Name: Wysoka ekspresja rekombinowanych białek ludzkich z przejściową transfekcją komórek HEK293 w zawiesinie (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-12-28T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 42 s
Description: Poznaj metodę ekspresji rekombinowanych glikoprotein ludzkich w komórkach HEK293 z zastosowaniem ścieżek sekretorycznych ER i Golgi. Ta technika umożliwia badanie struktury przeciwciał i aktywacji immunologicznej.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była finansowana z grantów K22AI099165 (AWB), P41GM103390 (KWM) i P01GM107012 (KWM) z National Institutes of Health, oraz z funduszy z Wydziału Biochemii, Biofizyki i Biologii Molekularnej im. Roya J. Carvera na Uniwersytecie Stanowym Iowa. Za treść tej pracy wyłączną odpowiedzialność ponoszą autorzy i niekoniecznie reprezentuje ona oficjalne poglądy NIH.

Ten protokół jest wystarczający do wyrażania przy użyciu komórek HEK293F lub HEK293S. 
1. Założenie komórki 
<ol>
	<li>Inokulacja kultur 
	Uwaga: Wszystkie procedury manipulacji kulturami muszą być przeprowadzane w obiekcie BSL-2, a każdy przedmiot wniesiony do szafy bezpieczeństwa biologicznego musi zostać wysterylizowany przez spryskanie 70% etanolem w roztworze wodnym.
	<ol>
		<li>Wytrząsarkę inkubatora należy uruchomić przy 135 obr./min, wilgotności 80% i przy 8.0% CO2 i temperaturze 37 °C. Włączyć lampę UV w szafie bezpieczeństwa biologicznego co najmniej 1 godzinę przed rozpoczęciem pracy. Szczelnie zamknięte butelki Medium A i Medium B należy podgrzać w łaźni wodnej w temperaturze 37 °C przez 1 godzinę.</li>
		<li>Wysterylizuj 125 ml kolby wzrostowe Erlenmeyera z wentylowaną nakrętką, pipetami, pipetami i wstępnie podgrzanymi butelkami z pożywką, spryskując 70% etanolem w roztworze wodnym. Umieść te przedmioty w szafie bezpieczeństwa biologicznego. Uwaga: Sterylizować tylko zewnętrzną folię przykrywającą kolbę hodowlaną Erlenmeyera o pojemności 125 ml, a następnie wyjmować tylko wtedy, gdy znajduje się ona w komorze bezpieczeństwa biologicznego.</li>
		<li>W przypadku 30 ml kultury pobrać 26 ml pożywki A i 3 ml pożywki B (10% końcowej kultury) i przenieść do 125 ml kolby hodowlanej Erlenmeyera i delikatnie wymieszać przez wstrząsanie (zwane dalej świeżą pożywką hodowlaną).</li>
		<li>Przenieść jedną fiolkę z komórkami zawierającymi HEK293F komórek, zamrożoną w temperaturze -80 °C, na lód i przenieść do pomieszczenia hodowlanego. Uwaga: HEK293F komórek jest dostarczanych w gęstości 1 x 107 komórek/ml.</li>
		<li>Delikatnie ogrzać fiolkę w łaźni wodnej w temperaturze 37 °C, aby częściowo rozmrozić komórki (trwa to około jednej minuty i komórki nie powinny być całkowicie rozmrożone). Wysterylizuj zewnętrzną część fiolki 70% etanolem w roztworze wodnym i przenieś ją do szafki bezpieczeństwa biologicznego.</li>
		<li>Za pomocą pipety o pojemności 1 ml pobrać zawiesinę komórek (około 0,7 ml) i przenieść do kolby Erlenmeyera o pojemności 125 ml zawierającej 29 ml świeżej pożywki hodowlanej. Zamknąć pokrywę kolby hodowlanej i przenieść ją do inkubowanego wytrząsarki.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Konserwacja komórek: sprawdź gęstość komórek, żywotność i pasaże komórkowe
	<ol>
		<li>Sprawdź gęstość komórek po 24 godzinach od rozmrożenia kultury, postępując zgodnie z poniższym protokołem. Uwaga: Komórki są hodowane przez 24 godziny po rozmrożeniu, aby zapewnić niezbędny wzrost komórek i żywotność >80%.</li>
		<li>Wysterylizuj kolbę hodowlaną 70% etanolem w roztworze wodnym i przenieś ją do szafki bezpieczeństwa biologicznego.</li>
		<li>Za pomocą pipety i pipetora o pojemności 1 ml powoli pobrać 100 μl kultury zawiesinowej i przenieść do sterylnej probówki eppendorfa o pojemności 0,5 ml. Zamknąć i przenieść kolbę hodowlaną z powrotem do wytrząsarki tak szybko, jak to możliwe.</li>
		<li>Wymieszaj 7,5 μl roztworu błękitu trypanowego z 7,5 μl komórek. Wymieszać energicznie z 7,5 μl mieszaniny komórki/błękitu trypanowego i przenieść na szkiełko liczące.</li>
		<li>Włącz automatyczny licznik komórek i umieść szkiełko zliczające w komorze załadowczej. Automatyczny czytnik jest aktywowany, a komórki są automatycznie liczone w jednostkach liczby komórek na ml i procentowej żywotności</li>
		<li>Oznaczyć objętość kultury dawcy wymaganą do przeniesienia na świeżą pożywkę hodowlaną przy gęstości komórek 0,3 x 106 żywych komórek/ml. 
		Uwaga: Zobacz przykładowe obliczenia w sekcji Materiały dodatkowe.</li>
		<li>Powtórzyć kroki 1.1.2 i 1.1.3 protokołu "1.1 Inokulacja kultur" powyżej, aby przygotować materiały wymagane do świeżej pożywki hodowlanej.</li>
		<li>Przenieść pożywkę A (23 ml) i pożywkę B (3 ml) do świeżej kolby hodowlanej o pojemności 125 ml. Wyjąć butelki magazynowe Medium A i Medium B z szafy bezpieczeństwa biologicznego. 
		Uwaga: Zapasy butelek z pożywką nie powinny być przechowywane w komorze bezpieczeństwa biologicznego w tym samym czasie, co ogniwa HEK 293F. Ogranicza to możliwość zanieczyszczenia butelek z podłożem wyjściowym.</li>
		<li>Wyjmij hodowlę komórkową HEK293 z inkubatora i spryskaj 70% etanolem w roztworze wodnym. Za pomocą nowej pipety pobrać podwielokrotność komórek (4 ml, objętość ta została oznaczona zgodnie z krokiem 1.2.6) z kultury i przenieść ją do kolby zawierającej świeżą pożywkę hodowlaną.</li>
		<li>Przenieść obie kultury z komory bezpieczeństwa biologicznego do zestawu wytrząsarki inkubatora zgodnie z ppkt 1.1.1. Hoduj komórki do przybliżonej gęstości 2-3 x 106 żywych komórek/ml. 
		Uwaga: Przybliżony czas podwajania komórek wynosi 32 godziny. Osiągnięcie tej gęstości zajmie 3-4 dni. Inkubuj komórki przez 3-4 przejścia, aby uzyskać stabilny wzorzec wzrostu komórek przed pierwszą transfekcją.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Przygotuj materiały do transfekcji
<ol>
	<li>Przygotowanie komórek HEK293 (dzień 1)
	<ol>
		<li>Subkultura komórek do gęstości 1 x 106 komórek/ml w świeżej pożywce B 24 godziny przed transfekcją zgodnie z etapem 1.2. 
		Uwaga: objętość kultury transfekcyjnej będzie zależała od liczby komórek. Większe objętości transfekcji (>20 ml) będą wymagały na tym etapie większej objętości hodowli.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotowanie zapasów materiałów
	<ol>
