia biologicznego. UWAGA: Do demonstracji zebraliśmy dane z 54° z przyrostami o 2° przy rozmiarze piksela 3,5 Å41,42,43.</li>
</ol>

<ol><li>Komeili, A., Li, Z., Newman, D. K., Jensen, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Magnetosomes+are+cell+membrane+invaginations+organized+by+the+actin-like+protein+MamK%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Magnetosomes are cell membrane invaginations organized by the actin-like protein MamK.</a> Science. 311 (5758), 242-245 (2006).</li>
<li>Bykov, Y. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+structure+of+the+COPI+coat+determined+within+the+cell%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">The structure of the COPI coat determined within the cell.</a> eLife. 6, e32493(2017).</li>
<li>Mahamid, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualizing+the+molecular+sociology+at+the+HeLa+cell+nuclear+periphery%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Visualizing the molecular sociology at the HeLa cell nuclear periphery.</a> Science. 351 (6276), 969-972 (2016).</li>
<li>Xue, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualizing+translation+dynamics+at+atomic+detail+inside+a+bacterial+cell%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Visualizing translation dynamics at atomic detail inside a bacterial cell.</a> Nature. 610 (7930), 205-211 (2022).</li>
<li>Hampton, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Correlated+fluorescence+microscopy+and+cryo-electron+tomography+of+virus-infected+or+transfected+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Correlated fluorescence microscopy and cryo-electron tomography of virus-infected or transfected mammalian cells.</a> Nat Protoc. 12 (1), 150-167 (2017).</li>
<li>Oikonomou, C. M., Jensen, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+electron+cryotomography%3A+Toward+structural+biology+in+situ%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Biochem%22%5BJournal%5D)">Cellular electron cryotomography: Toward structural biology in situ.</a> Annu Rev Biochem. 86 (1), 873-896 (2017).</li>
<li>Grimm, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electron+tomography+of+ice-embedded+prokaryotic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Electron tomography of ice-embedded prokaryotic cells.</a> Biophys J. 74 (2), 1031-1042 (1998).</li>
<li>Medalia, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macromolecular+architecture+in+eukaryotic+cells+visualized+by+cryoelectron+tomography%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Macromolecular architecture in eukaryotic cells visualized by cryoelectron tomography.</a> Science. 298 (5596), 1209-1213 (2002).</li>
<li>Tamborrini, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+of+the+native+myosin+filament+in+the+relaxed+cardiac+sarcomere%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Structure of the native myosin filament in the relaxed cardiac sarcomere.</a> Nature. 623 (7988), 863-871 (2023).</li>
<li>Kaplan, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bdellovibrio+predation+cycle+characterized+at+nanometre-scale+resolution+with+cryo-electron+tomography%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Bdellovibrio predation cycle characterized at nanometre-scale resolution with cryo-electron tomography.</a> Nat Microbiol. 8 (7), 1267-1279 (2023).</li>
<li>Schur, F. K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+atomic+model+of+HIV-1+capsid-SP1+reveals+structures+regulating+assembly+and+maturation%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">An atomic model of HIV-1 capsid-SP1 reveals structures regulating assembly and maturation.</a> Science. 353 (6298), 506-508 (2016).</li>
<li>Arnold, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Site-specific+cryo-focused+ion+beam+sample+preparation+guided+by+3D+correlative+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Site-specific cryo-focused ion beam sample preparation guided by 3D correlative microscopy.</a> Biophys J. 110 (4), 860-869 (2016).</li>
<li>Lam, V., Villa, E. Practical approaches for cryo-FIB milling and applications for cellular cryo-electron tomography. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aLam%2C+V+%22cryoEM%3A+Methods+and+Protocols%22">cryoEM: Methods and Protocols</a>. , Springer. 49-82 (2020).</li>
<li>Rigort, A., Plitzko, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cryo-focused-ion-beam+applications+in+structural+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Arch+Biochem+Biophys%22%5BJournal%5D)">Cryo-focused-ion-beam applications in structural biology.</a> Arch Biochem Biophys. 581, 122-130 (2015).</li>
<li>Noble, A. J., de Marco, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cryo-focused+ion+beam+for+in+situ+structural+biology%3A+State+of+the+art%2C+challenges%2C+and+perspectives%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Struct+Biol%22%5BJournal%5D)">Cryo-focused ion beam for in situ structural biology: State of the art, challenges, and perspectives.</a> Curr Opin Struct Biol. 87, 102864(2024).</li>
<li>Rigort, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Focused+ion+beam+micromachining+of+eukaryotic+cells+for+cryoelectron+tomography%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Focused ion beam micromachining of eukaryotic cells for cryoelectron tomography.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (12), 4449-4454 (2012).</li>
<li>Iancu, C. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electron+cryotomography+sample+preparation+using+the+Vitrobot%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Electron cryotomography sample preparation using the Vitrobot.</a> Nat Protoc. 1 (6), 2813-2819 (2006).</li>
<li>Dobro, M. J., Melanson, L. A., Jensen, G. J., McDowall, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plunge+freezing+for+electron+cryomicroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Plunge freezing for electron cryomicroscopy.</a> Methods Enzymol. 481, 63-82 (2010).</li>
<li>Chang, Y. -W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Correlated+cryogenic+photoactivated+localization+microscopy+and+cryo-electron+tomography%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Correlated cryogenic photoactivated localization microscopy and cryo-electron tomography.</a> Nat Methods. 11 (7), 737-739 (2014).</li>
<li>Wu, G. -H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multi-scale+3D+cryo-correlative+microscopy+for+vitrified+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Structure%22%5BJournal%5D)">Multi-scale 3D cryo-correlative microscopy for vitrified cells.</a> Structure. 28 (11), 1231-1237.e3 (2020).</li>
<li>Lin, C., Zhang, L., Zhang, Z., Jiang, Y., Li, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Locating+cellular+contents+during+cryo-FIB+milling+using+cellular+secondary-electron+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22J+Struct+Biol%22%5BJournal%5D)">Locating cellular contents during cryo-FIB milling using cellular secondary-electron imaging.</a> J Struct Biol. 215 (3), 108005(2023).</li>
<li>Wagner, F. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparing+samples+from+whole+cells+using+focused-ion-beam+milling+for+cryo-electron+tomography%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Preparing samples from whole cells using focused-ion-beam milling for cryo-electron tomography.</a> Nat Protoc. 15 (6), 2041-2070 (2020).</li>
<li>Carter, S. D., Mamede, J. I., Hope, T. J., Jensen, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Correlated+cryogenic+fluorescence+microscopy+and+electron+cryo-tomography+shows+that+exogenous+TRIM5%CE%B1+can+form+hexagonal+lattices+or+autophagy+aggregates+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Correlated cryogenic fluorescence microscopy and electron cryo-tomography shows that exogenous TRIM5α can form hexagonal lattices or autophagy aggregates in vivo.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 117 (47), 29702-29711 (2020).</li>
<li>Guo, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+situ+structure+of+neuronal+C9orf72+poly-GA+aggregates+reveals+proteasome+recruitment%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">In situ structure of neuronal C9orf72 poly-GA aggregates reveals proteasome recruitment.</a> Cell. 172 (4), 696-705.e12 (2018).</li>
