Name: Pożywka kondycjonowana z kością: przygotowanie i test biologiczny (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-07-08T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 18 s
Description: Naucz się przygotowywać pożywkę kondycjonowaną z kością z fragmentów szczęki świni i testować jej aktywność biologiczną na komórkach in vitro. Metoda obejmuje zbieranie fragmentów kości, ich obróbkę cieplną lub demineralizację oraz analizę ekspresji genów metodą PCR.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy chcieliby podziękować Catherine Solioz za jej umiejętną pomoc.

1. Przygotowanie BCM
<ol>
	<li>Zaopatrz się w żuchwy wieprzowe od lokalnego rzeźnika tak świeże, jak to możliwe. Umieść żuchwy na twardej powierzchni i zwolnij klapę o pełnej grubości, zwracając szczególną uwagę, aby nie pozostawić żadnej tkanki miękkiej lub okostnej przyczepionej do kości. Praca w czystym środowisku bez konieczności pracy pod okapem przepływowym.</li>
	<li>Po zwolnieniu płata o pełnej grubości użyj skrobaka do kości, aby zebrać wióry kostne od strony policzkowej. Należy pamiętać, że skrobak do kości musi być ostry. Trzymaj mocno skrobak do kości i długimi ruchami zbierz kość. Wyrzuć kawałki kości mniejsze niż 1 mm.
	<ol>
		<li>Aby utrzymać natywne wióry kostne, umieść je bezpośrednio w plastikowych naczyniach o średnicy 10 cm z pożywką Dulbecco's Modified Eagle's (DMEM) uzupełnioną 1% antybiotykami i środkami przeciwgrzybiczymi, nie dopuszczając do ich wyschnięcia.</li>
		<li>Aby ocenić wpływ obróbki termicznej, należy poddać wióry kostne pasteryzacji przez 30 minut w temperaturze 80 °C lub autoklawowi przez 20 minut w temperaturze 121 °C.</li>
		<li>Aby ocenić wpływ demineralizacji, należy wstrząsać wiórami kostnymi w 1 M HCL przez 4-6 godzin w temperaturze 4 °C i kilkakrotnie przemywać pożywką hodowlaną, aż pH będzie neutralne.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Umieść łącznie 5 g wiórów kostnych na 10 ml świeżego DMEM uzupełnionego 1% antybiotykami i środkami przeciwgrzybiczymi w nowym plastikowym naczyniu.</li>
	<li>Umieść plastikowe naczynia w wilgotnej atmosferze w temperaturze 37 °C na 24 godziny. Następnie zbierz BCM. Odwirować BCM przy 200 x g przez 10 minut w celu usunięcia zanieczyszczeń, przefiltrować go do sterylnego (0,2 nm) i utrzymać podwielokrotności zamrożone w temperaturze -80 °C.</li>
	<li>Rozmrażaj bulion BCM bezpośrednio przed użyciem i unikaj powtarzających się cykli zamrażania i rozmrażania.</li>
	<li>We wskazanych eksperymentach należy namoczyć błony kolagenowe za pomocą BCM lub pożywki bez surowicy przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej. Energicznie przemyć membrany PBS i umieścić je w 96-dołkowych płytkach. Mokre błony są obsiane komórkami.</li>
	<li>Proces przygotowania BCM podsumowano na rysunku 1.</li>
</ol>
2. Testy biologiczne na podstawie komórek mezenchymalnych
<ol>
	<li>Wysiewaj ludzkie komórki mezenchymalne (na przykład komórki kostne, fibroblasty więzadeł dziąseł i przyzębia) na 12-dołkową płytkę o stężeniu 30 000 komórek/cm2. Do wysiewu komórek należy użyć pożywki wzrostowej składającej się z DMEM, 10% płodowej surowicy cielęcej i antybiotyków. Pozwól komórkom przymocować się do płytki O/N.</li>
	<li>Odrzucić pożywkę hodowlaną i przemyć komórki wstępnie ogrzanym PBS w temperaturze 37 °C. Stymulować komórki poprzez dodanie wstępnie podgrzanej pożywki hodowlanej bez surowicy z 20% BCM lub bez niej. Umieścić komórki w wilgotnej atmosferze o temperaturze 37 °C na 24 godziny.</li>
	<li>Wyrzuć pożywkę hodowlaną, przepłucz komórki wstępnie podgrzanym PBS i wyekstrahuj RNA zgodnie z preferowanym protokołem.</li>
	<li>Dostosuj stężenie RNA, aby uzyskać taką samą ilość RNA w każdej próbce. Przygotować cDNA i przeprowadzić qRT-PCR w celu analizy wybranych genów przy użyciu starterów pokazanych w tabeli 1. 
	UWAGA: Są to rozcieńczenia każdego składnika: 2x SYBR Green, 20x starter do przodu, 20x starter reverse, 5x sterylna woda DD, 5x cDNA. qRT-PCR wykonuje się w 40 cyklach w temperaturze 95 °C 15 sekund i 60 °C 1 min.</li>
	<li>Obliczyć względne poziomy ekspresji, normalizując do genu porządkowego GAPDH przy użyciu metody Δ(ΔCt), gdzie ΔCT jest celem CT - CT GAPDH, a Δ(ΔCT) jest stymulowany ΔCT - kontrola ΔCT.</li>
	<li>Po tej kontroli jakości dodaj BCM do pożywki hodowlanej, aby stymulować wszystkie typy komórek, w tym komórki mezenchymalne, komórki krwiotwórcze lub komórki śródbłonka.</li>
</ol>