		<li>Przygotować roztwór podstawowy liniowej polietyleneniminy (PEI) o stężeniu 1 mg/ml w buforze zawierającym 25 mM kwasu 4-(2-hydroksyetylo)-1-piperazynoetanosulfonowego (HEPES) i 150 mM NaCl (pH 7,5). Całkowicie rozpuść PEI; może to zająć 30-60 minut w temperaturze pokojowej. Wysterylizować przez filtr strzykawkowy 0,22 μM i przechowywać w temperaturze -20 °C do długotrwałego użytkowania.</li>
		<li>Przygotować sterylne plazmidowe DNA (zgodnie z krokami 2.2.2.1-2.2.2.4). Procedura budowy plazmidu jest opisana w innym miejscu42. Krótka procedura przygotowania DNA jest wyjaśniona tutaj:
		<ol>
			<li>Hodować kulturę chemicznie kompetentnych komórek Escherichia coli przekształconych za pomocą wektora pGEn2 w 1 l pożywki LB (trypton - 10 g / L, ekstrakt drożdżowy - 5 g / L i chlorek sodu - 10 g / L) uzupełnionych 100 μg / ml ampicyliny. Bakterie E. coli hoduje się w temperaturze 37 °C w nienawilżanym inkubatorze z wytrząsaniem.</li>
			<li>Oczyść wektor pGEn2 kodujący docelowe plazmidowe DNA zgodnie z protokołem oczyszczania DNA producenta.</li>
			<li>Aby zapewnić całkowitą sterylność plazmidowego DNA, należy przeprowadzić końcowe etapy wytrącania i ponownego zawieszania izopropanolu w procedurach ekstrakcji DNA w komorze bezpieczeństwa biologicznego.</li>
			<li>Dodać objętość izopropanolu (określoną w zestawie do przygotowania plazmidu) do eluowanego DNA i odwirować przy 10 000 x g przez 10 minut. Wysterylizować zewnętrzną część pojemnika DNA 70 % etanolem w roztworze wodnym i przenieść go do komory bezpieczeństwa biologicznego. Wyrzucić supernatant izopropanolu za pomocą pipety i wysuszyć osad DNA na powietrzu. Po wyschnięciu ponownie zawiesić osad w sterylnym 10 mM buforze Tris, pH 8,0.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Przygotować roztwór podstawowy 220 mM kwasu walproinowego (VPA) w wodzie i sterylizować, przechodząc przez sterylny filtr 0,22 μm. Przechowywać roztwór w temperaturze -20 °C do czasu dalszego użycia.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Ustanawianie transfekcji przejściowej 
<ol>
	<li>Transfekcja (dzień 0)
	<ol>
		<li>Sprawdź gęstość komórek, wykonując kroki od 1.2.2 do 1.2.5 z "1.2. Konserwacja komórki" powyżej. Określić ilość komórek do transfekcji (2,5-3,0 x 106 żywych komórek/ml o żywotności >95%). Zobacz przykładowe obliczenia w Materiałach uzupełniających.</li>
		<li>Objętość komórek hodowli zawiesiny obliczoną w poprzednim kroku (tutaj 67 ml) przenieść do probówki wirówkowej o pojemności 250 ml za pomocą sterylnej pipety serologicznej. Zebrać komórki przez odwirowanie przez 5 minut przy 100 x g.</li>
		<li>W międzyczasie należy przygotować świeżą pożywkę do transfekcji, postępując zgodnie z krokiem 1.1.3 zgodnie z "1.1. Inokulacja kultur" powyżej. Zapoznaj się z materiałami uzupełniającymi, aby zapoznać się z przykładowymi obliczeniami. Przenieść również 5 ml świeżej pożywki hodowlanej do sterylnej probówki o pojemności 15 ml i odstawić na bok.</li>
		<li>Przenieść probówki zawierające granulowane komórki do komory bezpieczeństwa biologicznego po wysterylizowaniu zewnętrznej części probówek 70% etanolem w roztworze wodnym i użyć sterylnej pipety do zdekantowania supernatantu składającego się ze zużytej pożywki hodowlanej.</li>
		<li>Energicznie zawiesić granulowane komórki, pipetując w górę i w dół przy użyciu 10 ml świeżej pożywki hodowlanej i przenieść do kolby ze świeżą pożywką do hodowli transfekcyjnej (przygotowaną w kroku 3.1.3 powyżej). Nakręcić nakrętkę na wentylowaną kolbę do hodowli komórkowej i przenieść kolbę do inkubatora (jak ustawiono w ppkt 1.1.1) na 15 minut do 1 godziny z wytrząsaniem.</li>
		<li>W tym czasie rozcieńczyć plazmidowe DNA i PEI za pomocą świeżej pożywki hodowlanej (używając 5 ml objętości pobranej z kroku 3.1.3 powyżej) do końcowego stężenia 0,5 μg/μl. Zobacz przykładowe obliczenia w Materiałach uzupełniających, aby określić ilość DNA i PEI. Przenieść kolbę hodowlaną z rozproszonymi komórkami do komory bezpieczeństwa biologicznego.</li>
		<li>Dodać plazmidowe DNA (300 μl z 0,5 μg/μl) do kultury za pomocą mikropipety i wymieszać przez delikatne ręczne potrząsanie. Dodaj PEI (900 μl z 0,5 μg/μl) do kultury, wymieszaj delikatnie wstrząsając. Dodać 3,8 ml świeżej pożywki hodowlanej, z etapu 3.1.3 powyżej, i przenieść kolbę do wytrząsarki inkubatora na 24 godziny.</li>
		<li>Wyczyść komorę bezpieczeństwa biologicznego zgodnie z krokiem 1.1.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Rozcieńczenie (dzień 1) (dla objętości transfekcji 50 ml)
	<ol>
		<li>Inkubować transfekowaną kulturę przez 24 godziny.</li>
		<li>Pobrać 1 ml wstępnie podgrzanego 220 mM kwasu walproinowego (VPA; przygotowanego zgodnie z krokiem 2.2.3.) za pomocą sterylnej pipety serologicznej o pojemności 1 ml i przenieść go do sterylnej probówki o pojemności 50 ml.</li>
		<li>Pobrać 5,0 ml podgrzanej pożywki B i 44 ml podgrzanej pożywki A i dodać je do roztworu VPA za pomocą sterylnej pipety serologicznej, aby przygotować 50 ml świeżej pożywki hodowlanej o końcowym stężeniu 4,4 mM VPA.</li>
		<li>Po wysterylizowaniu zewnętrznej części kolby roztworem 70% etanolu w roztworze wodnym przenieść transfekowaną kulturę do komory bezpieczeństwa biologicznego, dodać przygotowaną pożywkę rozcieńczającą i przenieść kolbę z powrotem do inkubowanego wytrząsarki.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Ekspresja i żniwa (dni 2-6)
	<ol>
		<li>Inkubuj komórki przez dodatkowe 4-5 dni (łącznie 5-6 dni od transfekcji).</li>
		<li>Pobrać podwielokrotności pożywki zgodnie z krokami 1.2.2-1.2.5 opisanymi w "1.2. Cell Maintenance" powyżej przy użyciu sterylnej pipety serologicznej o pojemności 1 ml, w celu monitorowania żywotności komórek i zapisywania podwielokrotności do analizy ekspresji białek każdego dnia za pomocą SDS-PAGE (patrz sekcja 5 poniżej).</li>
		<li>Zebrać komórki po 5-6 dniach, odwirowując komórki wraz z podłożem w ilości 1 000 g przez 5 minut. Dodatkowo, jeśli żywotność komórek spadnie poniżej 50%, należy zebrać supernatant (patrz kroki 1.2.2-1.2.5).</li>
		<li>Odlej supernatant, który będzie zawierał wydzielane białko. Dodaj 5 ml 10% wybielacza do osadu komórek HEK i wyrzuć jako zagrożenie biologiczne.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. Oczyszczanie białek
<ol>
	<li>Przygotować kolumnę z 5 ml sefarozy Protein-A. Zrównoważyć kolumnę z 5 objętościami buforu A (20 mM kwasu 3-(N-morfolino)propanosulfonowego (MOPS), pH 7,4, 100 mM NaCl).</li>
	<li>Odwirować zebrany supernatant z wyrażonym białkiem z dużą prędkością (14 000 g przez 10 minut) w celu usunięcia wszelkich pozostałych resztek komórkowych. Zbierać, dekantując do świeżej tuby. Wyrzuć granulki jako zagrożenie biologiczne.</li>
