Name: In vitro Synteza zmodyfikowanego mRNA do indukcji ekspresji białek w komórkach ludzkich (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-11-13T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 7 s
Description: Poznaj syntezę mRNA in vitro do indukcji ekspresji białek w komórkach ludzkich. Metoda obejmuje amplifikację plazmidu, transkrypcję in vitro i usunięcie DNA matrycowego. Technika umożliwia kontrolowane badania w biotechnologii i terapii genowej.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Ten projekt został sfinansowany przez Europejski Fundusz Społeczny w Badenii-Wirtembergii, Niemcy.

1. Augmentacja plazmidów zawierających wymagane sekwencje kodujące DNA (CDS)
<ol>
	<li>Wstępnie podgrzać pożywkę SOC, która jest dołączona do zestawu do transformacji, do temperatury pokojowej, a płytki agarowe LB zawierające 100 μg/ml ampicyliny do temperatury 37 °C. Wyrównać temperaturę łaźni wodnej do 42 °C.</li>
	<li>Rozmrozić jedną fiolkę chemicznie składowej E. coli na lodzie.</li>
	<li>Dodać 1-5 μl plazmidu (10 pg do 100 ng) zawierającego CDS do fiolki z chemicznie składową E. coli i delikatnie wymieszać. Nie mieszać komórek przez pipetowanie. Po dodaniu plazmidów wymieszaj, delikatnie stukając w probówkę.</li>
	<li>Inkubować mieszaninę na lodzie przez 30 minut.</li>
	<li>Szok termiczny E. coli przez 30 sekund w temperaturze 42 °C w łaźni wodnej bez wstrząsania.</li>
	<li>Umieścić fiolkę na lodzie na 2 minuty.</li>
	<li>Dodać 250 μl wstępnie podgrzanej pożywki SOC do E. coli i wstrząsać bakteriami poziomo z prędkością 300 obr./min przez 1 godzinę w temperaturze 37 °C w inkubatorze bakteryjnym.</li>
	<li>Rozprowadzić 100 μl i 150 μl z mieszanki transformacyjnej na wstępnie ogrzanych płytkach agarowych LB, odwrócić płytki i inkubować przez noc w temperaturze 37 °C.</li>
	<li>Po tym, jak kolonie staną się widoczne, należy zaszczepić pojedynczą kolonię z każdej płytki do 15 ml probówki hodowlanej zawierającej 5 ml pożywki LB ze 100 μg/ml ampicyliny. Inkubować je przez noc w temperaturze 37 °C, wytrząsając z prędkością 300 obr./min, aż kultura znajdzie się w fazie późnej logarytmicznej lub stacjonarnej.</li>
	<li>W celu długotrwałego przechowywania przekształconej E. coli należy odpipetować 75 μl 100% glicerolu do kriowialu. Dodać 225 μl kultury bakteryjnej (zamrożony bulion będzie zawierał 25% glicerolu), dobrze wymieszać i przechowywać kriowial w temperaturze -80 °C.</li>
	<li>Wyizolować plazmidy zawierające wymagane CDS za pomocą zestawu do oczyszczania plazmidu zgodnie z instrukcjami producenta.</li>
	<li>Określić stężenie plazmidu za pomocą spektrofotometru.</li>
	<li>Przygotować porcje o objętości 20 μl i przechowywać je w temperaturze -20 °C przez dłuższy czas.</li>
</ol>
2. Amplifikacja wstawek plazmidowych i dodawanie ogona poli T przez reakcję łańcuchową polimerazy (PCR)
<ol>
	<li>UWAGA: Aby uzyskać matrycę DNA do transkrypcji in vitro (IVT), interesujący CDS, w tym przypadku eGFP, jest amplifikowany za pomocą PCR. Jednocześnie do wkładu dodaje się poli T-tail ze 120 tymidynami (T) za pomocą odwrotnego startera z przedłużeniem T120. W ten sposób wygenerowane mRNA uzyskują ogon poli A o określonej długości po IVT.</li>
	<li>Przygotować mieszaninę PCR zgodnie z tabelą 1.</li>
	<li>Dokładnie wymieszaj mieszankę reakcyjną. UWAGA: Produkt PCR może być stosowany w 4-5 reakcjach IVT. Aby zwiększyć ilość matrycy DNA do IVT, można zwiększyć całkowitą objętość mieszaniny PCR. Można użyć kilku probówek PCR, z których każda zawiera 100 μl mieszaniny PCR, aby uzyskać wystarczającą wydajność produktu PCR.</li>
	<li>Umieść probówki PCR w termocyklerze i uruchom PCR przy użyciu protokołu cyklicznego PCR (Tabela 2).</li>
	<li>Oczyść reakcję PCR za pomocą zestawu do oczyszczania PCR zgodnie z instrukcjami producenta i wymyj DNA za pomocą 20 μl wody wolnej od nukleaz</li>.
	<li>Zmierz stężenie DNA za pomocą spektrofotometru. UWAGA: Wykryte stężenie DNA wynosi około 300 μg/ml. Zatem oczekiwana łączna ilość powinna wynosić ~6 μg. Ilość DNA dla innych białek może się różnić w zależności od długości CDS, ilości plazmidu użytego do PCR, temperatury wyżarzania starterów i liczby cykli.</li>
	<li>Zamrażać DNA w temperaturze -20 °C przez długi czas lub używać go bezpośrednio do IVT.</li>
</ol>
3. Etap kontroli: Jakość produktu PCR
<ol>
	<li>Sprawdź jakość produktu PCR za pomocą elektroforezy żelu DNA.</li>
	<li>Wymieszaj żądaną ilość agarozy z 1x TBE w kolbie. Aby uzyskać 1% żel agarozowy, dodaj 0,5 g agarozy do 50 ml 1x TBE.</li>