<ol><li>Buser, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+Stability+of+Early+Implant+Placement+with+Contour+Augmentation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+dental+research%22%5BJournal%5D)">Long-term Stability of Early Implant Placement with Contour Augmentation.</a> Journal of dental research. , (2013).</li>
<li>Chiapasco, M., Casentini, P., Bone Zaniboni, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((augmentation+procedures+in+implant+dentistry%5BTitle%5D)+AND+%22The+International+journal+of+oral+%26+maxillofacial+implants.+24+Suppl%22%5BJournal%5D)">augmentation procedures in implant dentistry.</a> The International journal of oral & maxillofacial implants. 24 Suppl. , 237-259 (2009).</li>
<li>Giannoudis, P. V., Dinopoulos, H., Bone Tsiridis, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((substitutes%3A+an+update.+Injury%5BTitle%5D)+AND+%2236%2C+Suppl+3.+S20-S27%22%5BJournal%5D)">substitutes: an update. Injury.</a> 36, Suppl 3. S20-S27. , (2005).</li>
<li>Jensen, S. S., Broggini, N., Hjorting-Hansen, E., Schenk, R., Bone Buser, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((healing+and+graft+resorption+of+autograft%2C+anorganic+bovine+bone+and+beta-tricalcium+phosphate.+A+histologic+and+histomorphometric+study+in+the+mandibles+of+minipigs%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+oral+implants+research%22%5BJournal%5D)">healing and graft resorption of autograft, anorganic bovine bone and beta-tricalcium phosphate. A histologic and histomorphometric study in the mandibles of minipigs.</a> Clinical oral implants research. 17, 237-243 (2006).</li>
<li>Jensen, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+a+novel+biphasic+calcium+phosphate+in+standardized+bone+defects%3A+a+histologic+and+histomorphometric+study+in+the+mandibles+of+minipigs%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+oral+implants+research%22%5BJournal%5D)">Evaluation of a novel biphasic calcium phosphate in standardized bone defects: a histologic and histomorphometric study in the mandibles of minipigs.</a> Clinical oral implants research. 18, 752-760 (2007).</li>
<li>Grabowski, G., Bone Cornett, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((graft+and+bone+graft+substitutes+in+spine+surgery%3A+current+concepts+and+controversies%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+the+American+Academy+of+Orthopaedic+Surgeons%22%5BJournal%5D)">graft and bone graft substitutes in spine surgery: current concepts and controversies.</a> The Journal of the American Academy of Orthopaedic Surgeons. 21, 51-60 (2013).</li>
<li>Khan, S. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+biology+of+bone+grafting%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+the+American+Academy+of+Orthopaedic+Surgeons%22%5BJournal%5D)">The biology of bone grafting.</a> The Journal of the American Academy of Orthopaedic Surgeons. 13, 77-86 (2005).</li>
<li>Bohr, H., Ravn, H. O., Werner, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+osteogenic+effect+of+bone+transplants+in+rabbits.+The+Journal+of+bone+and+joint+surgery%5BTitle%5D)+AND+%22British%22%5BJournal%5D)">The osteogenic effect of bone transplants in rabbits. The Journal of bone and joint surgery.</a> British. 50, 866-873 (1968).</li>
<li>Bone Urist, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((formation+by+autoinduction%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">formation by autoinduction.</a> Science. 150, 893-899 (1965).</li>
<li>Caballé-Serrano, J. D., Buser, D., Gruber, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteomic+analysis+of+porcine+bone+conditioned+medium%5BTitle%5D)+AND+%22The+International+journal+of+oral+%26+maxillofacial+implants%22%5BJournal%5D)">Proteomic analysis of porcine bone conditioned medium.</a> The International journal of oral & maxillofacial implants. , (2014).</li>
<li>Peng, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bone-Conditioned+Medium+Inhibits+Osteogenic+and+Adipogenic+Differentiation+of+Mesenchymal+Cells+In+Vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+implant+dentistry+and+related+research%22%5BJournal%5D)">Bone-Conditioned Medium Inhibits Osteogenic and Adipogenic Differentiation of Mesenchymal Cells In Vitro.</a> Clinical implant dentistry and related research. , (2014).</li>