	<li>Pobrać 10 μl podwielokrotności supernatantu i dodatkowo pobrać małą próbkę na każdym etapie oczyszczania białka w celu analizy próbki za pomocą SDS-PAGE (opisanej w sekcji 5). Załadować oczyszczony supernatant i zebrać przez niego przepływ.</li>
	<li>Przemyć kolumnę 3-kolumnowymi objętościami buforu A i wymyć białko 5-kolumnowymi objętościami 100 mM glicyny o pH 3,0. Zebrać eluat w probówkach zawierających połowę objętości 1 M buforu TRIS o pH 8,0 w celu szybkiego zneutralizowania pH.</li>
	<li>Umyj kolumnę 10 objętościami buforu A i przechowuj do wykorzystania w przyszłości.</li>
	<li>Wymiana buforowa eluowanego białka z co najmniej 10-krotnym nadmiarem buforu A przy użyciu filtrów odśrodkowych o masie cząsteczkowej 10 kDa. Uwaga: Nie należy zagęszczać eluowanej próbki do bardzo małej objętości (<2 ml) w eluowanym buforze. Użyj filtrów odśrodkowych, aby wymienić bufor na bufor A.</li>
	<li>Oczyszczone białko przechowywać w temperaturze 4 °C do następnego użycia. 
	Uwaga: Białko wyrażone w supernatance może być oczyszczone za pomocą kolumn powinowactwa dobranych na podstawie właściwości białka lub przy użyciu znaczników powinowactwa. W typowej procedurze oczyszczania kolumna białka A może być używana do fragmentów IgG lub Fc lub kolumna niklowa może być używana do białek wyrażanych za pomocą znacznika polihistydynowego. Oto opis etapów oczyszczania IgG1-Fc przy użyciu kolumny białka A.</li>
</ol>
5. Analiza białka za pomocą SDS-PAGE
<ol>
	<li>Rozcieńczyć podwielokrotności (7,5 μl) każdej próbki równą objętością 2x buforu ładującego (0,125 M Tris, pH 8,0, 4% SDS, 10% β-merkaptoetanolu, 20% glicerolu i 0,01% błękitu bromofenolowego).</li>
	<li>Gotować mieszaninę w temperaturze 90 °C przez 5 minut, używając bloku grzewczego lub łaźni wodnej. Odwirować próbki o masie 10 000 g przez 1 minutę. Do przygotowanego żelu należy załadować 5 μl białka znacznikowego i 14 μl próbek do analiz za pomocą pipety o pojemności 20 μl z jednorazową końcówką.</li>
	<li>Uruchom jeden żel przy natężeniu 25 miliamperów przez 60 minut. Po zakończeniu etapu elektroforezy przenieś żel do pojemnika z 1 litrem wody i mikrofalówki na 5 minut.</li>
	<li>Zabarwić żel roztworem barwiącym (40% etanolu, 10% kwasu octowego i 0,1% błękitu brylantowego coomassie) przez 2 godziny i odbarwić w wodzie.</li>
</ol>
6. Analiza glikanów za pomocą spektrometrii mas
<ol>
	<li>Analizuj glikany zgodnie z wcześniejszym opisem44. Krótko mówiąc, 75 μg IgG1-Fc poddano trypsynizacji, a następnie potraktowano PNGaseF w celu uwolnienia glikanów45. Uwolnione glikany poddano permetylacji i przeanalizowano za pomocą spektrometrii mas czasu przelotu wspomaganej desorpcją laserową wspomaganą matrycą (MALDI-TOFMS).</li>
</ol>
7. Poprawki protokołu dla specjalnych scenariuszy
<ol>
	<li>Znakowanie białek za pomocą 15aminokwasów znakowanych N (dla objętości transfekcji 50 ml)
	<ol>
		<li>Dozować 5 mg każdego aminokwasu do jednej sterylnej szklanej fiolki. Zawiesić ponownie w 4 ml autoklalawowanej wody (uwaga: Tyr nie rozpuszcza się całkowicie, w przeciwieństwie do Lys i Phe). Wysterylizować roztwór przez autoklawowanie w temperaturze 121 °C przez 15 minut. Pozostawić roztwór do ostygnięcia do temperatury około 50-60 °C.</li>
		<li>W przypadku transfekcji o objętości 50 ml należy postępować zgodnie z krokiem 3.1.3 zgodnie z "3.1 Ustanawianie transfekcji przejściowej". Zapoznaj się z sekcją Materiały uzupełniające, aby zapoznać się z przykładem z odpowiednimi woluminami.</li>
		<li>Aby wykonać transfekcję, wykonaj czynności opisane w "3. Ustanawianie transfekcji przejściowej" przy użyciu świeżej pożywki hodowlanej podstawionej znakowanymi resztami aminokwasowymi, jak przygotowano powyżej.</li>
		<li>Po 24 godzinach od transfekcji, w dniu rozcieńczenia hodowli, pobrać 5,0 ml wstępnie podgrzanej pożywki B, 40 ml podgrzanej pożywki A i świeżo autoklawowaną 4 ml podwielokrotności mieszaniny aminokwasów (przygotowanej jak w kroku 7.1.1 powyżej) i dodać 1 ml wstępnie podgrzanego roztworu podstawowego roztworu VPA w celu przygotowania 50 ml świeżej pożywki hodowlanej do rozcieńczania o końcowym stężeniu 4,4 mM VPA. Dodać tę pożywkę do kultury transfekcyjnej za pomocą sterylnej pipety serologicznej.</li>
		<li>Przenieść transfekowaną kulturę do komory bezpieczeństwa biologicznego po wysterylizowaniu zewnętrznej części kolby 70% roztworem etanolu w wodzie, dodać przygotowane podłoże rozcieńczające i przenieść kolbę z powrotem do inkubowanego wytrząsarki. 
		Uwaga: Medium A to chemicznie zdefiniowane podłoże bez surowicy. W ten sposób możliwe jest przygotowanie innego preparatu. Skontaktuj się z dostawcą, aby uzyskać niestandardowy preparat Medium A, który nie zawiera niektórych aminokwasów. Możliwe jest pominięcie wszystkich aminokwasów, jednak wolimy używać pożywki, która nie zawiera tylko kilku wybranych reszt, ponieważ kompletna pożywka dropout wymagałaby dostosowania osmolarności po suplementacji. Wybraliśmy pożywkę Lys-Tyr-Phe, która może być suplementowana i nie wymaga regulacji osmolarności. Ponadto dostawca medium A nie dzieli się swobodnie stężeniami składników medium; z powodzeniem stosowaliśmy po 100 mg / L dla Lys, Tyr i Phe. Objętość pożywki do transfekcji i ekspresji musi być dostosowana w celu uwzględnienia dodanych aminokwasów. Poniżej przedstawiono zmiany w powyższym protokole dotyczące znakowania izotopów</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Uzupełnij transfekcję małą cząsteczką
	<ol>
		<li>Przygotować 100 mM roztwór podstawowy 2-deoksy-2-fluoro-l-fukozy przy użyciu autoklalawowanej wody i wysterylizować ten roztwór za pomocą filtra 0,22 μM.</li>
		<li>W przypadku hodowli o objętości 50 ml dodać 125 μl (przy 250 μM) roztworu analogu fukozy do pożywki do transfekcji i rozcieńczania. Uwaga: Zaniedbaliśmy dalszą regulację objętości, ponieważ dodanie podstawnika w tym stężeniu stanowi tylko 0,25% całkowitej objętości kultury. Możliwa jest modyfikacja ekspresji za pomocą małocząsteczkowych inhibitorów przetwarzania glikanów. Tutaj opisujemy warunki włączenia 2-deoksy-2-fluoro-l-fukozy, inhibitora fukozylacji glikanów. Stwierdziliśmy >90% redukcję fukozylacji poprzez dodanie analogu fukozy w stężeniu 250 μM w pożywce do transfekcji i rozcieńczania.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