<li>Perez, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+and+demonstration+of+roGFP2+as+an+environmental+sensor+for+cryogenic+correlative+light+and+electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Struct+Biol%22%5BJournal%5D)">Identification and demonstration of roGFP2 as an environmental sensor for cryogenic correlative light and electron microscopy.</a> J Struct Biol. 214 (3), 107881(2022).</li>
<li>Sartor, A. M., Dahlberg, P. D., Perez, D., Moerner, W. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+mApple+as+a+red+fluorescent+protein+for+cryogenic+single-molecule+imaging+with+turn-off+and+turn-on+active+control+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22J+Phys+Chem+B%22%5BJournal%5D)">Characterization of mApple as a red fluorescent protein for cryogenic single-molecule imaging with turn-off and turn-on active control mechanisms.</a> J Phys Chem B. 127 (12), 2690-2700 (2023).</li>
<li>Sexton, D. L., Burgold, S., Schertel, A., Tocheva, E. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Super-resolution+confocal+cryo-CLEM+with+cryo-FIB+milling+for+in+situ+imaging+of+Deinococcus+radiodurans%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Res+Struct+Biol%22%5BJournal%5D)">Super-resolution confocal cryo-CLEM with cryo-FIB milling for in situ imaging of Deinococcus radiodurans.</a> Curr Res Struct Biol. 4, 1-9 (2022).</li>
<li>Dahlberg, P. D., Moerner, W. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cryogenic+super-resolution+fluorescence+and+electron+microscopy+correlated+at+the+nanoscale%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Phys+Chem%22%5BJournal%5D)">Cryogenic super-resolution fluorescence and electron microscopy correlated at the nanoscale.</a> Annu Rev Phys Chem. 72 (1), 253-278 (2021).</li>
<li>Perez, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exploring+transient+states+of+PAmKate+to+enable+improved+cryogenic+single-molecule+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22J+Am+Chem+Soc%22%5BJournal%5D)">Exploring transient states of PAmKate to enable improved cryogenic single-molecule imaging.</a> J Am Chem Soc. 146 (42), 28707-28716 (2024).</li>
<li>Li, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ELI+trifocal+microscope%3A+A+precise+system+to+prepare+target+cryo-lamellae+for+in+situ+cryo-ET+study%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">ELI trifocal microscope: A precise system to prepare target cryo-lamellae for in situ cryo-ET study.</a> Nat Methods. 20 (2), 276-283 (2023).</li>
<li>Loginov, S. V., Boltje, D. B., Hensgens, M. N. F., Hoogenboom, J. P., vander Wee, E. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Depth-dependent+scaling+of+axial+distances+in+light+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Optica%22%5BJournal%5D)">Depth-dependent scaling of axial distances in light microscopy.</a> Optica. 11 (4), 553-568 (2024).</li>
<li>Petrov, P. N., Moerner, W. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Addressing+systematic+errors+in+axial+distance+measurements+in+single-emitter+localization+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Opt+Express%22%5BJournal%5D)">Addressing systematic errors in axial distance measurements in single-emitter localization microscopy.</a> Opt Express. 28 (13), 18616-18632 (2020).</li>
<li>Yang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Precise+3D+localization+by+integrated+fluorescence+microscopy+%28iFLM%29+for+cryo-FIB-milling+and+in+situ+cryo-ET%5BTitle%5D)+AND+%22Microsc+Microanal%22%5BJournal%5D)">Precise 3D localization by integrated fluorescence microscopy (iFLM) for cryo-FIB-milling and in situ cryo-ET.</a> Microsc Microanal. 29 (Suppl. 1), 1055-1057 (2023).</li>
<li>Perton, E., Boltje, D., Jakobi, A., Hoogenboom, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Workflow+for+fluorescence-targeted+lamella+milling+from+vitrified+cells+with+a+coincident+fluorescence%2C+electron%2C+and+ion+beam+microscope%5BTitle%5D)+AND+%22Bio+Protoc%22%5BJournal%5D)">Workflow for fluorescence-targeted lamella milling from vitrified cells with a coincident fluorescence, electron, and ion beam microscope.</a> Bio Protoc. 15 (14), e5390(2025).</li>
<li>Boltje, D. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+cryogenic%2C+coincident+fluorescence%2C+electron%2C+and+ion+beam+microscope%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">A cryogenic, coincident fluorescence, electron, and ion beam microscope.</a> eLife. 11, e82891(2022).</li>
<li>Sica, A. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+interference+for+the+guidance+of+cryogenic+focused+ion+beam+milling+beyond+the+axial+diffraction+limit%5BTitle%5D)+AND+%22bioRxiv%22%5BJournal%5D)">Optical interference for the guidance of cryogenic focused ion beam milling beyond the axial diffraction limit.</a> bioRxiv. , (2024).</li>
<li>Dahlberg, P. D., Perez, D., Hecksel, C. W., Chiu, W., Moerner, W. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metallic+support+films+reduce+optical+heating+in+cryogenic+correlative+light+and+electron+tomography%5BTitle%5D)+AND+%22J+Struct+Biol%22%5BJournal%5D)">Metallic support films reduce optical heating in cryogenic correlative light and electron tomography.</a> J Struct Biol. 214 (4), 107901(2022).</li>
<li>Lukinavicius, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorogenic+probes+for+live-cell+imaging+of+the+cytoskeleton%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Fluorogenic probes for live-cell imaging of the cytoskeleton.</a> Nat Methods. 11 (7), 731-733 (2014).</li>
<li>Wang, J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWang%2C+J+%22Direct+visualization+of+cellular+protein+complexes+in+situ+by+fluorescence-guided+cryo-FIB-SEM+and+cryo-ET%22">Direct visualization of cellular protein complexes in situ by fluorescence-guided cryo-FIB-SEM and cryo-ET</a>. , California Institute of Technology. (2025).</li>
<li>Last, M. G., Tuijtel, M. W., Voortman, L. M., Sharp, T. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selecting+optimal+support+grids+for+super-resolution+cryogenic+correlated+light+and+electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Selecting optimal support grids for super-resolution cryogenic correlated light and electron microscopy.</a> Sci Rep. 13 (1), 8270(2023).</li>
<li>Mastronarde, D. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+electron+microscope+tomography+using+robust+prediction+of+specimen+movements%5BTitle%5D)+AND+%22J+Struct+Biol%22%5BJournal%5D)">Automated electron microscope tomography using robust prediction of specimen movements.</a> J Struct Biol. 152 (1), 36-51 (2005).</li>
<li>Mastronarde, D. N., Held, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+tilt+series+alignment+and+tomographic+reconstruction+in+IMOD%5BTitle%5D)+AND+%22J+Struct+Biol%22%5BJournal%5D)">Automated tilt series alignment and tomographic reconstruction in IMOD.</a> J Struct Biol. 197 (2), 102-113 (2017).</li>
<li>Kremer, J. R., Mastronarde, D. N., McIntosh, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Computer+visualization+of+three-dimensional+image+data+using+IMOD%5BTitle%5D)+AND+%22J+Struct+Biol%22%5BJournal%5D)">Computer visualization of three-dimensional image data using IMOD.</a> J Struct Biol. 116 (1), 71-76 (1996).</li>
<li>Meng, E. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((UCSF+ChimeraX%3A+Tools+for+structure+building+and+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Sci%22%5BJournal%5D)">UCSF ChimeraX: Tools for structure building and analysis.</a> Protein Sci. 32 (11), e4792(2023).</li>
<li>Heebner, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deep+learning-based+segmentation+of+cryo-electron+tomograms%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Deep learning-based segmentation of cryo-electron tomograms.</a> J Vis Exp. (189), e64435(2022).</li>
<li>Klumpe, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+modular+platform+for+automated+cryo-FIB+workflows%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">A modular platform for automated cryo-FIB workflows.</a> eLife. 10, e70506(2021).</li>
<li>Li, Y., Kang, D. -D., Dai, J. -Y., Wang, L. -W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+cage+effect+of+electron+beam+irradiation+damage+in+cryo-electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22npj+Comput+Mater%22%5BJournal%5D)">The cage effect of electron beam irradiation damage in cryo-electron microscopy.</a> npj Comput Mater. 10 (1), 115(2024).</li>
</ol>

