Name: Zoptymalizowany protokół skutecznej transfekcji komórek dendrytycznych bez dojrzewania komórek (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-07-08T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 8 s
Description: Poznaj zoptymalizowany protokół transfekcji komórek dendrytycznych człowieka przy użyciu nukleofekcji z siRNA bez indukowania dojrzewania. Metoda umożliwia skuteczne wyciszanie genów, np. RIG-I, w badaniach immunologicznych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Projekt był wspierany przez NIH NIAID w ramach kontraktu nr HHSN2662000500021C. Dziękujemy Ming Chen za pomoc techniczną.

1. Zaprogramowanie Nucleofektora Amaxa 96 well shuttle
<ol>
 <li>Otwórz nowy plik parametrów.</li>
 <li>Wybierz liczbę studzienek, których będziesz używać do standardowej transfekcji, przeciągając kursor po schemacie płytki 96-dołkowej. Użyj minimum 3 studzienek do złączenia dla każdej próbki eksperymentalnej.</li>
 <li>Wprowadź kod programu: w części part1 wybierz „FF”, a w części part2 wybierz „168” z menu rozwijanych.</li>
 <li>Z pola Solution wybierz „Monocyte, human”.</li>
 <li>W sekcji Control Option wybierz „standard”.</li>
 <li>Kliknij Apply.</li>
 <li>Aby uwzględnić kontrolę bez transfekcji, zaznacz na schemacie dodatkowe studzienki zgodnie z potrzebami, następnie w sekcji Control Option wybierz „No Program Control” i kliknij Apply.</li>
 <li>Zaznacz pozostałe nieużywane studzienki na schemacie płytki i kliknij Undefine.</li>
</ol>
2. Przygotowanie komórek DC do transfekcji
<ol>
 <li>Wszystkie prace należy w miarę możliwości prowadzić w warunkach sterylnych, w komorze do hodowli komórek. Przygotować roztwór do nukleofekcji, dodając suplement do płytek 96-dołkowych do roztworu Human Monocyte 96-well Nucleofector Solution w stosunku 450 do 2025. Wymieszać i pozostawić do ogrzania do temperatury pokojowej. Na każdy dołek wymagane będzie 20μl roztworu do nukleofekcji. Przygotować nadwyżkę w ilości 10%, aby zrekompensować błędy pipetowania.</li>
 <li>Umieścić wymaganą liczbę modułów nukleokuwet w płytce do nukleokuwet w odpowiedniej orientacji, np. wkładając pierwszy moduł do rzędów 1 i 2.</li>
 <li>Określić liczbę komórek DC potrzebną do eksperymentu, przyjmując 50,0 komórek na dołek, a następnie osadzić je poprzez wirowanie przy 400g przez 10min. Ostrożnie usunąć nadsącz.</li>
 <li>Resuspendować komórki w roztworze do nukleofekcji, delikatnie pipetując w górę i w dół kilka razy.</li>
 <li>Podzielić odpowiednią objętość resuspendowanych komórek do probówek typu eppendorf oznakowanych dla konkretnejy obróbki, np. GLO i RIG-I.</li>
 <li>Dodać 0.25μg siRNA na 500,0 komórek i wymieszać za pomocą pipety. W próbce kontrolnej bez transfekcji należy zastosować niecelowane siRNA.</li>
 <li>Nanieść pipetą 20μl powyższych mieszanin do modułów nukleokuwet zgodnie z układem doświadczalnym, upewniając się, że ciecz dotarła do dna dołka.</li>
 <li>Przykryć płytkę do nukleokuwet pokrywą i kilka razy stuknąć płytką o twardą powierzchnię, aby pomóc w usunięciu pęcherzyków powietrza.</li>
</ol>
3. Transfekcja komórek DC
<ol>
 <li>Włóż płytkę do tacy transportowej Nucleofector 96-well, kliknij Upload, a następnie start.</li>
 <li>Śledź postępy procesu transfekcji na wyświetlaczu laptopa; czarny krzyżyk na zielonym tle oznacza udaną transfekcję w danej studzce, natomiast czarny pasek na czerwonym tle oznacza niepowodzenie.</li>
 <li>Po zakończeniu procesu transfekcji wyjmij płytkę i dodaj 80μl pożywki wzrostowej DC do każdej studzki za pomocą pipety wielokanałowej.</li>
 <li>Inkubuj płytkę przez 10 min w temperaturze 37°C i 5% CO2.</li>
 <li>Przenieś objętość 10μl z nukleokuwet do probówek matrycowych zawierających 10μl uprzednio ogrzanej pożywki wzrostowej DC, zachowując prawidłową orientację.</li>
 <li>Usuń i zutylizuj probówki, w których nie doszło do transfekcji.</li>
 <li>Inkubuj w temperaturze 37°C i 5% CO2 przez 24h lub inny wybrany odstęp czasu.</li>
