Wysoka ekspresja rekombinowanych białek ludzkich z przejściową transfekcją komórek HEK293 w zawiesinie

Laboratoryjna produkcja białek eukariotycznych z odpowiednią modyfikacją potranslacyjną stanowi istotną barierę. Oto solidny protokół z szybkim ustanowieniem i przekształceniem w ekspresję białek przy użyciu systemu ekspresji ssaków. System ten wspomaga selektywne znakowanie aminokwasów, selektywne znakowanie białek i małocząsteczkowych modulatorów składu glikanów.

Ogólnym celem tej procedury jest ekspresja glikoprotein ssaków za pomocą odpowiedniej glikozylacji ssaków poprzez ukierunkowanie rekombinowanych białek na szlak wydzielniczy za pośrednictwem ER i GOGI. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w immunologii, takie jak rola specyfikacji, wzorce w strukturze i potencjał aktywacji immunologicznej przeciwciał i fragmentów przeciwciał. Główną zaletą tej techniki jest to, że wykorzystuje ona ludzkie komórki do ekspresji ludzkich białek, co zapewnia odpowiedniego misjonarza komórkowego do prawidłowego fałdowania i modyfikowania docelowych białek.

Wytrząsarka inkubatora do zakładania komórek powinna pracować przy 135 obr./min, 80% wilgotności, 8% dwutlenku węgla i 37 stopniach Celsjusza co najmniej godzinę przed inokulacją hodowli. Włącz lampę UV w szafie bezpieczeństwa biologicznego, podgrzej szczelnie zamknięte butelki z podłożem A i medium B w łaźni wodnej o temperaturze 37 stopni Celsjusza. Wyłącz światła UV i wysterylizuj szafkę bezpieczeństwa biologicznego 70% roztworem etanolu i wody.

Wysterylizuj 125-mililitrową kolbę wzrostu Erlenmeyera z wentylowanymi pipetami, pipetami i podgrzewanymi butelkami z pożywką, spryskując 70% etanolem w roztworze wodnym. Umieść te przedmioty w komorze bezpieczeństwa biologicznego przez cały czas trwania tej procedury. Wszystkie przedmioty muszą zostać wysterylizowane w ten sposób przed wniesieniem ich do szafy bezpieczeństwa biologicznego.

Przygotować świeżą pożywkę do 30 mililitrów kultury, pobierając 26 mililitrów pożywki A i trzy mililitry pożywki B i przenosząc do 125-mililitrowej kolby Erlenmeyera. Wymieszać przez delikatne potrząsanie, w cieple, fiolkę z komórkami HEK 2 93 F uprzednio zamrożonymi w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza w łaźni wodnej w temperaturze 37 stopni Celsjusza, aby częściowo rozmrozić komórki. Zajmuje to około minuty, a komórki nie powinny być całkowicie rozmrożone.

Następnie wysterylizuj zewnętrzną stronę fiolki za pomocą 70% etanolu w roztworze wodnym i przenieś ją do szafki bezpieczeństwa biologicznego. Za pomocą pipety o pojemności jednego mililitra pobrać zawiesinę komórek i przenieść ją do 125-mililitrowej kolby Erlenmeyera zawierającej 29 mililitrów świeżej pożywki hodowlanej. Zamknąć pokrywę kolby hodowlanej i umieścić kolbę w wytrząsarce inkubatora na 24 godziny.

24 godziny po zaszczepieniu posiewu. Sprawdź gęstość komórek, wysterylizuj kolbę hodowlaną 70% roztworem etanolu i wody i przenieś ją do szafy bezpieczeństwa biologicznego. Za pomocą pipety o pojemności jednego mililitra i pipetera powoli pobrać 100 mikrolitrów kultury i przenieść ją do sterylnej probówki einor o pojemności 0,5 mililitra.

