Opracowanie systemu modelowego in vitro do badania interakcji Equus caballus IgE z jego receptorem o wysokim powinowactwie FcεRI

Ogólnym celem poniższego eksperymentu jest zmierzenie ilości uwalniania mediatora zależnego od IgE z komórek białaczki bazofilowej RAD. Objawy alergii są spowodowane uwalnianiem mediatorów, takich jak histamina. Histamina nie jest jedynym mediatorem uwalnianym przez bazofile, są komórki tuczne.

Suma wszystkich mediatorów, które są uwalniane przez te komórki, powoduje oznaki i objawy natychmiastowej i opóźnionej nadwrażliwości. Ludzie nie są jedynymi organizmami, które cierpią na alergię, na którą cierpią również psy i konie. W celu dalszego rozwoju badań i znalezienia metod leczenia alergii, takich jak szczepionki, wymagany jest test uwalniania w celu ilościowego określenia ilości mediatorów uwolnionych w wyniku leczenia badawczego, jeśli takie istnieją.

To jest powód tego testu uwalniania. Test wydany przez mediatora RBL dla systemu ludzkiego został po raz pierwszy opracowany i opublikowany przez Iana i Hooka w 1986 roku. Później został opracowany dla systemu DOC, a teraz dla systemu konnego.

Modyfikacje są tak proste, jak zmiana interesujących nas białek. Wiadomością o linii komórkowej była białaczka Rat Baso lub linia komórkowa RBL dwie H 3.1 wyrażające łańcuch alfa końskich receptorów seryny R o wysokiej zawartości FNT i fcf do gęstości komórek 500 000 komórek na mililitr. Dodaj interesujące Cię przeciwciało IgE do końcowego stężenia jednego nanograma na mililitr.

Dodaj 100 mikrolitrów mieszanki do płytki glebowej 96 i inkubuj przez 16 godzin w temperaturze 37 stopni. Dzięki temu komórki przylegają do powierzchni studzienki, a przeciwciało wiąże się z płukaniem receptora. Dwa razy pożywka zawierająca pozostałe niezwiązane przeciwciało i martwe komórki ze 100 mikrolitrami ciepłego buforu o temperaturze 37 stopni.

Odrzucić bufor z ostatniego przemywania i zastąpić go 100 mikrolitrami antygenu będącego przedmiotem zainteresowania w stężeniu będącym przedmiotem zainteresowania. Po 20 minutach inkubacji w temperaturze 37 stopni przenieś 50 mikrolitrów natynki SUP zawierającej mediatory uwalniania do nowej studzienki i zastąp pozostały supernatant buforem Triton X o pojemności 50 mikrolitrów, aby ułożyć komórki i uwolnić pozostałe mediatory wewnątrz komórek. Przy 50 mikrolitrach 2 milionów molowców beta hx.

Wielodniowy substrat rozpuszczony w buforze cytrynianowym. Po dwugodzinnej inkubacji w temperaturze 37 stopni dodaj 150 mikrolitrów buforu tris do każdej studzienki, zmieniając dołek na żółty. Zmierz absorbancję koloru przy 405 nanometrach Po 16 godzinach.

Ogrzej bufor do oznaczania uwalniania, znany również jako bufor Iana w temperaturze 37 stopni. Przygotować również gradient stężeń antygenu w buforze uwalniającym przy stężeniach. Zero 0,1 1 10, 100, 1000 i 10 000 nanogramów na mililitr.

Następnie ogrzej się w 37 stopniach. Umyj studzienki, szybko przesuwając naczynie, aby usunąć pożywkę i delikatnie dodaj 100 mikrolitrów buforu o ciepłym uwalnianiu w kierunku ścianek studzienek. Ma to na celu zmniejszenie stresu komórkowego spowodowanego różnicą temperatur, co powoduje przedwczesne uwalnianie mediatorów.

Naczynie należy umyć dwukrotnie. Odrzucić bufor o końcowym uwalnianiu, umyć i dodać 100 mikrolitrów antygenu, zaczynając od zerowego stężenia antygenu w rzędzie A dla kontroli ujemnej i schodząc w dół gradientu stężeń od rzędów B do G, a na końcu do plasterków Triton X, bufor w rzędzie H. To dla kontroli pozytywnej. Inkubować płytkę przez 20 minut w temperaturze 37 stopni.

