Name: Oparte na HeLa systemy ekspresji bezkomórkowej do ekspresji białek Plasmodium Rhoptry (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-06-10T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 3 s
Description: Poznaj bezkomórkowe systemy ekspresji białek Plasmodium z komórek HeLa do ekspresji białek rhoptry malarii. Metoda obejmuje jedno- i dwuetapową translację in vitro z chromatografią afinityczną na żywicy niklowej.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

To badanie było wspierane przez Fundusze Rozwoju Wydziału Uniwersytetu Stanowego w Cleveland.

1. Przygotowanie kultur komórek pasożytów, zbieranie osadów pasożytów
<ol>
	<li>Przygotować pożywkę RPMI-1640-HEPES, dodając 10 g proszku RPMI-1640, 66 mg siarczanu gentamycyny, 2 g wodorowęglanu sodu, 5,9 g buforu HEPES, 50 mg hipoksantyny i 3,8 g dekstrozy w 1 l sterylnego dH2O. Mieszać za pomocą stołowego mieszadła magnetycznego, aż cały proszek rozpuści się w 1 l wody destylowanej. Wykonaj mikrofiltrację mediów za pomocą filtra 0,22 μm. Przechowywać pożywkę w sterylnych butelkach.</li>
	<li>Umyj niezakażone (świeże) erytrocyty typu A+ za pomocą RPMI. Przygotuj 5% hematokrytu erytrocytów (0,5 ml umytych świeżych erytrocytów w 9,5 ml 10% RPMI + surowica ludzka).</li>
	<li>Zrób 15% ludzkiej surowicy + RPMI (15 ml ludzkiej surowicy i 85 ml RPMI), aby rozpocząć hodowlę pasożytów. Wykonaj 10% ludzkiej surowicy i RPMI (10 ml ludzkiej surowicy i 90 ml RPMI), aby kontynuować hodowlę pasożytów w czerwonych krwinkach.</li>
	<li>Hodowla P. falciparum (szczepy 3D7 i FCR-3) w ludzkich erytrocytach typu A+ przy 5% hematokrycie i 20% parazytemii na szalce Petriego lub w kolbie hodowlanej o średnicy 75cm3. Utrzymuj kulturę in vitro zgodnie z metodą słoika na świecę Tragera i Jensena26. Alternatywnie, hodowle podtrzymujące są w inkubatorze w temperaturze 37 °C, utrzymując 9,5% CO2 i 3,4% N2 gazu. Hodowla P. falciparum w pożywce RPMI 1640-HEPES uzupełniona 10% surowicą ludzką.</li>
	<li>Zsynchronizuj kulturę P. falciparum, dodając 65% percollu (65 ml percollu + 35 ml RPMI-1640 bez ludzkiej surowicy) do koncentratu hodowlanego27.</li>
	<li>Odwirować koncentrat kulturowy z perkolem o sile 2500 x g przez 5 minut, co daje 3 warstwy. Ostrożnie, za pomocą pipety transferowej, odizolować schizonty od środkowej warstwy, przenieść do oddzielnej probówki w warunkach aseptycznych27.</li>
	<li>Przemyć izolowane kultury 10% surowicą ludzką + RPMI-1640 dwukrotnie, aby usunąć nadmiar perkolu przez odwirowanie przy 7500 x g przez 5 minut. Wyrzucić supernatant za każdym razem w warunkach aseptycznych27.</li>
	<li>Kontynuuj hodowlę zsynchronizowanych schizontów P. falciparum w 10% ludzkiej surowicy + RPMI-164027.</li>
	<li>Zebrać schizonty, traktując erytrocyty zakażone Plasmodium 10 mM Tris pH 8,8 i wirując przy 15000 x g przez 15 minut23. Granulki pasożytów należy przechowywać w temperaturze -70 °C po dodaniu do nich 5 μl inhibitora proteazy (aprotyniny). Użyj granulek pasożytów do ekstrakcji białek, izolacji genomowego DNA i izolacji RNA.</li>
</ol>
2. Przygotowanie wektora plazmidu
<ol>
	<li>Wyizolować genomowe DNA z granulek schizontu P. falciparum przygotowanych z kultur około 20% parazytemii.</li>
	<li>Dodać 600 μl 10mM Tris-HCl o pH 7,6, 50 mM EDTA pH 8,0, 0,1% SDS i 1 mg/ml proteinazy K do granulek w probówce do mikrowirówki, homogenizować osad za pomocą strzykawki o pojemności 1 ml dołączonej do igły 26 G. Naprzemiennie napełniać strzykawkę mieszanką granulek i opróżniać ją do probówki mikrowirówkowej 20 razy. Probówkę do inkubacji zawierającą homogenat O/N w łaźni wodnej o temperaturze 50 °C.</li>
	<li>Przeprowadzić ekstrakcję fenol – chloroform (P+C) przez dodanie 600 μl P+C (300 μl fenolu i 300 μl chloroformu) do homogenizowanego osadu. Szczelnie zakręć probówkę i energicznie potrząśnij mieszaniną, odwracając rurkę od końca do końca. Odwirować probówkę o pojemności 14 000 x g przez 2 minuty i zebrać górny roztwór wodny za pomocą mikropipety do nowej probówki do mikrowirówki. Powtórz ten krok dwukrotnie.</li>
