Name: Generacja samoorganizujących się unaczynionych odpowiedników ludzkiej skóry (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-02-12T14:45:00.000+00:00
Duration: 9 min 4 s
Description: Poznaj metodę generacji unaczynionych odpowiedników ludzkiej skóry do badań nad chorobami, starzeniem i medycyną spersonalizowaną. Protokół obejmuje hodowlę długoterminową oraz analizę objętościową.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy dziękują Dr. Jimowi Rheinwaldowi59 i dr Ellen H. van den Bogaard20 za ich hojny dar linii komórkowych N/TERT. Praca ta była wspierana przez American Heart Association (19IPLOI34760636).

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Protokół ten zademonstrował prostą i powtarzalną metodę generowania VHSE i ich trójwymiarowej analizy. Co ważne, metoda ta opiera się na kilku specjalistycznych technikach lub elementach wyposażenia, dzięki czemu jest dostępna dla wielu laboratoriów. Co więcej, typy komórek mogą zostać zastąpione ograniczonymi zmianami w protokole, co pozwala naukowcom dostosować ten protokół do swoich konkretnych potrzeb.
Prawidłowe żelowanie kolagenu jest trudnym krokiem w tworzeniu kultury skórnej. Zwłaszcza w przypadku stosowania surowych preparatów bez oczyszczania, śladowe ilości zanieczyszczeń mogą wpływać na proces żelowania. Aby zapewnić spójność, grupy eksperymentów powinny być wykonywane z tym samym zapasem kolagenu, który będzie używany do wytwarzania VHSE. Co więcej, żelowanie powinno przebiegać idealnie przy pH 7-7,4, a śladowe ilości zanieczyszczeń mogą zmienić pH. Przed użyciem jakiegokolwiek wywaru kolagenowego należy przygotować praktyczny żel bezkomórkowy o pożądanym stężeniu, a przed żelowaniem zmierzyć pH. Przeprowadzenie tej kontroli jakości kolagenu przed rozpoczęciem wysiewu składników skórnych pozwoli zidentyfikować problemy z prawidłowym żelowaniem i jednorodnością kolagenu przed przeprowadzeniem pełnego eksperymentu. Zamiast wysiewać kolagen bezkomórkowy bezpośrednio na wkładkę hodowlaną, wysiew trochę kolagenu na pasku pH, który ocenia całą skalę pH i sprawdź pH 7-7,4. Żelowanie można ocenić, nakładając kroplę roztworu żelu kolagenowego na szkiełko nakrywkowe lub plastikową płytkę dołka do hodowli tkankowej (zaleca się płytkę dołkową w celu symulacji ograniczonych boków wkładki hodowlanej). Po czasie żelowania kolagen powinien być stały, tzn. nie powinien płynąć, gdy płytka jest przechylona. Pod mikroskopią kontrastu fazowego kolagen powinien wyglądać na jednorodny i klarowny. Sporadyczne pęcherzyki z wysiewu kolagenu są normalne, ale duże amorficzne plamki nieprzezroczystego kolagenu w przezroczystym żelu wskazują na problem - prawdopodobnie z powodu niewystarczającego wymieszania, niewłaściwego pH i / lub niemożności utrzymania kolagenu w stanie schłodzonym podczas mieszania.
Ilości wysiewu komórek i pożywki można dostosować. W powyższym protokole kapsułkowane ilości komórek zostały zoptymalizowane pod kątem 12-dołkowej wkładki przy 7,5 x 104 fibroblastach i 7,5 x 105 komórek śródbłonka na ml kolagenu z 1,7 x 105 keratynocytów wysianych na wierzchu konstruktu skórnego. Gęstości komórek zostały zoptymalizowane pod kątem tego protokołu VHSE w oparciu o wstępne badania i poprzednie badania badające generowanie sieci naczyniowej 3D w różnych stężeniach kolagenu48 i generację HSE 22,80,81. W podobnych systemach opublikowana gęstość komórek śródbłonka wynosi 1,0 x 106 komórek/ml kolagenu48; stężenia fibroblastów często wahają się od 0,4 x 105 komórek/ml kolagenu 22,28,82 do 1 x 10 5 komórek/ml kolagenu 8,58,83,84,85; a stężenia keratynocytów wahają się od 0,5 x 105 [komórek/cm2]80 do 1 x 105 [komórek/cm2]8. Gęstości komórek można zoptymalizować pod kątem konkretnych komórek i pytania badawczego. Trójwymiarowe kultury z komórkami kurczliwymi, takimi jak fibroblasty, mogą się kurczyć, co prowadzi do zmniejszenia żywotności i utraty kultur86,87. Należy przeprowadzić wstępne eksperymenty w celu zbadania skurczu kompartmentu skórnego (który może wystąpić w przypadku większej liczby komórek skóry właściwej, bardziej kurczliwych komórek skóry właściwej, dłuższych kultur zanurzeniowych lub bardziej miękkich matryc) oraz w celu zbadania pokrycia powierzchni naskórka. Dodatkowo, liczbę dni w zanurzeniu i szybkość zmniejszania się zawartości surowicy można również dostosować, jeśli występuje nadmierny skurcz skóry lub wymagana jest inna szybkość pokrycia keratynocytami. Na przykład, jeśli skurcz zostanie zauważony w okresie zanurzenia skóry lub gdy keratynocyty tworzą monowarstwę powierzchniową, szybsze przechodzenie przez proces zmniejszania surowicy i podniesienie VHSE do ALI może pomóc w zapobieganiu dodatkowym skurczom. Podobnie, jeśli pokrycie keratynocytów nie jest idealne, zmiana liczby dni, w których VHSE jest zanurzony bez surowicy, może pomóc zwiększyć pokrycie monowarstwy naskórka i złagodzić skurcz, ponieważ surowica jest pomijana. Zmiany w gęstości komórek lub inne powyższe sugestie muszą być zoptymalizowane pod kątem konkretnych kultur i celów badawczych.