Jest to punkt, w którym komórki uwalniają mediatory po okresie inkubacji. Przenieś 50 mikrolitrów cieczy z każdej studzienki do odpowiedniej studzienki. W kolumnach od siódmej do dwunastej całkowicie usunąć pozostałą ciecz i wyrzucić ją w miejscach od pierwszej do szóstej i zastąpić 50 mikrolitrami buforu do lizy Triton X.

Dodaj 50 mikrolitrów przygotowanego podłoża do wszystkich 96 dołków naczynia. Inkubować w temperaturze 37 stopni przez dwie godziny. Beta H, wiele dni zamienia substrat na cztery nitrofenol.

Po okresie inkubacji zatrzymaj reakcję, dodając 150 mikrolitrów buforu tris, zmieniając cztery nitrofenol na żółty kolor. Odczytaj płytkę za pomocą spektrofotometru płytkowego o długości 405 nanometrów. Po zmierzeniu danych dotyczących absorbancji obliczyć całkowitą ilość mediatorów wewnątrz komórek w pozycji studzienek A jeden, mnożąc je.

Jego odpowiedni dobrze na pozycji siedem na dwa i dodanie wyniku do wartości na jedynce. Dzieje się tak dlatego, że podczas eksperymentu mamy supinat zawierający opozycję mediatorów uwalniania A, gdy przenieśliśmy ją do nowej opozycji studzienki. Siódemka.

Powtórz obliczenia dla pozostałych studni. Oblicz procent mediatorów uwalniania w opozycji studzienki, A siedem z obliczonych całkowitych mediatorów wewnątrz komórek, mnożąc wartość pozycji A siedem przez dwa. Ponownie, ponieważ podczas eksperymentu mamy supernat zawierający mediatory Reese'a.

Gdy przenieśliśmy go do nowego, pomnóż ten iloczyn przez 100 i podziel ten iloczyn przez odpowiednią całkowitą wartość mediatorów wewnątrz komórek dla tej pozycji. Daje to procent mediatorów uwalniania dla pęcznienia. Powtórz obliczenia dla pozostałych studzienek, ponieważ sześć fal w każdym rzędzie jest kwestionowanych przez to samo średnie stężenie antygenu.

Wartości te i oblicz odchylenie standardowe, wykreśl te wartości na wykresie w następujący sposób. Wykres pokazuje, że wraz ze wzrostem stężenia antygenu uwalnianych jest więcej mediatorów, aż osiągnie szczyt na poziomie 100 nanogramów na mililitr, po czym uwalnianie mediatora zmniejsza się wraz ze wzrostem stężenia antygenu. Ostateczny wynik eksperymentu powinien wyglądać jak te wykresy, jak widać na wykresie B. Test uwalniania kontrolnego w kolorze jasnoniebieskim nie zawiera przeciwciał IgE, a zatem nie wykazuje zmian w uwalnianiu mediatorów wraz ze wzrostem stężenia antygenu.

Porównaj to z wynikiem eksperymentalnym w kolorze ciemnoniebieskim, który może zawierać przeciwciało IgE. Jest to przykład szczepionki anty-IgE testowanej pod kątem bezpieczeństwa. Z tego wykresu w kolorze czerwonym jasno wynika, że surowica anty-IgE łączy krzyżowo receptory na powierzchni komórki, powodując degranulację komórek RBL, tak jak to widać w kontroli pozytywnej na fioletowo w porównaniu z kontrolą negatywną na szaro, co czyni tę szczepionkę niebezpieczną.

Test ten jest bardzo przydatny, ponieważ może mierzyć uwalnianie mediatora lub jego opóźnienie podczas testowania potencjalnych leków przeciwalergicznych lub szczepionek, które można również dostosować do układów ludzkich, psów lub koni, jak pokazano, test może określić pomyślne zablokowanie lub nieskuteczne zablokowanie uwalniania mediatora podczas testowania przeciwciał przeciwalergicznych.