Autorzy nie mają żadnych konfliktów interesów do ujawnienia.

Nasze wyniki podkreślają użyteczność platformy obrazowania trójkobiegielnego, która umożliwia jednoczesne obrazowanie fluorescencyjne i frezowanie. Wykorzystując tę informację zwrotną, demonstrujemy dwie strategie frezowania kierowane fluorescencją — półdestrukcyjną i interferometryczną — które eliminują konieczność uciążliwych i rejestracyjnych podejść napotykających fundamentalne ograniczenia dokładności związane z niedopasowaniem współczynnika załamania światła i ruchem podczas frezowania 12,33,46. Ponadto, ponieważ precyzyjne naprowadzanie opiera się na mikroskopii fluorescencyjnej, a nie SEM, promieniowanie optyczne nie powoduje wykrywalnych uszkodzeń, o ile intensywność pozostaje poniżej progu prowadzącego do dewitryfikacji37,47. Przedstawione tutaj możliwości rozszerzają dostępne próbki biologiczne o rzadkie i małe (<300 nm w zasięgu osiowym) interesujące cele, jednocześnie usprawniając przepływ pracy.
Kluczowym krokiem w tym protokole jest określenie, kiedy zaprzestać mielenia na podstawie zmian jasności jarzeniówek interesującego go obiektu. Obecnie wymaga to szybkiej ręcznej interwencji, aby zatrzymać frezowanie w pożądanych momentach. Ta metoda okazała się wystarczająca dla obecnie badanych celów, ale przyszłe modyfikacje mogą dodatkowo zintegrować zestaw narzędzi Pythona z systemem FIB, aby bezpośrednio zatrzymać frezowanie. Ta modyfikacja może być konieczna, jeśli wymagane są szybsze tempo frezowania, ponieważ pozwoli to na mniej czasu na ręczną interwencję. Alternatywnie, jeśli wolniejsze tempo mielenia można tolerować, da to więcej czasu na ręczną interwencję w razie potrzeby.
Po wygenerowaniu interesujących się struktur biologicznych zawierających lamelę, nasze spersonalizowane oprogramowanie do transformacji obrazów umożliwia korelację na poziomie CryoTEM, wykorzystując przeglądy atlasowe lamel do prowadzenia zbierania danych CryoET. Ogólnie rzecz biorąc, przedstawiony tutaj protokół jest niezbędny do obrazowania fluorescencyjnie oznakowanych, małych i rzadkich celów biologicznych za pomocą tomografii elektronowej kriogenicznej w grubych próbkach komórek eukariotycznych. W porównaniu z istniejącymi nieprzypadkowymi systemami krio-FIB, takimi jak Aquilos 2 z iFLM, nasz workflow osiąga wyższy wskaźnik skuteczności w realizacji tych funkcji.
Ta wysoka precyzja celowania odbywa się kosztem efektywności. Ponieważ frezowanie odbywa się ręcznie, a nie automatycznie, przepustowość wytwarzania lameli jest ograniczona. W 8-godzinnej sesji mielenia zazwyczaj produkujemy 6-8 lameli, z czego około pięć zawiera interesujący cel. Jednak uważamy, że ten przepływ pracy może zostać w przyszłości zautomatyzowany, aby poprawić przepustowość. Automatyzacja wymagałaby niestandardowych skryptów do ciągłego monitorowania aktywnych obszarów frezowania na obrazie FIB oraz śledzenia intensywności fluorescencji w czasie rzeczywistym, aby zapewnić retencję docelową. Pozostają kluczowe wyzwania, w tym zapewnienie skutecznej komunikacji między wszystkimi niestandardowymi skryptami a oprogramowaniem sterującym zarówno dla CryoFIB-SEM, jak i mikroskopu fluorescencyjnego.
Patrząc w przyszłość, przed nami wiele prac nad wdrożeniem innych zaawansowanych technik mikroskopii fluorescencyjnej omawianych wcześniej, w tym fluorescencyjnego biosensorów, obrazowania superrozdzielczości oraz mikroskopii konfokalnej. Niemniej jednak przewidujemy, że geometrie trójzbiegowe staną się standardem w przyszłych instrumentach, a jednoczesne obrazowanie fluorescencyjne podczas frezowania stanie się rutyną. Jeśli tak, protokół ten może służyć jako cenny przewodnik dla badaczy dążących do uchwycenia szczegółów molekularnych małych i rzadkich struktur biologicznych, które mimo swojego rozmiaru i liczności są kluczowe dla biologii komórki.

