Wysoka ekspresja rekombinowanych białek ludzkich z przejściową transfekcją komórek HEK293 w zawiesinie

Ogólnym celem niniejszej procedury jest ekspresja ssaczych glikoprotein z odpowiednią glikozylacją ssaczą poprzez kierowanie białek rekombinowanych do retikulum endoplazmatycznego (ER) i zależnej od GOGI ścieżki wydzielniczej. Metoda ta może pomóc w udzieleniu odpowiedzi na kluczowe pytania z zakresu immunologii, takie jak rola konkretnej specyfikacji, wzorce w strukturze oraz potencjał aktywacji immunologicznej przeciwciał i fragmentów przeciwciał. Główną zaletą tej techniki jest wykorzystanie ludzkich komórek do ekspresji ludzkich białek, co zapewnia odpowiednie środowisko komórkowe do prawidłowego fałdowania i modyfikacji białek docelowych.

Inkubator z wytrząsarką do namnażania komórek powinien pracować z prędkością 135 RPM, przy wilgotności 80%, stężeniu dwutlenku węgla 8% i temperaturze 37 stopni Celsjusza przez co najmniej jedną godzinę przed inokulacją hodowli. Włączyć lampę UV w komorze z laminarnym przepływem powietrza i podgrzać szczelnie zamknięte butelki z medium A oraz medium B w łaźni wodnej o temperaturze 37 stopni Celsjusza. Wyłączyć lampy UV i zdezynfekować komorę z laminarnym przepływem powietrza roztworem 70% etanolu w wodzie.

Zdezynfekuj 125 ml kolbę Erlenmeyera z wentylowaną zakrętką, pipety, pipetory oraz podgrzane wcześniej butelki z pożywką, spryskując je 70% roztworem etanolu w wodzie. Umieść te przedmioty w komorze z laminarnym przepływem powietrza na czas trwania całej procedury. Wszystkie elementy muszą zostać zdezynfekowane w ten sposób przed wprowadzeniem ich do komory z laminarnym przepływem powietrza.

Przygotować świeżą pożywkę dla hodowli o objętości 30 ml, pobierając 26 ml pożywki A oraz trzy ml pożywki B i przenosząc je do kolby Erlenmeyera o pojemności 125 ml. Wymieszać poprzez delikatne potrząsanie. Fiolkę z komórkami HEK 293 F, wcześniej zamrożoną w temperaturze -80 °C, ogrzać w kąpieli wodnej o temperaturze 37 °C, aby częściowo rozmrozić komórki. Czynność ta trwa około jednej minuty; komórki nie powinny zostać całkowicie rozmrożone.

Następnie wysterylizuj zewnętrzną stronę fiolki roztworem 70% etanolu w wodzie i przenieś ją do komory z laminarnym przepływem powietrza. Za pomocą pipety o pojemności 1 ml pobierz zawiesinę komórkową i przenieś ją do kolby Erlenmeyera o pojemności 125 ml zawierającej 29 ml świeżej pożywki hodowlanej. Zamknij kolbę hodowlaną i umieść ją w inkubatorze z wytrząsarką na 24 godziny.

24 godziny po zaszczepieniu hodowli. Należy sprawdzić gęstość komórek, wysterylizować kolbę z hodowlą roztworem 70% etanolu i wody, a następnie przenieść ją do komory z laminarnym przepływem powietrza. Za pomocą pipety 1 ml i dozownika powoli pobrać 100 µL hodowli i przenieść ją do sterylnej probówki typu einor o pojemności 0,5 ml.

Zamknąć pokrywę kolby hodowlanej i jak najszybciej przenieść ją z powrotem do inkubatora z wytrząsarką. Wymieszać 7,5 µL roztworu trypan blue z 7,5 µL zawiesiny komórek. Wymieszać energicznie, a następnie przenieść 7,5 µL mieszaniny na szkiełko do liczenia.