<li>Brolese, E., Buser, D., Kuchler, U., Schaller, B., Gruber, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+bone+chips+release+of+sclerostin+and+FGF-23+into+the+culture+medium%3A+an+in+vitro+pilot+study%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+oral+implants+research%22%5BJournal%5D)">Human bone chips release of sclerostin and FGF-23 into the culture medium: an in vitro pilot study.</a> Clinical oral implants research. , (2014).</li>
<li>Caballé-Serrano, J., Bosshardt, D. D., Gargallo-Albiol, J., Buser, D., Bone Gruber, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((conditioned+medium+enhances+osteoclastogenesis+in+murine+bone+marrow+cultures.+Clin+Oral+Impl+Res%3B+in%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Oral+Maxillofac+Surg%22%5BJournal%5D)">conditioned medium enhances osteoclastogenesis in murine bone marrow cultures. Clin Oral Impl Res; in.</a> Int J Oral Maxillofac Surg. , (2015).</li>
<li>Zimmermann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bone-conditioned+medium+changes+gene+expression+in+bone-derived+fibroblasts%29%5BTitle%5D)+AND+%22IJOMI+accepted%22%5BJournal%5D)">Bone-conditioned medium changes gene expression in bone-derived fibroblasts).</a> IJOMI accepted. , (2014).</li>
<li>Fulzele, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myelopoiesis+is+regulated+by+osteocytes+through+Gsalpha-dependent+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Myelopoiesis is regulated by osteocytes through Gsalpha-dependent signaling.</a> Blood. 121, 930-939 (2013).</li>
<li>Becerra, J., Andrades, J. A., Ertl, D. C., Sorgente, N., Nimni, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Demineralized+bone+matrix+mediates+differentiation+of+bone+marrow+stromal+cells+in+vitro%3A+effect+of+age+of+cell+donor%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of%22%5BJournal%5D)">Demineralized bone matrix mediates differentiation of bone marrow stromal cells in vitro: effect of age of cell donor.</a> Journal of. 11, 1703-1714 (1996).</li>
<li>Kupcova Skalnikova,, H, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteomic+techniques+for+characterisation+of+mesenchymal+stem+cell+secretome%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimie%22%5BJournal%5D)">Proteomic techniques for characterisation of mesenchymal stem cell secretome.</a> Biochimie. , (2013).</li>
<li>Romanello, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Osteoblastic+cell+secretome%3A+A+novel+role+for+progranulin+during+risedronate+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Osteoblastic cell secretome: A novel role for progranulin during risedronate treatment.</a> , Bone. (2013).</li>
<li>Schuldt Filho,, G, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conditioned+medium+of+demineralized+bone+matrix+activates+TGF-%CE%B2+signaling+pathways+in+mesenchymal+cells+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cranio+Maxill+Surg%22%5BJournal%5D)">Conditioned medium of demineralized bone matrix activates TGF-β signaling pathways in mesenchymal cells in vitro.</a> J Cranio Maxill Surg. , (2015).</li>
<li>Buser, D., Chen, S. T., Weber, H. P., Belser, U. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Early+implant+placement+following+single-tooth+extraction+in+the+esthetic+zone%3A+biologic+rationale+and+surgical+procedures%29%5BTitle%5D)+AND+%22The+International+journal+of+periodontics+%26+restorative+dentistry%22%5BJournal%5D)">Early implant placement following single-tooth extraction in the esthetic zone: biologic rationale and surgical procedures).</a> The International journal of periodontics & restorative dentistry. 28, 441-451 (2008).</li>
<li>Stoecklin-Wasmer, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Absorbable+collagen+membranes+for+periodontal+regeneration%3A+a+systematic+review%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+dental+research%22%5BJournal%5D)">Absorbable collagen membranes for periodontal regeneration: a systematic review.</a> Journal of dental research. 92, progress. 773-781 (2013).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia. Jordi Caballé-Serrano otrzymał stypendium Fundacji Badań i Edukacji Stomatologicznej w Bazylei w Szwajcarii.