	<li>Kuchenka mikrofalowa, aż agaroza się rozpuści. Nie pozwól mu się zagotować. Upewnij się, że agaroza jest całkowicie w roztworze.</li>
	<li>Dodaj 5 μl barwnika z kwasem nukleinowym do 50 ml żelu agarozowego.</li>
	<li>Wlej żel do pudełka z żelem agarozowym, ustaw grzebień i odczekaj około 1 godziny, aż żel stężeje.</li>
	<li>Wyjmij grzebień i umieść pojemnik z żelem w tacce na żel.</li>
	<li>Wymieszać 2 μl (200 ng) 80-10 000 pz DNA-Ladder i 200 ng produktu PCR każdy z 2 μl 6x buforem ładującym w całkowitej objętości 12 μl.</li>
	<li>Ostrożnie załaduj próbki DNA do studzienek żelu agarozowego.</li>
	<li>Używając 1x TBE jako bufora bieżącego, uruchom żel agarozowy pod napięciem 100 V przez 1 godzinę.</li>
	<li>Wizualizuj prążki DNA w systemie obrazowania (ryc. 2).</li>
</ol>
4. Transkrypcja in vitro (IVT)
<ol>
	<li>UWAGA: Po PCR wstawki plazmidowe są amplifikowane i dodawany jest poli T-tail. Podczas IVT informacja genetyczna jest transkrybowana z DNA na RNA. Wygenerowany transkrypt mRNA jest wykorzystywany do produkcji białek w komórkach.</li>
	<li>Oczyść obszar roboczy i pipety roztworem do odkażania RNazy. Używaj czystych i sterylnych końcówek do pipet z podwójnym filtrem do PCR i często zmieniaj rękawice, aby zminimalizować zanieczyszczenie mieszanin reakcyjnych RNazami.</li>
	<li>Przygotować mieszaninę analogową NTP/nasadki zgodnie z opisem w Tabeli 3.</li>
	<li>Dokładnie wymieszaj mieszaninę analogową NTP/nasadki przez wirowanie i krótko odwiruj.</li>
	<li>Zebrać mieszaninę reakcyjną IVT zgodnie z opisem w tabeli 4.</li>
	<li>Mieszaninę reakcyjną IVT dokładnie wymieszać, delikatnie pipetując w górę i w dół. Następnie krótko odwiruj probówkę PCR, aby zebrać mieszaninę na dnie probówki.</li>
	<li>Inkubować w temperaturze 37 °C przez 3 godziny w termomikserze. 
	UWAGA: Optymalny czas inkubacji zależy od długości insertów i wydajności transkrypcji danego szablonu. W przypadku krótkich wkładek (<500 nt) korzystny może być dłuższy czas inkubacji. Można przeprowadzić eksperyment z biegiem w czasie, aby określić optymalny czas inkubacji dla maksymalnego plonu. Dlatego należy ustawić reakcje IVT, na przykład na 1, 2, 3, 4, 6 godzin i inkubację nocną i określić ilość mRNA. Kinetykę transkrypcji in vitro w celu wytworzenia mRNA eGFP przedstawiono na rycinie 3.</li>
	<li>W celu usunięcia matrycowego DNA dodać 1 μl DNazy (2 U/μl) do mieszaniny reakcyjnej IVT, dobrze wymieszać i inkubować przez 15 minut w temperaturze 37 °C.</li>
	<li>Mieszaninę reakcyjną należy oczyścić za pomocą zestawu do oczyszczania RNA zgodnie z instrukcjami producenta. Dwukrotnie wypłucz zmodyfikowane mRNA z błony kolumny spinowej za pomocą 40 μl wody wolnej od nukleaz. UWAGA: Wykryte stężenie RNA wynosi około 1 500 μg/ml. Zatem oczekiwana łączna ilość powinna wynosić ~120 μg. Ilość syntetyzowanego mRNA dla innych białek może się różnić w zależności od długości CDS i ilości produktu PCR użytego do IVT.</li>
</ol>
5. Leczenie oczyszczonego mRNA fosfatazą antarktyczną
<ol>
	<li>UWAGA: Wygenerowane mRNA jest traktowane fosfatazą w celu usunięcia trifosforanów 5', które mogą być rozpoznane przez RIG-I i prowadzą do aktywacji immunologicznej. Ponadto leczenie fosfatazą zapobiega recyrkularyzacji w reakcji samoligacji.</li>
	<li>Dodać 9 μl 10x buforu reakcyjnego fosfatazy antarktycznej do 79 μl oczyszczonego roztworu mRNA. Następnie dodać 2 μl fosfatazy antarktycznej (5 U/μl) i delikatnie wymieszać próbkę. Mieszaninę reakcyjną inkubować w temperaturze 37 °C przez 30 minut.</li>
	<li>Mieszaninę reakcyjną należy oczyścić za pomocą zestawu do oczyszczania RNA zgodnie z instrukcjami producenta. Dwukrotnie eluować zmodyfikowane mRNA z błony kolumny spinowej za pomocą 50 μl wody wolnej od nukleaz.</li>
	<li>Zmierz stężenie zmodyfikowanego mRNA za pomocą spektrofotometru. Sprawdzić, czy stosunek absorbancji przy 260 nm/280 nm (A260/A280) wynosi ≥ 1,8, a stosunek A260/A230 wynosi 2,0, co wskazuje na czystość. 
	UWAGA: Oczekiwana łączna wydajność powinna wynosić około 90 μg, co jest wystarczające dla około 36 transfekcji mRNA.</li>
	<li>Dostosuj stężenie mRNA do 100 ng/μl, dodając wodę wolną od nukleaz.</li>
	<li>Zmodyfikowane mRNA należy podzielić na jednorazowe podwielokrotności wymagane do transfekcji i przechowywać w temperaturze -80 °C. Unikać wielokrotnych cykli zamrażania i rozmrażania. Prawidłowo przygotowane i przechowywane mRNA jest stabilne przez wiele lat. Podczas pracy zawsze trzymaj zmodyfikowane mRNA na lodzie.</li>
</ol>