	<li>Dodać 600 μl chloroformu do warstwy wodnej w nowej probówce z kroku 2.1.2. Wirować probówkę przez 10 sekund i odwirowywać przy 14 000 x g przez 2 minuty. Zmierz górną warstwę wodną za pomocą mikropipety i przenieś ją do nowej probówki do mikrowirówki.</li>
	<li>Dodać 0,1 obj. 5 M octanu sodu o pH 5,5 i 1 obj. izopropanolu (jeżeli warstwa wodna wynosi 300 μl, dodać 30 μl 5 M octanu sodu o pH 5,5 + 330 μl izopropanolu) do warstwy wodnej z etapu 2.1.3. Inkubować probówkę w temperaturze pokojowej przez 15 minut.</li>
	<li>Odwirować probówkę o sile 14 000 x g przez 10 minut, aby wytrącić osad DNA. Odrzucić supernatant i przepłukać osad 100 μl 70% etanolu (70 μl etanolu i 30 μldH2O) w celu usunięcia nadmiaru soli z DNA. Przechowywać DNA w 50 μl dH2O w temperaturze -20 °C.</li>
	<li>Zaprojektuj startery do przodu i do tyłu za pomocą oprogramowania lub ręcznie do amplifikacji genów P. falciparum PF3D7_1361800, PF3D7_0925900, PF3D7_1436300 i PF3D7_0114100 wcześniej zidentyfikowanych w badaniach proteomu16,18 z odpowiednimi miejscami restrykcyjnymi, aby umożliwić klonowanie sekwencji genów do wielu miejsc klonowania plazmidu ekspresyjnego pT7CFE1-CHis, jak pokazano w tabeli 2.</li>
	<li>Sporządzić 50 μl mieszaniny reakcyjnej przez dodanie 5 μl wyizolowanego genomowego DNA P. falciparum, 5 μl 10x buforu, 5 μl MgCl2, 1,5 μl startera do przodu, 1,5 μl startera odwrotnego, 0,5 μl polimerazy DNA T7 i 31,5 μldH2Oi przeprowadzić reakcję łańcuchową polimerazy (PCR) w temperaturze 94 °C przez 8 minut w celu denaturacji, 50 °C przez 1 minutę 30 sekund w celu wydłużenia i 72 °C przez 9 minut w celu wyżarzania i renaturyzacji w celu amplifikacji genów przedstawionych w tabeli 1.</li>
	<li>Rozdziel produkty PCR na 1% żelu agarozowym (1 g agarozy i 100 ml buforu EDTA (TAE) z octanu trisu)32.</li>
	<li>Z żelu agarozowego odciąć pasma DNA amplifikowane metodą PCR, umieścić plastry żelu zawierające DNA w kolumnie wirowej do ekstrakcji żelu DNA i zamrażać w temperaturze -20 °C przez 5 minut. Dodać 100 μl izopropanolu do zamrożonych plastrów żelu i odwirować przy 14 000 x g przez 5 minut.</li>
	<li>Zmierzyć przepływ wodny przefiltrowany w probówce zbiorczej z kroku 2.5 za pomocą mikropipety i przenieść do nowej probówki. Dodać 0,1 obj. 5 M octanu sodu i odwirować przy 14 000 x g przez 5 min. Odrzucić supernatant i dodać 10 μl dH2O do osadu DNA.</li>
	<li>Trawić wektor ekspresyjny pT7CFE1-CHis i oczyszczone fragmenty DNA (z 2,6) w dwóch oddzielnych probówkach, dodając 3 μl plazmidu i 5 μl produktów genu PCR do każdej probówki. Do każdej probówki dodać 1 μl specyficznych enzymów restrykcyjnych, 2 μl buforu reakcyjnego i 14 μl dH2O.</li>
	<li>Dodać 3 μl strawionego plazmidu, 5 μl strawionych fragmentów DNA, 2 μl 10x buforu ligazy, 1 μl ligazy i 9 μldH2O do probówki do mikrowirówki. Inkubować w temperaturze 12 °C O/N.</li>
	<li>Dodać 0,1 obj. 3 M octanu sodu o pH 5,5 i 2 objętości etanolu (jeśli objętość probówek do podwiązywania wynosi 20 μl, dodać 2 μl 3 M octanu sodu + 44 μl etanolu) do probówki z kroku 2.14. Dobrze wymieszać i inkubować w temperaturze -20 °C przez 15 minut.</li>
	<li>Odwirować probówkę o stężeniu 14 000 x g przez 15 minut. Ostrożnie usunąć supernatant za pomocą mikropipety, nie naruszając osadu.</li>
	<li>Dodaj 100 μl 70% etanolu do granulki z kroku 2.10. Odwirować probówkę o stężeniu 14 000 x g przez 5 minut. Usunąć i wyrzucić sklarowany osad. Do osadu DNA dodać 10 μl wody wolnej od nukleaz.</li>
</ol>
3. Ekspresja białek za pomocą systemu ekspresji in vitro na komórkach ludzkich
<ol>
	<li>Przygotować 20 μl mieszaniny transkrypcyjnej, mierząc 2 μl rekombinowanego plazmidowego DNA pT7CFE1-CHis, 4 μl 5-krotnego buforu transkrypcyjnego, 4 μl mieszaniny NTP, 2 μl polimerazy RNA T7 i 8 μl wody wolnej od nukleaz do 2-etapowej ekspresji białek ludzkich in vitro przy użyciu matryc DNA. Wymieszać składniki w probówce do mikrowirówek i inkubować przez 75 minut w temperaturze 30 °C w łaźni wodnej.</li>
