Pożywka kondycjonowana z kością: przygotowanie i test biologiczny

Ogólnym celem tego filmu jest opisanie sposobu przygotowania podłoża kondycjonowanego z kością i przetestowania jego działania in vitro. Osiąga się to poprzez pierwsze zebranie wiórów kostnych z żuchwy świni za pomocą skrobaka do kości. Drugim krokiem jest obróbka cieplna, demineralizacja lub nic nie robienie z wiórami kostnymi przed inkubacją ich w pożywce hodowlanej przez 24 godziny.

Następnie pobierana jest pożywka kondycjonowana przez kość, zawierająca wszystkie czynniki uwolnione z wiórów kostnych. Ostatnim etapem jest stymulacja komórek za pomocą pożywki kondycjonowanej kością lub wstępna inkubacja biomateriału z podłożem kondycjonowanym kostnie i komórkami nasiennymi na nim po okresie inkubacji. Ostatecznie ilościowy PCR w czasie rzeczywistym służy do pokazania zmian w ekspresji genów komórek po leczeniu.

Wykorzystanie autologicznych przeszczepów kostnych samodzielnie lub w połączeniu z innymi biomateriałami stymuluje regenerację kości w ubytkach kostnych wokół implantu, a tym samym zapewnia dobre wyniki długoterminowe. Ten film przedstawia test biologiczny in vitro, który jest przydatny w określaniu odpowiedzi genetycznej komórek masy na biomolekuły w stanie kości. Medium Bone Condition Medium może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie urazów szczękowo-twarzowych i stomatologicznych, takich jak to, dlaczego autologiczna kość jest celem standardowego przeszczepu w regeneracji kości.

Przygotowanie podłoża w stanie z przetworzonej kości, takiego jak automatyczny przeszczep kości poddany obróbce cieplnej lub zaktualizowana matryca kostna, może być trudne do standaryzacji. Dlatego ważne jest, aby być precyzyjnym. Na początek zaopatrz się w świeże żuchwy świni od lokalnego rzeźnika i umieść je na twardej powierzchni.

Następnie użyj okostnej, aby uwolnić płat okostnej o pełnej grubości, zwracając szczególną uwagę, aby nie pozostawić żadnej tkanki miękkiej przyczepionej do kości. Po usunięciu okostnej mocno chwyć skrobak do kości i długimi ruchami zbieraj wióry kostne z policzkowej strony żuchwy. Wyrzuć wszystkie wióry kostne, które mają mniej niż jeden milimetr długości.

Zapobiegaj wysychaniu wiórów kostnych, szybko przykrywając je pożywką hodowlaną na 10-centymetrowej szalce Petriego. Po zebraniu wystarczającej ilości wiórów kostnych przygotuj partię kontroli termicznej, pasteryzując pięć gramów wiórów kostnych. Pasteryzuj frytki, podgrzewając je przez 30 minut w temperaturze 80 stopni Celsjusza lub sterylizuj w autoklawie przez 20 minut w temperaturze 121 stopni Celsjusza.

Następnie przygotuj zdemineralizowaną kontrolę, dodając pięć gramów wiórów kostnych do jednotrzonowego roztworu kwasu solnego i umieszczając je na wytrząsarce na cztery do sześciu godzin w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Następnie kilkakrotnie przemyj wióry kostne pożywką hodowlaną, aż do osiągnięcia neutralnego pH. Umieścić pięć gramów świeżych wiórów kostnych i pięć gramów każdego z preparatów kontrolnych w oddzielnych naczyniach i dodać 10 mililitrów świeżej pożywki hodowlanej do każdej pożywki.

Następnie inkubować próbki w wilgotnej atmosferze w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 24 godziny, aby następnego dnia wytworzyć kondycjonowaną pożywkę. Wyjmij pożywkę z każdego naczynia i umieść ją w stożkowej tubie o pojemności 15 mililitrów. Odwiruj pożywkę kondycjonowaną z kością pod ciśnieniem 200-krotności grawitacji przez 10 minut, aby usunąć wszelkie zanieczyszczenia.