6. Etap kontroli: Jakość syntetyzowanego zmodyfikowanego mRNA
<ol>
	<li>Sprawdź jakość zmodyfikowanego mRNA za pomocą elektroforezy żelowej RNA.</li>
	<li>Wymieszaj żądaną ilość agarozy z 1x TBE w kolbie. Aby uzyskać 1% żel agarozowy, dodaj 0,5 g agarozy do 50 ml 1x TBE.</li>
	<li>Kuchenka mikrofalowa, aż agaroza się rozpuści. Nie pozwól mu się zagotować. Upewnij się, że agaroza jest całkowicie w roztworze.</li>
	<li>Dodaj 5 μl barwnika z kwasem nukleinowym do 50 ml żelu agarozowego.</li>
	<li>Wlej żel do pudełka z żelem agarozowym, ustaw grzebień i odczekaj około 1 godziny, aż żel zastygnie.</li>
	<li>Wyjmij grzebień i umieść pojemnik z żelem w tacce na żel.</li>
	<li>Wymieszać 3 μl (3 μg) drabinki RNA o wielkości 0,5-10 kb i 200 ng zsyntetyzowanego zmodyfikowanego mRNA, każdy z 7 μl buforu ładującego w całkowitej objętości 10 μl. Skład bufora załadowczego opisano w tabeli 5.</li>
	<li>Denaturować drabinkę i próbki mRNA w temperaturze 70 °C przez 10 minut.</li>
	<li>Ostrożnie załaduj drabinkę i próbki mRNA na 1% żel agarozowy.</li>
	<li>Wykonaj elektroforezę przy napięciu 100 V przez 1 godzinę przy użyciu 1x TBE jako bufora bieżącego.</li>
	<li>Zwizualizuj drabinkę i prążki mRNA na transiluminatorze UV i sfotografuj za pomocą systemu dokumentacji żelu (ryc. 4).</li>
</ol>
7. Przygotowanie komórek do transfekcji
<ol>
	<li>Płytka 2 x105 komórek (komórki HEK293) na dołek płytki 12-dołkowej.</li>
	<li>Inkubować komórki przez noc w temperaturze 37 °C w inkubatorze komórkowym. UWAGA: W dniu transfekcji komórki powinny osiągnąć 80-90% zbieżności.</li>
</ol>
8. Wykonywanie transfekcji mRNA komórek
<ol>
	<li>Rozmrozić zmodyfikowane mRNA.</li>
	<li>Wygeneruj lipopleksy do transfekcji.</li>
	<li>Dodać 25 μl (2,5 μg) zmodyfikowanego mRNA i 2 μl odczynnika do transfekcji lipidów kationowych do 473 μl Opti-MEM (Minimal Essential Medium) I zredukowałem pożywkę surowicy, aby wytworzyć mieszaninę transfekcji do transfekcji jednego dołka 12-dołkowej płytki. Zwiększ objętości w zależności od liczby studzienek, które mają być transfekowane. Jako kontrolę ujemną przygotuj mieszaninę transfekcji bez mRNA.</li>
	<li>Składniki należy delikatnie wymieszać, pipetując. Inkubować mieszaninę transfekcji w temperaturze pokojowej przez 20 minut, aby wytworzyć lipopleksy do transfekcji. 
	UWAGA: Mieszanina transfekcyjna nie zawiera antybiotyków. Dlatego należy zadbać o zapewnienie sterylności podczas obchodzenia się z komórkami.</li>
	<li>Przemyć komórki 500 μl DPBS/studzienkę.</li>
	<li>Dodać 500 μl mieszaniny transfekcyjnej do jednego dołka płytki 12-dołkowej.</li>
	<li>Inkubować komórki przez 4 godziny w temperaturze 37 °C i 5% CO2 .</li>
	<li>Odessać mieszaninę transfekcji i dodać do komórek 1 ml kompletnej pożywki do hodowli komórkowych.</li>
	<li>Inkubować komórki przez 24 godziny w inkubatorze komórkowym.</li>
	<li>Wykonaj analizy mikroskopowe fluorescencji za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego (ryc. 5). UWAGA: Aby zbadać ekspresję innych białek w komórkach, które są wytwarzane przez transfekcję z innym mRNA niż eGFP kodujące mRNA, komórki można hodować na szkiełkach nakrywkowych. Następnie można wykonać transfekcję, a komórki można wybarwić odpowiednimi przeciwciałami i przeanalizować za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej.</li>
</ol>
9. Analizy cytometryczne przepływu ekspresji eGFP w komórkach
<ol>
	<li>Usunąć pożywkę do hodowli komórkowych ze studzienek i umyć każdą studzienkę 1 ml DPBS (bez wapnia i magnezu). Dodać 500 μl trypsyny/EDTA do dołka, aby oderwać komórki od powierzchni płytek do hodowli komórkowych. Następnie dodaj 500 μl TNS na studzienkę, aby dezaktywować trypsynę.</li>
	<li>Odwirować oderwane komórki przez 5 minut przy 300 x g w temperaturze pokojowej. Usunąć sklarowany osad, pozostawiając tylko osad. Zawiesić osad komórkowy w roztworze do utrwalania komórek o stężeniu 150 μl i przenieść zawiesinę komórek do probówki do cytometrii przepływowej.</li>
	<li>Przeanalizuj procent komórek wykazujących ekspresję eGFP i intensywność fluorescencji za pomocą średniej geometrycznej (średnia geometryczna intensywności fluorescencji) (ryc. 6).</li>
</ol>
10. Pomiar ekspresji białka w czasie
<ol>
	<li>Wykonaj transfekcję mRNA komórek w 3 dołkach 12-dołkowej płytki, jak opisano w kroku 8. Dodatkowo inkubować 3 dołki komórek HEK293 z mieszaniną transfekcji bez dodatku mRNA.</li>
	<li>Zmierz ekspresję eGFP 1, 2 i 3 dni po transfekcji, aby ocenić czas trwania ekspresji białka (ryc. 7).</li>
</ol>