Pożywka kondycjonowana kością odzwierciedla uwolnioną aktywność przeszczepów kostnych we wczesnych stadiach regeneracji kości. Opisany tutaj protokół można dostosować do badania odpowiedzi różnych typów komórek biorących udział w regeneracji kości. Ponadto protokół może być stosowany do przygotowania kondycjonowanego podłoża z przetworzonej kości lub wypełniaczy kostnych. Metody są łatwe do wykonania i opierają się na prostej koncepcji: czynniki uwalniane z różnych natywnych i przetworzonych kości. Zrozumienie, w jaki sp...

Autologiczna kość jest powszechnie stosowana do wypełniania defektów, które powstały w wyniku wad rozwojowych, chirurgii resekcyjnej, chirurgii urazów rekonstrukcyjnych i przed wszczepieniem implantu 1,2. Zrozumienie biologicznych zasad tego, w jaki sposób przeszczepy kostne wspierają proces konsolidacji przeszczepów, jest nie tylko kluczem do zrozumienia, dlaczego autoprzeszczepy są uważane za złoty standard w chirurgii rekonstrukcyjnej, ale jest również bioniczne dla ulepszonego projektowania substytutów kości 3. Mimo to konsolidacja przeszczepu jest szybsza w przypadku kości autologicznej w porównaniu z substytutami kości 4,5. Dlatego konieczne jest ujawnienie mechanizmów molekularnych i komórkowych, które sprawiają, że autologiczna kość jest tak skuteczna we wspomaganiu regeneracji kości.
Istnieją trzy podręcznikowe cechy autoprzeszczepów, które są uważane za wspierające proces konsolidacji 6,7. Po pierwsze, kość autologiczna jest osteokondukcyjna, zapewniając wskazówki dla nowo powstałej kości, aby wrastać w ubytek. Po drugie, kość autologiczna jest kościonetna, co oznacza, że zawiera komórki mezenchymalne, które mogą różnicować się w osteoblasty 8. Po trzecie, kość autologiczna jest kościochłonna, ponieważ czynniki wzrostu, takie jak białka morfogenetyczne kości zanurzone w macierzy, mogą inicjować proces tworzenia kości śródchrzęstnej lub nawet śródbłoniastej 9. Jest jeszcze jeden aspekt: świeżo przygotowane wióry kostne pełnią funkcję parakrynną na podstawie obserwacji in vitro z "pożywką kondycjonowaną przez kość" 10-15. Należy również wspomnieć o wpływie mielopoezy 16. Podobny termin "zdemineralizowane podłoże kondycjonowane macierzą kostną" został ukuty już w 1996 roku i wspiera ogólną koncepcję parakrynnej funkcji kości, nawet gdy jest przetwarzana przez demineralizację 17. Dla naszych celów BCM może być przygotowany ze świeżych żuchw świni 10,11. Analizy proteomiczne BCM ujawniły złożony skład, w tym czynniki wzrostu i składniki macierzy zewnątrzkomórkowej 10, poszerzając również istniejącą wiedzę na temat proteasomu całej kości 18,19. W związku z tym BCM powinien odzwierciedlać uwolnioną aktywność różnych modyfikacji przeszczepów kostnych in vitro.
Co się dzieje, gdy komórki mezenchymalne, na przykład te wyizolowane z wiórów kostnych lub z tkanek miękkich jamy ustnej, są narażone na działanie BCM? In vitro BCM zmniejsza różnicowanie osteogenne i adipogenne oraz wywołuje silny wzrost ekspresji IL11 11. Mikromacierz obejmująca cały genom ujawniła, że więcej genów ulega zróżnicowanej ekspresji w komórkach mezenchymalnych w odpowiedzi na BCM. Wśród tych genów są adrenomedullina (ADM), IL11, IL33, oksydaza NADPH 4 (NOX4), proteoglikan 4 (PRG4 lub lubrycyna) i pentraksyna 3 (PTX3) 15. BCM uzyskany z autoklawowanych chipów kostnych nie zmienił ekspresji odpowiednich genów 14. BCM z wiórów kostnych, które zostały poddane pasteryzacji i zamrażaniu, był w stanie zmienić ekspresję genów 14. Również kondycjonowane podłoże zdemineralizowanej macierzy kostnej (DBM-CM) zmienia ekspresję genów regulowanych przez TGF-β 20. Co ciekawe, błony barierowe kolagenu używane do ochrony wiórów kostnych przed otaczającą tkanką miękką 21,22 adsorbowały te części BCM, które są odpowiedzialne za zmiany w ekspresji genów 23. Badania BCM można rozszerzyć na inne typy komórek biorące udział w regeneracji kości, takie jak osteoklasty resorbujące kości i komórki śródbłonka, by wymienić tylko kilka. Ogólnie rzecz biorąc, zgromadzone dane z badań in vitro stanowią podstawę naukową do zaprojektowania badania przedklinicznego.
Obecny protokół jest dwojaki: Po pierwsze, pokazuje, jak przygotować BCM. Po drugie, pokazuje, jak badać jego aktywność biologiczną w oparciu o komórki mezenchymalne in vitro.