	<li>Pobrać 2 μl mieszaniny transkrypcyjnej i dodać ją do 23 μl mieszaniny translacyjnej zawierającej 12,5 μl lizatu komórek HeLa, 2,5 μl białek dodatkowych, 1 μl roztworu soli A, 0,5 μl aminokwasów –Met, 0,5 μl aminokwasów –Leu, 1 μl inhibitora RNAzy, 1,25 μl miksu energetycznego i 3,75 μl wody wolnej od nukleaz.</li>
	<li>Mieszaninę translacyjną inkubować z kroku 3.2 w temperaturze 30 °C przez 90 minut. Przechowywać przetłumaczone produkty w temperaturze -20 °C.</li>
	<li>Przygotować 25 μl mieszaniny transkrypcyjnej i translacyjnej, dodając 3 μl rekombinowanego plazmidowego DNA pT7CFE1-CHis, 2 μl wody wolnej od nukleaz, 5 μl mieszaniny reakcyjnej, 12,5 μl lizatu HeLa i 2,5 μl białek pomocniczych do 1-etapowej ekspresji białka IVT sprzężonego przez człowieka dla matryc DNA.</li>
	<li>Mieszaninę reakcyjną inkubować z etapu 3.4 przez 90 minut do 6 godzin w temperaturze 30 °C. Przechowywać produkty translacji w temperaturze -20 °C.</li>
</ol>
4. Oczyszczanie ekspresji białek rekombinowanych
<ol>
	<li>Dodać 75 μl 1x buforu oczyszczającego do 25 μl produktu translacyjnego, aby uzyskać 100 μl mieszaniny oczyszczającej.</li>
	<li>Dodać 100 μl żywicy chelatującej nikiel do 100 μl mieszaniny oczyszczającej. Przepłukać żywicę niklową dwukrotnie, dodając 300 μldH2O i 300 μl buforu wiążącego. Ponownie zawiesić żywicę i odwirować przy 14 000 x g na 1 minutę, aby usunąć nadmiar etanolu.</li>
	<li>Dodać 100 μl mieszaniny oczyszczającej z etapu 4.2 do 100 μl żywicy chelatującej nikiel i inkubować mieszaninę przez 60 minut w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Odwirować mieszaninę przy 14 000 x g przez 1 minutę i zebrać supernatant do świeżej probówki oznaczonej jako "przepływowy".</li>
	<li>Przepłukać żywicę 100 μl 1x buforu do przemywania (20 mM imidazolu, 250 mM NaH2PO4 przy pH 8, 2,5 M NaCl i dH2O). Wirować przy 14 000 x g przez 1 minutę i zebrać supernatant w świeżej probówce z napisem "wash". Powtórz krok 4.5 dwa razy.</li>
	<li>Dodać 100 μl 1x buforu elucyjnego (100 mM Imidazolu, 250 mM Na2PO4 przy pH 8,0, 2,5M NaCl idH2O) do żywicy i inkubować przez 15 min. Wirować przy 14 000 x g przez 1 min. Wykonaj etap elucji dwukrotnie. Za każdym razem zebrać sklarowany osad do świeżych probówek do mikrowirówek i oznaczyć jako "eluat".</li>
	<li>Po elucji umyj żywicę dwukrotnie, jak opisano w kroku 4.5. Przechowywać przepływowe próbki, przemywania i elucję w temperaturze -20 °C lub niższej. Żywica musi być przechowywana w temperaturze 4 °C. Użyć 30 μl każdej próbki do SDS-PAGE i analizy immunoblottingowej.</li>
</ol>
5. Test białka Coomassie (Bradford) 34
<ol>
	<li>Przygotować wzorcowe roztwory albuminy surowicy bydlęcej (BSA) o stężeniu 20 μg/ml (zmieszać 10 μl BSA (2 mg/ml) i 90 μldH2O), 40 μg/ml (zmieszać 20 μl BSA (2 mg/ml) i 80 μldH2O), 60 μg/ml (zmieszać 30 μl BSA (2 mg/ml) i 70 μldH2O), 80 μg/ml (zmieszać 40 μl BSA (2 mg/ml) i 60 μl dH2O), 100 μg/ml (zmieszać 50 μl BSA (2 mg/ml) i 50 μl dH2O), 160 μg/ml (zmieszać 80 μl BSA (2 mg/ml) i 20 μl dH2O) i 200 μg/ml (100 μl BSA (2 mg/ ml).</li>
	<li>Zmierzyć 5 μl przepływu, przepłukać i wypłukać próbki z kroku 4.7. Dodać 95 μl dH2O.</li>
	<li>Dodać 5 ml odczynnika Coomassie blue do mieszanin z kroków 5.1 i 5.2. Przykryj probówki parafilmem i wiruj przez 10 sekund, a następnie inkubuj przez 20 minut w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Za pomocą spektrofotometru zmierzyć gęstość optyczną (OD) o długości fali 650 nm dla probówek białkowych z kroku 5.3. Wykreśl stężenie w funkcji odczytu OD w celu określenia stężeń białka34.</li>
</ol>
6. Western Blotting
<ol>
	<li>Do oddzielnych probówek dodać 5 μl ekstraktów schizontu z P. falciparum, 2 μl rekombinowanych białek Rhop-3 eksprymowanych przez Escherichia coli,31, 5 μl rekombinowanych białek eksprymowanych przy użyciu 2-etapowych i 1-etapowych systemów ekspresji u ludzi in vitro oraz 10 μl produktów białkowych oczyszczonych metodą powinowactwa.</li>