<ol><li>Bangel-Ruland, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CFTR-mRNA+delivery%3A+a+novel+alternative+for+cystic+fibrosis+%26%2334%3Bgene+therapy%26%2334%3B%5BTitle%5D)+AND+%22The+journal+of+gene+medicine%22%5BJournal%5D)">CFTR-mRNA delivery: a novel alternative for cystic fibrosis &#34;gene therapy&#34;.</a> The journal of gene medicine. , (2013).</li>
<li>Benteyn, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Design+of+an+Optimized+Wilms%26%2334%3B+Tumor+1+%28WT1%29+mRNA+Construct+for+Enhanced+WT1+Expression+and+Improved+Immunogenicity+In+Vitro+and+In+Vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+therapy+Nucleic+acids%22%5BJournal%5D)">Design of an Optimized Wilms&#34; Tumor 1 (WT1) mRNA Construct for Enhanced WT1 Expression and Improved Immunogenicity In Vitro and In Vivo.</a> Molecular therapy Nucleic acids. 2, 134(2013).</li>
<li>Petsch, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protective+efficacy+of+in+vitro+synthesized%2C+specific+mRNA+vaccines+against+influenza+A+virus+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Protective efficacy of in vitro synthesized, specific mRNA vaccines against influenza A virus infection.</a> Nature. 30, 1210-1216 (2012).</li>
<li>Mandal, P. K., Rossi, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reprogramming+human+fibroblasts+to+pluripotency+using+modified+mRNA%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+protocols%22%5BJournal%5D)">Reprogramming human fibroblasts to pluripotency using modified mRNA.</a> Nature protocols. 8, 568-582 (2013).</li>
<li>Warren, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+efficient+reprogramming+to+pluripotency+and+directed+differentiation+of+human+cells+with+synthetic+modified+mRNA%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+stem+cell%22%5BJournal%5D)">Highly efficient reprogramming to pluripotency and directed differentiation of human cells with synthetic modified mRNA.</a> Cell stem cell. 7, 618-630 (2010).</li>
<li>Yakubov, E., Rechavi, G., Rozenblatt, S., Givol, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reprogramming+of+human+fibroblasts+to+pluripotent+stem+cells+using+mRNA+of+four+transcription+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+and+biophysical+research+communications%22%5BJournal%5D)">Reprogramming of human fibroblasts to pluripotent stem cells using mRNA of four transcription factors.</a> Biochemical and biophysical research communications. 394, 189-193 (2010).</li>
<li>Anderson, B. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Incorporation+of+pseudouridine+into+mRNA+enhances+translation+by+diminishing+PKR+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+acids+research%22%5BJournal%5D)">Incorporation of pseudouridine into mRNA enhances translation by diminishing PKR activation.</a> Nucleic acids research. 38, 5884-5892 (2010).</li>
<li>Kariko, K., Buckstein, M., Ni, H., Weissman, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Suppression+of+RNA+recognition+by+Toll-like+receptors%3A+the+impact+of+nucleoside+modification+and+the+evolutionary+origin+of+RNA%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Suppression of RNA recognition by Toll-like receptors: the impact of nucleoside modification and the evolutionary origin of RNA.</a> Immunity. 23, 165-175 (2005).</li>
<li>Kariko, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Incorporation+of+pseudouridine+into+mRNA+yields+superior+nonimmunogenic+vector+with+increased+translational+capacity+and+biological+stability%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+therapy+%3A+the+journal+of+the+American+Society+of+Gene+Therapy%22%5BJournal%5D)">Incorporation of pseudouridine into mRNA yields superior nonimmunogenic vector with increased translational capacity and biological stability.</a> Molecular therapy : the journal of the American Society of Gene Therapy. 16, 1833-1840 (2008).</li>
<li>Kariko, K., Weissman, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Naturally+occurring+nucleoside+modifications+suppress+the+immunostimulatory+activity+of+RNA%3A+implication+for+therapeutic+RNA+development%5BTitle%5D)+AND+%22Current+opinion+in+drug+discovery+%26+development%22%5BJournal%5D)">Naturally occurring nucleoside modifications suppress the immunostimulatory activity of RNA: implication for therapeutic RNA development.</a> Current opinion in drug discovery & development. 10, 523-532 (2007).</li>
<li>Kormann, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+therapeutic+proteins+after+delivery+of+chemically+modified+mRNA+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+biotechnology%22%5BJournal%5D)">Expression of therapeutic proteins after delivery of chemically modified mRNA in mice.</a> Nature biotechnology. 29, 154-157 (2011).</li>
<li>Hacein-Bey-Abina, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insertional+oncogenesis+in+4+patients+after+retrovirus-mediated+gene+therapy+of+SCID-X1%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+clinical+investigation%22%5BJournal%5D)">Insertional oncogenesis in 4 patients after retrovirus-mediated gene therapy of SCID-X1.</a> The Journal of clinical investigation. 118, 3132-3142 (2008).</li>
<li>Hacein-Bey-Abina, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficacy+of+gene+therapy+for+X-linked+severe+combined+immunodeficiency%5BTitle%5D)+AND+%22The+New+England+journal+of+medicine%22%5BJournal%5D)">Efficacy of gene therapy for X-linked severe combined immunodeficiency.</a> The New England journal of medicine. 363, 355-364 (2010).</li>
<li>Avci-Adali, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimized+conditions+for+successful+transfection+of+human+endothelial+cells+with+in+vitro+synthesized+and+modified+mRNA+for+induction+of+protein+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+biological+engineering%22%5BJournal%5D)">Optimized conditions for successful transfection of human endothelial cells with in vitro synthesized and modified mRNA for induction of protein expression.</a> Journal of biological engineering. 8, 8(2014).</li>
</ol>