Aby ustalić prawidłowe rozwarstwienie naskórka w okresie granicy faz powietrza i cieczy (ALI), kluczowe znaczenie ma regularne sprawdzanie i utrzymywanie poziomu płynów w każdym dołku, tak aby ALI i odpowiednie nawodnienie każdego konstruktu było utrzymane przez cały okres hodowli. Poziomy pożywek powinny być sprawdzane i śledzone codziennie, aż do ustalenia stałych poziomów ALI. Warstwa naskórka powinna wyglądać na nawilżoną, nie suchą, ale na konstrukcji nie powinno być kałuż mediów. Podczas ALI konstrukt rozwinie nieprzezroczysty biało-żółty kolor, co jest normalne. Warstwa naskórka prawdopodobnie będzie się rozwijać nierównomiernie. Zwykle VHSE są przechylone z powodu wysiewu kolagenu lub skurczu skóry. Normalne jest również obserwowanie wyższej części naskórka w środku konstruktu w mniejszych konstrukcjach (wielkość 24 dołków) i formacja grzbietu wokół obwodu VHSE w rozmiarze 12 dołków. Kurczenie się konstruktów13 może zmienić te formacje topograficzne i/lub w ogóle nie być obserwowane.
Barwienie i obrazowanie VHSE wprowadza mechaniczną manipulację do VHSE. Bardzo ważne jest zaplanowanie i ograniczenie manipulacji każdą kulturą. Gdy konieczna jest manipulacja, należy zachować delikatne ruchy podczas usuwania VHSE z membran wkładu, podczas dodawania roztworów barwiących lub płuczących do powierzchni konstrukcji oraz podczas usuwania i wymiany VHSE w ich studzienkach magazynowych/obrazowych podczas przygotowywania obrazowania. W szczególności warstwy wierzchołkowe składnika naskórka mogą być delikatne i mogą złuszczać się z podstawowych warstw naskórka. Warstwy wierzchołkowe naskórka są kruche i ulegają złuszczaniu nawet w tkance natywnej4, ale dla dokładnej analizy struktury naskórka ważne jest zminimalizowanie uszkodzeń lub utraty. Jeśli warstwy naskórka oderwą się od konstruktu, można je obrazować oddzielnie. Warstwy podstawne naskórka najprawdopodobniej są nadal przyczepione do skóry właściwej, podczas gdy części warstw wierzchołkowych mogą się oderwać. W wizualizacji naskórka pomocne w obserwacji tego jest plama jądrowa, ponieważ gęste jądra są charakterystyczne dla dolnych i środkowych warstw naskórka.
Obrazowanie konfokalne VHSE po fiksacji zostało omówione w protokole, ale możliwe jest również obrazowanie VHSE w całej hodowli za pomocą pionowej optycznej koherentnej tomografii (OCT)88,89,90,91,92,93. VHSE są wystarczająco stabilne, aby wytrzymać obrazowanie bez inkubacji lub nawilżania przez co najmniej dwie godziny bez zauważalnych efektów. Ponieważ OCT jest nieinwazyjny i nieinwazyjny, możliwe jest śledzenie grubości naskórka podczas dojrzewania. Prawdopodobnie można również zastosować inne nieinwazyjne metody obrazowania.
Obrazowanie wolumetryczne połączonych struktur skóry i naskórka może być trudne ze względu na tłumienie lasera w głębi VHSE. Można temu zapobiec, obrazując konstrukt w dwóch orientacjach, od strony naskórka (ryc. 1) i od strony skóry właściwej (ryc. 2), co pozwala na dobrą rozdzielczość struktur naczyniowych skóry właściwej i naskórka. Dodatkowo próbka może zostać usunięta, co pozwala na uzyskanie wolumetrycznych obrazów całej konstrukcji przy minimalnym tłumieniu. Próbowano kilku metod oczyszczania, jednak opisana metoda metanolu/salicylanu metylu przyniosła najlepsze wyniki. Badacze zainteresowani optymalizacją innych metod rozliczania są kierowani do tych przeglądów 49,61,62. W przypadku oczyszczania zaleca się pełne zobrazowanie próbki przed usunięciem, ponieważ metoda ta może uszkodzić fluorofory i/lub strukturę. Ponadto obrazowanie należy zakończyć tak szybko, jak to możliwe po oczyszczeniu, ponieważ fluorescencja może zaniknąć w ciągu kilku dni.
Dla uproszczenia i dostępności, protokół ten wykorzystywał najprostsze mieszanki mediów, które można znaleźć w poprzedniej literaturze11,80. Chociaż korzystanie z prostych mieszanek mediów ma wiele zalet, dostrzega się również ograniczenia tego wyboru. Inne grupy badały wpływ określonych składników pożywek na zdrowie naskórka i skóry i odkryły, że inne dodatki do pożywek, takie jak zewnętrzne wolne kwasy tłuszczowe/lipidy, wzmacniają warstwę rogową naskórka i poprawiają funkcję bariery skórnej. Mimo, że nasze markery immunofluorescencyjne wykazują odpowiednie różnicowanie i stratyfikację w naskórku, to w zależności od prowadzonych badań może być konieczna dodatkowa optymalizacja pożywki. Ponadto nie przeprowadzono obszernej analizy naskórkowego BM podczas oceny przedstawionych tutaj VHSE. Integralność BM jest ważnym wskaźnikiem odpowiedników skóry; różne grupy przeprowadziły badania nad czasem trwania hodowli i jej wpływem na oznaczenia BM95, a także analizą obecności fibroblastów i dodatkowego wpływu czynnika wzrostu na ekspresję BM14. Ważne jest, aby pamiętać, że analiza komponentu BM powinna być oceniana i optymalizowana podczas korzystania z tego protokołu.
W protokole tym opisano procedurę generowania VHSE, wykazując wyniki po 8 tygodniach w ALI. Kultury VHSE były hodowane do 12 tygodni w ALI bez zauważalnych zmian lub utraty żywotności i możliwe jest, że mogą być żywotne dłużej. Co ważne, protokół ten można łatwo dostosować do powszechnie dostępnych typów komórek, czego dowodem jest zastąpienie fibroblastów skóry fibroblastami płuc IMR90. W zależności od potrzeb badacza i dostępnych zasobów, typy komórek i mieszanki pożywek w kulturze mogą być dostosowywane, chociaż bardziej różne typy komórek mogą wymagać optymalizacji pożywki. Podsumowując, procedury te mają na celu zapewnienie jasności co do hodowli VHSE w celu badania biologii i chorób skóry. Aby zmaksymalizować dostępność, protokół został opracowany w ten prosty i solidny sposób przy użyciu wspólnego sprzętu, linii komórkowych i odczynników jako minimalnego skutecznego podejścia, które można dodatkowo dostosować do konkretnych potrzeb badań naukowych.