	<li>Dodać bufor do próbki elektroforezy zawierający merkaptoetanol do każdej probówki w celu uzyskania końcowej objętości 20 μl, aby uzyskać rozpuszczone próbki białka. Gotuj probówki przez 2 minuty.</li>
	<li>Załaduj rozpuszczone próbki białek na 10% żele SDS-PAGE, aby oddzielić białka.</li>
	<li>Przenieść oddzielone białka z żeli SDS-PAGE na bibułę nitrocelulozową (NCP) przez elektroforesowanie prądem 35 mA na żel w półsuchej komorze western blotting przez 2 godziny.</li>
	<li>Zablokować KPK po przeniesieniu za pomocą 2% mleka beztłuszczowego.</li>
	<li>Inkubować zablokowane NCP z następującymi przeciwciałami poliklonalnymi rozcieńczonymi w stosunku 1:100 w 2% mleku, aby wykonać western blot; przeciwciało królika #67621 specyficzne dla rhoptri merozoitowych P. falciparum, przeciwciała mysie20 specyficzne dla rutrii merozoitowych P. yoelii i P. berghei, surowice odpornościowe # 685 specyficzne dla białka wakuoli parazytoforycznej P. falciparum, SUROWICA (antygen bogaty w serynę)22 i przeciwciała specyficzne dla białka rozszczepu Maurera PfMC-2TM28.</li>
	<li>Inkubować NCP również w rozcieńczonej w stosunku 1:100 normalnej surowicy myszy i królika oraz supernatance z hodowli (SCS) z komórek szpiczaka SP2 jako kontroli negatywnej.</li>
	<li>Inkubować KPK z przeciwciałami i kontrolami w temperaturze 4 ºC O/N.</li>
	<li>Przemyć NCP 4x buforem Blot i inkubować NCP z gatunkowo specyficznymi dla gatunku przeciwciałami drugorzędowymi sprzężonymi z peroksydazą chrzanową (HRP) rozcieńczonymi w stosunku 1:1000 w 2% mleku.</li>
	<li>Przemyć NCP 4x buforem Blot. Inkubować przemyte KPK z roztworem do tworzenia barwy A + B (roztwór A: dodać 50 ml 1x Bufor do Blot i 30 μl H2O2; Roztwór B: dodać 10 ml metanolu i 30 mg 3-chloro-naftolu) przez 30 minut w ciemności. Analizuj wyniki western blot kolorymetrycznie.</li>
</ol>

<ol><li>Alexandrov, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Leishmania.+cell-free+expression+system%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Leishmania. cell-free expression system.</a> Methods. 55 (1), 58-64 (2011).</li>
<li>Alexandrov, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Towards+the+construction+of+expressed+proteomes+using+a+Leishmania+tarentolae.+based+cell-free+expression+system%5BTitle%5D)+AND+%22PLOS+One%22%5BJournal%5D)">Towards the construction of expressed proteomes using a Leishmania tarentolae. based cell-free expression system.</a> PLOS One. 5 (12), e14388(2010).</li>
<li>Baca, A. M., Hol, W. G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Overcoming+codon+bias%3A+A+method+for+high-level+over-expression+of+Plasmodium.+and+other+AT-rich+parasite+genes+in+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Parasitol%22%5BJournal%5D)">Overcoming codon bias: A method for high-level over-expression of Plasmodium. and other AT-rich parasite genes in Escherichia coli.</a> Int J Parasitol. 30 (2), 113-118 (2000).</li>
<li>Birkholtz, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heterologous+expression+of+plasmodial+proteins+for+structural+studies+and+functional+annotation%5BTitle%5D)+AND+%22Malar.+J%22%5BJournal%5D)">Heterologous expression of plasmodial proteins for structural studies and functional annotation.</a> Malar. J. 7, 197(2008).</li>
<li>Doolan, D. L., Mu, Y., Unal, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Profiling+humoral+immune+responses+to+P.+falciparum.+infection+with+protein+microarrays%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">Profiling humoral immune responses to P. falciparum. infection with protein microarrays.</a> Proteomics. 8 (22), 4680-4694 (2008).</li>
<li>Endo, Y., Sawasaki, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-free+expression+systems+for+eukaryotic+protein+production%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Cell-free expression systems for eukaryotic protein production.</a> Curr. Opin. Biotechnol. 17 (4), 373-380 (2006).</li>