Następnie usuń supernatant i przepuść go przez sterylny filtr o wielkości 0,2 mikrona, przechowuj quady Ali zamrożone w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza, aż będą potrzebne. Zacznij od wysiania ludzkich komórek mezenchymalnych, takich jak komórki kostne lub fibroblasty więzadeł dziąseł i przyzębia, na płytce 12 wielorybów w stężeniu 30 000 komórek na centymetr kwadratowy. Przykryj komórki pożywką wzrostową i pozwól komórkom przyczepić się do płytki na noc następnego ranka.

Wyrzuć pożywkę hodowlaną i umyj komórki ciepłym PBS w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Następnie stymuluj komórki, dodając wstępnie rozgrzaną pożywkę hodowlaną z 20% pożywką kondycjonowaną z kością i bez niej. W przypadku badania zdolności wchłaniania biomateriału, należy dodać pożywkę kondycjonowaną z kości, w tym wszelkie próby kontrolne, do probówek zawierających interesujący biomateriał, i inkubować probówki w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez jedną godzinę.

Następnie energicznie spłucz biomateriał za pomocą wstępnie rozgrzanego PBS i wysiej ludzkie komórki mezenchymalne w stężeniu 30 000 komórek na centymetr kwadratowy na materiale. Inkubować same komórki lub te wysiane na biomateriałach w wilgotnej atmosferze w temperaturze 37 stopni CS komórek przez 24 godziny. Następnie wyrzuć pożywkę hodowlaną.

Przepłucz komórki wstępnie ciepłym PBS i wyekstrahuj RNA komórek przy użyciu standardowego protokołu izolacji RNA. Po wyizolowaniu RNA należy przygotować próbki CD NA z każdej grupy poddanej działaniu substancji, rozpoczynając od równych stężeń wyekstrahowanego RNA i przeprowadzając reakcję odwrotnej transkryptazy na każdej próbce. Następnie wykonaj ilościowy PCR w czasie rzeczywistym na próbkach, aby wyszukać poziomy wybranych genów przy użyciu starterów i warunków wymienionych w dołączonym protokole tekstowym.

Na koniec oblicz jakość pożywki kondycjonowanej z kością na podstawie względnych poziomów ekspresji genów, normalizując do poziomów progowych cyklu genów do genu porządkowego Gabb dh przy użyciu metody delta delta CT. Oto kilka typowych wyników pokazujących zmiany w ekspresji genów fibroblastów jamy ustnej wystawionych na działanie pożywki kondycjonowanej z kością przez 24 godziny. Dwa geny, adrenalina i pent trax oraz trzy, zostały znacznie obniżone do 40% pierwotnych poziomów, podczas gdy interleukiny 11 i 33, wraz z oksydazą N-A-D-P-H 4 i proteglikanem 4 były regulowane w górę aż 200-krotnie.

Co ciekawe, błony bariery kolagenowej używane do ochrony wiórów kostnych przed otaczającą tkanką miękką pochłaniają większość pożywki kondycjonowanej przez kość, która jest odpowiedzialna za zmiany w ekspresji genów. Błony kolagenowe nie były jednak w stanie wchłonąć czynników kontrolujących ekspresję interleukiny 33. Dlatego ekspresja interleukiny 33 nie jest regulowana w tym ustawieniu.

Opisany tutaj protokół można dostosować do badania odpowiedzi różnych typów komórek na regenerację kości. Co więcej, protokół może być stosowany do przygotowania podłoża kondycjonalnego z kości procesowej i innych wypełniaczy kostnych. Znaczenie kliniczne tego testu biologicznego pozostaje niejasne.

Odpowiedź komórkowa na BCM in vivo jest prawdopodobnie bardziej złożona i obejmuje szerokie spektrum genów i różnych komórek docelowych, rozszerzając te przedstawione tutaj. Niemniej jednak nasz test biologiczny dostarcza pierwszych informacji na temat przypuszczalnie złożonego składu cząsteczek RAF kości i odpowiedzi komórkowej in vitro.