Ludzka skóra pełni wiele istotnych funkcji biologicznych, w tym działa jako bariera immunologiczna/mechaniczna, reguluje temperaturę ciała, uczestniczy w zatrzymywaniu wody i pełni role sensoryczne1,2,3,4. Anatomicznie skóra jest największym narządem w ludzkim ciele i składa się z trzech głównych warstw (naskórka, skóry właściwej i tkanki podskórnej) i oprócz komórek naskórka posiada złożony system składników zrębu, naczyń krwionośnych, gruczołowych i układu odpornościowego/nerwowego. Sam naskórek składa się z czterech warstw komórek, które są stale odnawiane w celu utrzymania funkcji bariery ochronnej i innych struktur rodzimej skóry (tj. gruczołów potowych i łojowych, paznokci)3. Fizjologia skóry jest ważna w funkcjonowaniu układu odpornościowego, gojeniu się ran, biologii nowotworów i innych dziedzinach, co skłoniło naukowców do wykorzystania szerokiej gamy modeli, od monokultur in vitro po modele zwierzęce in vivo. Modele zwierzęce oferują możliwość badania pełnej złożoności fizjologii skóry, jednak powszechnie używane modele zwierzęce, takie jak myszy, mają znaczące różnice fizjologiczne w porównaniu z ludźmi5. Te ograniczenia oraz zwiększony koszt modeli zwierzęcych skłoniły wielu badaczy do skupienia się na opracowywaniu modeli in vitro, które lepiej odzwierciedlają fizjologię ludzkiej skóry1,6. Spośród nich jednym z prostszych typów modeli jest ludzki odpowiednik naskórkowy (HEE; określany również jako modele skóry o połowie grubości), który składa się tylko z keratynocytów naskórka na bezkomórkowej macierzy skórnej, ale wychwytuje różnicowanie i stratyfikację naskórka obserwowane in vivo. Opierając się na tym, modele zawierające składniki skórne i naskórkowe (keratynocyty i fibroblasty) są często określane jako odpowiedniki ludzkiej skóry (HSE), modele skóry o pełnej grubości lub organotypowe konstrukcje skóry (OSC). Krótko mówiąc, modele te są generowane przez zamknięcie komórek skóry właściwej w matrycach żelowych i wysianie komórek naskórka na wierzchu. Różnicowanie i stratyfikację naskórka można następnie osiągnąć za pomocą specjalistycznych mediów i ekspozycji na powietrze7. Odpowiedniki skóry były najczęściej generowane za pomocą technik samoorganizacji przy użyciu żeli skórnych wykonanych z kolagenu typu I (pochodzącego ze szczurzego ogona lub skóry bydlęcej)1,8, ale podobne modele zawierały inne składniki matrycy, takie jak fibrin9,10, pochodna fibroblastów11,12, martwe błony pozbawione naskórka13,14,15,16, dostępne na rynku żele i inne1,12,13,17,18,19. Obecnie na rynku dostępne są odpowiedniki skórek (jak wcześniej sprawdzono1,2). Są one jednak opracowywane przede wszystkim w celach terapeutycznych i nie można ich łatwo dostosować do konkretnych pytań badawczych.
HSE zostały zastosowane w badaniach nad gojeniem się ran, szczepieniami, toksykologią i chorobami skóry/developement11,12,13,16,8,20,21,22,23. Chociaż hodowla 3D bardziej kompleksowo modeluje funkcje tkanki ludzkiej w porównaniu z kulturami 2D24, włączenie różnych typów komórek, które dokładniej odzwierciedlają populację in vivo, umożliwia badania koordynacji komórka-komórka w złożonych tkankach24,25,26. Większość HSE obejmuje tylko fibroblasty skóry i keratynocyty naskórka27, chociaż środowisko skóry in vivo obejmuje wiele innych typów komórek. Ostatnie badania zaczęły obejmować więcej populacji komórek; Należą do nich komórki śródbłonka w naczyniach krwionośnych<klasa SUP="xref">10,<Klasa SUP="XREF">28,<klasa SUP="XREF">29,<Klasa SUP="XREF">30,31,32,33,34, adipocyty w tkance podskórnej35,<Klasa SUP="Xref">36, Składniki nerwowe19,21, stem cells27,37,38, immune cells10,39,40,41,42 i inne modele specyficzne dla choroby/raka16, 40, 43,44,45,46,47. Szczególnie ważne wśród nich jest unaczynienie; podczas gdy niektóre HSE obejmują komórki naczyniowe, ogólnie rzecz biorąc, nadal brakuje im kompleksowych elementów kapilarnych z łącznością w całej skórze właściwej<klasa sup = "xref" >10,< klasa sup = "xref">29 , rozszerzona stabilność in vitro<klasa sup = "xref">28 i odpowiedniej gęstości naczyń. Co więcej, modele HSE są zazwyczaj oceniane za pomocą sekcji histologicznej po hodowli, co ogranicza analizę trójwymiarowej struktury HSE. Analiza trójwymiarowa pozwala na wolumetryczną ocenę gęstości naczyń krwionośnych48,49, a także regionalne zróżnicowanie grubości i zróżnicowania naskórka.
Chociaż HSE są jednym z najpowszechniejszych modeli organotypowych, istnieje wiele technicznych wyzwań związanych z generowaniem tych konstrukcji, w tym identyfikacja odpowiedniej macierzy zewnątrzkomórkowej i gęstości komórek, receptury pożywek, właściwe procedury interfejsu ciecz powietrznej i analiza po hodowli. Ponadto, chociaż modele HEE i HSE opublikowały protokoły, nie istnieje szczegółowy protokół obejmujący obrazowanie naczyń skórnych i wolumetryczne, a nie analizę histologiczną. W pracy przedstawiono dostępny protokół hodowli unaczynionych odpowiedników ludzkiej skóry (VHSE) pochodzących głównie z komercyjnych linii komórkowych. Protokół ten został napisany tak, aby można go było łatwo dostosować, co pozwala na prostą adaptację do różnych typów komórek i potrzeb badawczych. W trosce o dostępność, dostępność i koszty, stosowanie prostych produktów i technik wytwarzania było traktowane priorytetowo w stosunku do stosowania produktów dostępnych na rynku. Ponadto opisano proste metody obrazowania wolumetrycznego i kwantyfikacji, które pozwalają na ocenę trójwymiarowej struktury VHSE. Przełożenie tej procedury na solidny i dostępny protokół umożliwia badaczom niebędącym specjalistami zastosowanie tych ważnych modeli w medycynie spersonalizowanej, unaczynionej inżynierii tkankowej, opracowywaniu przeszczepów i ocenie leków.