<li>Fernández-Robledo, J. A., Vasta, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+of+recombinant+proteins+from+protozoan+parasites%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Parasitol%22%5BJournal%5D)">Production of recombinant proteins from protozoan parasites.</a> Trends Parasitol. 26 (5), 244-254 (2010).</li>
<li>Gowda, D. C., Davidson, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+glycosylation+in+the+malaria+parasite%5BTitle%5D)+AND+%22Parasitol.+Today%22%5BJournal%5D)">Protein glycosylation in the malaria parasite.</a> Parasitol. Today. 15 (4), 147-152 (1999).</li>
<li>Goshima, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+protein+factory+for+converting+the+transcriptome+into+an+in+vitro-expressed+proteome%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Human protein factory for converting the transcriptome into an in vitro-expressed proteome.</a> Nat. Methods. 5, 1011-1017 (2008).</li>
<li>Hinnebusch, A. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aHinnebusch%2C+A+%22Mechanism+and+regulation+of+initiator+methionyl-tRNA+binding+to+ribosomes%22">Mechanism and regulation of initiator methionyl-tRNA binding to ribosomes</a>. 5, Cold Spring Harbor Laboratory. Cold Spring Harbor, N.W. 185-243 (2000).</li>
<li>Hino, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficiency+of+cell-free+protein+synthesis+based+on+a+crude+cell+extract+from+Escherichia+coli.%2C+wheat+germ%2C+and+rabbit+reticulocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Efficiency of cell-free protein synthesis based on a crude cell extract from Escherichia coli., wheat germ, and rabbit reticulocytes.</a> Journal of Biotechnology. 133 (2), 183-189 (2008).</li>
<li>Le Roch, K. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Discovery+of+gene+function+by+expression+profiling+of+the+malaria+parasite+life+cycle%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Discovery of gene function by expression profiling of the malaria parasite life cycle.</a> Science. 301 (5639), 1503-1508 (2003).</li>
<li>Makrides, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Strategies+for+achieving+high-level+expression+of+genes+in+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiol.+Rev%22%5BJournal%5D)">Strategies for achieving high-level expression of genes in Escherichia coli.</a> Microbiol. Rev. 60 (3), 512-538 (1996).</li>
<li>Mehlin, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heterologous+expression+of+proteins+from+Plasmodium+falciparum.%3A+results+from+1000+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Biochem.+Parasitol%22%5BJournal%5D)">Heterologous expression of proteins from Plasmodium falciparum.: results from 1000 genes.</a> Mol. Biochem. Parasitol. 148 (2), 144-160 (2006).</li>
<li>Mikami, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+human+cell-derived+in+vitro+coupled+transcription%2Ftranslation+system+optimized+for+production+of+recombinant+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Expr.+Purif%22%5BJournal%5D)">A human cell-derived in vitro coupled transcription/translation system optimized for production of recombinant proteins.</a> Protein Expr. Purif. 62 (2), 190-198 (2008).</li>
<li>Sam-Yellowe, T. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteome+analysis+of+rhoptry%3A+Enriched+isolated+from+Plasmodium.+merozoites%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Proteome+Research%22%5BJournal%5D)">Proteome analysis of rhoptry: Enriched isolated from Plasmodium. merozoites.</a> Journal of Proteome Research. 3 (5), 995-1001 (2004).</li>
<li>Sam-Yellowe, T. Y., Fujioka, H., Aikawa, M., Hall, T., Drazbar, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasmodium+falciparum.+protein+located+in+Maurer%E2%80%99s+clefts+underneath+knobs+and+protein+localization+in+association+with+Rhop-3+and+SERA+in+the+intracellular+network+of+infected+erythrocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Parasitol+Res%22%5BJournal%5D)">Plasmodium falciparum. protein located in Maurer’s clefts underneath knobs and protein localization in association with Rhop-3 and SERA in the intracellular network of infected erythrocytes.</a> Parasitol Res. 87 (3), 173-185 (2001).</li>