<table><tbody><tr><td>Żuchwy świni</td><td>Lokalny bucher</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Skrobak</td><td>do kości Hu-Friedy</td><td>PPBUSE2/36</td><td></td></tr><tr><td>Antybiotyki i Antymikotyki</td><td>All life Technologies</td><td>15240-062</td><td></td></tr><tr><td>Membrany kolagenowe (Bio-Gide)</td><td>Geistlich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Surowica cielęca płodu</td><td>Invitrogen Corporation</td><td>16030074</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Invitrogen Corporation</td><td>21885-025</td><td></td></tr><tr><td> Zestaw do izolacji RNA o wysokiej czystości</td><td></td> Roche <td>11828665001</td><td></td></tr><tr><td>Najpierw transkryptor Zestaw do syntezy nici cDNA</td><td>Roche</td><td>4379012001</td><td></td></tr><tr><td>Startery</td><td>Microsynth</td><td></td><td></td></tr><tr><td>SYBR Green (dla Q-RT-PCR)</td><td>Roche</td><td>4673484001</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Roche</td><td>11666789001</td><td></td></tr></tbody></table>

pożywka kondycjonowana z kością: przygotowanie i test biologiczny

Bone Conditioned Medium: Preparation and Bioassay

Autologiczne przeszczepy kostne są szeroko stosowane w chirurgii szczękowo-twarzowej, ortopedii i traumatologii. Autologiczne przeszczepy kostne nie tylko zastępują brakujące kości, ale także wspomagają złożony proces regeneracji kości. To korzystne zachowanie autoprzeszczepów przypisuje się trzem cechom: przewodnictwu kostnemu, osteogenności i osteoindukcyjności. Jest jednak inny aspekt: przeszczepy kostne uwalniają niezliczone cząsteczki, w tym czynniki wzrostu, które mogą celować w komórki mezenchymalne zaangażowane w regenerację kości. Właściwości parakrynne przeszczepów kostnych można badać in vitro przy użyciu podłoża kondycjonowanego kością (BCM). W niniejszej pracy przedstawiamy protokół przygotowania pożywki kondycjonowanej przez kość z rodzimej kości korowej świni oraz kości poddanej obróbce termicznej lub demineralizacji. Komórki mogą być bezpośrednio wystawione na działanie BCM lub wysiane na biomateriały, takie jak błony kolagenowe, wcześniej nasączone BCM. Podajemy przykłady testów biologicznych in vitro z komórkami mezenchymalnymi dotyczących ekspresji genów regulowanych przez TGF-β. Przedstawione protokoły powinny zachęcać do dalszego odkrywania parakrynnego działania przeszczepów kostnych podczas regeneracji kości oraz otworzyć drogę do badań translacyjnych w szeroko pojętej dziedzinie chirurgii rekonstrukcyjnej.

Pożywka warunkowana kością (BCM) jest przygotowywana ze świeżych wiórów kostnych świni. Ogólny przegląd procesu przygotowania BCM oraz wykorzystania biomateriałów w połączeniu z BCM przedstawiono odpowiednio na Rysunku 1 oraz Rysunku 2. Podczas przygotowywania BCM ważne jest uzyskanie dużych wiórów kostnych za pomocą długich ruchów, ponieważ krótkie ruchy lub bardzo małe wióry kostne mogą wpłynąć na jakość końcowej pożywki BCM. Jakość BCM można kontrolować poprzez analizę ekspresji genów...

Opisujemy tutaj, jak przygotować podłoże kondycjonowane z kością (BCM) i przetestować jego aktywność in vitro.

Pożywka kondycjonowana z kością: przygotowanie i test biologiczny

Autologous bone grafts are widely used in oral and maxillofacial surgery, orthopedics, and traumatology. Autologous bone grafts not only replace missing ...