<table><tbody><tr><td>1 N NaOH</td><td>Fisher Chemical</td><td>S318-100</td> <td>(Rozcieńczony z zapasu laboratoryjnego)</td></tr> <tr><td>4% Paraformaldehyd</td><td>ACROS Organics</td> <td># 41678-5000, Lot # B0143461</td><td>Wykonany przy użyciu stałego paraformaldehydu w PBS, pH dostosowane do 6,9</td></tr><tr><td>Autoklawizowane kleszcze</td><td>Fine Science Tools</td><td>#11295-00</td><td>Dumont #5 kleszcze</td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Odczynniki Fisher</td><td>Cat # BP510-250, Lot # 190231</td><td>Rnaza, Dnaza, linia komórkowa wolna od proteazy</td></tr><tr><td>, śródbłonek: komórka śródbłonka mikronaczyniowego (HMEC1)</td><td>ATCC</td><td>CRL-3243</td><td>SV40 Unieśmiertelniona komórka śródbłonka mikronaczyniowego. Należy zauważyć, że użyto 750 000 komórek/ml kolagenu.</td></tr><tr><td>Linia komórkowa, fibroblasty: skórny ludzki fibroblast, dorosły</td><td>ATCC</td><td>PCS-201-012</td><td>Pierwotne komórki skórne. Należy zauważyć, że użyto 75 000 komórek/ml kolagenu.</td></tr><tr><td>Linia komórkowa, fibroblasty: ludzki firbroblast płucny (IMR90)</td> <td>ATCC</td><td>CCL-186</td><td>Pierwotne komórki embrionalne. Należy zauważyć, że użyto 75 000 komórek/ml kolagenu.</td></tr><tr><td>Linia komórkowa, keratynocyty: N/TERT-1</td><td></td><td></td><td>unieśmiertelniony przez ekspresję hTERT. N/TERT-1 wytworzono przy użyciu wektora retrowirusowego nadającego oporność na higromycynę. Linia komórkowa założona przez Dickson i wsp. 2000. Może być zastąpiony przez ATCC PCS-200-010 lub PCS-200-011. Należy zauważyć, że na konstrukt użyto 170 000 komórek; Komórki N / TERT1 muszą być używane z płytek, które są w 30% zlewające się - dwie 30% zlewające się 90-milimetrowe szalki do hodowli tkankowej dają więcej niż wystarczającą ilość komórek. Autorzy dziękują dr Jimowi Rheinwaldowi i dr Ellen H. van den Bogaard za hojny dar linii komórkowych N/TERT.</td></tr><tr><td>Wirówka</td><td>Thermo Scientific; Sorvall Legend X1R</td><td></td> <td>(standardowe wyposażenie laboratorium)</td></tr><tr><td>Oprogramowanie obliczeniowe</td><td>MATLAB</td><td>MATLAB 2020a</td><td>MathWorks, Natick, MA.</td></tr><tr><td>Mikroskop konfokalny</td><td>Leica TCS SPEII konfokalny</td><td></td><td>skaning laserowy konfokalny. Może być zastąpiony innymi mikroskopami konfokalnymi lub mikroskopią dekonwolucyjną.</td></tr><tr><td>Szkło nakrywkowe (22 x 22)</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-545F</td><td>0,13-0,17 mm Grubość nr 1</td></tr><tr><td>Super klej cyjanoakrylowy lub smar silikonowy</td><td>Mistrzowie kleju</td><td>#THI0102</td><td>Mistrzowie kleju, GRUBY, Klej błyskawiczny, Cyjanoakrylan; preferowany jest super klej</td></tr><tr><td>Baza medialna DMEM</td><td>Corning; Mediatech, Inc</td><td>REF # 10-013-CM; Lot # 26119007</td><td>DMEM, 1X (Dulbecco's Modification of Eagle's Medium) z 4,5 g/L glukozy, L-glutaminą i pirogronianem sodu</td></tr><tr><td>DMEM/F-12 50/50</td><td>Corning; Mediatech, Inc</td><td>REF # 10-090-CV; Numer pojazdu # 21119006</td><td>DMEM/F-12 50/50, 1X (Dulbecco's Mod. Of Eagle's Medium / Ham's F12 50/50 Mix) z L-glutaminą</td></tr><tr><td>Etanol</td><td>Decon Labs</td><td>#V1101</td><td>(standardowy odczynnik laboratoryjny)</td></tr><tr><td>Płodowa surowica bydlęca</td><td>Fisher Scientific</td><td>Cat # FB12999102, Lot # AE29451050</td> Research <td>Grade Płodowa surowica bydlęca, potrójnie 0,1 um sterylnie filtrowana</td></tr><tr><td>Kleszcze z cienką końcówką</td><td>Fine Science Tools</td><td>#11295-00</td><td>Kleszcze Dumont #5</td></tr><tr><td>Ludzki czynnik wzrostu naskórka (EFG) Panie przewodniczący!</td><td>Peprotech</td><td>Cat # AF-100-15-1MG, Lot # 0318AFC05 D0218</td><td>Składa się z 0,1% BSA w PBS</td></tr><tr><td>Hydrokortyzon</td><td>Alpha Easar</td><td>Lot # 5002F2A</td><td>składa się z DMSO</td></tr><tr><td>Insulina (ludzka)</td><td>Peprotech</td><td>Lot # 9352621</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop z odwróconym światłem/kontrastem fazowym</td><td>VWR</td><td>76317-470</td> <td>(standardowe wyposażenie laboratorium)</td></tr><tr><td>Izoproterenol</td><td>Alfa Aesar</td><td>#AAJ6178806</td><td>Chlorowodorek DL-izoproterenolu, 98%</td></tr> <tr><td>Keratynocyty-SFM (1x) podłoże</td><td>Gibco; Life Technologies Corporation</td><td>REF #: 10724-011; Lot # 2085518</td><td>Keratynocyt-SFM (1X); pożywka wolna od surowicy</td></tr><tr><td>Kwas L-askorbinowy</td><td>Fisher Chemical</td><td>Cat # A61-100, Lot # 181977, CAS # 50-81-7</td><td>Krystaliczny. Kwas L-askorbinowy można również kupić jako sól</td></tr><tr><td>L-glutamina (stała)</td><td>Fisher Bioreagents</td><td>CAT # BP379-100, LOT # 172183, CAS # 56-85-9</td><td>L-glutamina, białe kryształy lub krystaliczny proszek</td></tr><tr><td>MCDB 131 baza medialna</td><td>Gen Depot</td><td>CM034-050, Lot # 03062021</td><td>MCDB 131 Medium Base, bez L-glutaminy, sterylnie filtrowane</td></tr><tr><td>Stemple metalowe</td><td>Sona Enterprises (SE)</td><td>791LP, 12PC</td><td>Zestaw dziurkaczy do pustej skóry, stal wysokowęglowa, twardość: 48HRC; (różne rozmiary, w tym): 1/8", 5/32", 3/16", 7/32", 1/4", 9/32", 5/16", 3/4", 7/16", 1/2", 5/8:, 3/4". Ten zestaw dziurkaczy jest pomocny, ale nóż x-acto również może działać. Rozmiar metalowego stempla, który dobrze sprawdza się w przypadku 12-dołkowego transwell VHSE, to 3/8 "lub 1/2".