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Terapia mRNA ma ogromny potencjał w dziedzinie medycyny regeneracyjnej, leczenia chorób i szczepień. W tym filmie pokazujemy produkcję stabilizowanego, zmodyfikowanego mRNA do indukcji ekspresji białek w komórkach. Za pomocą tego protokołu można wygenerować inne pożądane mRNA. Synteza zmodyfikowanego mRNA in vitro umożliwia transfekcję komórek z pożądanymi mRNA w celu indukowania ekspresji docelowych białek. W ten sposób pożądane białko ulega przejściowej ekspresji w warunkach fizjologicznych, aż do całkowitego ...

W komórkach transkrypcja informacyjnego RNA (mRNA) i następująca po niej translacja mRNA na pożądane białka zapewniają prawidłowe funkcjonowanie komórek. Dziedziczne lub nabyte zaburzenia genetyczne mogą prowadzić do niewystarczającej i dysfunkcyjnej syntezy białek oraz powodować poważne choroby. Tak więc nowym podejściem terapeutycznym do indukowania produkcji brakujących lub wadliwych białek jest egzogenne dostarczanie syntetycznego zmodyfikowanego mRNA do komórek, które koduje pożądane białko. W ten sposób komórki są pobudzane do syntezy funkcjonalnych białek, których normalnie nie mogą wyprodukować lub naturalnie nie potrzebują. Stosując to podejście, zaburzenia genetyczne można skorygować poprzez wprowadzenie mRNA, które koduje wadliwe lub brakujące białko 1. Terapia mRNA może być również stosowana do szczepień w celu syntezy antygenów białkowych, które ulegają ekspresji przez komórki nowotworowe lub patogeny. W ten sposób można aktywować układ odpornościowy gospodarza, aby skutecznie eliminować komórki nowotworowe lub zapobiegać infekcjom 2,3. Co więcej, w ostatnich latach mRNA było z powodzeniem wykorzystywane do generowania indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (iPSC). W tym celu fibroblasty transfekowano mRNA, aby indukować ekspresję czynników przeprogramowujących 4-6 i przekształcać je w iPSC o ogromnym potencjale w medycynie regeneracyjnej.
Poprzednio, użycie konwencjonalnego mRNA wiązało się z niską stabilnością i silną immunogennością. W związku z tym kliniczne zastosowania konwencjonalnych mRNA były ograniczone. Jednak zastąpienie cytydyny i urydyny przez 5-metylocytydynę i pseudourydynę w cząsteczce mRNA przez Kariko i współpracowników sprawiło, że cząsteczki mRNA stały się stabilne w płynach biologicznych i radykalnie zmniejszyły aktywację immunologiczną 7-10, co obecnie umożliwia kliniczne zastosowanie zmodyfikowanych mRNA.
Korzystając z syntetycznie wytworzonych zmodyfikowanych mRNA, pożądane transkrypty genów mogą być tymczasowo dostarczone in vivo 11 lub in vitro w celu wywołania ekspresji białka. Wprowadzone mRNA jest poddawane translacji w warunkach fizjologicznych przez komórkową maszynerię translacyjną. Ze względu na brak integracji z genomem komórki gospodarza w porównaniu z wektorami wirusowej terapii genowej, ryzyko onkogenezy jest zapobieżone 12,13. Dzięki temu terapia z wykorzystaniem zmodyfikowanego syntetycznego mRNA uzyska w przyszłości lepszą akceptację kliniczną.
Tutaj opisujemy szczegółowy protokół produkcji zmodyfikowanego mRNA (Rysunek 1), transfekcji komórek z mRNA i oceny ekspresji białek w transfekowanych komórkach.