</ol>
4. Zakażanie komórek wirusem NDV
<ol>
 <li>Przenieść probówki matrycowe z inkubatora do dygestorium do hodowli komórkowych i połączyć probówki dla każdej próbki eksperymentalnej w probówkach typu Eppendorf</li>
 <li>Gently odwirować komórki w wirówce laboratoryjnej przez 5 min, a następnie usunąć supernatant.</li>
 <li>Resuspendować komórki w bezzbełkowym medium wzrostowym zawierającym NDV przy MOI wynoszącym 1 i inkubować w temperaturze 37°C i 5% CO2 przez 45 min, przy lekko przykrytych w sposób sterylny probówkach Eppendorf.</li>
 <li>Dodać 90μl medium wzrostowego DC i ponownie inkubować przez 8-10 h.</li>
</ol>
5. Zbiór komórek
<ol>
 <li>Odwirować komórki w wirówce stołowej, aby uzyskać osad, a następnie usunąć nadsącz.</li>
 <li>Zebrać komórki do ekstrakcji RNA lub białka zgodnie z zastosowanym protokołem.</li>
</ol>
6. Reprezentatywne wyniki:
Korzystając z naszego zoptymalizowanego protokołu, przeprowadziliśmy transfekcję komórek DC siRNA celującym w RIGI przez 24 h, a następnie zainfekowaliśmy komórki wirusem NDV (paramyksowirusem wykrywanym przez RIG-I), aby pobudzić szlak odpowiedzi interferonowej. Za pomocą analizy qRT-PCR wykazaliśmy obniżenie ekspresji genu o 75% na poziomie transkrypcji. Zaobserwowaliśmy również podobną redukcję ekspresji IFNβ, który jest efektorem downstream RIG-I w kaskadzie sygnalizacyjnej IFN. Ponadto stwierdzono, że ekspresja IFNβ w niezinfekowanych komórkach z transfekcją kontrolną była niewykrywalna, natomiast ekspresja MxA, genu odpowiedzi downstream IFNβ, była minimalna (Rysunek 1A). 
Drugą transfekcję komórek DC za pomocą siRNA celującego w RIGI przeprowadzono przy użyciu wystarczającej liczby komórek, aby umożliwić analizę Western blot. Podczas gdy wyniki RT-PCR były zbliżone do wcześniej zaobserwowanych (odpowiednio 62% i 6% wyciszenia ekspresji RIG-I oraz IFNβ) (Rycina 1B), analiza Western blot w kierunku RIG-I wykazała, że ekspresja tego genu została całkowicie zablokowana (Rycina 1C).
<img src="/files/ftp_upload/2766/2766fig1.jpg" alt="Analiza ekspresji genów, wykresy słupkowe przedstawiające liczbę kopii RIG-I, IFNβ i MxA oraz wyniki western blotu." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 1A"> Rysunek 1. (A) mMoDC poddano transfekcji albo siRNA celującym w RIG-I, albo nieswoistym siRNA GLO, a następnie zbadano wpływ tych zabiegów na ekspresję RIG-I, IFNβ i MxA wyznaczono za pomocą qRT-PCR. Protokół transfekcji wykorzystywał bufor specyficzny dla monocytów oraz program nukleoporacji FF168 (Lonza Walkersville Inc.). Po 24-godzinnej inkubacji transfektowane komórki zostały zainfekowane NDV (+) lub pozostawiono niezinfekowane (-). Po kolejnej 10-godzinnej inkubacji komórki zebrano i wyekstrahowano RNA. Poziomy transkrypcji stanowią wyniki dwóch powtórzonych eksperymentów. Źródło: Bowles i in. 16. 
(B) MoDCs uzyskane z innego buffy coat niż ten użyty do ryciny 1A ponownie poddano transfekcji za pomocą siRNA skierowanego przeciwko RIG-I lub niespecyficznego siRNA GLO, stosując ten sam protokół transfekcji co powyżej. Do eksperymentu włączono dodatkową kontrolę z użyciem nietransfekowanych MoDCs. Po 24-godzinnej inkubacji wszystkie komórki zainfekowano wirusem NDV i inkubowano przez kolejne 10 godzin przed ich zebraniem w celu ekstrakcji RNA i białek. Poziomy transkrypcji RIG-I, IFNβ i MxA wyznaczone za pomocą qRT-PCR przedstawiają wyniki dwóch powtórzonych eksperymentów. Zaczerpnięto z Bowles i wsp. 16.
(C) Lizaty komórek opisanych powyżej na rysunku 1B przeanalizowano metodą Western blot. Ścieżki 1 i 2: lizaty z komórek nieprzetransfekowanych; ścieżki 3 i 4: lizaty z komórek przetransfekowanych siRNA przeciwko GLO; ścieżki 5 i 6: lizaty z komórek przetransfekowanych siRNA skierowanym przeciwko RIG-I. Próbki poddano detekcji w kierunku RIG-I oraz GAPDH (jako kontroli ładowania); analizę przeprowadzono w duplikacie. Źródło: Bowles i wsp. 16.

