Generacja samoorganizujących się unaczynionych odpowiedników ludzkiej skóry

Szczegóły zawarte w tym protokole dotyczą generacji odpowiedników ludzkiej skóry, co często jest wyzwaniem technicznym. Uwzględniono nowatorskie elementy protokołu równoważnego ludzkiej skórze, takie jak obrazowanie naczyniowe i wolumetryczne. Technika ta umożliwia prostą konstrukcję modelu skóry, który bardziej odpowiada tkance in vivo do badań nad chorobami, starzeniem się i medycyną spersonalizowaną.

Najtrudniejszą częścią tego protokołu jest przejście między zanurzeniem a interfejsem powietrze-ciecz. Prawdopodobnie zajmie to kilka prób, aby zoptymalizować czas i poziomy mediów w celu uzyskania spójnych wyników. Na początek dodaj 516 mikrolitrów pożywki do rurki z zimną nakrętką i natychmiast dodaj 375 mikrolitrów zimnego kolagenu za pomocą 1000-mikrolitrowej pipety wyporowej.

Wyjmij pustą końcówkę pipety i przełącz się na przygotowaną pipetę wyporową o pojemności 250 mikrolitrów w celu wymieszania. Wymieszaj szybko, ale delikatnie, aby zapobiec nadmiernemu tworzeniu się pęcherzyków. Trzymając końcówkę w roztworze, mieszaj równomiernie z różnych pozycji probówki, aż roztwór uzyska jednorodny kolor, co zwykle zajmuje około pięciu cykli pipetowania lub 10 sekund.

Natychmiast rozprowadzić 125 mikrolitrów kolagenu bezkomórkowego na błonie 12-dołkowej wkładki hodowlanej. Aby zapewnić równomierne pokrycie, przechyl płytkę i użyj końcówki pipety, aby pomalować membranę, delikatnie rozprowadzając kolagen wokół. Natychmiast przenieś 12-dołkową płytkę do inkubatora do hodowli komórkowych o temperaturze 37 stopni Celsjusza, aby żelowała przez co najmniej 20 minut.

Po okresie żelowania wyjmij 12-dołkową płytkę z kolagenem bezkomórkowym z inkubatora. Wyjmij 1.7-mililitrową nakrętkę z mokrego lodu, a następnie wyjmij zapas kolagenu z lodówki i umieść go na mokrym lodzie z otwartą pokrywką. Dodaj 516 mikrolitrów schłodzonej zawiesiny ogniw do rurki z zimną nakrętką.

Użyj pipety o pojemności 1000 mikrolitrów, aby natychmiast odpipetować 375 mikrolitrów zimnego roztworu kolagenu bezpośrednio do roztworu wewnątrz zakorkowanej probówki. Wyrzuć cały kolagen z pipety do probówki i wyrzuć końcówkę pipety wyporowej. Natychmiast przełącz się na pipetę o pojemności 250 mikrolitrów i wymieszaj roztwór kolagenu Po wymieszaniu przenieś 250 mikrolitrów komórkowego roztworu kolagenu na bezkomórkowe nośniki kolagenu w 12-dołkowej wkładce hodowlanej, a następnie przenieś 12-dołkową płytkę do inkubatora do hodowli komórkowych o temperaturze 37 stopni Celsjusza.

Po 30-minutowym czasie żelowania delikatnie przechyl płytkę, aby ocenić żelowanie i upewnić się, że kolagen zastygł. Dodaj 500 mikrolitrów i 1000 mikrolitrów mieszanki odpowiednio do górnej i dolnej komory wkładu. Upewnij się, że żel kolagenowy jest zanurzony, w razie potrzeby dodając więcej pożywki.

Umieścić płytkę studzienkową w inkubatorze do hodowli komórkowych w celu inkubacji przez noc. W siódmym dniu zanurzenia użyj ręcznej pipety, aby zebrać i wyrzucić pożywkę z dolnej i górnej komory każdej studzienki. Aby zebrać media, które utknęły bezpośrednio pod przepuszczalną membraną, umieść końcówkę pipety pod membraną, tymczasowo wybijając wkładkę z miejsca.

Dodaj jeden mililitr ekwiwalentu ludzkiej skóry lub pożywki HSE uzupełnionej o 5% FPS do dolnej komory każdej studzienki i 200 mikrolitrów zawiesiny komórkowej do górnej komory każdej studzienki. Wysiewaj keratynocyty bezpośrednio na powierzchnię konstruktu skórnego i pozwól im osiąść przez dwie godziny w inkubatorze. Dwie godziny po wysianiu keratynocytów ostrożnie dodaj 300 mikrolitrów pożywki HSE, uzupełnionej o 5% FPS do górnej komory każdej studzienki konstruktu.

Po załadowaniu pożywki umieść konstrukcję z powrotem w inkubatorze. Za pomocą pipety ręcznej podnieś każdą konstrukcję do granicy faz powietrze-ciecz lub ALI, usuwając odpady mediów tylko z górnej komory. Staraj się zbliżyć jak najbliżej warstwy naskórka, nie dotykając jej ani nie uszkadzając.