Ogólnym celem tego filmu jest opisanie sposobu przygotowania podłoża kondycjonowanego z kością i przetestowania jego działania in vitro. Osiąga się to poprzez pierwsze zebranie wiórów kostnych z żuchwy świni za pomocą skrobaka do kości. Drugim krokiem jest obróbka cieplna, demineralizacja lub nic nie robienie z wiórami kostnymi przed inkubacją ich w pożywce hodowlanej przez 24 godziny.Następnie pobierana jest pożywka kondycjonowana przez kość, zawierająca wszystkie czynniki uwolnione z wiórów kostnych. Ostatnim etapem jest stymulacja komórek za pomocą pożywki kondycjonowanej kością lub wstępna inkubacja biomateriału z podłożem kondycjonowanym kostnie i komórkami nasiennymi na nim po okresie inkubacji. Ostatecznie ilościowy PCR w czasie rzeczywistym służy do pokazania zmian w ekspresji genów komórek po leczeniu.Wykorzystanie autologicznych przeszczepów kostnych samodzielnie lub w połączeniu z innymi biomateriałami stymuluje regenerację kości w ubytkach kostnych wokół implantu, a tym samym zapewnia dobre wyniki długoterminowe. Ten film przedstawia test biologiczny in vitro, który jest przydatny w określaniu odpowiedzi genetycznej komórek masy na biomolekuły w stanie kości. Medium Bone Condition Medium może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie urazów szczękowo-twarzowych i stomatologicznych, takich jak to, dlaczego autologiczna kość jest celem standardowego przeszczepu w regeneracji kości.Przygotowanie podłoża w stanie z przetworzonej kości, takiego jak automatyczny przeszczep kości poddany obróbce cieplnej lub zaktualizowana matryca kostna, może być trudne do standaryzacji. Dlatego ważne jest, aby być precyzyjnym. Na początek zaopatrz się w świeże żuchwy świni od lokalnego rzeźnika i umieść je na twardej powierzchni.Następnie użyj okostnej, aby uwolnić płat okostnej o pełnej grubości, zwracając szczególną uwagę, aby nie pozostawić żadnej tkanki miękkiej przyczepionej do kości. Po usunięciu okostnej mocno chwyć skrobak do kości i długimi ruchami zbieraj wióry kostne z policzkowej strony żuchwy. Wyrzuć wszystkie wióry kostne, które mają mniej niż jeden milimetr długości.Zapobiegaj wysychaniu wiórów kostnych, szybko przykrywając je pożywką hodowlaną na 10-centymetrowej szalce Petriego. Po zebraniu wystarczającej ilości wiórów kostnych przygotuj partię kontroli termicznej, pasteryzując pięć gramów wiórów kostnych. Pasteryzuj frytki, podgrzewając je przez 30 minut w temperaturze 80 stopni Celsjusza lub sterylizuj w autoklawie przez 20 minut w temperaturze 121 stopni Celsjusza.Następnie przygotuj zdemineralizowaną kontrolę, dodając pięć gramów wiórów kostnych do jednotrzonowego roztworu kwasu solnego i umieszczając je na wytrząsarce na cztery do sześciu godzin w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Następnie kilkakrotnie przemyj wióry kostne pożywką hodowlaną, aż do osiągnięcia neutralnego pH. Umieścić pięć gramów świeżych wiórów kostnych i pięć gramów każdego z preparatów kontrolnych w oddzielnych naczyniach i dodać 10 mililitrów świeżej pożywki hodowlanej do każdej pożywki.Następnie inkubować próbki w wilgotnej atmosferze w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 24 godziny, aby następnego dnia wytworzyć kondycjonowaną pożywkę. Wyjmij pożywkę z każdego naczynia i umieść ją w stożkowej tubie o pojemności 15 mililitrów. Odwiruj pożywkę kondycjonowaną z kością pod ciśnieniem 200-krotności grawitacji przez 10 minut, aby usunąć wszelkie zanieczyszczenia.Następnie usuń supernatant