<table><tbody><tr><td colspan="4">Hodowla komórkowa</td></tr><tr><td>DMEM, PAA o wysokiej zawartości glukozy</td><td></td><td>E15-009</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Life Technologies</td><td>10500</td><td></td></tr><tr><td>Penicylina/Streptomycyna&nbsp;</td><td>PAA</td><td>P11-010</td><td>100x</td></tr><tr><td>L-glutamina&nbsp;</td><td>PAA</td><td>M11-004</td><td>200 mM</td></tr><tr><td>DPBS bez wapnia i magnezu&nbsp;</td><td>PAA</td><td>E15-002</td><td></td></tr><tr><td>0,04% trypsyna / 0,03% EDTA&nbsp;</td><td>Promocell</td><td>C-41020</td><td></td></tr><tr><td>TNS</td><td>Promocell</td><td>C-41120</td><td>Roztwór neutralizujący trypsynę, 0,05% inhibitor trypsyny w 0,1% komórkach BSA</td></tr><tr><td>HEK-293</td><td>ATCC</td><td>CRL-1573</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Consumables</td></tr><tr><td>Płytki do hodowli tkankowych, 12-dołkowe&nbsp;</td><td>Corning</td><td>3512</td><td></td></tr><tr><td>Kolba do hodowli komórkowych (75 cm2)&nbsp;</td><td>Corning</td><td>430641</td><td></td></tr><tr><td>sterylne probówki do mikrowirówek 1,5 ml wolne od DNaz i RNaz&nbsp;</td><td>Eppendorf</td><td>0030 121.589</td><td>Safe-Lock, Biopur</td></tr><tr><td>15 ml probówki stożkowe&nbsp;</td><td>greiner bio-one</td><td>188271</td><td></td></tr><tr><td>czyste i sterylne końcówki do pipet epT.I.P.S. z podwójnym filtrem&nbsp;</td><td>Eppendorf</td><td>10 & mikro; l: 022491202; 100 &mikro; l: 022491237; 1 000 i mikro; l: 022491253</td><td></td></tr><tr><td>Cryovial</td><td>greiner bio-one</td><td>122279-128</td><td>Cryo.s&nbsp;</td></tr><tr><td>14 ml polipropylenowa probówka z okrągłym dnem do hodowli bakterii&nbsp;</td><td>BD Falcon</td><td>352059</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Amplifikacja i oczyszczanie plazmidu</td></tr><tr><td>pcDNA 3.3_eGFP Plazmid&nbsp;</td><td>Addgene</td><td>26822</td><td></td></tr><tr><td>One Shot Top10 chemicznie składnik Escherichia coli&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>C4040-10</td><td></td></tr><tr><td>Sterylna woda (Ampuwa)</td><td>Fresenius Kabi</td><td>1636071</td><td></td></tr><tr><td>LB medium (Luria/Miller)&nbsp;</td><td>Carl Roth</td><td>X968.1</td><td>Rozpuść 25 g L-1 w sterylnej wodzie.</td></tr><tr><td>Agar LB (Luria/Miller)&nbsp;</td><td>Carl Roth</td><td>X969.1</td><td>Rozpuścić 40 g L-1 w sterylnej wodzie.</td></tr><tr><td>Ampicylina Gotowy roztwór</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A5354</td><td>100 mg/ml&nbsp;</td></tr><tr><td>Glycerol</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G2025</td><td></td></tr><tr><td>QIAprep Spin Miniprep Kit&nbsp;</td><td>Qiagen</td><td>27104</td><td></td></tr><tr><td colspan="4"><produkcja > mRNA</td></tr><tr><td>HotStar HiFidelity Polymerase Kit&nbsp;</td><td></td> Zestaw do oczyszczania <td>Qiagen</td> 202602 <td></td></tr><tr><td>QIAquick PCR&nbsp;</td><td>Zestaw Qiagen</td><td>28106</td><td></td></tr><tr><td>MEGAscript T7&nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td>AM1334</td><td></td></tr><tr><td>5-metylocytydyno-5&ostra;-trifosforan&nbsp;</td><td>Trilink</td><td>N1014</td><td>5-metylo-CTP</td></tr><tr><td>Pseudourydyno-5&ostra;-trifosforan&nbsp;</td><td>Trilink</td><td>N1019</td><td>Pseudo-UTP</td></tr><tr><td>3&acute;-O-Me-m7G(5&acute;)ppp(5&acute;)G Struktura kapu RNA analogowa&nbsp;</td><td>New England Biolabs</td><td>S1411L</td><td></td></tr><tr><td>Inhibitor RNazy RiboLock</td><td>Thermo Scientific</td><td>EO0381</td><td>40 U/&mikro; l&nbsp;</td></tr><tr><td>TURBO DNase</td><td>Life Technologies</td><td>AM1334</td><td>2 U/&mikro; l (z zestawu MEGAscript T7)</td></tr><tr><td>Fosfataza antarktyczna&nbsp;</td><td>Zestaw New England Biolabs</td><td>MO289S</td><td></td></tr><tr><td>RNeasy mini&nbsp;</td><td>Rozwiązanie Qiagen</td><td>74104</td><td></td></tr><tr><td>RNaseZap&nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td>AM9780</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Transfekcja</td></tr><tr><td>Odczynnik do transfekcji Lipofectamine 2000&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>11668-019</td><td>Kationowy odczynnik do transfekcji lipidów</td></tr><tr><td>Opti-MEM I Zredukowane podłoże w surowicy&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>11058-021</td><td>Ulepszone Minimal Essential Medium (MEM), które pozwala na zmniejszenie suplementacji płodowej surowicy bydlęcej (FBS)&nbsp;</td></tr><tr><td colspan="4">Elektroforeza żelowa</td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9539</td><td></td></tr><tr><td>Żelowy barwnik żelowy z kwasem nukleinowym</td><td>Biotium</td><td>41003</td><td>10 000x w wodzie&nbsp;</td></tr><tr><td>peqGOLD Range Mix DNA-Drabinka&nbsp;</td><td>Peqlab</td><td>25-2210</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Analizy cytometrii przepływowej</td></tr><tr><td>CellFIX (1x)</td><td>BD Biosciences</td><td>340181</td><td>10x koncentrat&nbsp;</td></tr><tr><td colspan="4">Podkład do amplifikacji insertu i poli (T) tail PCR</td></tr><tr><td>Forward Primer (klasa HPLC) 10 &micro; M</td><td>Ella Biotech</td><td></td><td>5&acute;-TTGGACCCTCGTAC AGAAGCTAATACG-3&acute;</td></tr><tr><td>Podkład odwrotny (klasa HPLC) 10 i mikro; M</td><td>Ella Biotech</td><td></td><td>5&acute;- T120-CTTCCTACT CAGGCTTTATTCAA AGACCA-3&acute;</td></tr><tr><td colspan="4">Equipment</td></tr><tr><td>Cell inkubator</td><td>Binder</td><td></td><td>CO2 (5%) i O2 (20%)&nbsp;</td></tr><tr><td>Licznik komórek CASY&nbsp;</td><td>Sch&auml; System</td><td></td><td></td>rfe</tr><tr><td>Sterylny stół warsztatowy&nbsp;</td><td>BDK Luft-und Reinraumtecknik GmbH</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Inkubator bakteryjny&nbsp;</td>Spektrofotometr <td>ScanDrop</td> do kąpieli wodnej Incutec<td></td><td></td></tr><tr><td></td>&nbsp;<td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>Termocykler analityczny Jena</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PCR&nbsp;</td><td>Mikrowirówka Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Vortex</td><td>peqlab</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Thermomixer</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Gel aparatura do elektroforezy&nbsp;</td>System dokumentacji <td>Bio-Rad</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Gel&nbsp;</td>System <td>Bio-Rad</td><td></td><td></td></tr><tr><td>FACScan&nbsp;</td>Mikroskop fluorescencyjny <td>BD Biosciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&nbsp;</td>Mikroskop z kontrastem fazowym <td>firmy Nikon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