Przechyl płytki lekko pod różnymi kątami, aby zebrać pożywkę, a następnie dodaj około dwóch mililitrów sterylnej wody do otaczających studzienek w płycie, aby utrzymać stałą wilgotność. Sprawdź płytkę kilka godzin później, aby upewnić się, że keratynocyty nadal znajdują się w ALI. Usuń wszelkie media z górnej komory, śledząc, ile mediów zostało usuniętych z każdej studzienki.

Warstwy naskórka powinny wyglądać na nawilżone, a nie suche, ale na wierzchu konstrukcji nie powinny gromadzić się media. Aby przygotować konstrukt do barwienia immunofluorescencyjnego, odwróć wkładkę do góry nogami i umieść ją nad dołkiem na płytce studzienki. Ustabilizuj wkładkę jedną ręką, używając kleszczyków z cienką końcówką lub precyzyjnego noża, aby przeciąć około połowy obwodu membrany.

Przytnij jak najbliżej plastikowej obudowy. Za pomocą kleszczyków z cienką końcówką chwyć krawędź przeciętej klapki membrany i delikatnie oderwij porowatą membranę od wkładki, a także konstrukcji VHSE. Jeśli konstrukcja utknie z boku komory, użyj kleszczyków z cienką końcówką lub małej czerpaka, aby przesunąć ją do studni.

Gdy VHSE znajdzie się w studzience, wyrzuć wszelkie pozostałe kawałki membrany wkładki i trzymaj obudowę wkładki hodowlanej w każdym dołku, aby utrzymać VHSE w pozycji zanurzonej podczas barwienia. Dwa dni przed obrazowaniem przygotuj polidimetylosiloksan lub PDMS. Umieść czyste naczynie do mieszania na wadze i wytaruj wagę.

Dodaj bazę, a następnie dodaj środek sieciujący. Mieszaj energicznie roztwór przez co najmniej cztery minuty, tworząc małe bąbelki. Po wystarczającym wymieszaniu wlej PDMS do 90 lub 100-milimetrowej szalki Petriego.

Odgazuj PDMS w komorze próżniowej, aż wszystkie pęcherzyki znikną, a PDMS będzie czysty. Powoli zwolnij odkurzacz i wyjmij PDMS. Wstaw naczynie do piekarnika, aby utwardziło się przez noc w temperaturze od 50 do 60 stopni Celsjusza, upewniając się, że naczynie jest płasko, aby PDMS utwardził się równomiernie.

Na dzień przed obrazowaniem użyj stalowego stempla lub ręcznego noża precyzyjnego, aby przebić lub wyciąć okrągłą studnię z arkusza PDMS, mniej więcej tego samego rozmiaru co konstrukcja VHSE. Wytnij kwadratową łatkę wokół okrągłej studzienki, aby utworzyć pojedynczą studzienkę PDMS. Używając szklanego szkiełka nakrywkowego o podobnym rozmiarze jak PDMS, dobrze dodaj klej cyjanoakrylowy do dolnej powierzchni PDMS i równomiernie rozsmaruj za pomocą jednorazowej końcówki do pipety.

Wyśrodkuj szkło i dobrze dociśnij je do PDMS, pozostawiając przezroczyste szklane okienko w dziurkowanym okręgu. Pozostaw klej do wyschnięcia na noc przed użyciem. Charakterystyka naskórka i skóry właściwej wykazuje odpowiednie markery immunofluorescencyjne dla skóry człowieka w konstruktach VHSE.

Cytokeratyna 10 jest markerem keratynocytów różnicowania wczesnego, który zwykle oznacza wszystkie warstwy nadpodstawne w odpowiednikach skóry. Inwolukryna i filagryna są późnymi markerami różnicowania w keratynocytach i oznaczają najwyższe warstwy nadpodstawne w odpowiednikach skóry. Oczyszczenie VHSE pozwoliło na proste obrazowanie w jednym ustawieniu i wyeliminowało potrzebę zmiany orientacji konstruktu w celu oddzielnego obrazowania skóry właściwej i naskórka.

Obrazy wolumetryczne umożliwiają generowanie renderingów 3D w celu odwzorowania unaczynienia w każdym konstrukcie. Stosy obrazów zostały załadowane do oprogramowania obliczeniowego, a do renderowania 3D i kwantyfikacji użyto niestandardowego algorytmu. Szkieletyzacja określiła ostateczny środek każdego naczynia oznaczonego kolagenem IV, a uzyskane dane wykorzystano do obliczenia średnicy naczynia, a także frakcji naczyniowej.

Po tej procedurze można przeprowadzić metody charakteryzacji, takie jak analiza bariery, skaningowa mikroskopia elektronowa, profile lipidowe i inne, aby zrozumieć, w jaki sposób unaczynienie wpływa na dojrzewanie i stabilność naskórka. Protokół ten umożliwia badania istotne tkankowo i specyficzne dla typu komórki w unaczynionym modelu skóry. Jest szczególnie przydatny do badań nad starzeniem się i medycyną spersonalizowaną.