In vitro Synteza zmodyfikowanego mRNA do indukcji ekspresji białek w komórkach ludzkich

Ogólnym celem tej procedury jest synteza in vitro zmodyfikowanego mRNA w celu indukcji ekspresji białek w komórkach. Osiąga się to poprzez najpierw amplifikację wstawki plazmidowej lub kodującej sekwencji DNA i dodanie ogona poli T 120 tymidyny za pomocą reakcji łańcuchowej polimerazy. Drugim krokiem jest transkrypcja in vitro wygenerowanego DNA do mRNA z ogonami poliadeniny.

Następnie matrycowy DNA jest usuwany przez obróbkę D mieszaniny reakcji transkrypcji in vitro. Ostatnim etapem jest obróbka fosfatazą antarktyczną wytworzonego mRNA w celu usunięcia pięciu głównych fosforanów. Ostatecznie komórki są transfekowane przez wytworzone mRNA, kompleksy lipidowe.

Mikroskopia fluorescencyjna i analiza cytometrii przepływowej są wykorzystywane do wykazania syntezy wzmocnionego GFP w komórkach. Główną przewagą tej techniki nad istniejącymi metodami, takimi jak transfekcja wirusowa, jest brak integracji z genomem komórki gospodarza, co zapobiega ryzyku onkogenezy. Metoda ta może pomóc w wytwarzaniu brakujących lub wadliwych białek w komórkach i może być stosowana w leczeniu chorób genetycznych za pomocą szczepień.

A w dziedzinie medycyny regeneracyjnej, procedurę zademonstruje Steinle, doktorant z mojego laboratorium. Przed rozpoczęciem tej procedury plazmidy zawierające wymagane kodujące sekwencje DNA lub CDS amplifikowano w E. coli i izolowano zgodnie z opisem w tekście protokołu. W tym przykładzie interesującym CDS jest wzmocnione białko zielonej fluorescencji lub EGFP, aby jednocześnie amplifikować i dodawać szczegóły poli do CDS EGFP.

Przygotować mieszaninę PCR zgodnie z opisem w tekście protokołu. Umieść probówkę do PCR w termocyklerze i uruchom protokół cykliczny PCR, który jest opisany w tekście protokołu. Po zakończeniu reakcji PCR oczyść reakcję PCR za pomocą dostępnego w handlu zestawu do oczyszczania PCR i rozcieńczyć DNA za pomocą 20 mikrolitrów wody wolnej od nukleaz.

Aby sprawdzić jakość produktu PCR, należy wykonać elektroforezę żelu DNA i uwidocznić prążki DNA w systemie obrazowania. Przezroczysty prążek DNA o długości około 1 100 par zasad powinien zostać wykryty podczas transkrypcji in vitro lub IVT. Wygenerowane wcześniej DNA zostanie przepisane na mRNA.

Przygotuj mieszaninę analogową nasadki NTP, jak pokazano tutaj. Dokładnie wymieszaj mieszaninę analogową nasadki NTP przez wirowanie. Następnie odkręć go w dół Krótko złóż mieszaninę reakcyjną IVT zgodnie z opisem w tej tabeli.

Mieszaninę reakcyjną IVT dokładnie wymieszać, delikatnie pipetując w górę i w dół. Następnie krótko odwiruj probówkę PCR, aby zebrać mieszaninę na dnie probówki. Mieszaninę reakcyjną IVT inkubować w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez trzy godziny w mieszalniku termicznym

Po trzech godzinach usuń matrycowy DNA, dodając jeden mikrolitr DNA do mieszaniny reakcyjnej IVT. Dobrze mieszając i inkubując w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 15 minut. Oczyść mieszaninę reakcyjną za pomocą zestawu do oczyszczania RNA i dwukrotnie rozcieńczyć zmodyfikowany MR NA z membrany kolumny wirowej 40 mikrolitrami wody wolnej od nukleaz, zmodyfikowane mRNA wygenerowane przez IVT należy potraktować fosfatazą w celu usunięcia pięciu głównych trifosforanów, co może prowadzić do aktywacji immunologicznej.

Aby rozpocząć tę procedurę, dodaj dziewięć mikrolitrów 10 x bufor reakcyjny fosfatazy antarktycznej do 79 mikrolitrów oczyszczonego roztworu mRNA. Następnie dodaj dwa mikrolitry fosfatazy antarktycznej i delikatnie wymieszaj próbkę. Inkubować mieszaninę w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 30 minut.