<li>Sam-Yellowe, T. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Plasmodium.+gene+family+encoding+Maurer%E2%80%99s+cleft+membrane+proteins%3A+Structural+properties+and+expression+profiling%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Res%22%5BJournal%5D)">A Plasmodium. gene family encoding Maurer’s cleft membrane proteins: Structural properties and expression profiling.</a> Genome Res. 14 (6), 1052-1059 (2004).</li>
<li>Sam-Yellowe, T. Y., Banks, T. L., Fujioka, H., Drazba, J. A., Yadav, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasmodium+yoelii.%3A+Novel+rhoptry+proteins+identified+within+the+body+of+merozoite+rhoptries+in+rodent+Plasmodium+malaria%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Parasitol%22%5BJournal%5D)">Plasmodium yoelii.: Novel rhoptry proteins identified within the body of merozoite rhoptries in rodent Plasmodium malaria.</a> Exp Parasitol. 120 (1), 113-117 (2008).</li>
<li>Sam-Yellowe, T. Y., Rio, D., Fujioka, H., Aikawa, M., Yang, J. C., Yakubu, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+merozoite+rhoptries%2C+identification+of+novel+rhoptry+associated+proteins+from+P.+yoelii.%2C+P.+chabaudi.%2C+P.+berghei.+and+conserved+interspecies+reactivity+of+organelles+and+proteins+with+P.+falciparum.+rhoptry-specific+antibodies%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Parasitol%22%5BJournal%5D)">Isolation of merozoite rhoptries, identification of novel rhoptry associated proteins from P. yoelii., P. chabaudi., P. berghei. and conserved interspecies reactivity of organelles and proteins with P. falciparum. rhoptry-specific antibodies.</a> Exp Parasitol. 89 (3), 271-284 (1998).</li>
<li>Sam-Yellowe, T. Y., Fujioka, H., Masamichi, A., Messineo, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasmodium+falciparum.+rhoptry+proteins+of+140%2F130%2F110kd+%28Rhop-H%29+are+located+in+an+electron+lucent+compartment+in+the+neck+of+the+rhoptries%5BTitle%5D)+AND+%22J+Euk+Microbial%22%5BJournal%5D)">Plasmodium falciparum. rhoptry proteins of 140/130/110kd (Rhop-H) are located in an electron lucent compartment in the neck of the rhoptries.</a> J Euk Microbial. 42 (3), 224-231 (1995).</li>
<li>Sam-Yellowe, T. Y., Hishashi, F., Masamichi, A., Messineo, D. G., Leash, A. M., Hall, T., Drazba, J. A., Ndengele, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+Organization+and+cross+linking+analysis+of+the+Plasmodium+falciparum+erythrocyte+binding+proteins+Rhop-H+and+SERA%5BTitle%5D)+AND+%22J+Protozool.+Res%22%5BJournal%5D)">Molecular Organization and cross linking analysis of the Plasmodium falciparum erythrocyte binding proteins Rhop-H and SERA.</a> J Protozool. Res. 10 (3), 128-154 (2000).</li>
<li>Sam-Yellowe, T. Y., Shio, H., Perkins, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Secretion+of+Plasmodium+falciparum.+rhoptry+protein+into+plasma+membrane+of+host+erythrocytes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Secretion of Plasmodium falciparum. rhoptry protein into plasma membrane of host erythrocytes.</a> J Cell Biol. 106 (5), 1507-1513 (1988).</li>
<li>Sundaresh, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+humoral+immune+responses+in+protein+microarrays+using+DNA+microarray+data+analysis+techniques%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">Identification of humoral immune responses in protein microarrays using DNA microarray data analysis techniques.</a> Bioinformatics. 22 (14), 1760-1766 (2006).</li>