<ol><li>Reis e Sousa, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+of+dendritic+cells%3A+translating+innate+into+adaptive+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Activation of dendritic cells: translating innate into adaptive immunity.</a> Curr. Opin. Immunol. 16, 21-25 (2004).</li>
<li>Bancherau, J., Steinman, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dendritic+cells+and+the+control+of+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Dendritic cells and the control of immunity.</a> Nature. 392, 245-252 (1998).</li>
<li>Clark, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+dendritic+cells+in+the+innate+immune+system%5BTitle%5D)+AND+%22Microbes+Infect%22%5BJournal%5D)">The role of dendritic cells in the innate immune system.</a> Microbes Infect. 2, 257-272 (2000).</li>
<li>Hamm, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+transfection+method+for+primary+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Eng%22%5BJournal%5D)">Efficient transfection method for primary cells.</a> Tissue Eng. 8, 235-245 (2002).</li>
<li>Henderson, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+dendritic+cells+genetically+engineered+to+express+high+levels+of+the+human+epithelial+tumor+antigen+mucin+%28MUC-1%29%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Human dendritic cells genetically engineered to express high levels of the human epithelial tumor antigen mucin (MUC-1).</a> Cancer Res. 56, 3763-3770 (1996).</li>
<li>Reeves, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retroviral+transduction+of+human+dendritic+cells+with+a+tumor-associated+antigen+gene%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Retroviral transduction of human dendritic cells with a tumor-associated antigen gene.</a> Cancer Res. 56, 5672-5677 (1996).</li>
<li>Aicher, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Successful+retroviral+mediated+transduction+of+a+reporter+gene+in+human+dendritic+cells%3A+feasibility+of+therapy+with+gene-modified+antigen+presenting+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Hematol%22%5BJournal%5D)">Successful retroviral mediated transduction of a reporter gene in human dendritic cells: feasibility of therapy with gene-modified antigen presenting cells.</a> Exp. Hematol. 25, 39-44 (1997).</li>
<li>Thomas, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Progress+and+problems+with+the+use+of+viral+vectors+for+gene+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Genet%22%5BJournal%5D)">Progress and problems with the use of viral vectors for gene therapy.</a> Nat Rev Genet. 4, 346-358 (2003).</li>
<li>Jooss, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transduction+of+dendritic+cells+by+DNA+viral+vectors+directs+the+immune+response+to+transgene+products+in+muscle+fibers%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Transduction of dendritic cells by DNA viral vectors directs the immune response to transgene products in muscle fibers.</a> J. Virol. 72, 4212-4223 (1998).</li>
<li>Mitchell, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA-transfected+dendritic+cells+in+cancer+immunotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Invest%22%5BJournal%5D)">RNA-transfected dendritic cells in cancer immunotherapy.</a> J. Clin. Invest. 106, 1065-1069 (2000).</li>
<li>Mincheff, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+transfection+and%2For+cross-priming+of+dendritic+cells+following+DNA+and+adenoviral+immunizations+for+immunotherapy+of+cancer-changes+in+peripheral+mononuclear+subsets+and+intracellular+IL-4+and+IFN-gamma+lymphokine+profile%5BTitle%5D)+AND+%22Crit.+Rev.+Oncol.+Hematol%22%5BJournal%5D)">In vivo transfection and/or cross-priming of dendritic cells following DNA and adenoviral immunizations for immunotherapy of cancer-changes in peripheral mononuclear subsets and intracellular IL-4 and IFN-gamma lymphokine profile.</a> Crit. Rev. Oncol. Hematol. 39, 125-132 (2001).</li>
<li>Roth, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Helper-dependent+adenoviral+vectors+efficiently+express+transgenes+in+human+dendritic+cells+but+still+stimulate+antiviral+immune+responses%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Helper-dependent adenoviral vectors efficiently express transgenes in human dendritic cells but still stimulate antiviral immune responses.</a> J. Immunol. 169, 4651-4656 (2002).</li>
<li>Tendeloo, V. F. V. an <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+efficient+gene+delivery+by+mRNA+electroporation+in+human+hematopoietic+cells%3A+superiority+to+lipofection+and+passive+pulsing+of+mRNA+and+to+electroporation+of+plasmid+cDNA+for+tumor+antigen+loading+of+dendritic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Highly efficient gene delivery by mRNA electroporation in human hematopoietic cells: superiority to lipofection and passive pulsing of mRNA and to electroporation of plasmid cDNA for tumor antigen loading of dendritic cells.</a> Blood. 98, 49-56 (2001).</li>
<li>Lenz, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nucleoporation+of+dendritic+cells%3A+efficient+gene+transfer+by+electroporation+into+human+monocyte-derived+dendritic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Lett%22%5BJournal%5D)">Nucleoporation of dendritic cells: efficient gene transfer by electroporation into human monocyte-derived dendritic cells.</a> FEBS Lett. 538, 149-154 (2003).</li>
<li>Prechtel, A. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Small+interfering+RNA+%28siRNA%29+delivery+into+monocyte-derived+dendritic+cells+by+electroporation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol.+Methods%22%5BJournal%5D)">Small interfering RNA (siRNA) delivery into monocyte-derived dendritic cells by electroporation.</a> J. Immunol. Methods. 311, 139-152 (2006).</li>
<li>Bowles, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Validation+of+efficient+high-throughput+plasmid+and+siRNA+transfection+of+human+monocyte-derived+dendritic+cells+without+cell+maturation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol.+Methods%22%5BJournal%5D)">Validation of efficient high-throughput plasmid and siRNA transfection of human monocyte-derived dendritic cells without cell maturation.</a> J. Immunol. Methods. , Forthcoming Forthcoming.</li>
<li>Kato, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+type-specific+involvement+of+RIG-I+in+antiviral+response%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Cell type-specific involvement of RIG-I in antiviral response.</a> Immunity. 23, 19-28 (2005).</li>
<li>Kato, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+roles+of+MDA5+and+RIG-I+helicases+in+the+recognition+of+RNA+viruses%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Differential roles of MDA5 and RIG-I helicases in the recognition of RNA viruses.</a> Nature. 441, 101-105 (2006).</li>
<li>Haller, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Mx+GTPase+family+of+interferon-induced+antiviral+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Microbes+Infect%22%5BJournal%5D)">The Mx GTPase family of interferon-induced antiviral proteins.</a> Microbes Infect. 9, 1636-1643 (2007).</li>
</ol>