</td></tr><tr><td>Metanol</td><td>Fisher Chemical CAS</td><td># 67-56-1</td> <td>(opcjonalnie). Do usuwania etapu odwodnienia.</td></tr><tr><td>Salicylan metylu</td><td>Fisher Chemical</td><td>O3695-500; Część # 164535; CAS # 119-36-8</td> <td>(opcjonalnie). Do rozliczenia.</td></tr><tr><td>Mikroprobówki, 1,7 ml</td><td>Genesee Scientific Corporation; Olympus Plastikowy</td><td>Kot # 24-282; Lot # 19467</td><td>Mikroprobówki 1,7 ml, przezroczyste; Odporny na gotowanie, polipropulen, certyfikowany Rnaza, Dnaza, DNA, inhibitor PCR i PBS bez endotoksyn</td></tr>, <tr><td>10x klasa hodowlana lub autoklawizowana</td><td>APEX Bioresearch Products</td><td>Cat # 20-134, Lot # 202237</td><td>Bufor PBS, 10x Suche opakowanie; Dodaj zawartość opakowania do pojemnika i dodaj wodę do 1 litra, aby uzyskać 10x skoncentrowany.</td></tr><tr><td>PBS, 1x Klasa hodowlana, (-) Wapń, (-) magnez</td><td>Genesee Scientific Corporation</td><td>Ref # 25-508; Lot # 07171015</td><td></td></tr><tr><td>PBS, 1x</td><td>APEX Bioresearch Products</td> klasy niehodowlanej <td>Kat # 20-134, Lot # 202237</td><td>Bufor PBS, 10x Suche opakowanie; Dodaj zawartość opakowania do pojemnika i dodaj wodę do 1 litra, aby uzyskać 10x skoncentrowany. Rozcieńczyć do 1x wodą.</td></tr><tr><td>Penicylina/Streptomycyna</td><td>Gibco; Life Technologies Corporation</td><td>Nr ref. # 15140-122, partia # 2199839</td><td>Pen Strep (10 000 jednostek/ml penicyliny; 10 000 ug/ml Streptomycyny)</td></tr><tr><td>Szalka Petriego, szkło, mała</td><td>Corning</td><td>PYREX 316060</td> <td>(opcjonalnie). Do stosowania jako pojemnik do czyszczenia</td></tr><tr><td>szalek Petriego, 100 mm</td><td>Fisher Scientific</td><td>FB0875713</td><td>Służy do sporządzania PDMS.</td></tr><tr><td>Polidimetylosiloksan (PDMS)</td><td>Dow Corning</td><td>GMID 02065622, partia # H04719H035</td><td>Sylgard 184 Silikonowa baza elastomerowa, Dow Corning, Midland, MI)</td></tr><tr><td></td><td>Dow Corning</td><td>GMID 02065622, Partia # H047JC4003</td><td>DOWSIL 184, Utwardzacz z elastomeru silikonowego</td></tr><td colspan="4">Uwaga: PDMS jest zwykle sprzedawany jako zestaw, który zawiera zarówno składniki bazy, jak i utwardzacza.<tr></td></tr><tr><td>Pipety wyporowe (1000 i 250 uL)</td><td>Gilson</td><td>1000 uL: HM05136, M1000. 250 uL: T12269L</td><td>Pojemność pipety M1000 (100-1000 uL); Pojemność pipety M250 do 250 uL</td></tr><tr><td>Końcówki/tłoki wyporowe (1000 i 250 uL)</td><td>Gilson</td><td>1000 uL: CAT # F148180, PARTIA # B01292902S; 250 uL: CAT # F148114, PARTIA # B05549718S</td><td>Sterylizowane kapilary i tłoki</td></tr><tr><td>Czerpak</td><td></td><td></td> z okrągłą końcówką <td>(opcjonalnie; standardowe wyposażenie laboratorium) Do manipulowania VHSE przed obrazowaniem</td></tr><tr><td>Suplementy do pożywek</td> <td>Keratynocyt-SFMGibco; Life Technologies Corporation</td><td>Nr ref. # 37000-015, partia # 2154180</td><td>zawiera rekombinowany ludzki EGF (kat. # 10450-013), ekstrakt z przysadki bydlęcej (kat. # 13028-014)</td></tr><tr><td>Wkładki do kultur tkankowych, 12 dołków, 3 i mikro; m wielkość porów</td><td>Corning; Costar</td><td>REF # 3462 - Przezroczysty; Lot # 14919057</td><td>Transwell; Wkładki o średnicy 12 mm, wielkość porów 3,0 um, poddana obróbce kultur tkankowych, membrana poliestrowa, płyty polistyrenowe,&nbsp;</td></tr><tr><td>Płytki do hodowli tkankowych, 12 dołków</td><td>Greiner Bio-one; Komórka Gwiazda</td><td>Kot # 665 180; Partia # E18103QT</td><td>12-dołkowa płytka do hodowli komórkowej; sterylna, z pokrywką; produkty są sterylne, wolne od wykrywalnych Dnazy, Rnazy, ludzkiego DNA i pirogenów. Zawartość niecytotoksyczne</td></tr><tr><td>płytki do hodowli tkankowych, 60,8 cm^2 obszar wzrostu</td><td>Genesee Scientific Corporation</td><td>Cat # 25-202; Nr partii: 191218-177B</td><td>Naczynia do hodowli tkankowych; poddane obróbce, powierzchnia wzrostu 60,8 cm^2; sterylne, Dnaza, Rnaza, bez pirogenów; polistyren z pierwszego tłoczenia</td></tr><tr><td>Triton x 100</td><td>Ricca Chemical Company</td><td>Cat # 8698.5-16, Lot # 4708R34</td><td>Środek zwilżający</td></tr><tr><td>Trypsyna 0,25%</td><td>Corning; Mediatech, Inc</td><td>Nr ref. # 25-053-CI</td><td>0,25% trypsyna, 2,21 mM EDTA, 1x [-] wodorowęglan sodu</td></tr><tr><td>Kolagen typu 1 wyizolowany z ogona szczura</td><td>Pel-Freez Biologicals</td><td>56054-1</td><td>Ogony szczurów Sprauge-Dawley można kupić zamrożone w Pel-Freez lub u innych dostawców. Kolagen można wyizolować ze ścięgien ogonowych. Odniesienia do protokołu izolacji [Cross i wsp., 2010; Rajan i wsp., 2007; Bornstein, 1958] . Alternatywnie, kolagen o wysokim stężeniu szczurzego ogona można kupić od dostawców, w tym Corning (numer katalogowy: 354249)</td></tr> <tr><td>Komora próżniowa, blat</td><td>Bel-Art</td><td>F42010-0000</td> <td>(standardowe wyposażenie laboratoryjne)</td></tr> <tr><td>Ręczny nóż precyzyjny</td><td>X-Acto</td><td>X3311</td> <td>(nóż X-Acto opcjonalnie w przypadku zakupu stempli stalowych)</td></tr></tbody></table>