Zamknąć pokrywę kolby hodowlanej i jak najszybciej umieścić kolbę hodowlaną z powrotem w wytrząsarce inkubatora. Wymieszaj 7,5 mikrolitra roztworu błękitu trianowego z 7,5 mikrolitrami komórek. Energicznie wymieszaj, a następnie przenieś 7,5 mikrolitra mieszanki na szkiełko liczące.

Włącz automatyczny licznik komórek i umieść szkiełko zliczające w komorze załadowczej. Automatyczny czytnik jest aktywowany, a komórki są automatycznie liczone w jednostkach liczby komórek na mililitr i procentowej żywotności. Określić objętość kultury dawcy wymaganą do przeniesienia do świeżej pożywki hodowlanej, aby uzyskać gęstość komórek 300 000 żywych komórek na mililitr.

Przygotować świeżą pożywkę hodowlaną, jak pokazano powyżej, przenosząc 23 mililitry pożywki A i trzy mililitry pożywki B do świeżej kolby hodowlanej o pojemności 125 mililitrów. Następnie wyjmij butelki podstawowe z podłożem A i medium B z komory bezpieczeństwa biologicznego, aby zmniejszyć ryzyko ich zanieczyszczenia. Wyjąć kolbę do hodowli komórek F HEK 2 93 z inkubatora.

Spryskaj go 70% roztworem etanolu i wody i umieść w komorze bezpieczeństwa biologicznego za pomocą nowej pipety. Pobrać właściwą porcję komórek z hodowli i przenieść ją do kolby zawierającej świeżą kulturę. Średni. Przenieść obie kultury z komory bezpieczeństwa biologicznego do wytrząsarki inkubatora.

Hoduj komórki do przybliżonej gęstości od dwóch do 3 milionów żywych komórek na mililitr przed transfekcją. Sprawdź gęstość komórek, jak pokazano wcześniej, i określ ilość komórek do transfekcji. Za pomocą sterylnej pipety serologicznej.

Przenieś odpowiednią objętość zawiesiny komórek do probówki wirówkowej o pojemności 250 mililitrów. Zebrać komórki przez odwirowanie w temperaturze 100 razy G przez pięć minut. Po sterylizacji przenieść probówkę zawierającą granulowane komórki do komory bezpieczeństwa biologicznego.

Za pomocą sterylnej pipety zdekantować supernatant składający się ze zużytego składnika. Pożywkę hodowlaną energicznie ponownie wysłać granulowane komórki, pipetując w górę i w dół przy użyciu 10 mililitrów świeżej pożywki hodowlanej, a następnie przenieść do przygotowanej kolby zawierającej świeżą kulturę transfekcyjną. Średni. Nakręcić nakrętkę na wentylowaną kolbę do hodowli komórkowych i inkubować kolbę w wytrząsarce inkubatora przez 15 minut do jednej godziny, podczas gdy komórki są w inkubacji.

Rozcieńczyć osocze DNA i POLIETERAMINĘ lub PEI za pomocą świeżej pożywki hodowlanej do końcowego stężenia 0,5 mikrograma na mikrolitr. Wyjąć kolbę hodowlaną z rozproszonymi komórkami z wytrząsarki inkubatora i przenieść ją do szafki bezpieczeństwa biologicznego za pomocą mikropipety i 300 mikrolitrów DNA osocza do kultury i wymieszać przez delikatne ręczne wstrząsanie w 900 mikrolitrach PEI z kulturą i ponownie wymieszać. Następnie w 3,8 mililitra świeżej pożywki hodowlanej.

Przenieść kolbę do wytrząsarki inkubatora na 24 godziny. 24 godziny po transfekcji kulturę komórkową należy rozcieńczyć. Aby najpierw przygotować pożywkę rozcieńczającą, użyj sterylnej pipety serologicznej o pojemności jednego mililitra, aby pobrać jeden mililitr PREWARM 220 milimolowego kwasu walproinowego lub VPA i przenieść go do sterylnej probówki o pojemności 50 mililitrów.