Nie zgłoszono żadnych konfliktów interesów.

Wydajna transfekcja naiwnych pierwotnych komórek dendrytycznych jest istotna dla analiz wysokoprzepustowych oraz inżynierii wstecznej komórkowych szlaków zapalnych w tych kluczowych komórkach pośredniczących w przejściu między odpornością wrodzoną a adaptacyjną. Jednak większość badaczy stwierdza, że komórki te są trudne do efektywnej transfekcji przy użyciu standardowych technik, a sama procedura często indukuje dojrzewanie komórek. Zbadaliśmy, czy ograniczenia te można przezwyciężyć poprzez wysokoprzepustową optymaliza...

<table><tbody><tr><td>Amaxa Nucleofector 96-well Shuttle</td><td>Lonza Inc.</td><td>108S0109</td><td>Numer seryjny</td></tr><tr><td>Amaxa Human Monocyte 96-well Nucleofector Kit</td><td>Lonza Inc.</td><td>VHPA-2007</td><td>Zawiera roztwór do nukleofekcji monocytów ludzkich do płytek 96-dołkowych, suplement do płytek 96-dołkowych oraz nukleokuwety i płytki</td></tr><tr><td>RIG-I siRNA</td><td>Dharmacon</td><td>L-012511-00</td><td></td></tr><tr><td>GLO siRNA</td><td>Dharmacon</td><td>D-001600-01-20</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>Invitrogen</td><td>11875</td><td>Uzupełnione o 10% FCS, 2 mM L-glutaminy, 100 U/ml penicyliny i 100 &amp;#x03BC;g/ml streptomycyny w celu przygotowania pożywki wzrostowej dla komórek dendrytycznych</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Invitrogen</td><td>11965</td><td></td></tr><tr><td>L-glutamina</td><td>Invitrogen</td><td>25030081</td><td></td></tr><tr><td>Penicylina/streptomycyna</td><td>Invitrogen</td><td>15070063</td><td></td></tr><tr><td>Płodowa surowica bydlęca</td><td>Hyclone</td><td>3070.03</td><td></td></tr><tr><td>Komórki dendrytyczne</td><td>New York Blood center</td><td></td><td>Komórki DC są oczyszczane z warstwy leukocytarnej zgodnie ze standardową procedurą</td></tr></tbody></table>

zoptymalizowany protokół wydajnej transfekcji komórek dendrytycznych bez dojrzewania komórek