Po 30 minutach oczyścić mieszaninę reakcyjną za pomocą zestawu do oczyszczania RNA i dwukrotnie rozcieńczyć zmodyfikowane mRNA z membrany kolumny wirowej 50 mikrolitrami wody wolnej od nukleaz. Po zmierzeniu stężenia zmodyfikowanego mRNA dostosuj stężenie do 100 nanogramów na mikrolitr, dodając wodę wolną od nukleaz. Sprawdź jakość zsyntetyzowanego zmodyfikowanego mRNA za pomocą elektroforezy żelowej RNA i zwizualizuj drabinkę i zakazy mRNA na oświetlaczu UV trans.

Należy wykryć przezroczyste pasmo mRNA o długości około 1 100 par zasad. Przygotuj komórki HEC 2 9 3 do transfekcji zsyntetyzowanym zmodyfikowanym mRNA przez dwukrotne posiew. Wyśrodkuj pięć komórek na dołek 12-dołkowej płytki, inkubuj komórki przez noc w temperaturze 37 stopni Celsjusza w inkubatorze komórkowym Następnego dnia komórka powinna osiągnąć 80 do 90% konfluencji.

Wygeneruj splot lipo do transfekcji. Przygotuj wystarczającą ilość mieszaniny transfekcyjnej dla wszystkich studzienek do transfekcji, każda studzienka 12-dołkowej płytki wymaga 2,5 mikrograma zmodyfikowanego mRNA, dwóch mikrolitrów odczynnika do transfekcji lipidów i 473 mikrolitrów opt one. Zmniejszyć pożywkę w surowicy.

Składniki należy delikatnie wymieszać, pipetując jako środek kontroli ujemnej. Przygotować mieszaninę transfekcji bez Mr.NA, inkubować mieszaniny transfekcji w temperaturze pokojowej przez 20 minut, aby wytworzyć lipopleksy. Do transfekcji.

Umyj komórki 500 mikrolitrami DPBS na. Dobrze dodać 500 mikrolitrów mieszaniny transfekcyjnej do każdego dołka 12-dołkowej płytki, inkubować komórki przez cztery godziny w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla po czterech godzinach, odessać mieszaninę transfekcji i dodać jeden mililitr kompletnej hodowli komórkowej. Pożywkę do komórek w każdym dołku.

Inkubować komórki przez 24 godziny w inkubatorze komórkowym. Następnie wykonaj analizę mikroskopową komórek za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego, aby przygotować komórki do cytometrii przepływowej. Usunąć pożywkę do hodowli komórkowych ze studzienek i umyć każdą studzienkę jednym z DPBS bez wapnia i magnezu.

Dodać 500 mikrolitrów TRIPSIN EDTA do dołka, aby oderwać komórki od powierzchni płytek do hodowli komórkowych. Następnie dodaj 500 mikrolitrów roztworu neutralizującego trypsynę na studzienkę, aby dezaktywować tryinę, odwirować odłączone komórki przez pięć minut w temperaturze pokojowej 300-krotności G. Po usunięciu supinatu Reese'a zawiesić podniebienie komórkowe w 150 mikrolitrach roztworu utrwalającego komórki i przenieść zawiesinę komórkową do probówki cytometrii przepływowej.

Przeanalizuj procent komórek wykazujących ekspresję EGFP i intensywność fluorescencji przy użyciu średniej geometrycznej intensywności fluorescencji. Ekspresję białka w czasie ocenia się również za pomocą analizy cytometrii przepływowej komórek eksprymujących EGFP po jednym, dwóch i trzech dniach po transfekcji, jak opisano w tekście protokołu, funkcjonalność wygenerowanego mRNA EGFP przetestowano przez transfekcję komórek HEC 2 9 3. Wytwarzanie EGFP w komórkach wykryto 24 godziny po transfekcji za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej.

W tym przypadku obraz kontrastu twarzy komórek jest pokazany obok obrazu fluorescencyjnego komórek. Ekspresję EGFP w komórkach wykryto również za pomocą cytometrii przepływowej 24 godziny po transfekcji. Różowa linia reprezentuje komórki bez mRNA, transfekcji, a niebieska linia reprezentuje komórki dodatnie EGFP.

Po transfekcji mRNA EGFP 93,91% wszystkich mierzonych komórek było dodatnich, a średnia geometryczna intensywności fluorescencji wyniosła 720,16. Czas ekspresji białka w komórkach HC 2 93 oceniano, mierząc ekspresję EGFP jeden, dwa i trzy dni po mRNA. Ekspresja białka transfekcji była najwyższa w komórkach 24 godziny po transfekcji.

Ilość ta zmniejszała się o 1,6 razy każdego następnego dnia, ale nawet po trzech dniach komórki zawierały EGFP Once Mastered. Tę technikę można wykonać w ciągu dwóch dni, jeśli zostanie wykonana prawidłowo. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak wytwarzać stabilizowane zmodyfikowane MRNA w celu indukcji pożądanej ekspresji białka w komórkach.