Wszyscy autorzy deklarują, że nie mają sprzecznych interesów finansowych w tym manuskrypcie.

Protokół ten ilustruje ekspresję białek poprzez przejściową transfekcję komórek HEK293F lub S. Optymalne warunki transfekcji ustalone w laboratoriach Barb i Moremen wykorzystują krytyczną kombinację gęstości komórek i stężeń odczynników w celu osiągnięcia wysokiej wydajności transfekcji. Krytyczne kwestie związane z wdrażaniem tego protokołu obejmują: utrzymanie stabilnej kultury przed transfekcją (ze stałymi czasami podwajania hodowli); transfekcja aktywnie rosnących komórek (osiągana przez rozcieńczenie komórek do 1 × ...

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/53568">High Yield Expression of Recombinant Human Proteins with the Transient Transfection of HEK293 Cells in Suspension</a>. The Authors section was updated. from:
Ganesh P. Subedi1 
Roy W. Johnson2 
Heather A. Moniz2 
Kelley W. Moremen2 
Adam Barb1 
1The Roy J. Carver Department of Biochemistry, Biophysics and Molecular Biology, Iowa State University 
2Complex Carbohydrate Research Center, University of Georgia
to
Ganesh P. Subedi1 
Roy W. Johnson2 
Heather A. Moniz2 
Kelley W. Moremen2 
Adam W. Barb1 
1The Roy J. Carver Department of Biochemistry, Biophysics and Molecular Biology, Iowa State University 
2Complex Carbohydrate Research Center, University of Georgia

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/53568">High Yield Expression of Recombinant Human Proteins with the Transient Transfection of HEK293 Cells in Suspension</a>. The Authors section was updated.

Erratum: High Yield Expression of Recombinant Human Proteins with the Transient Transfection of HEK293 Cells in Suspension

Produkcja wysokiej wydajności odpowiednio złożonych i zmodyfikowanych potranslacyjnie ludzkich białek do szczegółowej analizy struktury i funkcji pozostaje znaczącym wyzwaniem. Dostępna jest duża liczba systemów ekspresji, które wytwarzają rekombinowane białka o natywnej funkcji i zachowaniu. Bakteryjne systemy ekspresji, głównie szczepy Escherichia coli, stanowią najbardziej dostępne i powszechnie stosowane narzędzia na arenie badawczej, ze względu na prostotę tych systemów ekspresji, chociaż opisano również systemy drożdżowe, roślinne, owadzie i ssacze1-4. Jednak większość tych systemów nie jest zdolna do odpowiedniej modyfikacji potranslacyjnej białek docelowych. Podstawowym zainteresowaniem laboratoriów Barb i Moremen jest wytwarzanie białek eukariotycznych o odpowiedniej glikozylacji. Wiele ludzkich białek wymaga odpowiedniej glikozylacji do prawidłowego funkcjonowania (patrz5).
Maszyneria glikozylacji eukariotycznej jest rozległa i zdolna do dokonywania różnorodnych modyfikacji, w tym zarówno asparaginy(N)- jak i seryny/treoniny(O) kompleksu glikanów6. Szacuje się, że >50% ludzkich białek to N-glikozylowane7. Glikany są niezbędnymi składnikami wielu białek, w tym terapeutycznych przeciwciał monoklonalnych, erytropoetyny i czynników krzepnięcia krwi, takich jak czynnik IX, by wymienić tylko kilka. Chociaż istnieje wiele metod odpowiedniego przygotowania białek N-glikozylowanych i wahają się od czysto syntetycznych8-10 do chemoenzymatycznych11-14 lub odzyskiwania z inżynieryjnych systemów rekombinowanych15-20, nie jest zaskoczeniem, że ludzkie systemy ekspresji okazały się do tej pory najbardziej niezawodnymi metodami wytwarzania ludzkich białek.
Wiele terapeutycznych ludzkich glikoprotein jest wytwarzanych w systemach rekombinowanych przy użyciu komórek ssaków. Na uwagę zasługują następujące źródła: jajnik chomika chińskiego (CHO), szpiczak myszy (NS0), nerka chomika (BHK), nerka zarodkowa człowieka (HEK-293) oraz linie komórkowe siatkówki ludzkiej, które są wykorzystywane w hodowli adhezyjnej lub zawiesinowej do produkcji białek4,21,22. Jednak systemy ekspresji białek ssaków wymagały wytworzenia stabilnych linii komórkowych, drogich pożywek wzrostowych i procedur transfekcji wspomaganej substratem23.
Transfekcja komórek ssaków jest osiągana za pomocą licznych czynników, w tym fosforanów wapnia24,25, polimerów kationowych (DEAE-dektran, polibrenu, polilizyny, polietylenoaminy (PEI)) lub dodatnio naładowanych liposomów kationowych26-29. PEI jest polikationowym, naładowanym, liniowym lub rozgałęzionym polimerem (25 kDa)26, który tworzy stabilny kompleks z DNA i jest endocytozowany. Uważa się, że po zakwaszeniu endosomu PEI pęcznieje, co prowadzi do pęknięcia endosomów i uwolnienia DNA do cytoplazmy26,30.
Do niedawna, transfekcja przejściowa w hodowli zawiesinowej była przeprowadzana przez wcześniejsze tworzenie kompleksu DNA/PEI, a następnie dodawanie do hodowli komórkowej29. Jednak Würm i współpracownicy opisali wysoce wydajny protokół zoptymalizowany pod kątem produkcji rekombinowanych białek w komórkach HEK293, które utworzyły kompleks DNA/PEI in situ31,32. W ten sposób uniknięto przygotowania, sterylizacji kompleksu i wymiany buforu na pożywkę hodowlaną. Dalsza optymalizacja poprzez włączenie plazmidów zwiększających ekspresję doprowadziła do znacznego wzrostu plonów33. Jest to metoda, która opiera się na tych postępach i ma szerokie zastosowanie. Warunki ekspresji mogą być również zmienione w celu wpłynięcia na skład N-glikanów.
Linia komórkowa HEK293S, z delecją genu, która zatrzymuje przetwarzanie N-glikanów na etapie pośrednim, prowadzi do ekspresji białek o jednolitych N-glikanach składających się z 2 reszt N-acetyloglukozaminy plus pięć reszt mannozy (Man5GlcNAc2)34,35. Komórki te nie mają genu N-acetyloglukozaminylotransferazy I (GntI), który jest wymagany do dalszego przetwarzania N-glikanów36,37. Stosowanie inhibitorów glikozylotransferazy, w tym kifunenzyny, analogów kwasu sjalowego oraz analogu fukozy i 2-deoksy-2-fluoro-fukozy ma podobne efekty i ogranicza przetwarzanie N-glikanów38-41.
Protokół opisany tutaj wykorzystuje wektor pGEn2, jak pokazano na rysunku 142,43, transfekcję przejściową wspomaganą przez PEI do linii komórek ssaków (HEK293F lub HEK293S komórek) oraz odzyskiwanie wysokich plonów odpowiednio glikozylowanego białka. System ten jest solidny i może uwzględniać różne czynniki, w tym znakowanie izotopowe i inżynierię glikanów w celu produkcji dużych mian białek rekombinowanych.