Optimized Protocol for Efficient Transfection of Dendritic Cells without Cell Maturation

Komórki dendrytyczne (DCs) można uznać za strażników układu odpornościowego, które odgrywają kluczową rolę w jego inicjacji i odpowiedzi na infekcję1. Wykrywanie antygenów patogennych przez naiwne DCs odbywa się za pośrednictwem receptorów rozpoznających wzorce (PRRs), które są zdolne do rozpoznawania specyficznych konserwowanych struktur określanych jako patogenowe wzorce molekularne (PAMPS). Wykrycie PAMPs przez DCs wywołuje wewnątrzkomórkową kaskadę sygnalizacyjną, prowadzącą do ich aktywacji i przekształcenia w dojrzałe DCs. Proces ten charakteryzuje się zazwyczaj produkcją interferonu typu 1 wraz z innymi cytokinami prozapalnymi, zwiększeniem ekspresji markerów powierzchni komórki, takich jak MHCII i CD86, oraz migracją dojrzałych DCs do drenujących węzłów chłonnych, gdzie interakcja z limfocytami T inicjuje adaptacyjną odpowiedź immunologiczną2,3. W ten sposób DCs łączą wrodzony i adaptacyjny układ odpornościowy.
Zdolność do analizy sieci molekularnych leżących u podstaw odpowiedzi komórek DC na różne patogeny jest kluczowa dla lepszego zrozumienia regulacji tych szlaków sygnałowych i indukowanych przez nie genów. Powinno to również pomóc w opracowaniu szczepionek opartych na komórkach DC przeciwko chorobom zakaźnym i nowotworom. Jednakże ten kierunek badań był poważnie utrudniony ze względu na trudności w transfekcji pierwotnych komórek DC4.
Zazwyczaj stosuje się metody transdukcji wirusowej, takie jak system lentiwirusowy, jednak wiążą się one z wieloma ograniczeniami, m.in. z wysoką złożonością i ryzykiem biologicznym (wraz z powiązanymi kosztami)5,6,7,8. Ponadto dostarczanie wirusowych produktów genowych zwiększa immunogenność tych przetransdukowanych komórek DC9,10,11,12. Elektroporacja była stosowana z mieszanymi rezultatami13,14,15, jednak jesteśmy pierwszymi, którzy zgłaszają użycie wysokoprzepustowego protokołu transfekcji i jednoznacznie wykazują jego użyteczność.
W niniejszym raporcie podsumowujemy zoptymalizowany komercyjny protokół wysokoprzepustowej transfekcji ludzkich pierwotnych komórek dendrytycznych (DC), charakteryzujący się ograniczoną toksycznością komórkową i brakiem dojrzewania DC16. Wydajność transfekcji (plazmidu GFP) oraz żywotność komórek wyniosły odpowiednio ponad 50% i 70%. Analiza FACS potwierdziła brak wzrostu ekspresji markerów dojrzewania CD86 i MHCII w transfekowanych komórkach, natomiast qRT-PCR nie wykazał nadekspresji IFNβ. Wykorzystując ten protokół elektroporacji, dostarczamy dowodów na skuteczną transfekcję DC za pomocą siRNA oraz efektywny knockdown docelowego genu RIG-I, kluczowego receptora rozpoznawania wirusów16,17, zarówno na poziomie mRNA, jak i białka.

Przedstawiamy nasz zoptymalizowany protokół wysokoprzepustowej nukleofekcji jako wydajny sposób transfekcji pierwotnych ludzkich komórek dendrytycznych pochodzących z monocytów za pomocą plazmidowego DNA lub siRNA, bez wywoływania dojrzewania komórek. Dostarczamy ponadto dowodów na skuteczne wyciszenie siRNA docelowego genu RIG-I zarówno na poziomie mRNA, jak i białka.

Zoptymalizowany protokół wydajnej transfekcji komórek dendrytycznych bez dojrzewania komórek

Komórki dendrytyczne (DCs) można uznać za strażników układu odpornościowego, którzy odgrywają kluczową rolę w jego aktywacji oraz odpowiedzi na infekcję1. Wykrywanie ...