generacja samoorganizujących się unaczynionych odpowiedników ludzkiej skóry

Generation of Self-assembled Vascularized Human Skin Equivalents

Odpowiedniki ludzkiej skóry (HSE) to konstrukty inżynierii tkankowej, które modelują składniki naskórka i skóry ludzkiej skóry. Modele te zostały wykorzystane do badania rozwoju skóry, gojenia się ran i technik szczepienia. Wiele HSE nadal nie ma unaczynienia i jest dodatkowo analizowanych poprzez sekcje histologiczne po hodowli, co ogranicza wolumetryczną ocenę struktury. Przedstawiono tutaj prosty protokół wykorzystujący dostępne materiały do generowania unaczynionych odpowiedników ludzkiej skóry (VHSE); Dalej opisano techniki obrazowania wolumetrycznego i kwantyfikacji tych konstruktów. Krótko mówiąc, VHSE są zbudowane w 12-dołkowych wkładkach hodowlanych, w których komórki skóry właściwej i naskórka są umieszczane w żelu kolagenu typu I z ogona szczura. Przedział skórny składa się z fibroblastów i komórek śródbłonka rozproszonych w żelu kolagenowym. Przedział naskórka składa się z keratynocytów (komórek nabłonka skóry), które różnicują się na granicy faz powietrze-ciecz. Co ważne, metody te można dostosować w zależności od potrzeb badacza, a wyniki wskazują na wytwarzanie VHSE z dwoma różnymi typami komórek fibroblastów: ludzkimi fibroblastami skórnymi (hDF) i ludzkimi fibroblastami płuc (IMR90). Opracowano VHSE, zobrazowano je za pomocą mikroskopii konfokalnej i poddano analizie objętościowej za pomocą oprogramowania obliczeniowego w 4- i 8-tygodniowych punktach czasowych. Opisano zoptymalizowany proces utrwalania, barwienia, obrazowania i czyszczenia VHSE do badania wolumetrycznego. Ten kompleksowy model, techniki obrazowania i analizy można łatwo dostosować do konkretnych potrzeb badawczych poszczególnych laboratoriów, z wcześniejszym doświadczeniem w zakresie BHP lub bez niego.

Celem tego protokołu jest opisanie generacji i analizy objętościowej unaczynionych odpowiedników ludzkiej skóry przy użyciu dostępnych i prostych technik dla długoterminowej hodowli. W miarę możliwości opisano uzasadnienie kroków, aby umożliwić badaczom dostosowanie ich do ich potrzeb badawczych.

Generacja samoorganizujących się unaczynionych odpowiedników ludzkiej skóry

Human skin equivalents (HSEs) are tissue engineered constructs that model epidermal and dermal components of human skin. These models have been used to ...