<li>Terpe, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Overview+of+bacterial+expression+systems+for+heterologous+protein+production%3A+from+molecular+and+biochemical+fundamentals+to+commercial+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Microbiol.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Overview of bacterial expression systems for heterologous protein production: from molecular and biochemical fundamentals to commercial systems.</a> Appl. Microbiol. Biotechnol. 72 (2), 211-222 (2006).</li>
<li>Trager, W., Jensen, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+malaria+parasites+in+continuous+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Human malaria parasites in continuous culture.</a> Science. 193 (4254), 673-675 (1976).</li>
<li>Tsarukyanova, I., Drazba, J. A., Fujioka, H., Yadav, S., Sam-Yellowe, T. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteins+of+the+Plasmodium+falciparum.+two+transmembrane+Maurer%E2%80%99s+cleft+protein+family%2C+PfMC-2TM+and+the+130+kDa+Maurer%E2%80%99s+cleft+protein+define+different+domains+of+the+infected+erythrocyte+intramembranous+network%5BTitle%5D)+AND+%22Parasitol+Res%22%5BJournal%5D)">Proteins of the Plasmodium falciparum. two transmembrane Maurer’s cleft protein family, PfMC-2TM and the 130 kDa Maurer’s cleft protein define different domains of the infected erythrocyte intramembranous network.</a> Parasitol Res. 104 (4), 875-891 (2009).</li>
<li>Tsuboi, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wheat+germ+cell-free+system-based+production+of+malaria+proteins+for+discovery+of+novel+vaccine+candidates%5BTitle%5D)+AND+%22Infect.+Immun%22%5BJournal%5D)">Wheat germ cell-free system-based production of malaria proteins for discovery of novel vaccine candidates.</a> Infect. Immun. 76 (4), 1702-1708 (2008).</li>
<li>Tsuboi, T., Takeo, S., Sawasaki, T., Torii, M., Endo, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+efficient+approach+to+the+production+of+vaccines+against+the+malaria+parasite%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">An efficient approach to the production of vaccines against the malaria parasite.</a> Methods in Mol. Biol. 607, 73-83 (2010).</li>
<li>Wang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+versatile+protein+microarray+platform+enabling+antibody+profiling+against+denatured+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics+Clin.+Appl%22%5BJournal%5D)">A versatile protein microarray platform enabling antibody profiling against denatured proteins.</a> Proteomics Clin. Appl. 7 (5-6), 378-383 (2013).</li>
<li>Wang, T., Fujioka, H., Drazba, J. A., Sam-Yellowe, T. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rhop-3+protein+conservation+among+Plasmodium%5BTitle%5D)+AND+%22species+and+induced+protection+against+lethal%22%5BJournal%5D)">Rhop-3 protein conservation among Plasmodium.</a> species and induced protection against lethal. 99 (3), 238-252 (2006).</li>
<li>Yadavalli, R., Ledger, C., Sam Yellowe, T. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+human+cell+free+expression+for+synthesis+of+malaria+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Parasitol+Res%22%5BJournal%5D)">In vitro human cell free expression for synthesis of malaria proteins.</a> Parasitol Res. 111 (6), 2461-2465 (2012).</li>
<li>Machida, K., Masutan, M., Imataka, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+Synthesis+in+vitro.%3A+Cell-Free+Systems+Derived+from+Human+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Intech%22%5BJournal%5D)">Protein Synthesis in vitro.: Cell-Free Systems Derived from Human Cells.</a> Intech. , (2012).</li>
<li>Bradford, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+rapid+and+sensitive+method+for+the+quantification+of+microgram+quantities+of+protein+utilizing+the+principle+of+protein-dye+binding%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Biochem%22%5BJournal%5D)">A rapid and sensitive method for the quantification of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding.</a> Anal Biochem. 72, 248-254 (1976).</li>
</ol>

W tym badaniu nie mamy żadnych konkurencyjnych interesów finansowych.