Ogólnym celem tej procedury jest wyciszenie ekspresji genu docelowego w komórkach DCS za pomocą transfekcji siRNA. Jest to realizowane poprzez wstępne zaprogramowanie urządzenia AM Maxin Nucleo. Drugim krokiem procedury jest zmieszanie komórek DCS z siRNA, a następnie przeniesienie otrzymanej zawiesiny komórkowej pipetą do modułów Nucleo QVE.Trzecim krokiem procedury jest umieszczenie płytki w tacy urządzenia amaxa shuttle w celu rozpoczęcia procesu transfekcji. Ostatnim krokiem procedury jest zakażenie komórek wirusem, aby aktywować odpowiedź interferonową. Ostatecznie można uzyskać wyniki wykazujące wyciszenie genu za pomocą ilościowego R-T-P-C-R oraz analizy Western blotting.Technika ta jest cenna w charakterystyce szlaków sygnałowych w komórkach dendrytycznych i może przyczynić się do rozwoju immunoterapii opartych na komórkach dendrytycznych. Aby zaprogramować system transportowy Maxon 96 well shuttle nucleo factor do transfekcji komórek dendrytycznych, otwórz nowy plik parametrów. Wybierz liczbę dołków, które zostaną wykorzystane do standardowej transfekcji, przeciągając kursor po schemacie płytki 96-dołkowej.Do każdej próbki doświadczalnej należy użyć co najmniej trzech studzienek do łączenia. Następnie należy wprowadzić kod programu: w części pierwszej wybrać F, F, a w części drugiej wybrać 1 68 z menu rozwijanego. Następnie z pola wyboru roztworu należy wybrać monocyte human, a w opcji kontroli wybrać standard, po czym kliknąć apply.Aby uwzględnić kontrolę bez transfekcji, należy wybrać dodatkowe studzienki z diagramu. Następnie z opcji kontroli należy wybrać kontrolę bez programu i ponownie kliknąć zastosuj. Po wymieszaniu roztworu do nukleofekcji należy pozwolić mu ogrzać się do temperatury pokojowej.Umieść wymaganą liczbę modułów nucleo vete w płytce nucleo VETE w odpowiedniej orientacji, wkładając pierwszy z nich do rzędów jeden i dwa, a następnie powtarzając czynność dla wszystkich kolejnych probówek. Przenieś z kolby do hodowli komórkowej do probówki o pojemności 50 ml odpowiednią ilość komórek DCS, aby uzyskać 500 000 komórek na dołek do transfekcji. Wirowarkuj komórki przez 10 minut przy 400 G w temperaturze 4°C, a następnie ostrożnie usuń nadsącz. Następnie dodaj do probówki roztwór do nukleofekcji i resuspenduj komórki DCS, delikatnie pipetując zawiesinę kilka razy w górę i w dół.Teraz należy opisać probówki DPH zgodnie z konkretną procedurą, która ma zostać wykonana, a następnie rozdzielić resuspenderowane komórki do opisanych probówek. Do odpowiednich probówek należy dodać siRNA w końcowym stężeniu 0,25 µg na 500 000 komórek, a następnie wymieszać zawiesiny komórkowe za pomocą pipetowania. W próbce kontrolnej bez transfekcji należy zastosować nietargetowe siRNA.Następnie pipetujemy 20 µL zawiesiny komórek SI RA DC do modułów NucleoVet zgodnie z wcześniej zaprogramowanym układem eksperymentalnym, upewniając się, że ciecz została dostarczona na dno studni; przykrywamy płytkę NucleoVet pokrywką i kilka razy uderzamy płytką o twardą powierzchnię, aby ułatwić usunięcie pęcherzyków powietrza w celu transfekcji komórek DC. Wkładamy przygotowaną płytkę NucleoVet do tacy zasuwczej NucleoEffector 96-dołkowej. Następnie klikamy przycisk „upload and start”.Monitor postęp procesu transfekcji na wyświetlaczu. Czarny krzyżyk na zielonym tle oznacza pomyślną transfekcję w danej studzience, natomiast czarny pasek na czerwonym tle oznacza niepowodzenie w trakcie transfekcji komórek. Po zakończeniu procesu transfekcji podgrzej pożywkę wzrostową DC, wyjmij płytkę i dodaj 80 µL podgrzanej pożywki wzrostowej DC do każdej studzienki.Używając pipety wielokanałowej, inkubuj teraz płytkę przez 10 minut w temperaturze 37 °C i 5% CO2. W czasie inkubacji dodaj 100 µL podgrzanego wcześniej medium wzrostowego DC do probówek matrycowych, zachowując tę samą orientację co w przypadku przygotowania płytki z kuwetami Nucleo. Po zakończeniu inkubacji przenieś całe 100 µL zawiesiny komórkowej z kuwet Nucleo CVE do wcześniej przygotowanych probówek matrycowych.Następnie należy usunąć i zutylizować probówki, w których nie doszło do transfekcji. Na koniec inkubować probówki z macierzą przez 24 godziny lub w innym wybranym przedziale czasowym. Przygotować etykiety dla każdej z inkubowanych probówek z macierzą.Następnie przenieś probówki matrycowe z inkubatora do komory z laminarnym przepływem powietrza i połącz probówki matrycowe dla każdej próbki doświadczalnej w uprzednio oznakowanych probówkach eend dfs. Następnie delikatnie zwirowuj komórki, wirując probówki eend DPH w wirówce laboratoryjnej przez 10 minut. Przy 400 G usuń snat i delikatnie resuspenduj komórki w bezsurowiczym medium wzrostowym zawierającym wirusa choroby Nowego Zamku lub NDV przy MOI równym 1.Przykryj epi endorphins w sposób sterylny, a następnie inkubuj probówki przez 45 minut. Po tym czasie inkubacji dodaj 900 µl pożywki wzrostowej do DC i inkubuj probówki przez kolejne osiem do 10 godzin, aby zebrać przetransfekowane i zainfekowane DC.Odwirować komórki w probówkach typu einor w wirówce stołowej, tak jak wcześniej, a następnie usunąć supernatant. Monocyty dcs zostały przetransfekowane albo siRNA celującym w RIG I, albo niespecyficznym glow irna, a następnie zainfekowane NDV (oznaczone znakiem plus) lub pozostawione niezinfekowane (oznaczone znakiem minus), co zdetekowano za pomocą ilościowej R-T-P-C-R. Zaobserwowano knockdown R RGA o 75% na poziomie transkrypcji; podobną redukcję odnotowano w ekspresji interferonu beta. Zaobserwowano również wpływ na efektor downstream RGA w kaskadzie sygnalizacyjnej interferonu. Ponadto, w niezinfekowanych komórkach kontrolnych po transfekcji nie wykryto ekspresji interferonu beta.Podczas gdy w przypadku MXA oraz genu odpowiedzi w dół dla interferonu beta była ona minimalna. Tutaj przedstawiono dane z drugiej transfekcji komórek DCS za pomocą siRNA ukierunkowanego na RIG-I, przeprowadzonej analogicznie do poprzedniej postaci. Jednak w tym eksperymencie wszystkie komórki zostały zainfekowane NDV, a dodatkowo włączono kontrolę z wykorzystaniem niepoddanych resekcji monocytowych komórek DCS.Wyniki wyciszania genów były podobne do tych zaobserwowanych na poprzedniej rycinie. Western blot przeprowadzony w celu wykrycia RGA wykazał, że ekspresja białka tego genu została całkowicie zablokowana. Ścieżki pierwsza i druga przedstawiają dane dla lizatów z komórek niepoddanych resekcji.Ścieżki trzecia i czwarta przedstawiają lizaty z komórek transfekowanych glow irna, a ścieżki piąta i szósta przedstawiają lizaty z komórek transfekowanych S irna nakierowanym na RIG I. Po opanowaniu ta technika może zostać wykonana w ciągu jednej godziny, wliczając w to jednoczesne wyciszanie wielu genów.