<table><tbody><tr><td>Szafa bezpieczeństwa biologicznego&nbsp;</td><td>NuAire, Inc.</td><td>CellGard ES NU-S475-400</td><td>Klasa II, typ A2 Komora bezpieczeństwa biologicznego</td></tr><tr><td>Wytrząsarka inkubacyjna</td><td>INFORS HT</td><td></td><td>Multitron Cell&nbsp;</td></tr><tr><td>Medium A: FreeStyle Expression Medium&nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td>12338-018</td><td></td></tr><tr><td>Medium B: ExCell 293 Podłoże bez Serum&nbsp;</td><td>SIGMA</td><td>14571C&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>125 Kolba Erlenmeyera z wentylowaną nasadką</td><td>Corning Incorporated/Life Sciences</td><td>431143</td><td></td></tr><tr><td>250 Kolba Erlenmeyera z wentylowaną nasadką</td><td>Corning Incorporated/Life Sciences</td><td>431144</td><td></td></tr><tr><td>FreeStyle HEK 293F Cells</td> Life <td>Technologies</td><td>R790-07</td><td></td></tr><tr><td>1 ml Jednorazowa pipeta serologiczna</td><td>Fisher Scietific</td><td>13-676-10B</td><td></td></tr><tr><td>10 ml Jednorazowa pipeta serologiczna</td><td>Fisher Scietific</td><td>13-676-10J</td><td></td></tr><tr><td>25 ml Jednorazowa pipeta serologiczna</td><td>Fisher Scietific</td><td>13-676-10K</td><td></td></tr><tr><td>Pipetor (Pipet-Aid XP)</td><td>Drummond Scientific</td><td>161263</td><td></td></tr><tr><td>Trypan Blue Solution&nbsp;</td><td>Thermo Scientific&nbsp;</td><td>SV30084.01</td><td></td></tr><tr><td>Zjeżdżalnie do liczenia&nbsp;</td><td>Bio-Rad</td><td>145-0011</td><td></td></tr><tr><td>TC20 Automatyczny licznik komórek&nbsp;</td><td>Bio-Rad&nbsp;</td><td>145-0102</td><td></td></tr><tr><td>Polietyleninina (PEI)</td><td>Polysciences Inc.</td><td>23966</td><td>Przygotować roztwór podstawowy o stężeniu 1 mg/ml w buforze zawierającym 25 mM kwasu 4-(2-hydroksyetylo)-1-piperazynoetanosulfonowego (HEPES) i 150 mM NaCl (pH 7,5). Całkowicie rozpuść PEI; sterylizować przez 0,22 &mu; M strzykawkę przefiltrować i przechowywać w temperaturze -20 stopni Celsjusza.</td></tr><tr><td>Kwas 4-(2-hydroksyetylo)-1-piperazynoetanosulfonowy (HEPES)</td><td>EMD Chemicals Inc.</td><td>7365-45-9</td><td></td></tr><tr><td>Filtr strzykawkowy 25 mm, 0,22 &mu; M</td><td>Fisher Scietific</td><td>09-719A</td><td></td></tr><tr><td>Trisaminometan (baza Tris)</td><td>Fisher Scietific</td><td>BP152-1</td><td></td></tr><tr><td>XL1-Blue</td><td>Stratagene</td><td>222249</td><td></td></tr><tr><td>Trypton</td><td>Fisher Scietific</td><td>BP1421-2</td><td></td></tr><tr><td>Ekstrakt drożdżowy</td><td>Fluka Analytical&nbsp;</td><td>92144</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek sodu</td><td>Chemikalia BDH</td><td>BDH8014</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw do oczyszczania plazmidu</td><td>QIAGEN</td><td>12145</td><td></td></tr><tr><td>Valproic (VPA)</td><td>SIGMA</td><td>P4543</td><td>Przygotować roztwór podstawowy 220 mM w wodzie, wysterylizować przez przejście przez sterylny filtr 0,22 mm i przechowywać w temperaturze -20 &deg; C</td></tr><tr><td>Wirówka</td><td>Thermo Scientific&nbsp;</td><td>EW-17707-65</td><td></td></tr><tr><td>Kolumna białkowa A-Sepharose</td><td>SIGMA</td><td>P9424</td><td></td></tr><tr><td>Ni-NTA superflow</td><td>QIAGEN</td><td>30430</td><td></td></tr><tr><td>Kwas 3-(N-morfolino)propanosulfonowy (MOPS)</td><td>Fisher Scietific</td><td>BP308-500</td><td></td></tr><tr><td>Glicyna</td><td>Fisher Scietific</td><td>BP381-500</td><td></td></tr><tr><td>10 kDa odcięcie masy cząsteczkowej Amicon&reg; Filtry ultra odśrodkowe&nbsp;</td><td>Millipore</td><td>UFC901096</td><td></td></tr><tr><td>Dodecylosiarczan sodu</td><td>ALDRICH</td><td>L3771</td><td></td></tr><tr><td>Beta-merkaptoetanol</td><td>ALDRICH</td><td>M6250</td><td></td></tr><tr><td>Glicerol</td><td>SIGMA</td><td>G5516</td><td></td></tr><tr><td>Precision Plus Białko Wszystkie niebieskie standardy</td><td>Bio-Rad</td><td>161-0373</td><td></td></tr><tr><td>Kwas octowy, lodowaty&nbsp;</td><td>Fisher Scietific</td><td>64-19-7</td><td></td></tr><tr><td>coomassie brylantowo niebieski&nbsp;</td><td>Bio-Rad&nbsp;</td><td>161-0406</td><td></td></tr><tr><td>MALDI-TOFMS Voyager-DE PRO&nbsp;</td><td>Applied Biosystems</td><td></td><td></td></tr><tr><td>15N znakowane L-tyrozyna</td><td>ALDRICH</td><td>332151</td><td></td></tr><tr><td>15N znakowane L-lizyna</td><td>ALDRICH</td><td>592900</td><td></td></tr><tr><td>Nieznakowane L-fenyloalanina</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>P2126</td><td></td></tr><tr><td>13C6-glukoza</td><td>ALDRICH</td><td>389374</td><td></td></tr><tr><td>2- Deoksy-2-fluoro-L-fukoza&nbsp;</td><td>SANTA CRUZ Biotechnologia</td><td>sc-283123</td><td></td></tr></tbody></table>

