Zoptymalizowany protokół skutecznej transfekcji komórek dendrytycznych bez dojrzewania komórek

Ogólnym celem tej procedury jest obniżenie ekspresji docelowego genu w DCS poprzez transfekcję SI RNA. Osiąga się to poprzez pierwsze zaprogramowanie efektora AM Maxin Nucleo. Drugim etapem procedury jest zmieszanie ze sobą DCS i siRNA i pipetowanie otrzymanego roztworu komórkowego do modułów Nucleo QVE.

Trzecim krokiem procedury jest umieszczenie płytki w tacce wahadłowej amaxa, aby rozpocząć proces transfekcji. Ostatnim etapem zabiegu jest zakażenie komórek wirusem w celu aktywacji odpowiedzi interferonowej. Ostatecznie można uzyskać wyniki, które wskazują na knockdown genów poprzez ilościowe R-T-P-C-R i Western blot.

Technika ta jest cenna dla scharakteryzowania szlaków sygnałowych w komórkach dendretycznych, a także może przyczynić się do opracowania terapii immunologicznych opartych na komórkach dendretycznych. Aby zaprogramować czynnik nukleo wahadłowy Maxon 96 do transfekcji prądu stałego, otwórz nowy plik parametrów. Wybierz liczbę studzienek, które będą używane do standardowej transfekcji, przeciągając kursor na schemat płytki 96-dołkowej.

Użyć co najmniej trzech studzienek do puli dla każdej próbki doświadczalnej. Teraz wprowadź kod programu w części pierwszej, wybierz F, F i i część drugą, wybierz 1 68 z menu rozwijanych. Następnie z pola rozwiązania wybierz monocyt człowiek następnie w opcji kontrolnej wybierz standard, a następnie kliknij Zastosuj.

Aby uwzględnić kontrolę bez transfekcji, wymagane jest wybranie dodatkowych studzienek ze schematu. Następnie z opcji sterowania wybierz brak kontroli programu i ponownie kliknij zastosuj. Po wymieszaniu roztworu uczucia nucleo pozwól mu ogrzać się do temperatury pokojowej.

Umieść potrzebną liczbę modułów nucleo vete na płytce nucleo VETE we właściwej orientacji, jak pokazano tutaj, wkładając pierwszy z nich do róży pierwszej i drugiej, a następnie tak dalej dla wszystkich następnych probówek. Przenieść wystarczającą ilość DCS z kolby do hodowli komórkowej do probówki o pojemności 50 mililitrów, aby uzyskać 500 000 komórek na studzienkę do transfekcji, odwirować komórki przez 10 minut w temperaturze 400 G w temperaturze czterech stopni Celsjusza, a następnie ostrożnie usunąć supernatant. Następnie dodaj roztwór jądrowy do probówki, a następnie ponownie zawieś DCS, delikatnie pipetując kilka razy w górę iw dół.

Teraz oznacz probówki DPH zgodnie z konkretnym zabiegiem, który ma być wykonany, a następnie podziel zawieszone komórki na oznakowane probówki. Dodać SI RNA w końcowym stężeniu 0,25 mikrograma na 500 000 komórek do odpowiednich probówek epi endorf, a następnie wymieszać zawiesiny komórek przez pipetowanie. Użyj niedocelowego SI RNA dla próbki kontrolnej bez transfekcji.

Następnie odpipetować 20 mikrolitrów zawiesiny komórek SI RA DC do modułów nucleo vete zgodnie z wcześniej zaprogramowanym układem eksperymentalnym, upewniając się, że płyn jest dostarczany na dno studzienki, przykryj płytkę nucleo vete pokrywką i kilkakrotnie postukaj płytką o twardą powierzchnię, aby ułatwić usunięcie pęcherzyków powietrza w celu transfekcji prądu stałego. Włóż przygotowaną płytkę nucleo Yvette do tacki wahadłowej nucleo effector 96 dołków. Następnie kliknij przycisk przesyłania i uruchamiania.