Kriogeniczna tomografia elektronowa (CryoET) umożliwia wizualizację próbek biologicznych w stanie bliskim naturalnym z rozdzielczością makrocząsteczkową 1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11 . Jednak grubość komórek eukariotycznych — często kilka mikronów — przekracza średnią drogę wolną (~300 nm) elektronów o napięciu 300 kV, co ogranicza głębokość penetracji elektronów nierozproszonych, a tym samym ogranicza użyteczną grubość próbki. Aby temu zaradzić, można użyć wiązki jonów skupionych (FIB) do ablacji większości ogniwa zachowanego kriogenicznie w procesie zwanym młynem CryoFIB, co pozwala uzyskać lamele wystarczająco cienkie do obrazowaniaCryoET 12,13,14,15,16.
W wcześniej raportowanych procesach próbki są najpierw konserwowane w zwitrzanym lodzie poprzez zanurzanie17, 18, 19, 19, a następnie ładowane do instrumentu dwuwiązkowego wyposażonego zarówno w krioFIB, jak i skaningowy mikroskop elektronowy (SEM). Obrazowanie SEM może być wykorzystywane do identyfikacji cech podkomórkowych, takich jak organelli, a nawet niektórych struktur białkowych20,21. Informacje te mogą być wykorzystywane do kierowania procesem mielenia CryoFIB, w którym próbka jest ablowana stopniowo, z zamiarem uzyskania lamelli o grubości poniżej 200 nm odpowiedniej do CryoET 13,14,22. Jednak to podejście stawia przed sobą dwa kluczowe wyzwania, które rozwiązuje obecny protokół. Po pierwsze, często konieczne jest uzyskanie CryoET konkretnych struktur białkowych, ale SEM może być szkodliwy, a większość struktur białkowych nie jest widoczna przez SEM podczas obrazowania niebarwionego materiału biologicznego. Jak można precyzyjnie kierować mielenie do konkretnych obszarów subkomórkowych lub obszarów zawierających określone biomolekuły w sposób wolny od uszkodzeń? Po drugie, nawet po produkcji cienkich lamel i późniejszym CryoET, identyfikacja konkretnych biomolekuł w końcowych rekonstrukcjach może być trudna ze względu na niewystarczającą rozdzielczość, stosunek sygnału do szumu i/lub kontrast wymagany do jednoznacznej identyfikacji. Jak można określić położenie przestrzenne tych biomolekuł w rekonstrukcjach krio-ET?
Aby sprostać obu wyzwaniom, dziedzina coraz częściej zwraca się ku mikroskopii fluorescencyjnej. Genetycznie kodowane fluorescencyjne białka lub egzogenne barwniki wiążące białka docelowe są rutynowo używane do oznaczania konkretnych biomolekuł interesujących 5,23,24. Kriogeniczna mikroskopia fluorescencyjna komórek szklistych wykonana po mieleniu może być powiązana z uzyskanymi tomogramami. To podejście, znane jako kriogeniczna korelacja mikroskopia świetlno-elektronowa (CryoCLEM), jest dobrze ugruntowane i szeroko stosowane do lokalizacji specyficznych białek w rekonstrukcjach CryoET 5,12,23,24. Najnowsze osiągnięcia obejmują zastosowanie fluorescencyjnych biosensorów oraz metod superrozdzielczości w celu zwiększenia informacji uzupełniających i precyzji przestrzennej 25,26,27,28,29.
CryoCLEM jest jednym ze sposobów na pokonanie drugiego wyzwania wskazanego powyżej, umożliwiającego określenie lokalizacji konkretnych białek w lamelach. Jednak CryoCLEM nie działa na korzyść, jeśli ostatnia lamella nie zawiera interesujących go białek. Na szczęście mikroskopia fluorescencyjna może być również wykorzystywana do kierowania mielenia do oznakowanych obszarów zainteresowania. Chociaż frezowanie FIB kierowane fluorescencją jest nowszym rozwiązaniem niż CryoCLEM, a pierwsze procesy powstały około dekadytemu, szybko i szeroko się przyjęły. Wczesne protokoły opierały się na zewnętrznych mikroskopach świetlnych do pozyskiwania zbiorów danych fluorescencyjnych 2D lub 3D, które następnie rejestrowano na obrazach SEM i wiązki jonowej po przeniesieniu próbki do CryoFIB-SEM. W ostatnich latach mikroskopy fluorescencyjne zostały zintegrowane bezpośrednio z komorami próżniowymi CryoFIB-SEM. Ta integracja zmniejsza zanieczyszczenie lodem podczas transferów i ułatwia obrazowanie końcowej lamelli. Opracowano już kilka platform łączących mikroskopię fluorescencyjną z CryoFIB-SEM do frezowania sterowanego fluorescencją. Skutecznie ukierunkowały się na organelle i duże kompleksy białkowe 5,23,24. Jednak z nielicznymi wyjątkami30, ścieżka optyczna tworzy oddzielną płaszczyznę ogniskową w innym obszarze fizycznym komory próżniowej niż FIB-SEM. W rezultacie do kierowania frezowaniem nadal wymagana jest precyzyjna rejestracja między obrazami fluorescencyjnymi a jonowymi, podobnie jak w przypadku samodzielnych mikroskopów optycznych.
Proces rejestracji jest podatny na niedokładności z powodu trzech kluczowych czynników: niezgodności współczynnika załamania (powodujące pozorne przesunięcia ogniskowej)31,32, ruchu próbki podczas frezowania oraz błędu lokalizacji. Ponadto rejestracja jest zazwyczaj wspomagana przez fluorescencyjne fiduciale o wielkości mikrona, widoczne zarówno w modalnościach jonowych, jak i optycznych, i wykorzystywane jako pary punktów wyrównania do obliczania przekształceń między obrazami jonowymi a optycznymi. Jednak te kulki mogą zaciemniać lub konkurować z sygnałem fluorescencji z próbki, a ich lokalizacja i wyrównanie na obrazach optycznych i jonowych jest powolne i wymagające dla użytkownika. Te ograniczenia utrudniają rutynowe celowanie małych i rzadkich obiektów. Chociaż trudno jest precyzyjnie określić granicę struktur, które można obecnie zachować w cienkich lameli, podejścia oparte na rejestracji są zazwyczaj uważane za nieskuteczne w łapaniu celów o wymiarach osiowych poniżej jednego mikrona33.
Tutaj opisujemy użycie systemu obrazowania trójkobiegowego, który integruje mikroskopię FIB, SEM i fluorescencję w jednej pozycji ogniskowej34,35. Ta konfiguracja pozwala na prostsze i dokładniejsze frezowanie sterowane fluorescencją w porównaniu z niezbieżnymi całowaniami, eliminując konieczność rejestrowania obrazów optycznych i jonowych. W idealnych warunkach niskiego tła i wysokiego sygnału można osiągnąć dokładność naprowadzania rzędu 10 nm napoziomie 36. Umożliwia także pozyskiwanie wielokolorowych danych z kriogenicznej mikroskopii fluorescencyjnej przez cały proces frezowania, w tym z końcowej cienkiej lameli, co umożliwia analizę korelacji i lokalizację celów ograniczonych subdyfrakcją35. Aby to osiągnąć, stosujemy spersonalizowany zestaw narzędzi do transformacji obrazów, aby precyzyjnie wyrównać te obrazy fluorescencji z mikroskopią transmisyjną o niskim powiększeniu, aby określić, gdzie pobrać CryoET, usprawniając zbieranie danych i zapewniając przechwycenie celów w końcowych rekonstrukcjach tomograficznych.
Aby kierować frezowaniem, wykorzystujemy zdolność systemu do monitorowania zmian intensywności fluorescencji w czasie rzeczywistym. Zamiast próbować wyrównywać obrazy optyczne i jonowe, aby znaleźć cel, użytkownik po prostu obserwuje sygnał fluorescencjonalny z próbki. W miarę postępu mielenia fluorescencja zachowuje się bardzo charakterystycznie: najpierw staje się jaśniejszy, gdy usuwana jest warstwa podtrzymująca węgla między obiektywem mikroskopu a fluorescencyjnie oznakowaną próbką, następnie stopniowo maleje, gdy materiał autofluorescencyjny jest frezowany, a ostatecznie gwałtownie maleje, gdy sama oznaczona struktura jest częściowo usuwana. Ten sygnał w czasie rzeczywistym precyzyjnie określa, na jakim etapie frezowania znajduje się proces frezowania i kiedy należy go zatrzymać, zapewniając, że docelowy obiekt pozostaje w końcowej lamelli37. W szczegółowym protokole omówimy również bardziej zaawansowane podejście, które wykorzystuje oscylacje jasności fluorescencji spowodowane efektami interferometrycznymi do kierowania frezowaniem do obiektów o zasięgu osiowym <300 nm.
Demonstrujemy użyteczność platformy, celując w centrum organizowania mikrotubul (MTOC)38. MTOC jest kluczowym organellem zaangażowanym w podział i różnicowanie komórek. W komórkach ssaków mikroskopia fluorescencyjna znakowanej tubuliny ujawnia MTOC jako pojedynczy fluorescencjonujący punkt o średnicy około 1 μm w komórkach żywych. To podejście zostało wykorzystane do skutecznej lokalizacji MTOC z wysoką wiernością do cienkich lamel komórek witryfikowanych. Szczegółowa organizacja mikrotubul w MTOC oraz ich interakcje z innymi organellami ujawniają kolejne rekonstrukcje tomograficzne. Ten workflow umożliwia precyzyjną mikroskopię fluorescencyjną korelację i CryoFIB-SEM bez rejestracji, ograniczając dane wejściowe użytkownika i rozszerzając dostęp do struktur komórkowych, które wcześniej były zbyt małe do solidnego rejestrowania przy nieprzypadkowych podejściach.
Definicje i opis instrumentów Zintegrowany mikroskop optyczny jest szczegółowo opisany w Boltje i in. 35, a dalsze szczegóły dotyczące użycia mikroskopu zintegrowanego można znaleźć w niedawno opublikowanym protokole34. Obiektyw jest zintegrowany od dołu i wyposażony w funkcje pozycjonowania x, y i z, umożliwiające wyrównanie z punktem zbieżności FIB-SEM. Obecnie działa z obiektywem 100x, 0,85 NA z korektorem pokrywy. Obrazowanie optyczne odbywa się za pomocą szkła osłonowego, które chroni obiektyw przed pryskającymi materiałami oraz napromieniowaniem zarówno z FIB, jak i SEM. Oświetlenie szerokokątne zapewnia zestaw diod LED obejmujących wiele długości fal widzialnych. Detekcja fluorescencji realizowana jest za pomocą detektora sCMOS. Istnieją trzy określone pozycje etapu: obciążenie: pozycja etapu, do której załadowana jest próbka; powłoka: pozycja etapu do powlekania przez system wtrysku gazu; 3-wiązka: pozycja sceniczna, dla której wszystkie trzy mikroskopy (FIB, SEM i optyczne) mogą być współwyrównane.