optimized-protocol-for-efficient-transfection-dendritic-cells-without

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Zoptymalizowany protokół efektywnej transfekcji komórek dendrytycznych bez dojrzewania komórek

Ten film demonstruje technikę opartą na małym interferującym RNA (siRNA) do zakłócania przepływu autofagicznego. SiRNA ukierunkowane na mRNA FIP200 jest wprowadzane do niedojrzałych komórek dendrytycznych (iDC) pochodzących z monocytów za pomocą elektroporacji, powodując obniżenie ekspresji FIP200 i prowadząc do zahamowania rozerwania laminy jądrowej poprzez autofagię. Po dodaniu wirusa opryszczki pospolitej (HSV) wychodzenie jądrowe potomstwa wirusa jest zahamowane z powodu braku rozerwania...

Hamowanie autofagii oparte na siRNA w niedojrzałych komórkach dendrytycznych zakażonych wirusem opryszczki pospolitej

Opisano najczęściej używaną metodę generowania dużej liczby autologicznych komórek dendrytycznych (DC) do wykorzystania w immunoterapii nowotworów.  Metoda wykorzystuje IL-4 i GM-CSF do różnicowania DC od monocytów.  Niedojrzałe DC są stymulowane do dojrzewania, a następnie ładowane antygenami przed wstrzyknięciem z powrotem pacjentowi.

Przygotowanie dojrzałych komórek dendrytycznych obciążonych antygenem nowotworowym do immunoterapii

Tutaj używamy transdukcji retrowirusowej i transfekcji konkategomerycznej, aby stworzyć linię komórkową, która może wyrażać składniki wektora lentiwirusowego (LV) przy braku tetracykliny. Ten LV koduje GFP i jest pseudotypowany glikoproteiną SVGmu, która jest specyficzna dla receptora na komórkach dendrytycznych.