wysoka ekspresja rekombinowanych białek ludzkich z przejściową transfekcją komórek hek293 w zawiesinie

High Yield Expression of Recombinant Human Proteins with the Transient Transfection of HEK293 Cells in Suspension

Sztuka produkcji białek rekombinowanych ze złożonymi modyfikacjami potranslacyjnymi stanowi główne wyzwanie dla badań nad strukturą i funkcją. Szybkie tworzenie się i wysoki powrót do zdrowia po przejściowo transfekowanych liniach komórkowych ssaków rozwiązuje tę barierę i jest skutecznym sposobem ekspresji białek, które są naturalnie kierowane przez szlak wydzielniczy za pośrednictwem ER i Golgiego. Oto jeden z protokołów ekspresji białek przy użyciu ludzkich linii komórkowych HEK293F i HEK293S transfekowanych wektorem ekspresyjnym ssaków zaprojektowanym w celu uzyskania wysokiej wydajności białka. Możliwość zastosowania tego systemu wykazano przy użyciu trzech reprezentatywnych glikoprotein, które ulegały ekspresji z wydajnością między 95-120 mg oczyszczonego białka odzyskanego na litr hodowli. Białka te to ludzka FcγRIIIa i szczurza α2-6 sjalilotransferaza, ST6GalI, obie ulegające ekspresji z N-końcową fuzją GFP, a także niezmodyfikowana ludzka immunoglobulina G1 Fc. Ten solidny system wykorzystuje pożywkę niezawierającą surowicy, która jest przystosowana do ekspresji izotopowo wzbogaconych białek i węglowodanów do badań strukturalnych z wykorzystaniem spektrometrii mas i spektroskopii magnetycznego rezonansu jądrowego. Co więcej, skład N-glikanu można dostosować, dodając małą cząsteczkę, aby zapobiec niektórym modyfikacjom glikanów w sposób, który nie zmniejsza wydajności.

Wysoki poziom ekspresji i czystości białka
Ten zoptymalizowany system ekspresji pozwolił na uzyskanie wysokiej wydajności glikozylowanych białek. Typowy wzorzec przedstawiono na przykładzie ekspresji IgG1-Fc (Rysunek 1). W tym przypadku Dzień 0 to dzień transfekcji, po którym następuje Dzień 1 (rozcieńczenie) oraz kolejne dni hodowli aż do Dnia 5. Ekspresję białka analizowano z wykorzystaniem rozpuszczalnej frak...

Laboratoryjna produkcja białek eukariotycznych z odpowiednią modyfikacją potranslacyjną stanowi istotną barierę. Oto solidny protokół z szybkim ustanowieniem i przekształceniem w ekspresję białek przy użyciu systemu ekspresji ssaków. System ten wspomaga selektywne znakowanie aminokwasów, selektywne znakowanie białek i małocząsteczkowych modulatorów składu glikanów.

Wysoka ekspresja rekombinowanych białek ludzkich z przejściową transfekcją komórek HEK293 w zawiesinie