<table><tbody><tr><td>Krio-FIB Aquilos 2</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td></td><td>https://www.thermofisher.com/us/en/home/electron-microscopy/products/dualbeam-fib-sem-microscopes/aquilos-cryo-fib.html?cid=msd_ls_xseg_xmkt_sdb-aquilos_285811_na_pso_gaw_pei90m & gad_source=1& gad_campaignid=12 764255901& gbraid=0AAAAADxi_GS s7OvZmg4cgCUm0PjSiq9X9& gclid= Cj0KCQjwh5vFBhCyARIsAHBx2w xlIfYHMvqY3sSWu6oEAdUynCSf9 KRg9Jhjp7l0Dot9qTl6GyQaEo8aAiy 2EALw_wcB</td></tr><tr><td>Kryokratka kompatybilna z Autogrid</td><td>Nauki o mikroskopii elektronowej</td><td></td><td>https://www.emsdiasum.com/autogrid -compatible-cryo-grid-box?srsltid= AfmBOorQAd3esD8fLmnDDO2TvrNk cj4UINXFnPSMgrpEmkWd0H7ImUq7</td></tr><tr><td>Pierścienie autosiatki i klipsy C</td><td>Nanosoft</td><td></td><td>https://www.nanosoftmaterials.com/product-page/100-pack-autogrid-rings-c-clips</td></tr><tr><td>Pakiet oprogramowania CLEM</td><td>Grupa Badawcza Dahlberga na Stanford/SLAC</td><td></td><td>https://github.com/pdahlb/CLEM_software_suite.git</td></tr><tr><td>Ważka 2022.1</td><td>Systemy badań obiektowych</td><td></td><td>https://dragonfly.comet.tech/</td></tr><tr><td>ENZEL</td><td>Delmic B. V.</td><td></td><td>System ENZEL jest instrumentem dostosowanym do spersonalizacji i obecnie nie jest dostępny komercyjnie</td></tr><tr><td>IMOD 4.12</td><td>Uniwersytet Kolorado</td><td></td><td>https://bio3d.colorado.edu/imod/</td></tr><tr><td>LD4 dewar ciekłego azotu</td><td>Nanosoft</td><td></td><td>https://www.nanosoftmaterials.com/product-page/ld4-liquid-dewar-4-liters</td></tr><tr><td>MATLAB 2023</td><td>MathWorks</td><td></td><td>https://www.mathworks.com/products/matlab.html</td></tr><tr><td>Narzędzie do manipulacji pokrywką kołka</td><td>Nanosoft</td><td></td><td>https://www.nanosoftmaterials.com/product-page/pin-lid-manipulator-tool</td></tr><tr><td>Zestaw narzędzi Pythona</td><td>Grupa Badawcza Dahlberga na Stanford/SLAC</td><td></td><td>https://github.com/pdahlb/trico_softwaresuite</td></tr><tr><td>Quantifoil R2/2, LF, siatka 200, siatka Au EM</td><td>Nauki o mikroskopii elektronowej</td><td></td><td>https://www.emsdiasum.com/quantifoil-r-22-lf-200-mesh-gold</td></tr><tr><td>Serial EM</td><td>Uniwersytet Kolorado w Boulder</td><td></td><td>https://bio3d.colorado.edu/SerialEM/</td></tr><tr><td>Standardowy statek z włóczniami (transfer Dewar)</td><td>Nanosoft</td><td></td><td>https://www.nanosoftmaterials.com/product-page/spearlab-standard-vessel</td></tr><tr><td>Pęseta</td><td>Nauki o mikroskopii elektronowej</td><td></td><td>https://www.emsdiasum.com/style-3sa</td></tr></tbody></table>

workflow z wykorzystaniem kriogenicznego mikroskopu fluorescencyjnego, elektronowo-jonowego do ukierunkowanego frezowania komórek

Workflow Using a Cryogenic Coincident Fluorescence, Electron, and Ion Beam Microscope for Targeted Milling of Cells

Kriogeniczne skierowanie wiązką jonów z mikroskopią skaningową (CryoFIB-SEM) stało się dominującym podejściem do przygotowywania lamel komórek o grubości poniżej 200 nm do tomografii elektronowej kriogenicznej (CryoET). Ostatnio mikroskopia fluorescencyjna została włączona do systemów CryoFIB-SEM, aby kierować produkcją lamelli w kierunku celów znakowanych fluorescencjo. Jednak w większości zastosowań systemy obrazowania optycznego i wiązki jonowej mają odrębne płaszczyzny ogniskowe w różnych rejonach komory próżniowej — działając skutecznie jako dwa oddzielne mikroskopy. Ta konfiguracja wymaga rejestracji obrazu pomiędzy modalnościami, co często nie jest wystarczające do niezawodnego celowania małych, rzadkich struktur in situ. Przedstawiamy workflow oparty na spersonalizowanej platformie obrazowania trójkobiegowego (trójkobiegowego), która umożliwia jednoczesne obrazowanie fluorescencyjne i frezowanie wiązką jonową o skupieniu. Pozwala to na uzyskanie sprzężenia zwrotnego fluorescencji w czasie rzeczywistym, które pozwala określić, kiedy zakończyć mielenie, aby zachować fluorescencyjne struktury, które są interesujące w końcowej lameli. Stosując to podejście, celowaliśmy w centrum organizujące mikrotubule (MTOC) w zsztartych makrofagach i osiągnęliśmy skuteczność >60%, potwierdzoną przez późniejszą kriogeniczną tomografię elektronową oraz korelacyjne mikroskopię świetlną i elektronową.