i przepuść go przez sterylny filtr o wielkości 0,2 mikrona, przechowuj quady Ali zamrożone w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza, aż będą potrzebne. Zacznij od wysiania ludzkich komórek mezenchymalnych, takich jak komórki kostne lub fibroblasty więzadeł dziąseł i przyzębia, na płytce 12 wielorybów w stężeniu 30 000 komórek na centymetr kwadratowy. Przykryj komórki pożywką wzrostową i pozwól komórkom przyczepić się do płytki na noc następnego ranka.Wyrzuć pożywkę hodowlaną i umyj komórki ciepłym PBS w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Następnie stymuluj komórki, dodając wstępnie rozgrzaną pożywkę hodowlaną z 20% pożywką kondycjonowaną z kością i bez niej. W przypadku badania zdolności wchłaniania biomateriału, należy dodać pożywkę kondycjonowaną z kości, w tym wszelkie próby kontrolne, do probówek zawierających interesujący biomateriał, i inkubować probówki w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez jedną godzinę.Następnie energicznie spłucz biomateriał za pomocą wstępnie rozgrzanego PBS i wysiej ludzkie komórki mezenchymalne w stężeniu 30 000 komórek na centymetr kwadratowy na materiale. Inkubować same komórki lub te wysiane na biomateriałach w wilgotnej atmosferze w temperaturze 37 stopni CS komórek przez 24 godziny. Następnie wyrzuć pożywkę hodowlaną.Przepłucz komórki wstępnie ciepłym PBS i wyekstrahuj RNA komórek przy użyciu standardowego protokołu izolacji RNA. Po wyizolowaniu RNA należy przygotować próbki CD NA z każdej grupy poddanej działaniu substancji, rozpoczynając od równych stężeń wyekstrahowanego RNA i przeprowadzając reakcję odwrotnej transkryptazy na każdej próbce. Następnie wykonaj ilościowy PCR w czasie rzeczywistym na próbkach, aby wyszukać poziomy wybranych genów przy użyciu starterów i warunków wymienionych w dołączonym protokole tekstowym.Na koniec oblicz jakość pożywki kondycjonowanej z kością na podstawie względnych poziomów ekspresji genów, normalizując do poziomów progowych cyklu genów do genu porządkowego Gabb dh przy użyciu metody delta delta CT. Oto kilka typowych wyników pokazujących zmiany w ekspresji genów fibroblastów jamy ustnej wystawionych na działanie pożywki kondycjonowanej z kością przez 24 godziny. Dwa geny, adrenalina i pent trax oraz trzy, zostały znacznie obniżone do 40% pierwotnych poziomów, podczas gdy interleukiny 11 i 33, wraz z oksydazą N-A-D-P-H 4 i proteglikanem 4 były regulowane w górę aż 200-krotnie.Co ciekawe, błony bariery kolagenowej używane do ochrony wiórów kostnych przed otaczającą tkanką miękką pochłaniają większość pożywki kondycjonowanej przez kość, która jest odpowiedzialna za zmiany w ekspresji genów. Błony kolagenowe nie były jednak w stanie wchłonąć czynników kontrolujących ekspresję interleukiny 33. Dlatego ekspresja interleukiny 33 nie jest regulowana w tym ustawieniu.Opisany tutaj protokół można dostosować do badania odpowiedzi różnych typów komórek na regenerację kości. Co więcej, protokół może być stosowany do przygotowania podłoża kondycjonalnego z kości procesowej i innych wypełniaczy kostnych. Znaczenie kliniczne tego testu biologicznego pozostaje niejasne.Odpowiedź komórkowa na BCM in vivo jest prawdopodobnie bardziej złożona i obejmuje szerokie spektrum genów i różnych komórek docelowych, rozszerzając te przedstawione tutaj. Niemniej jednak nasz test biologiczny dostarcza pierwszych informacji na temat przypuszczalnie złożonego składu cząsteczek RAF kości i odpowiedzi komórkowej in vitro.