in vitro synteza zmodyfikowanego mrna do indukcji ekspresji białek w komórkach ludzkich

In Vitro Synthesis of Modified mRNA for Induction of Protein Expression in Human Cells

Egzogenne dostarczanie kodującego syntetycznego informacyjnego RNA (mRNA) do indukcji syntezy białek w pożądanych komórkach ma ogromny potencjał w dziedzinie medycyny regeneracyjnej, podstawowej biologii komórki, leczenia chorób i przeprogramowania komórek. W tym miejscu opisujemy krok po kroku protokół generowania zmodyfikowanego mRNA o obniżonym potencjale aktywacji immunologicznej i zwiększonej stabilności, kontroli jakości wytwarzanego mRNA, transfekcji komórek z mRNA i weryfikacji indukowanej ekspresji białka za pomocą cytometrii przepływowej. Do 3 dni po pojedynczej transfekcji mRNA eGFP, transfekowane komórki HEK293 wytwarzają eGFP. W tym artykule wideo jako przykład opisano syntezę mRNA eGFP. Procedura ta może być jednak stosowana do produkcji innego pożądanego mRNA. Za pomocą syntetycznego zmodyfikowanego mRNA można skłonić komórki do przejściowej ekspresji pożądanych białek, których normalnie by nie wyraziły.

Wykorzystując plazmid pcDNA 3.3 zawierający CDS eGFP, opracowano syntezę zmodyfikowanego mRNA eGFP (Rycina 1). Po amplifikacji insertu metodą PCR i dodaniu ogona poly T, wykryto wyraźny prążek o długości około 1 100 bp (Rycina 2). Wydłużenie czasu IVT zwiększyło wydajność mRNA (Rycina 3). Po IVT wykryto wyraźny prążek mRNA o długości około 1 100 bp, co odpowiada długości produkowanego mRNA eGFP (Rycina 4).
Funkcjonalność wygen...

W tym artykule wideo opisujemy syntezę in vitro zmodyfikowanego mRNA do indukcji ekspresji białek w komórkach.

In vitro Synteza zmodyfikowanego mRNA do indukcji ekspresji białek w komórkach ludzkich

The exogenous delivery of coding synthetic messenger RNA (mRNA) for induction of protein synthesis in desired cells has enormous potential in the fields ...

Ogólnym celem tej procedury jest synteza in vitro zmodyfikowanego mRNA w celu indukcji ekspresji białek w komórkach. Osiąga się to poprzez najpierw amplifikację wstawki plazmidowej lub kodującej sekwencji DNA i dodanie ogona poli T 120 tymidyny za pomocą reakcji łańcuchowej polimerazy. Drugim krokiem jest transkrypcja in vitro wygenerowanego DNA do mRNA z ogonami poliadeniny.Następnie matrycowy DNA jest usuwany przez obróbkę D mieszaniny reakcji transkrypcji in vitro. Ostatnim etapem jest obróbka fosfatazą antarktyczną wytworzonego mRNA w celu usunięcia pięciu głównych fosforanów. Ostatecznie komórki są transfekowane przez wytworzone mRNA, kompleksy lipidowe.Mikroskopia fluorescencyjna i analiza cytometrii przepływowej są wykorzystywane do wykazania syntezy wzmocnionego GFP w komórkach. Główną przewagą tej techniki nad istniejącymi metodami, takimi jak transfekcja wirusowa, jest brak integracji z genomem komórki gospodarza, co zapobiega ryzyku onkogenezy. Metoda ta może pomóc w wytwarzaniu brakujących lub wadliwych białek w komórkach i może być stosowana w leczeniu chorób genetycznych za pomocą szczepień.A w dziedzinie medycyny regeneracyjnej, procedurę zademonstruje Steinle, dokto

in-vitro-synthesis-modified-mrna-for-induction-protein-expression

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

W erze genomiki post-humanistycznej dostępność białek rekombinowanych w natywnych konformacjach jest kluczowa dla badań i rozwoju w obszarze strukturalnym, funkcjonalnym oraz terapeutycznym. W niniejszej pracy opisujemy system ekspresji białek w skali testowej i przemysłowej z wykorzystaniem ludzkich komórek embrionalnej nerki 293T, który może być stosowany do produkcji różnorodnych białek rekombinowanych.