Przed zamrożeniem oznaczaliśmy zróżnicowane komórki makrofagów markerem tubulinowym SiR-tubuliną. Zgodnie z protokołem zidentyfikowaliśmy MTOC jako pojedynczy fluorescencjonalny punktum o średnicy ~ 1 μm pod mikroskopem fluorescencyjnym (rysunek 1A). Dodatkowo zaobserwowaliśmy fluorescencyjne struktury przypominające włókna promieniujące z MTOC w kierunku obwodów komórek, zgodne z siecią mikrotubul (Rysunek 1A). Zdjęcia stopniowego frezowania o różnych grubościach próbek pokazano na Rysunku 1B. Co istotne, gdy lamella osiągnęła grubość około 800 nm, pojedynczy punkt MTOC rozdzielał się na dwie sąsiadujące plamki, każda o średnicy około 700 nm. Późniejsza analiza potwierdziła, że każda plamka odpowiadała pojedynczemu centriole.
Jednoczesne obrazowanie i frezowanie pozwoliły nam monitorować zmiany intensywności fluorescencji w czasie rzeczywistym. Warto zauważyć, że zaobserwowaliśmy wzrost fluorescencji po usunięciu masowego materiału niefluorescencyjnego oraz absorpcyjnej folii nośnej (Rysunek 1B-D). W miarę jak lamella była przerzedzona z 2 μm do 800 nm, intensywność fluorescencji gwałtownie spadała, odzwierciedlając stopniowe usuwanie oznakowanych struktur. Spadek ten trwał dalej, gdy lamella była jeszcze bardziej przerzedzona poniżej 200 nm (Rysunek 1B-D). Skorelowany obraz fluorescencyjny i atlas mikroskopii elektronowej pokazują, że nasz sposób pracy umożliwia precyzyjne celowanie do frezowania (Rysunek 2A). Rekonstruowane tomogramy i modele segmentowane pokazują, że centriole składają się z trójek mikrotubul, co jest zgodne z wcześniejszymi raportami 42,43,44,45 (Rysunek 2A,B). W przypadkach, gdy w końcowej lamelli zachowana jest tylko jedna fluorescencja plamka, obserwujemy pojedynczy centriol w odpowiadającym tomogramie (rysunek 2B).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68238/68238fig1v2.jpg" /> 
Rysunek 1: Przepływ pracy trójkobiegowego CryoFM-FIB-SEM do precyzyjnej lokalizacji centrum organizującego mikrotubule. (A) (po lewej) Mikroskopia komórek na żywo oraz (po prawej) CryoFM MTOC. Skala = 10 μm. (B) Krokowe migawki CryoFM i CryoFIB do precyzyjnego frezowania. Zbliżenie FM oznaczone jest żółtymi przerywanymi ramkami. Centriole oznaczone są żółtymi strzałkami. Skala = 5 μm. (C) Intensywność fluorescencji MTOC podczas mielenia krioFIB. (D) Profil linii fluorescencyjnej na MTOC wykonany na różnych etapach podczas frezowania krioFIB. Skróty: CryoFM-FIB-SEM = Kriogeniczna mikroskopia fluorescencyjna z koncentrowanym frezowaniem wiązką jonową oraz skaningową mikroskopią elektronową; MTOC = centrum organizujące mikrotubule; ROI = region zainteresowania. Ta figura została zaadaptowana z Wang39. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68238/68238fig1large.jpg" target="_blank">Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tej figurki.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68238/68238fig2.jpg" /> 
Rysunek 2: Szczegóły molekularne MTOC ujawnione przez trójkobiegowy przepływ pracy CryoFM-FIB-SEM. (A) Skorelowane modele FM, EM i segmentacji MTOC. (a) Obraz FM po frezowaniu. To ten sam obraz z ostatniego panelu Rysunku 1B , oznaczony jako 180 nm, ale obrócony, aby odpowiadał rekonstrukcji i segmentacji CryoET. Pasek skali = 5 μm; (b) Powiększony widok przerywanego obszaru na żółto z (a). (c) skorelowana projekcja FM i TEM obszaru przerywanego w cyjanie, wskazana w (2). Pasek skali = 1 μm. (d) Model segmentowany rekonstrukcji tomograficznej w obszarze zainteresowania (żółty, centriol; zielony, mikrotubula). Skala = 100 nm. (B) Reprezentatywne obrazy FM i tomograficzne przekroje dwóch różnych lamel o różnych orientacjach centrioli. FM: Pasek skali = 5 μm. Przekrój tomograficzny: Skala = 200 nm. Skróty: CryoFM-FIB-SEM = kriogeniczne frezowanie wiązką jonów z mikroskopią skaningową elektronową; MTOC = centrum organizujące mikrotubule; FM = mikroskopia fluorescencja; ET = transmisja elektronów; TEM = transmisyjna mikroskopia elektronowa. Ta figura została zaadaptowana z Wang39. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68238/68238fig2large.jpg" target="_blank">Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tej figurki.</a>

Ten proces umożliwia produkcję lamelli, ukierunkowaną na fluorescencyjne struktury biologiczne, które są małe (<1 μm w zasięgu osiowym) i rzadkie (1 kopia na komórkę) przy użyciu kriogenicznej platformy obrazowania trójkokocyklnego. Ta platforma integruje mikroskopię fluorescencyjną, frezowanie wiązką jonową skupioną oraz skaningową mikroskopię elektronową w jednej pozycji ogniskowej, umożliwiając jednoczesną mikroskopię fluorescencyjną podczas frezowania.

Workflow z wykorzystaniem kriogenicznego mikroskopu fluorescencyjnego, elektronowo-jonowego do ukierunkowanego frezowania komórek

Cryogenic focused ion beam milling with scanning electron microscopy (CryoFIB-SEM) has become the&#160;dominant approach for preparing sub-200-nm thick ...