The art of producing recombinant proteins with complex post-translational modifications represents a major challenge for studies of structure and ...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest ekspresja ssaczych glikoprotein z odpowiednią glikozylacją ssaczą poprzez kierowanie białek rekombinowanych do retikulum endoplazmatycznego (ER) i zależnej od GOGI ścieżki wydzielniczej. Metoda ta może pomóc w udzieleniu odpowiedzi na kluczowe pytania z zakresu immunologii, takie jak rola konkretnej specyfikacji, wzorce w strukturze oraz potencjał aktywacji immunologicznej przeciwciał i fragmentów przeciwciał. Główną zaletą tej techniki jest wykorzystanie ludzkich komórek do ekspresji ludzkich białek, co zapewnia odpowiednie środowisko komórkowe do prawidłowego fałdowania i modyfikacji białek docelowych.Inkubator z wytrząsarką do namnażania komórek powinien pracować z prędkością 135 RPM, przy wilgotności 80%, stężeniu dwutlenku węgla 8% i temperaturze 37 stopni Celsjusza przez co najmniej jedną godzinę przed inokulacją hodowli. Włączyć lampę UV w komorze z laminarnym przepływem powietrza i podgrzać szczelnie zamknięte butelki z medium A oraz medium B w łaźni wodnej o temperaturze 37 stopni Celsjusza. Wyłączyć lampy UV i zdezynfekować komorę z laminarnym przepływem powietrza roztworem 70% etanolu w wodzie.Zdezynfekuj 125 ml kolbę Erlenmeyera z wentylowaną zakrętką, pipety, pipetory oraz podgrzane wcześniej butelki z pożywką, spryskując je 70% roztworem etanolu w wodzie. Umieść te przedmioty w komorze z laminarnym przepływem powietrza na czas trwania całej procedury. Wszystkie elementy muszą zostać zdezynfekowane w ten sposób przed wprowadzeniem ich do komory z laminarnym przepływem powietrza.Przygotować świeżą pożywkę dla hodowli o objętości 30 ml, pobierając 26 ml pożywki A oraz trzy ml pożywki B i przenosząc je do kolby Erlenmeyera o pojemności 125 ml. Wymieszać poprzez delikatne potrząsanie. Fiolkę z komórkami HEK 293 F, wcześniej zamrożoną w temperaturze -80 °C, ogrzać w kąpieli wodnej o temperaturze 37 °C, aby częściowo rozmrozić komórki. Czynność ta trwa około jednej minuty; komórki nie powinny zostać całkowicie rozmrożone.Następnie wysterylizuj zewnętrzną stronę fiolki roztworem 70% etanolu w wodzie i przenieś ją do komory z laminarnym przepływem powietrza. Za pomocą pipety o pojemności 1 ml pobierz zawiesinę komórkową i przenieś ją do kolby Erlenmeyera o pojemności 125 ml zawierającej 29 ml świeżej pożywki hodowlanej. Zamknij kolbę hodowlaną i umieść ją w inkubatorze z wytrząsarką na 24 godziny.24 godziny po zaszczepieniu hodowli. Należy sprawdzić gęstość komórek, wysterylizować kolbę z hodowlą roztworem 70% etanolu i wody, a następnie przenieść ją do komory z laminarnym przepływem powietrza. Za pomocą pipety 1 ml i dozownika powoli pobrać 100 µL hodowli i przenieść ją do sterylnej probówki typu einor o pojemności 0,5 ml.Zamknąć pokrywę kolby hodowlanej i jak najszybciej przenieść ją z powrotem do inkubatora z wytrząsarką. Wymieszać 7,5 µL roztworu trypan blue z 7,5 µL zawiesiny komórek. Wymieszać energicznie, a następnie przenieść 7,5 µL mieszaniny na szkiełko do liczenia.Włącz automatyczny licznik komórek i umieść slajd do liczenia w komorze załadowczej. Automatyczny czytnik zostanie aktywowany, a komórki zostaną policzone automatycznie w jednostkach liczby komórek na mililitr oraz procentu żywotności. Oblicz objętość kultury donora niezbędną do przeniesienia do świeżej pożywki w celu uzyskania gęstości komórek na poziomie 300 000 żywych komórek na mililitr.Przygotuj świeżą pożywkę hodowlaną zgodnie z wcześniejszym opisem, przenosząc 23 mililitrów pożywki A oraz trzy mililitry pożywki B do świeżej kolby hodowlanej o pojemności 125 mililitrów. Następnie wyjmij butelki zapasowe pożywki A i pożywki B z komory laminarnej, aby zmniejszyć ryzyko ich zanieczyszczenia. Wyjmij kolbę z hodowlą komórek HEK 2 93 F z inkubatora.Spryskać to roztworem 70% etanolu i wody, a następnie umieścić w komorze z laminarnym przepływem powietrza. Używając nowej pipety, pobrać odpowiednią alikwot komórek z hodowli i przenieść go do kolby zawierającej świeże pożywkę hodowlaną. Przenieść obie hodowle z komory z laminarnym przepływem powietrza do inkubatora z wytrząsarką.Przed transfekcją należy hodować komórki do przybliżonej gęstości od 2 do 3 milionów żywych komórek na mililitr. Należy sprawdzić gęstość komórek zgodnie z wcześniejszą instrukcją i określić liczbę komórek do transfekcji. Należy użyć sterylnej pipety serologicznej.Przenieś odpowiednią objętość zawiesiny komórkowej do probówki wirówkowej o pojemności 250 ml. Zbierz komórki poprzez wirowanie przy 100 ×g przez pięć minut. Po sterylizacji przenieś probówkę z osadem komórkowym do komory bezpieczeństwa biologicznego.Za pomocą sterylnej pipety odlej nadsącz consisting of zużytej pożywki hodowlanej. Energicznie resuspenduj osad komórkowy, pipetując go w górę i w dół w 10 milliliters świeżej pożywki hodowlanej, a następnie przenieś do przygotowanej kolby zawierającej świeżą pożywkę do transfekcji. Zakręć korek w wentylowanej kolbie do hodowli komórek i inkubuj ją w inkubatorze z wytrząsarką od 15 minut do jednej godziny w czasie inkubacji komórek.Rozcieńczyć zapasy DNA plazmidowego oraz POLIETEROAMINY lub PEI w świeżej pożywce hodowlanej do stężenia końcowego 0,5 µg/µL. Wyjąć z inkubatora z wytrząsarką kolbę hodowlaną z zawiesiną komórek, przenieść ją do komory z laminarnym przepływem powietrza i za pomocą mikropipety dodać do hodowli 300 µL DNA plazmidowego, a następnie wymieszać przez delikatne potrząsanie ręczne. Następnie dodać do hodowli 900 µL PEI i ponownie wymieszać. Na koniec dodać 3,8 mL świeżej pożywki hodowlanej.Przenieś kolbę do inkubatora z wytrząsarką na 24 godziny. 24 godziny po transfekcji należy rozcieńczyć hodowlę komórkową. Aby przygotować medium do rozcieńczania, należy najpierw za pomocą sterylnej pipety serologicznej o pojemności 1 ml pobrać 1 ml PODGRZANEGO 220 mM kwasu walproinowego (VPA) i przenieść go do sterylnej probówki o pojemności 50 ml.Następnie, używając sterylnej pipety serologicznej, dodaj pięć mililitrów podgrzanego medium B oraz 44 mililitrów podgrzanego medium A do roztworu VPA. W rezultacie otrzymamy 50 mililitrów świeżego medium hodowlanego o końcowym stężeniu VPA wynoszącym 4,4 millimolar. Wyjmij transfektowaną hodowlę z inkubatora.Zdezynfekuj zewnętrzną powierzchnię kolby i umieść ją w komorze z laminarnym przepływem powietrza. Dodaj przygotowane medium rozcieńczające do hodowli. Przenieś kolbę z powrotem do inkubatora z wytrząsarką na kolejne cztery do pięciu dni po transfekcji.Codziennie monitoruj żywotność komórek zgodnie z procedurą przedstawioną wcześniej. Należy również codziennie pobierać i przechowywać alikwoty do analizy ekspresji białek, pięć do sześciu dni po transfekcji lub w przypadku spadku żywotności komórek poniżej 50%. Zbierz komórki, odwirowując je wraz z pożywką przy 1000 ×g przez pięć minut. Zbierz nadsącz zawierający wydzielone białko, a do osadu komórek HEK dodaj pięć mililitrów 10% roztworu wybielacza i zutylizuj jako odpad biologiczny.Następnie białko jest oczyszczane z zebranego supernatantu. Ten system ekspresyjny pozwolił na uzyskanie wysokiej wydajności białek glikozylowanych, co ilustruje typowy wzór ekspresji IgG1 fc po przejściowej transfekcji komórek HK 293 F. Oczyszczanie powinowactwa z wykorzystaniem kolumny białkowej do IgG1 FC lub kolumny niklowej do GFP z tagiem histydynowym z receptorem FC gamma 3A pozwoliło na uzyskanie białek o wysokiej czystości.Układ ten efektywnie wyrażał izotopowo wzbogacone IgG one FC w tym dwuwymiarowym widmie NMR, które koreluje częstotliwość rezonansową jąder wodoru i bezpośrednio związanych z nimi atomów azotu amidowego. Zaobserwowano dobrze rozproszone sygnały 15 atomów. Różne formy glikozylowane zostały wytworzone przy użyciu komórek HEK 2 93 F oraz HEK 2 93 s w różnych warunkach hodowli, co wykazały analizy metodą spektrometrii mas z desorpcją laserową wspomaganą macierzą.IgG1 FC eksprymowane z komórek HEK 293S posiadało glikany w formie z pięcioma resztami mannozy i dwiema resztami N-acetyloglukozaminy, które nie zawierały fukozy; glikany z materiału eksprymowanego z HEK 293F były formami biantenowymi typu złożonego z rdzeniową fukozą i w większości posiadały terminalną N-acetyloglukozaminę lub niewielką proporcję form mono- lub dilatowanych. Dodanie inhibitora glikozylacji do ekspresji przeprowadzonej z użyciem komórek HEK 293F wykazało ponad 90% redukcję wbudowywania fukozy. Po opanowaniu techniki, ustanowienie transfekcji przejściowej może zostać zrealizowane w 1,5 godziny pierwszego dnia i w 15 minut drugiego dnia. Po okresie ekspresji trwającym od czterech do sześciu dni, roztwór zawierający białko można zebrać w ciągu 15 minut.Ostatecznie oczyszczanie białka zajmie około 1,5 godziny. Podczas przeprowadzania tej procedury należy pamiętać o utrzymaniu stabilnej hodowli przed transfekcją, transfekowaniu aktywnie rosnących komórek oraz dodawaniu DNA przed dodaniem PEI. Po zastosowaniu tej procedury można przeprowadzić inne metody, takie jak funkcjonalna charakterystyka białek z wykorzystaniem szeregu technik biofizycznych, w celu zbadania struktury i funkcji wyekspresowanej glikoproteiny po jej otrzymaniu.Technika ta utorowała drogę badaczom w dziedzinie immunologii do badania związku między strukturą a aktywnością IgG i glikozylacją in vitro oraz in vivo. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać gruntowną wiedzę na temat przygotowywania i oczyszczania glikoprotein przy użyciu naszej kombinacji komórek K 2 93 F oraz wektora PZ N two.