bone-conditioned-medium-preparation-and-bioassay

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Przetłumacz na język polski, zachowując dokładnie wszystkie tagi HTML i formatowanie.

Środowisko Kondycjonujące Kości: Przygotowanie i Biotest

Ten film pokazuje ocenę wielokrotnych aktywacji kaspazy w makrofagach pochodzących ze szpiku kostnego poprzez stymulację wirusem grypy. Po lizie makrofagów, inaktywacji termicznej lizatu i odwirowaniu pobiera się kaspazy wewnątrzkomórkowe do późniejszej analizy immunologicznej.

Ocena aktywacji wielu kaspaz w makrofagach

Ten film demonstruje produkcję pożywki kondycjonowanej oligodendrocytami (OCM) z komórek linii oligodendrocytów poprzez ich naprężenie w celu zwiększenia ich molekularnego uwalniania do pożywki. To podłoże, które jest bogate w czynniki wzrostu, cytokiny i inne bioaktywne cząsteczki, można dodać do kultur neuronów, aby uzyskać wgląd w wpływ czynników wydzielanych przez oligodendrocyty na fizjologię i łączność neuronów.

Metoda wytwarzania pożywki kondycjonowanej oligodendrocytami

Płyta podłogowa jest kluczową strukturą rozwijającego się rdzenia kręgowego, dostarczającą dyfuzyjnych sygnałów do progenitorów i różnicujących neurony. Opisujemy metodę wytwarzania pożywki kondycjonowanej płytką podłogową, stosowania jej do świeżej tkanki rdzenia kręgowego oraz oceny wpływu na białka będące przedmiotem zainteresowania przez biochemię.

Hodowla izolowanej tkanki płytki podłogowej i produkcja kondycjonowanej pożywki w celu oceny właściwości funkcjonalnych sygnałów uwalnianych przez płytkę podłogową

Ten manuskrypt opisuje model ex vivo składający się z narządowych pożywek pochodzących z węzłów chłonnych, kości, płuc i mózgu myszy. Ten system modelowy może być wykorzystany do identyfikacji i badania rozpuszczalnych czynników pochodzących z narządów oraz ich wpływu na tropizm narządów i przerzutowe zachowanie komórek nowotworowych.

Generowanie pożywek narządowych i aplikacje do badania specyficznych dla narządów wpływów na zachowanie przerzutowe raka piersi

Liczba nowatorskich biomateriałów zaprojektowanych do naprawy dużych uszkodzeń kości stale rośnie, mając na celu przyspieszenie gojenia kości i przezwyciężenie komplikacji związanych z przeszczepem kości. W tym miejscu przedstawiamy multidyscyplinarną strategię przedklinicznych badań biokompatybilności biomateriałów do naprawy kości.

Profil zgodności biologicznej biomateriałów do regeneracji kości

Ten protokół przedstawia test wychwytu aminokwasów znakowany radioaktywnie, który jest przydatny do oceny zużycia aminokwasów zarówno w komórkach pierwotnych, jak i w izolowanych kościach.

Ocena zużycia aminokwasów w hodowanych komórkach kostnych i izolowanych trzonach kostnych

Test przepływu metabolicznego komórek w czasie rzeczywistym mierzy zużycie tlenu i stopień zakwaszenia zewnątrzkomórkowego, co odpowiada produkcji mitochondrialnego i glikolitycznego trifosforanu adenozyny, przy użyciu czujników pH i tlenu. W manuskrypcie wyjaśniono metodę pozwalającą zrozumieć stan energetyczny osteoblastów oraz charakterystykę i interpretację statusu bioenergetycznego komórek.

Wykorzystanie analizatora strumienia metabolicznego komórek w czasie rzeczywistym do monitorowania bioenergetyki osteoblastów

Ten protokół opisuje kompleksową metodę oceny aktywacji kaspazy (kaspaza-1, kaspaza-3, kaspaza-7, kaspaza-8, kaspaza-9 i kaspaza-11) w odpowiedzi na modele infekcji zarówno in vitro, jak i in vivo (u myszy) infekcji, sterylnych zniewag i raka w celu określenia inicjacji szlaków śmierci komórki, takich jak piroptoza, apoptoza, nekroptoza i PANoptosis.

Ocena aktywacji kaspazy w celu oceny wrodzonej śmierci komórek odpornościowych

Prezentujemy dwuetapowy protokół wysokiej jakości izolacji mitochondriów, który jest zgodny z odkrywaniem białek i kwantyfikacją w skali proteomu. Nasz protokół nie wymaga inżynierii genetycznej, a zatem nadaje się do badania mitochondriów z dowolnych pierwotnych komórek i tkanek.

Dwuetapowa izolacja mitochondriów bez znaczników w celu lepszego odkrywania białek i kwantyfikacji

Niniejszy film opisuje metodę oczyszczania Wolbachia pipientis z linii komórkowej Anopheles gambiae, a następnie hodowli tego endosymbionta w medium bezkomórkowym. Przedstawiono również test żywotności bakterii.

Utrzymywanie Wolbachia w medium bezkomórkowym

Naucz się przygotowywać pożywkę kondycjonowaną z kością z fragmentów szczęki świni i testować jej aktywność biologiczną na komórkach in vitro. Metoda obejmuje zbieranie fragmentów kości, ich obróbkę cieplną lub demineralizację oraz analizę ekspresji genów metodą PCR.

Pożywka kondycjonowana z kością: przygotowanie i test biologiczny

Przeglądaj więcej filmów