Moje badania rozwijają metody mikroskopii optycznej mające na celu zachowanie cech komórkowych w kriogenicznych lamellach podczas skupionego mielenia wiązek jonowych, umożliwiając szczegółową analizę za pomocą kriogenicznej tomografii elektronowej w celu odkrycia rodzimej organizacji biologicznej. Mikroskopia optyczna została zintegrowana z systemami CryoFIB-SEM, ale rzadko w tej samej pozycji co FIB. Wymaga to stosowania metod wytycznych opartych na rejestracji, aby zachować fluorescencyjne oznakowane cele w końcowej lamelli.Na początek ręcznie schładz stację transferową za pomocą ciekłego azotu, gdy stopień osiągnie temperaturę kriogeniczną. Załaduj jedną przyciętą autosiatkę do kasety próbkowej zaprojektowanej dla systemu kriogenicznej mikroskopii świetlnej. Upewnij się, że autokrata jest umieszczona pomiędzy klejoną pokrywą a dystansem.Dokręć śrubę pierścieniową, aby zamknąć kasetę i włóż ją do szczeliny na stacji transferowej. Podłącz stację transferową do systemu kriogenicznej mikroskopii świetlnej. Użyj kamery komorowej wewnętrznej, aby poprowadzić kasetę próbkową na scenę próbkową.W oprogramowaniu do mikroskopii świetlnej przesuwaj etap próbki z pozycji ładowania do zdefiniowanej pozycji trzech wiązek. W oprogramowaniu FIB-SEM ustaw powiększenie na 100X i kliknij w okienko w lewym górnym rogu. W zakładce wyrównania w oprogramowaniu mikroskopii świetlnej kliknij Z i wybierz funkcję Play, aby uzyskać atlas SEM siatki.Zidentyfikuj kwadratowy obszar z uszkodzoną folią węglową i kliknij dwukrotnie, aby przenieść próbkę do tego miejsca. Powrót do interfejsu oprogramowania. Aktywuj FIB i zrób obraz.Reguluj powiększenie za pomocą menu rozwijanego w lewym górnym rogu. Naciśnij Play, aby wyświetlić obraz FIB. Następnie ustaw rozmiar kroku za pomocą drążka suwaka.Teraz kliknij Z i Z, aby dostosować pozycję etapu Z, aż pozioma linia obecna na obrazach jonów i elektronów będzie wyrównana z tą samą cechą. Wybierz zakładkę SEM w oprogramowaniu do mikroskopii świetlnej. Użyj przycisków X i Y, aby wyrównać wspólną cechę między obrazami SEM a jonami.Teraz włącz mikroskop fluorescencyjny. Wybierz zakładkę FLM, ustaw warunki obrazowania światła odbitego i wybierz Play. Następnie wyrównaj obraz światła odbitego z obrazem SEM.Przybliż obraz i kliknij opcję prostokąta, aby zdefiniować wzór frezowania wiązki jonowej. Naciśnij Start wzorowania na Wyświetlaczu 2, aby frezować mały wzór za pomocą skupionej wiązki jonowej. Potwierdź, że wzór frezowany jest widoczny zarówno w ostrym wiązce jonów, jak i w mikroskopie fluorescencyjnym.W oprogramowaniu do mikroskopii świetlnej przejdź do zakładki Lokalizacja i aktywuj odpowiednie warunki do ustawienia kanałów fluorescencjących. Przypisz każdemu fluoroforowi osobny kanał i dodaj dodatkowy kanał dla brightfield. Dostosuj moc diody LED i czas naświetlania dla każdego kanału fluorescencyjnego, aby zidentyfikować interesujący obiekt.Gdy parametry są zadowalające, należy uzyskać wstępnie frezujący fluorescencjonujący stos z, przechodząc przez kierunek osiowy. Następnie zaznacz cel jako obszar zainteresowania. Przełącz się na oprogramowanie FIB-SEM i narysuj lamellę w interesującym się obszarze.Wykonuj surowe frezowanie, aby usunąć masę materiału, jednocześnie utrzymując włączony mikroskop fluorescencyjny do monitorowania zmian sygnału. Otwórz zestaw narzędzi interferometrycznych oparty na Pythonie na terminalu, aby monitorować sygnał fluorescencjonalny podczas przerzedzania lamelli. Rozcieńcz zwrot z inwestycji do około dwóch mikrometrów w trybie przekroju czyszczącego.Dla celu o zasięgu osiowym przekraczającym 300 nanometrów, w interfejsie graficznym Pythona wybierz cel na mikrografie fluorescencyjnej. Oprogramowanie automatycznie zaczyna wyświetlać jasność w zależności od czasu przy każdej nowej klatce. Monitoruj intensywność fluorescencji za pomocą zestawu narzędzi Python.Zmiełuj próbkę w trybie czyszczenia przekroju, aby usunąć pozostałą warstwę podtrzymującą poniżej interesującego obszaru. Obserwuj nagłe spadki intensywności fluorescencji jako sygnały zmiany kierunku frezowania. Jeśli podczas frezowania od dołu do góry zauważymy gwałtowny spadek, zatrzymaj się i zacznij frezować od góry w dół.Po zakończeniu frezowania od góry do dołu finalizuj lamellę, frezując od dołu do góry w trybie przekroju czyszczącego aż do osiągnięcia pożądanej grubości. Następnie wykonaj obraz fluorescencyjny lameli po przeróbce. Przenieś próbkę do CryoTEM.Załaduj obraz fluorescencji wielokanałowej po frezowaniu oraz obraz projekcji CryoTEM do niestandardowego oprogramowania transformacji projektowej do rejestracji regionów zainteresowania. Teraz wybierz od ośmiu do dziesięciu par punktów odniesienia widocznych zarówno na obrazach mikroskopii fluorescencyjnej, jak i elektronowej, aby obliczyć transformację projektywną. Użyj nałożonego obrazu jako wskazówki do wyboru obszaru obrazowania.Następnie wybierz odpowiednie parametry powiększenia i akwizycji dla serii pochylenia, w zależności od rozmiaru struktury celu i pożądanej rozdzielczości. Zróżnicowane komórki makrofagów oznaczone SiR-Tubuliną wykazywały pojedynczy jasny fluorescencjonujący punkt o średnicy około jednego mikrometra, odpowiadający MTOC, wraz z włóknopodobnymi strukturami promieniującymi w kierunku obwodów komórki, zgodnymi z siecią mikrotubul. Gdy próbka była mielona do grubości około 800 nanometrów, pojedynczy fluorescencjonujący punkt MTOC rozdzielił się na dwie wyraźne kropki, każda o średnicy około 700 nanometrów.Intensywność fluorescencji wzrosła po usunięciu niefluorescencyjnego materiału objętego i powłoki wsporczej, a następnie gwałtownie spadła, gdy lamella została dalej przerzedzona z dwóch mikrometrów do poniżej 200 nanometrów. Skorelowana kriogeniczna fluorescencja i mikroskopia elektronowa umożliwiały precyzyjne celowanie struktur podczas frezowania. Rekonstruowane tomogramy i modele segmentowane ujawniają, że centriole składają się z trójek mikrotubul.W przypadkach, gdy w końcowej lameli zachowano tylko jedną fluorescencyjną plamkę, w odpowiadającym tomogramie wizualizowano pojedynczy centriol. Dokładność fluorescencji opartej na millimillingu jest ograniczona przez podejścia rejestracyjne, które często cierpią na ograniczenia rozdzielczości dyfrakcyjne, niedopasowania współczynnika załamania oraz ruch indukowany przez milling. Jednoczesna mikroskopia optyczna i frezowanie FIB eliminują błędy rejestracji, zamiast tego wykorzystując sprzężenie zwrotne w czasie rzeczywistym z mikroskopii fluorescencyjnej do kierowania procesem frezowania.Pozwala to uniknąć błędów wynikających z limitu dyfrakcyjnego i niedopasowania współczynników załamania, umożliwiając precyzyjne mielenie zachowujące fluorescencjonalnie oznakowane struktury do tomografii krioelektronowej w końcowej lameli. Nasze badania umożliwiają dostrzeganie struktur komórkowych, które wcześniej trudno było bezpośrednio zobrazować za pomocą cryoET, rzucając światło na mechanizmy molekularne stojące za szerokim spektrum kluczowych mikromolekularnych maszyn.