Wygodna i uniwersalna platforma ekspresyjna do produkcji białek wydzielanych z komórek ludzkich

Ekspresja białek rekombinowanych przez systemy ssaków staje się atrakcyjną metodą wytwarzania kompleksów białkowych dla biologii strukturalnej. W tym artykule przedstawiamy prosty, ale bardzo wydajny system ekspresji wykorzystujący hodowane w zawiesinie komórki ssaków do oczyszczania kompleksów białkowych do badań strukturalnych.

Ekspresja białek rekombinowanych w biologii strukturalnej w komórkach zawiesinowych HEK 293F: nowatorskie i dostępne podejście

Laboratoryjna produkcja białek eukariotycznych z odpowiednią modyfikacją potranslacyjną stanowi istotną barierę. Oto solidny protokół z szybkim ustanowieniem i przekształceniem w ekspresję białek przy użyciu systemu ekspresji ssaków. System ten wspomaga selektywne znakowanie aminokwasów, selektywne znakowanie białek i małocząsteczkowych modulatorów składu glikanów.

Wysoka ekspresja rekombinowanych białek ludzkich z przejściową transfekcją komórek HEK293 w zawiesinie

Tutaj opisujemy protokół generowania kationowych nanoliposomów, który opiera się na metodzie suchego filmu i może być wykorzystany do bezpiecznego i efektywnego dostarczania transkrybowanego in vitro informacyjnego RNA.

Wytwarzanie kationowych nanoliposomów w celu efektywnego dostarczania transkrybowanego in vitro informacyjnego RNA

Tutaj opisujemy klinicznie istotną, wysoce wydajną, bezkarmową metodę przeprogramowania ludzkich pierwotnych fibroblastów w indukowane pluripotencjalne komórki macierzyste za pomocą zmodyfikowanych mRNA kodujących czynniki przeprogramowujące i dojrzałe mimiki mikroRNA-367/302. Uwzględniono również metody oceny efektywności przeprogramowania, ekspansji klonalnych kolonii iPSC i potwierdzenia ekspresji markera pluripotencji TRA-1-60.

Oparte na RNA przeprogramowanie ludzkich pierwotnych fibroblastów w indukowane pluripotencjalne komórki macierzyste

Szczegółowe protokoły zarówno in vitro, jak i selektywnej acylacji 2'-hydroksylowej w komórce, analizowane za pomocą eksperymentów z rozszerzaniem starterów (SHAPE) w celu określenia drugorzędowej struktury sekwencji pre-mRNA interesujących w obecności małej cząsteczki ukierunkowanej na RNA, są przedstawione w tym artykule.

Wykorzystanie in vitro i in-cell SHAPE do badania zmian strukturalnych pre-mRNA wywołanych małymi cząsteczkami

Makrofagi, zwłaszcza makrofagi pierwotne, są trudne do transfekcji, ponieważ specjalizują się w wykrywaniu cząsteczek pochodzenia niewłasnego. Opisujemy protokół, który umożliwia wysoce wydajną transfekcję pierwotnych makrofagów za pomocą mRNA generowanego z matryc DNA, takich jak plazmidy.

Wysoce wydajna transfekcja pierwotnych makrofagów za pomocą mRNA transkrybowanego in vitro

Ten protokół opisuje metodę, materiały, sprzęt i kroki do oddolnego przygotowania RNA i komórek syntetycznych produkujących białka. Wewnętrzna komora wodna komórek syntetycznych zawierała lizat bakteryjny S30 zamknięty w dwuwarstwie lipidowej (tj. stabilnych liposomach), przy użyciu metody przenoszenia emulsji woda w oleju.

Przygotowanie syntetycznych komórek wytwarzających białka przy użyciu ekstraktów bakteryjnych wolnych od komórek, liposomów i transferu emulsji

Samoorganizująca się nanocząstka peptydu-poloksaminy (PP-sNp) jest rozwijana przy użyciu mikroprzepływowego urządzenia mieszającego do kapsułkowania i dostarczania in vitro transkrybowanego informacyjnego RNA. Opisane mRNA/PP-sNp może skutecznie transfekować hodowane komórki in vitro.

Wydajna transfekcja transkrybowanego mRNA in vitro w hodowanych komórkach przy użyciu nanocząstek peptydowo-poloksaminowych

Ten protokół opisuje system Cell-Free Protein Synthesis (CFPS) używany do budowy syntetycznych komórek. Przedstawiono w nim kluczowe etapy z reprezentatywnymi wynikami w różnych mikrokompartmentach. Protokół ma na celu ustanowienie najlepszych praktyk dla różnych laboratoriów w społeczności komórek syntetycznych, przyspieszając postęp w rozwoju komórek syntetycznych.

Bezkomórkowy system syntezy białek do budowy komórek syntetycznych

Poznaj syntezę mRNA in vitro do indukcji ekspresji białek w komórkach ludzkich. Metoda obejmuje amplifikację plazmidu, transkrypcję in vitro i usunięcie DNA matrycowego. Technika umożliwia kontrolowane badania w biotechnologii i terapii genowej.

In vitro Synteza zmodyfikowanego mRNA do indukcji ekspresji białek w komórkach ludzkich

Przeglądaj więcej filmów