Linia komórkowa regulowana tetracykliną wytwarza wektory lentiwirusowe o wysokim mianie, które są specyficznie ukierunkowane na komórki dendrytyczne

Ten protokół przedstawia efektywną i niezawodną metodę transfekcji ludzkich makrofagów THP-1 za pomocą siRNA lub plazmidowego DNA za pomocą elektroporacji z wysoką wydajnością transfekcji, przy jednoczesnym zachowaniu wysokiej żywotności komórek i pełnej zdolności makrofagów do różnicowania i polaryzacji.

Wysoce wydajna transfekcja ludzkich makrofagów THP-1 metodą nukleofekcji

Odrębne podzbiory komórek dendrytycznych istnieją jako rzadkie populacje w narządach limfoidalnych, dlatego są trudne do wyizolowania w wystarczającej liczbie i czystości do eksperymentów immunologicznych. W tym miejscu opisujemy metodę o wysokiej skuteczności i wysokiej wydajności do izolacji wszystkich obecnie znanych głównych podzbiorów komórek dendrytycznych śledziony myszy.

Wydajna i wysokowydajna metoda izolacji podzbiorów komórek dendrytycznych myszy

Niedojrzałe komórki dendrytyczne mogą być selektywnie różnicowane w tolerogenne lub dojrzałe komórki dendrytyczne, aby regulować równowagę między odpornością a tolerancją. W pracy przedstawiono sposób generowania z niedojrzałych komórek dendrytycznych pochodzących z monocytów (moDC), tolerogennych in vitro i dojrzałych moDC, które różnią się fenotypami metabolicznymi.

Wytwarzanie niedojrzałych, dojrzałych i tolerogennych komórek dendrytycznych o różnych fenotypach metabolicznych

W tym artykule przedstawiamy szczegółowy protokół ekspresji białek fuzyjnych fluorescencyjnych w komórkach dendrytycznych i makrofagach pochodzących ze szpiku kostnego myszy. Metoda opiera się na transdukcji komórek progenitorowych szpiku kostnego za pomocą konstruktów retrowirusowych, a następnie różnicowaniu do makrofagów i komórek dendrytycznych in vitro.

Ekspresja fluorescencyjnych białek fuzyjnych w mysich komórkach dendrytycznych i makrofagach pochodzących ze szpiku kostnego

Urządzenie lub płytka do transimmunizacji (TI) i związane z nim protokoły zostały opracowane w celu odtworzenia kluczowych cech pozaustrojowej fotochemoterapii (ECP), w warunkach eksperymentalnych, pozwalając na produkcję fizjologicznie aktywowanych, przestrajalnych komórek dendrytycznych (DC) do immunoterapii raka.

Nowy protokół generowania fizjologicznych immunogennych komórek dendrytycznych

Tutaj prezentujemy protokół do indukcji indukcji regulatorowych limfocytów T in vivo. W tym protokole komórki dendrytyczne są modyfikowane tak, aby lokalnie wytwarzały wysokie stężenia aktywnej witaminy D (1,25-dihydroksywitaminy D lub 1,25[OH]2D) i aktywnej witaminy A (kwas retinowy lub RA) de novo.

Augmentacja in vivo indukcji regulatorowych limfocytów T naprowadzających się na jelita

Tutaj prezentujemy ekonomiczną i efektywną metodę izolowania i generowania komórek dendrytycznych pochodzących ze szpiku kostnego o wysokiej czystości od myszy po 7 dniach hodowli z 10 ng/mL GM-CSF/IL-4.

Ekonomiczny i wydajny protokół izolacji i hodowli komórek dendrytycznych pochodzących ze szpiku kostnego od myszy

Protokół ten opisuje przeprogramowanie in vivo mysich komórek rakowych na komórki dendrytyczne typu 1 w mikrośrodowisku guza poprzez wymuszoną ekspresję czynników transkrypcyjnych PU.1, IRF8 i BATF3.

Wykonalne przeprogramowanie in vivo komórek nowotworowych na konwencjonalne komórki dendrytyczne typu 1

Poznaj zoptymalizowany protokół transfekcji komórek dendrytycznych człowieka przy użyciu nukleofekcji z siRNA bez indukowania dojrzewania. Metoda umożliwia skuteczne wyciszanie genów, np. RIG-I, w badaniach immunologicznych.

Zoptymalizowany protokół wydajnej transfekcji komórek dendrytycznych bez dojrzewania komórek

Przeglądaj więcej filmów