workflow-using-cryogenic-coincident-fluorescence-electron-ion-beam

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Przedstawiamy tutaj sposób wykorzystania kriotomografii elektronowej (ECT) do badania ultrastruktury komórek bakteryjnych w stanach zbliżonych do naturalnych, z rozdzielczością „makrocząsteczkową” (~4 nm).

Kriotomografia elektronowa komórek bakteryjnych

Kriomikroskopy elektronowe, zarówno skaningowe (SEM), jak i transmisyjne (TEM), są szeroko stosowane do charakteryzowania próbek biologicznych lub innych materiałów o wysokiej zawartości wody1. SEM/Focused Ion Beam (FIB) służy do identyfikacji interesujących cech próbek i ekstrakcji cienkiej, przezroczystej dla elektronów blaszki w celu przeniesienia do krio-TEM.

Przygotowanie próbki do mikroskopii krioelektronowej za pomocą skupionej wiązki jonów

Tutaj opisujemy protokoły rozbijania komórek ssaków poprzez mielenie w stanie stałym w temperaturze kriogenicznej, wytwarzanie ekstraktu komórkowego z powstałego proszku komórkowego i izolowanie interesujących kompleksów białkowych poprzez wychwytywanie powinowactwa na paramagnetycznych kulkach w skali mikronowej sprzężonych z przeciwciałami.

Wychwytywanie powinowactwa do kompleksu białkowego z komórek ssaków poddanych mieleniu w kriomerze

Prezentowany tutaj jest protokół hodowli komórek na membranach z azotku krzemu i zamrażania wgłębnego przed obrazowaniem fluorescencji rentgenowskiej za pomocą synchrotronowej kriogenicznej nanosondy rentgenowskiej. Gdy zapewniona jest tylko nanoanaliza w temperaturze pokojowej, zamrożone próbki można dalej liofilizować . Są to kluczowe kroki w celu uzyskania informacji na temat wewnątrzkomórkowego składu pierwiastków.

Hodowla komórkowa na membranach z azotku krzemu i kriopreparatyka do nanoanalizy synchrotronowej fluorescencji rentgenowskiej

Techniki kriogenicznej skupionej wiązki jonów (FIB) i skaningowej mikroskopii elektronowej (SEM) mogą dostarczyć kluczowych informacji na temat chemii i morfologii nienaruszonych granic faz ciało stałe-ciecz. Szczegółowo omówiono metody sporządzania wysokiej jakości map spektroskopowych takich interfejsów z dyspersją energii (EDX), ze szczególnym uwzględnieniem urządzeń do magazynowania energii.

Charakterystyka granic faz ciecz-ciało stałe w nanoskali poprzez sprzężenie kriofokusowego mielenia wiązki jonów ze skaningową mikroskopią elektronową i spektroskopią

Protokół przedstawiony tutaj opisuje użycie Spotiton, nowatorskiego systemu robotycznego, do dostarczenia dwóch interesujących próbek na samozasłaniającą się, nanodrucianą siatkę, które mieszają się przez minimum 90 ms przed zeszkleniem w płynnym kriogenie.

Przygotowanie mikroskopowej siatki krioelektronowej do badań rozdzielczych w czasie przy użyciu nowatorskiego systemu robotycznego, Spotiton

Ten protokół pokazuje, jak obrazować biologiczne próbki kriokonserwowane za pomocą kriostrukturalnej mikroskopii świetlnej. Demonstrujemy metodologię, obrazując cytoszkielet komórek U2OS.

Mikroskopijne gromadzenie danych z komórek zakonserwowanych kriogenicznie

Używanie mielenia skupionej wiązki jonów do produkcji szklistych blaszek na siatce z zamrożonych próbek biologicznych do krioelektronowej tomografii.

Przygotowanie blaszek z szklistych próbek biologicznych przy użyciu dwuwiązkowego skaningowego mikroskopu elektronowego do kriotomografii elektronowej

Prezentujemy protokół przygotowania lameli zamrożonych próbek biologicznych metodą kriogenicznej mikroobróbki wiązki jonów do wysokorozdzielczych badań strukturalnych makrocząsteczek in situ za pomocą krioelektronowej tomografii. Przedstawiony protokół zawiera wytyczne do przygotowania wysokiej jakości blaszek o wysokiej odtwarzalności do charakterystyki strukturalnej makrocząsteczek wewnątrz Saccharomyces cerevisiae.

Przygotowanie i mikroobróbka Cryo-FIB Saccharomyces cerevisiae do krioelektronowej tomografii

Tutaj prezentujemy proces frezowania wiązki jonów z korelacją 3D, który kieruje przygotowaniem próbek komórkowych do tomografii krioelektronowej. Pozycja 3D fluorescencyjnie znakowanych białek będących przedmiotem zainteresowania jest najpierw określana za pomocą mikroskopii kriofluorescencyjnej, a następnie kierowana do mielenia. Protokół jest odpowiedni dla komórek ssaków, drożdży i bakterii.

Przygotowanie próbki za pomocą korelacyjnego mielenia wiązki jonów w 3D do tomografii krioelektronowej o wysokiej rozdzielczości

Protokół ten standaryzuje tomografię krioelektronową (cryo-ET) dla grubych tkanek poprzez integrację zamrażania pod wysokim ciśnieniem (HPF) z metodą gofrową, wyciąganie kriogenicznej wiązki jonowej (krio-FIB) oraz równoległe pobieranie pod względem dawki, co daje jednolicie cienkie lamele i próbki zwitryfikowane do powtarzalnej analizy in situ w hipokampie myszy.

Workflow tomografii krioelektronowej dla grubych tkanek wykazany u hipokampa myszy

Poznaj metodę kriogenicznego mikroskopu fluorescencyjnego z FIB-SEM do precyzyjnego frezowania komórek. Technika ta umożliwia zachowanie fluorescencyjnie znakowanych struktur w lamelach dla tomografii kriogenicznej.

Workflow z wykorzystaniem kriogenicznego mikroskopu fluorescencyjnego, elektronowo-jonowego do ukierunkowanego frezowania komórek (Wideo) | JoVE Journal

Workflow z wykorzystaniem kriogenicznego mikroskopu fluorescencyjnego, elektronowo-jonowego do ukierunkowanego frezowania komórek

Przeglądaj więcej filmów