high-yield-expression-recombinant-human-proteins-with-transient

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Niezawodna metoda wysokowydajnej ekspresji in vitro i następującego po niej zapisu elektrofizjologicznego rekombinowanych napięciowo zależnych kanałów jonowych w hodowlach ludzkich komórek embrionalnej nerki (HEK-293T).

Zoptymalizowana strategia transfekcji dla ekspresji i rejestracji elektrofizjologicznej rekombinowanych napięciowo zależnych kanałów jonowych w komórkach HEK-293T

W erze genomiki post-humanistycznej dostępność białek rekombinowanych w natywnych konformacjach jest kluczowa dla badań i rozwoju w obszarze strukturalnym, funkcjonalnym oraz terapeutycznym. W niniejszej pracy opisujemy system ekspresji białek w skali testowej i przemysłowej z wykorzystaniem ludzkich komórek embrionalnej nerki 293T, który może być stosowany do produkcji różnorodnych białek rekombinowanych.

Wygodna i uniwersalna platforma ekspresyjna do produkcji białek wydzielanych z komórek ludzkich

Film demonstruje metodę wytwarzania przeciwciał terapeutycznych przy użyciu stabilnie transfekowanych komórek ssaków. Suplementacja tryptonem stymuluje podział komórek, powodując przerost i wspierając wyższą wydajność przeciwciał. Pożywka zawierająca przeciwciała jest zbierana, filtrowana i przechowywana do dalszego wykorzystania.

Wytwarzanie przeciwciał z okresowej hodowli przerostu transfekowanych komórek ssaków

Ekspresja białek rekombinowanych przez systemy ssaków staje się atrakcyjną metodą wytwarzania kompleksów białkowych dla biologii strukturalnej. W tym artykule przedstawiamy prosty, ale bardzo wydajny system ekspresji wykorzystujący hodowane w zawiesinie komórki ssaków do oczyszczania kompleksów białkowych do badań strukturalnych.

Ekspresja białek rekombinowanych w biologii strukturalnej w komórkach zawiesinowych HEK 293F: nowatorskie i dostępne podejście

Opisujemy tutaj opłacalny system ekspresji granzymu wykorzystujący komórki HEK293T, który daje wysokie plony czystej, w pełni glikozylowanej i enzymatycznie aktywnej proteazy.

Wysokowydajny i ekonomiczny system ekspresji ludzkich granzymów w komórkach ssaków

To jest szybki, efektywny kosztowo protokół produkcji wydzielanych, glikozylowanych białek ssaków i późniejszego jednoetapowego oczyszczania z wystarczającą wydajnością jednorodnego białka do krystalografii rentgenowskiej i innych badań biofizycznych.

Wydajna ekspresja komórek ssaków i jednoetapowe oczyszczanie zewnątrzkomórkowych glikoprotein do krystalizacji

Ten protokół opisuje produkcję przeciwciała terapeutycznego w systemie ekspresji ssaków. Opisane metody obejmują przygotowanie DNA wektora, stabilną transfekcję i adaptację ludzkiej linii komórkowej 293 zarodka nerki bez surowicy, stworzenie kultur na dużą skalę i oczyszczanie za pomocą chromatografii powinowactwa.

Produkcja i oczyszczanie przeciwciała terapeutycznego na skalę laboratoryjną

Badanie kanałów jonowych za pomocą heterologicznie wyrażającego systemu stało się podstawową techniką w badaniach biomedycznych. W tym manuskrypcie przedstawiamy efektywną czasowo metodę osiągania ściśle kontrolowanej ekspresji kanału jonowego poprzez przeprowadzanie transfekcji przejściowej pod kontrolą indukowalnego promotora.

Kontrolowana ekspresja kanału jonowego poprzez indukowalną transfekcję przejściową

Nielityczne systemy ekspresji komórek owadów są niedostatecznie wykorzystywane do produkcji, transportu/lokalizacji komórkowej i analizy funkcjonalnej białek rekombinowanych. W tym miejscu opisujemy metody generowania wektorów ekspresyjnych i późniejszej przejściowej ekspresji białek w dostępnych na rynku liniach komórkowych lepidoptera. Przedstawiono również kolokalizację akwaporyn Bemisia tabaci z subkomórkowymi białkami markerowymi fluorescencyjnymi.

Przejściowa ekspresja i lokalizacja komórkowa rekombinowanych białek w hodowanych komórkach owadów

Zapewniamy skalowalne protokoły obejmujące projektowanie konstrukcji, transfekcję przejściową oraz ekspresję i oczyszczanie pełnowymiarowych wariantów ludzkiego białka huntingtyny w komórkach HEK293.

Wydajna i skalowalna produkcja pełnowymiarowych wariantów ludzkiej huntingtyny w komórkach ssaków przy użyciu systemu ekspresji przejściowej

Tutaj prezentowany jest protokół produkcji zawiesiny HEK293 oparty na komórkach AAV, co skutkuje zmniejszeniem czasu i pracy potrzebnej do produkcji wektorów przy użyciu komponentów, które są dostępne do celów badawczych od komercyjnych dostawców.

Produkcja wysokowydajnych partii wektorów związanych z adeno przy użyciu komórek zawiesinowych HEK293

Poznaj metodę ekspresji rekombinowanych glikoprotein ludzkich w komórkach HEK293 z zastosowaniem ścieżek sekretorycznych ER i Golgi. Ta technika umożliwia badanie struktury przeciwciał i aktywacji immunologicznej.

Wysoka ekspresja rekombinowanych białek ludzkich z przejściową transfekcją komórek HEK293 w zawiesinie

Przeglądaj więcej filmów