Szczegóły zawarte w tym protokole dotyczą generacji odpowiedników ludzkiej skóry, co często jest wyzwaniem technicznym. Uwzględniono nowatorskie elementy protokołu równoważnego ludzkiej skórze, takie jak obrazowanie naczyniowe i wolumetryczne. Technika ta umożliwia prostą konstrukcję modelu skóry, który bardziej odpowiada tkance in vivo do badań nad chorobami, starzeniem się i medycyną spersonalizowaną.Najtrudniejszą częścią tego protokołu jest przejście między zanurzeniem a interfejsem powietrze-ciecz. Prawdopodobnie zajmie to kilka prób, aby zoptymalizować czas i poziomy mediów w celu uzyskania spójnych wyników. Na początek dodaj 516 mikrolitrów pożywki do rurki z zimną nakrętką i natychmiast dodaj 375 mikrolitrów zimnego kolagenu za pomocą 1000-mikrolitrowej pipety wyporowej.Wyjmij pustą końcówkę pipety i przełącz się na przygotowaną pipetę wyporową o pojemności 250 mikrolitrów w celu wymieszania. Wymieszaj szybko, ale delikatnie, aby zapobiec nadmiernemu tworzeniu się pęcherzyków. Trzymając końcówkę w roztworze, mieszaj równomiernie z różnych pozycji probówki, aż roztwór uzyska jednorodny kolor, co zwykle zajmuje około pięciu cykli pipetowania lub 10 sekund.Natychmiast rozprowadzić 125 mikrolitrów kolagenu bezkomórkowego na błonie 12-dołkowej wkładki hodowlanej. Aby zapewnić równomierne pokrycie, przechyl płytkę i użyj końcówki pipety, aby pomalować membranę, delikatnie rozprowadzając kolagen wokół. Natychmiast przenieś 12-dołkową płytkę do inkubatora do hodowli komórkowych o temperaturze 37 stopni Celsjusza, aby żelowała przez co najmniej 20 minut.Po okresie żelowania wyjmij 12-dołkową płytkę z kolagenem bezkomórkowym z inkubatora. Wyjmij 1.7-mililitrową nakrętkę z mokrego lodu, a następnie wyjmij zapas kolagenu z lodówki i umieść go na mokrym lodzie z otwartą pokrywką. Dodaj 516 mikrolitrów schłodzonej zawiesiny ogniw do rurki z zimną nakrętką.Użyj pipety o pojemności 1000 mikrolitrów, aby natychmiast odpipetować 375 mikrolitrów zimnego roztworu kolagenu bezpośrednio do roztworu wewnątrz zakorkowanej probówki. Wyrzuć cały kolagen z pipety do probówki i wyrzuć końcówkę pipety wyporowej. Natychmiast przełącz się na pipetę o pojemności 250 mikrolitrów i wymieszaj roztwór kolagenu Po wymieszaniu przenieś 250 mikrolitrów komórkowego roztworu kolagenu na bezkomórkowe nośniki kolagenu w 12-dołkowej wkładce hodowlanej, a następnie przenieś 12-dołkową płytkę do inkubatora do hodowli komórkowych o temperaturze 37 stopni Celsjusza.Po 30-minutowym czasie żelowania delikatnie przechyl płytkę, aby ocenić żelowanie i upewnić się, że kolagen zastygł. Dodaj 500 mikrolitrów i 1000 mikrolitrów mieszanki odpowiednio do górnej i dolnej komory wkładu. Upewnij się, że żel kolagenowy jest zanurzony, w razie potrzeby dodając więcej pożywki.Umieścić płytkę studzienkową w inkubatorze do hodowli komórkowych w celu inkubacji przez noc. W siódmym dniu zanurzenia użyj ręcznej pipety, aby zebrać i wyrzucić pożywkę z dolnej i górnej komory każdej studzienki. Aby zebrać media, które utknęły bezpośrednio pod przepuszczalną membraną, umieść końcówkę pipety pod membraną, tymczasowo wybijając wkładkę z miejsca.Dodaj jeden mililitr ekwiwalentu ludzkiej skóry lub pożywki HSE uzupełnionej o 5% FPS do dolnej komory każdej studzienki i 200 mikrolitrów zawiesiny komórkowej do górnej komory każdej studzienki. Wysiewaj keratynocyty bezpośrednio na powierzchnię konstruktu skórnego i pozwól im osiąść przez dwie godziny w inkubatorze. Dwie godziny po wysianiu keratynocytów ostrożnie dodaj 300 mikrolitrów pożywki HSE, uzupełnionej o 5% FPS do górnej komory każdej studzienki konstruktu.Po załadowaniu pożywki umieść konstrukcję z powrotem w inkubatorze. Za pomocą pipety ręcznej podnieś każdą konstrukcję do granicy faz powietrze-ciecz lub ALI, usuwając odpady mediów tylko z górnej komory. Staraj się zbliżyć jak najbliżej warstwy naskórka, nie dotykając jej ani nie uszkadzając.Przechyl płytki lekko pod różnymi kątami, aby zebrać pożywkę, a następnie dodaj około dwóch mililitrów sterylnej wody do otaczających studzienek w płycie, aby utrzymać stałą wilgotność. Sprawdź płytkę kilka godzin później, aby upewnić się, że keratynocyty nadal znajdują się w ALI. Usuń wszelkie media z górnej komory, śledząc, ile mediów zostało usuniętych z każdej studzienki.Warstwy naskórka powinny wyglądać na nawilżone, a nie suche, ale na wierzchu konstrukcji nie powinny gromadzić się media. Aby przygotować konstrukt do barwienia immunofluorescencyjnego, odwróć wkładkę do góry nogami i umieść ją nad dołkiem na płytce studzienki. Ustabilizuj wkładkę jedną ręką, używając kleszczyków z cienką końcówką lub precyzyjnego noża, aby przeciąć około połowy obwodu membrany.Przytnij jak najbliżej plastikowej obudowy. Za pomocą kleszczyków z cienką końcówką chwyć krawędź przeciętej klapki membrany i delikatnie oderwij porowatą membranę od wkładki, a także konstrukcji VHSE. Jeśli konstrukcja utknie z boku komory, użyj kleszczyków z cienką końcówką lub małej czerpaka, aby przesunąć ją do studni.Gdy VHSE znajdzie się w studzience, wyrzuć wszelkie pozostałe kawałki membrany wkładki i trzymaj obudowę wkładki hodowlanej w każdym dołku, aby utrzymać VHSE w pozycji zanurzonej podczas barwienia. Dwa dni przed obrazowaniem przygotuj polidimetylosiloksan lub PDMS. Umieść czyste naczynie do mieszania na wadze i wytaruj wagę.Dodaj bazę, a następnie dodaj środek sieciujący. Mieszaj energicznie roztwór przez co najmniej cztery minuty, tworząc małe bąbelki. Po wystarczającym wymieszaniu wlej PDMS do 90 lub 100-milimetrowej szalki Petriego.Odgazuj PDMS w komorze próżniowej, aż wszystkie pęcherzyki znikną, a PDMS będzie czysty. Powoli zwolnij odkurzacz i wyjmij PDMS. Wstaw naczynie do piekarnika, aby utwardziło się przez noc w temperaturze od 50 do 60 stopni Celsjusza, upewniając się, że naczynie jest płasko, aby PDMS utwardził się równomiernie.Na dzień przed obrazowaniem użyj stalowego stempla lub ręcznego noża precyzyjnego, aby przebić lub wyciąć okrągłą studnię z arkusza PDMS, mniej więcej tego samego rozmiaru co konstrukcja VHSE. Wytnij kwadratową łatkę wokół okrągłej studzienki, aby utworzyć pojedynczą studzienkę PDMS. Używając szklanego szkiełka nakrywkowego o podobnym rozmiarze jak PDMS, dobrze dodaj klej cyjanoakrylowy do dolnej powierzchni PDMS i równomiernie rozsmaruj za pomocą jednorazowej końcówki do pipety.Wyśrodkuj szkło i dobrze dociśnij je do PDMS, pozostawiając przezroczyste szklane okienko w dziurkowanym okręgu. Pozostaw klej do wyschnięcia na noc przed użyciem. Charakterystyka naskórka i skóry właściwej wykazuje odpowiednie markery immunofluorescencyjne dla skóry człowieka w konstruktach VHSE.Cytokeratyna 10 jest markerem keratynocytów różnicowania wczesnego, który zwykle oznacza wszystkie warstwy nadpodstawne w odpowiednikach skóry. Inwolukryna i filagryna są późnymi markerami różnicowania w keratynocytach i oznaczają najwyższe warstwy nadpodstawne w odpowiednikach skóry. Oczyszczenie VHSE pozwoliło na proste obrazowanie w jednym ustawieniu i wyeliminowało potrzebę zmiany orientacji konstruktu w celu oddzielnego obrazowania skóry właściwej i naskórka.Obrazy wolumetryczne umożliwiają generowanie renderingów 3D w celu odwzorowania unaczynienia w każdym konstrukcie. Stosy obrazów zostały załadowane do oprogramowania obliczeniowego, a do renderowania 3D i kwantyfikacji użyto niestandardowego algorytmu. Szkieletyzacja określiła ostateczny środek każdego naczynia oznaczonego kolagenem IV, a uzyskane dane wykorzystano do obliczenia średnicy naczynia, a także frakcji naczyniowej.Po tej procedurze można przeprowadzić metody charakteryzacji, takie jak analiza bariery, skaningowa mikroskopia elektronowa, profile lipidowe i inne, aby zrozumieć, w jaki sposób unaczynienie wpływa na dojrzewanie i stabilność naskórka. Protokół ten umożliwia badania istotne tkankowo i specyficzne dla typu komórki w unaczynionym modelu skóry. Jest szczególnie przydatny do badań nad starzeniem się i medycyną spersonalizowaną.