Włącz automatyczny licznik komórek i umieść slajd do liczenia w komorze załadowczej. Automatyczny czytnik zostanie aktywowany, a komórki zostaną policzone automatycznie w jednostkach liczby komórek na mililitr oraz procentu żywotności. Oblicz objętość kultury donora niezbędną do przeniesienia do świeżej pożywki w celu uzyskania gęstości komórek na poziomie 300 000 żywych komórek na mililitr.

Przygotuj świeżą pożywkę hodowlaną zgodnie z wcześniejszym opisem, przenosząc 23 mililitrów pożywki A oraz trzy mililitry pożywki B do świeżej kolby hodowlanej o pojemności 125 mililitrów. Następnie wyjmij butelki zapasowe pożywki A i pożywki B z komory laminarnej, aby zmniejszyć ryzyko ich zanieczyszczenia. Wyjmij kolbę z hodowlą komórek HEK 2 93 F z inkubatora.

Spryskać to roztworem 70% etanolu i wody, a następnie umieścić w komorze z laminarnym przepływem powietrza. Używając nowej pipety, pobrać odpowiednią alikwot komórek z hodowli i przenieść go do kolby zawierającej świeże pożywkę hodowlaną. Przenieść obie hodowle z komory z laminarnym przepływem powietrza do inkubatora z wytrząsarką.

Przed transfekcją należy hodować komórki do przybliżonej gęstości od 2 do 3 milionów żywych komórek na mililitr. Należy sprawdzić gęstość komórek zgodnie z wcześniejszą instrukcją i określić liczbę komórek do transfekcji. Należy użyć sterylnej pipety serologicznej.

Przenieś odpowiednią objętość zawiesiny komórkowej do probówki wirówkowej o pojemności 250 ml. Zbierz komórki poprzez wirowanie przy 100 ×g przez pięć minut. Po sterylizacji przenieś probówkę z osadem komórkowym do komory bezpieczeństwa biologicznego.

Za pomocą sterylnej pipety odlej nadsącz consisting of zużytej pożywki hodowlanej. Energicznie resuspenduj osad komórkowy, pipetując go w górę i w dół w 10 milliliters świeżej pożywki hodowlanej, a następnie przenieś do przygotowanej kolby zawierającej świeżą pożywkę do transfekcji. Zakręć korek w wentylowanej kolbie do hodowli komórek i inkubuj ją w inkubatorze z wytrząsarką od 15 minut do jednej godziny w czasie inkubacji komórek.

Rozcieńczyć zapasy DNA plazmidowego oraz POLIETEROAMINY lub PEI w świeżej pożywce hodowlanej do stężenia końcowego 0,5 µg/µL. Wyjąć z inkubatora z wytrząsarką kolbę hodowlaną z zawiesiną komórek, przenieść ją do komory z laminarnym przepływem powietrza i za pomocą mikropipety dodać do hodowli 300 µL DNA plazmidowego, a następnie wymieszać przez delikatne potrząsanie ręczne. Następnie dodać do hodowli 900 µL PEI i ponownie wymieszać. Na koniec dodać 3,8 mL świeżej pożywki hodowlanej.

Przenieś kolbę do inkubatora z wytrząsarką na 24 godziny. 24 godziny po transfekcji należy rozcieńczyć hodowlę komórkową. Aby przygotować medium do rozcieńczania, należy najpierw za pomocą sterylnej pipety serologicznej o pojemności 1 ml pobrać 1 ml PODGRZANEGO 220 mM kwasu walproinowego (VPA) i przenieść go do sterylnej probówki o pojemności 50 ml.

Następnie, używając sterylnej pipety serologicznej, dodaj pięć mililitrów podgrzanego medium B oraz 44 mililitrów podgrzanego medium A do roztworu VPA. W rezultacie otrzymamy 50 mililitrów świeżego medium hodowlanego o końcowym stężeniu VPA wynoszącym 4,4 millimolar. Wyjmij transfektowaną hodowlę z inkubatora.