Śledź postęp procesu transfekcji na wyświetlaczu. krzyżyk na zielonym tle oznacza udaną transfekcję w tej studni, podczas gdy pasek na czerwonym tle oznacza, że nie powiodła się, gdy komórki są transfekowane. Wstępnie podgrzana pożywka wzrostowa DC Po zakończeniu procesu transfekcji usuń płytkę i dodaj 80 mikrolitrów wstępnie podgrzanej pożywki wzrostowej DC do każdej studzienki.

Używając pipety wielokanałowej, inkubuj płytkę przez 10 minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% CO2. W okresie inkubacji dodać 100 mikrolitrów wstępnie podgrzanej pożywki wzrostowej prądu stałego do probówek matrycowych w tej samej orientacji, w jakiej ustawiono płytkę kuwety nukleo. Po okresie inkubacji przenieś wszystkie 100 mikrolitrów zawiesin komórkowych z CVE jądra do wstępnie ustawionych probówek matrycowych.

Następnie usuń i wyrzuć te rurki, w których transfekcja nie nastąpiła. Na koniec inkubuj probówki matrycowe przez 24 godziny lub w innym pożądanym przedziale czasu. Oznaczyć probówki einor dla każdej z probówek z matrycą inkubacyjną.

Następnie przenieś probówki matrycowe z inkubatora do okapu do hodowli komórkowych i połącz probówki matrycowe dla każdej próbki doświadczalnej we wstępnie znakowanych eend dfs. Następnie delikatnie granuluj komórki, obracając końcowe probówki DPH w wirówce stołkowej przez 10 minut. W stężeniu 400 G usunąć snat i ponownie zawiesić komórki w pożywce wzrostowej wolnej od surowicy zawierającej wirusa rzekomego pomoru drobiu lub NDV przy MOI równym jednym luźno.

Przykryj endorfiny epi w sterylny sposób, a następnie inkubuj probówki przez 45 minut. Po tym okresie inkubacji dodaj 900 mikrolitrów pożywki wzrostowej DC i ponownie inkubuj probówki przez kolejne osiem do 10 godzin. Aby zebrać transfekowane i zakażone dcs.

Osadzanie komórek poprzez obracanie probówek einor w wirówce stołkowej, jak poprzednio, i usuwanie monocytów snat, dcs transfekowano albo IRNA ukierunkowanym na RIG I, albo niespecyficznym irna świecącym i zakażono NDV, jak wskazano znakiem plus lub pozostało niezakażone, jak wskazano znakiem minus, wykrytym przez ilościowy R-T-P-C-R-A knockdown R RGA o 75%Na poziomie transkrypcji zaobserwowano podobne zmniejszenie ekspresji interferon beta. Zaobserwowano również efektor RGA w kaskadzie sygnalizacji interferonu. Co więcej, ekspresja interferonu beta w niezakażonych komórkach transfekowanych z grupy kontrolnej nie była wykrywalna.

Podczas gdy gen odpowiedzi MXA i interferonu beta był minimalny. Tu. W tym eksperymencie pokazano dane z drugiej transfekcji DCS z rigi ukierunkowanym na irna, wykonanej jak na poprzednim rysunku. Jednak wszystkie komórki są zakażone NDV i włączono dodatkową kontrolę przy użyciu niewyciętego monocytu DCS.

Wyniki wyciszania genów były podobne do tych zaobserwowanych na poprzednim rysunku. Western blot badany pod kątem RGA ujawnił, że ekspresja białka tego genu została całkowicie zablokowana. Pasy pierwszy i drugi pokazują dane dotyczące lizatów z niewyciętych komórek.

Pasy trzeci i czwarty pokazują lizaty z komórek transfekowanych świecącym irnem, a pasy piąty i szósty pokazują lizaty z komórek transfekowanych RIG I ukierunkowanym na S Irna Po opanowaniu tej techniki można wykonać w ciągu jednej godziny, włączając w to obalenie wielu genów jednocześnie.