generation-of-self-assembled-vascularized-human-skin-equivalents

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioinżynieria

Ten film opisuje szczegółowy protokół generowania organotypowych rekonstrukcji skóry in vitro 3D w celu zbadania progresji czerniaka. Ten model skóry naśladuje zarówno architekturę, jak i złożoność wielokomórkową narządów in vivo.

Generowanie organotypowych rekonstrukcji całej skóry: procedura tworzenia modelu 3D skóry na podstawie próbek ludzkiej skóry

Unaczynienie jest kluczem do skutecznego podejścia do inżynierii tkankowej. W związku z tym potrzebne są niezawodne technologie do oceny rozwoju sieci naczyniowych w konstruktach tkankowych. Tutaj przedstawiamy prostą i opłacalną metodę wizualizacji i ilościowego określania unaczynienia in vivo.

Pełny model ubytku skóry do oceny unaczynienia biomateriałów in vivo

Tutaj prezentujemy protokół do generowania przeszczepów naczyń krwionośnych z inżynierii tkankowej, które są funkcjonalne do szczepienia myszom poprzez podwójne wysiewanie częściowo indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (PiPSC) - pochodzących komórek mięśni gładkich i PiPSC - pochodzących komórek śródbłonka na bezkomórkowym bioreaktorze rusztowania naczyń krwionośnych.

Wytwarzanie i przeszczepianie naczyń krwionośnych metodą inżynierii tkankowej w modelu mysim

Celem tego protokołu jest stworzenie trójwymiarowego odpowiednika skóry o pełnej grubości, który przypomina naturalną skórę. Dzięki specjalnie skonstruowanemu zautomatyzowanemu urządzeniu do nawijania można generować precyzyjne i powtarzalne rany przy zachowaniu bezpłodności.

Generowanie trójwymiarowego ekwiwalentu skóry o pełnej grubości i automatycznego nawijania

Celem tego artykułu jest dostarczenie wyczerpującego i szczegółowego protokołu generowania genetycznie zmodyfikowanej ludzkiej organotypowej skóry z keratynocytów naskórka i zdewitalizowanej ludzkiej skóry właściwej.

Generowanie genetycznie zmodyfikowanych organotypowych kultur skóry przy użyciu zdewitalizowanej ludzkiej skóry właściwej

Proponujemy protokół, który pokazuje, jak różnicować indukowane pluripotencjalne keratynocyty i fibroblasty pochodzące z komórek macierzystych oraz generować organoid skóry 3D, używając tych keratynocytów i fibroblastów. Protokół ten zawiera dodatkowy krok generowania humanizowanego modelu myszy. Przedstawiona tutaj technika usprawni badania dermatologiczne.

Generowanie organoidu 3D skóry z pluripotencjalnych komórek macierzystych indukowanych krwią pępowinową

Ten protokół opisuje prostą metodę hodowli trójwymiarowego, zrekonstruowanego ludzkiego naskórka w powtarzalny i solidny sposób. Dodatkowo scharakteryzowano zależność struktura-funkcja modelu bariery naskórkowej. Przedstawiono również reakcje biologiczne zrekonstruowanego naskórka ludzkiego na bodźce prozapalne.

Hodowla trójwymiarowego zrekonstruowanego ludzkiego naskórka na dużą skalę

Tutaj prezentujemy protokół do generowania trójwymiarowego, uproszczonego i niezróżnicowanego modelu skóry za pomocą mikroobrabianej platformy mikroprzepływowej. Podejście oparte na przepływie równoległym pozwala na osadzanie na miejscu komory skórnej w celu wysiewu komórek nabłonka na wierzchu, a wszystko to kontrolowane przez pompy strzykawkowe.

Generowanie uproszczonego trójwymiarowego modelu typu skin-on-a-chip w mikroobrabianej platformie mikroprzepływowej

Ten protokół opisuje tworzenie samoorganizujących się naczyń krwionośnych z ludzkich pluripotencjalnych i indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych. Te sieci naczyń krwionośnych wykazują rozległą i połączoną sieć śródbłonka otoczoną perycytami, aktyną mięśni gładkich i ciągłą błoną podstawną.

Wytwarzanie organoidów ludzkich naczyń krwionośnych z pluripotencjalnych komórek macierzystych

Tutaj prezentujemy niedrogie i proste procedury wprowadzania różnych modeli 3D skóry do rutynowych badań w laboratorium hodowli komórkowych. Badacze mogą tworzyć modele dostosowane do ich potrzeb bez konieczności polegania na modelach dostępnych na rynku.

Tworzenie modeli skóry do wielu zastosowań - od dwuwymiarowej (2D) monokultury do trójwymiarowej (3D) wielokulturowości

Protokół ten określa metodę wytwarzania organoidów skóry zawierających mieszki włosowe pochodzące z ludzko indukowanych pluripotentnych komórek macierzystych, wykorzystując płaski, fizjologicznie istotny system hodowli powietrzno-cieczowy, aby odwzorować architekturę i funkcję skóry.

Generowanie ludzko indukowanych pluripotentnych pluripotentnych organoidów skórnych z komórek macierzystych z użyciem systemu hodowli powietrze-ciecz

Poznaj metodę generacji unaczynionych odpowiedników ludzkiej skóry do badań nad chorobami, starzeniem i medycyną spersonalizowaną. Protokół obejmuje hodowlę długoterminową oraz analizę objętościową.

Generacja samoorganizujących się unaczynionych odpowiedników ludzkiej skóry

Przeglądaj więcej filmów