Zdezynfekuj zewnętrzną powierzchnię kolby i umieść ją w komorze z laminarnym przepływem powietrza. Dodaj przygotowane medium rozcieńczające do hodowli. Przenieś kolbę z powrotem do inkubatora z wytrząsarką na kolejne cztery do pięciu dni po transfekcji.

Codziennie monitoruj żywotność komórek zgodnie z procedurą przedstawioną wcześniej. Należy również codziennie pobierać i przechowywać alikwoty do analizy ekspresji białek, pięć do sześciu dni po transfekcji lub w przypadku spadku żywotności komórek poniżej 50%. Zbierz komórki, odwirowując je wraz z pożywką przy 1000 ×g przez pięć minut. Zbierz nadsącz zawierający wydzielone białko, a do osadu komórek HEK dodaj pięć mililitrów 10% roztworu wybielacza i zutylizuj jako odpad biologiczny.

Następnie białko jest oczyszczane z zebranego supernatantu. Ten system ekspresyjny pozwolił na uzyskanie wysokiej wydajności białek glikozylowanych, co ilustruje typowy wzór ekspresji IgG1 fc po przejściowej transfekcji komórek HK 293 F. Oczyszczanie powinowactwa z wykorzystaniem kolumny białkowej do IgG1 FC lub kolumny niklowej do GFP z tagiem histydynowym z receptorem FC gamma 3A pozwoliło na uzyskanie białek o wysokiej czystości.

Układ ten efektywnie wyrażał izotopowo wzbogacone IgG one FC w tym dwuwymiarowym widmie NMR, które koreluje częstotliwość rezonansową jąder wodoru i bezpośrednio związanych z nimi atomów azotu amidowego. Zaobserwowano dobrze rozproszone sygnały 15 atomów. Różne formy glikozylowane zostały wytworzone przy użyciu komórek HEK 2 93 F oraz HEK 2 93 s w różnych warunkach hodowli, co wykazały analizy metodą spektrometrii mas z desorpcją laserową wspomaganą macierzą.

IgG1 FC eksprymowane z komórek HEK 293S posiadało glikany w formie z pięcioma resztami mannozy i dwiema resztami N-acetyloglukozaminy, które nie zawierały fukozy; glikany z materiału eksprymowanego z HEK 293F były formami biantenowymi typu złożonego z rdzeniową fukozą i w większości posiadały terminalną N-acetyloglukozaminę lub niewielką proporcję form mono- lub dilatowanych. Dodanie inhibitora glikozylacji do ekspresji przeprowadzonej z użyciem komórek HEK 293F wykazało ponad 90% redukcję wbudowywania fukozy. Po opanowaniu techniki, ustanowienie transfekcji przejściowej może zostać zrealizowane w 1,5 godziny pierwszego dnia i w 15 minut drugiego dnia. Po okresie ekspresji trwającym od czterech do sześciu dni, roztwór zawierający białko można zebrać w ciągu 15 minut.

Ostatecznie oczyszczanie białka zajmie około 1,5 godziny. Podczas przeprowadzania tej procedury należy pamiętać o utrzymaniu stabilnej hodowli przed transfekcją, transfekowaniu aktywnie rosnących komórek oraz dodawaniu DNA przed dodaniem PEI. Po zastosowaniu tej procedury można przeprowadzić inne metody, takie jak funkcjonalna charakterystyka białek z wykorzystaniem szeregu technik biofizycznych, w celu zbadania struktury i funkcji wyekspresowanej glikoproteiny po jej otrzymaniu.

Technika ta utorowała drogę badaczom w dziedzinie immunologii do badania związku między strukturą a aktywnością IgG i glikozylacją in vitro oraz in vivo. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać gruntowną wiedzę na temat przygotowywania i oczyszczania glikoprotein przy użyciu naszej kombinacji komórek K 2 93 F oraz wektora PZ N two.