Następnie za pomocą sterylnej pipety serologicznej dodać pięć mililitrów podgrzanego podłoża B i 44 mililitry podgrzanego podłoża A do roztworu VPA. W ten sposób otrzymuje się 50 mililitrów świeżej pożywki hodowlanej o końcowym stężeniu 4,4 milimola VPA. Pobrać transfekowaną kulturę z inkubatora.

Wysterylizuj zewnętrzną część kolby i umieść ją w komorze bezpieczeństwa biologicznego. Dodaj przygotowaną pożywkę do rozcieńczania do kultury. Przenieść kolbę z powrotem do wytrząsarki inkubatora na dodatkowe cztery do pięciu dni po transfekcji.

Codziennie monitoruj żywotność komórek za pomocą procedury przedstawionej wcześniej. Podwielokrotności powinny być również zapisywane każdego dnia do analizy ekspresji białka, pięć do sześciu dni po transfekcji lub jeśli żywotność komórek spadnie poniżej 50%Zbierz komórki, wirując komórki wraz z pożywką w temperaturze 1000 razy G przez pięć minut. Zebrać supernatant, który będzie zawierał wydzielane białko w pięciu mililitrach 10% roztworu wybielacza, do osadu komórek HEK i wyrzucić jako zagrożenie biologiczne.

Następnie białko jest oczyszczane z zebranego supernatantu. Ten system ekspresji wygenerował wysoką wydajność glikozylowanych białek, co ilustruje ten typowy wzorzec ekspresji IgG one fc po przejściowej transfekcji komórek F HK 2 93. Oczyszczanie powinowactwa przy użyciu kolumny białkowej dla IgG jednej FC lub kolumny niklowej dla GFP znakowanej histaminą z receptorem gamma FC trzy A dało białka o wysokiej czystości.

System ten skutecznie wyrażał wzbogaconą izotopowo IgG jeden FC w tym dwuwymiarowym widmie NMR, które koreluje częstotliwość rezonansową jąder wodoru i bezpośrednio związanego azotu amidowego. Zaobserwowano 15 atomów dobrze rozproszonych sygnałów. Różne formy glikoterapii wyprodukowano z komórkami HEK 2 93 F i HEK 2 93 s w różnych warunkach hodowli, jak wykazano za pomocą analiz spektrometrii mas z desorpcją laserową wspomaganą matrycą.

IgG jeden FC ulegający ekspresji z komórek HEK 2 93 s, zawierających i glikany, które miały postać z pięcioma anos plus dwie reszty N acetyloglukozaminy, które nie zawierały FU glikany glukozy z materiału ekspresyjnego HEK 2 93 F były złożonymi formami dwukierunkowymi z rdzeniową glukozą FU i głównie zawierającymi końcową N acetyloglukozaminę lub niewielką część form mono lub rozszerzonych. Dodanie inhibitora glikanacji do ekspresji przeprowadzonej przy użyciu komórek F HEK 2 93 wykazało ponad 90% zmniejszenie inkorporacji fuco Po opanowaniu, ustalenie transfekcji przejściowej można zakończyć w 1,5 godziny pierwszego dnia i 15 minut w drugim dniu. Po okresie odciągania trwającym od czterech do sześciu dni roztwór zawierający białko można zebrać w ciągu 15 minut.

Wreszcie, oczyszczenie białka zajmie około 1,5 godziny podczas próby tej procedury, ważne jest, aby pamiętać o utrzymaniu stabilnej kultury przed transfekcją aktywnie rosnących komórek i dodaniu DNA przed dodaniem PEI. Postępując zgodnie z tą procedurą. Inne metody, takie jak charakterystyka funkcjonalna białek przy użyciu szeregu technik biofizycznych, mogą być wykonywane w celu zbadania struktury i funkcji eksprymowanej glikoproteiny po jej rozwoju.

Technika ta utorowała drogę naukowcom zajmującym się immunologią do zbadania zależności między strukturą a aktywnością IgG i glikozylacji in vitro i in vivo. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak przygotować i oczyścić glikoproteiny przy użyciu naszej kombinacji komórek F 2 93 i wektora PZ N dwa.