Ważnymi krokami do pomyślnej ekspresji białek przy użyciu dwuetapowego systemu wolnej ekspresji i oczyszczania komórek ludzkich in vitro są: 1) udana amplifikacja i klonowanie genów do wektora plazmidowego pT7CFE-CHis; 2) transkrypcja RNA w temperaturze 30oC; 3) translacja białka w temperaturze 30 °C w obecności inhibitora RNAzy; 4) opracowanie protokołu oczyszczania opartego na powinowactwie przy użyciu kulek żywicznych pokrytych Ni oraz 5) analiza wyników na Western Blot przy użyciu przeciwciał poliklonalnyc...

W badaniach nad malarią, ekspresja białek immunogennych za pomocą systemów opartych na komórkach prokariotycznych lub eukariotycznych pozostaje wyzwaniem. Bogactwo A-T genomu Plasmodium i nieznane mechanizmy potranslacyjne14,7 przyczyniają się do trudności związanych z uzyskaniem prawidłowo sfałdowanych i immunogennych białek do produkcji przeciwciał i badań nad szczepionkami. Systemy prokariotyczne, takie jak Escherichia coli, były wykorzystywane do ekspresji białek rekombinowanych. Systemy prokariotyczne są tanie, skuteczne, dają wysokie plony rekombinowanego białka i mają wiele wektorów klonowania. Komórki gospodarza E. coli są łatwe do przekształcenia, a komórki szybko rosną. Jednak systemy prokariotyczne mają ograniczenia, takie jak brak substytucji aminokwasów, modyfikacja potranslacyjna, ryzyko zanieczyszczenia, produkty heterogeniczne i akumulacja rekombinowanych białek w ciałach inkluzyjnych24.
W badaniu przeprowadzonym przez Mehlina i in. (2006) wyrażono 1000 otwartych ramek odczytu (ORF). Około 7% eksprymowanych białek było rozpuszczalnych14. Zaobserwowana nierozpuszczalność wynika z tendencyjnego charakteru genów i wysokiej częstotliwości kodonów, które są idealnie wykorzystywane przez genom bogaty w Plasmodium A-T14. Opracowano alternatywną strategię przezwyciężenia tego problemu przy użyciu plazmidów lub komórek gospodarza zawierających tRNA, które rozpoznają rzadkie kodony lub kodony pasujące do częstotliwości3. Nawet po przeprowadzeniu tych optymalizacji, bardzo małe porcje białek są wyrażane jako rozpuszczalne, aktywne i immunogenne14. Bezkomórkowe systemy ekspresyjne zawierają wszystkie składniki niezbędne do transkrypcji i translacji, takie jak rybosomy, czynniki inicjacji, czynniki elongacji (czynniki translacyjne), syntetazy tRNA i aminoacylo-tRNA. Zarówno reakcje transkrypcji, jak i translacji są sprzężone w jednoetapowej procedurze11,29. Reakcję transkrypcji przeprowadza się w probówce przed inkubacją odpowiedniej ilości mRNA za pomocą maszynerii translacyjnej w innej probówce11,29. Chociaż metody te są skuteczne w ekspresji białka Plasmodium sp., główną wadą jest czas ekspresji białka, który wynosi około 22 godzin29. Ponadto wysokie koszty dostaw w celu włączenia do protokołów29, pracochłonne przygotowanie lizatu komórkowego i niespójności w przygotowaniach składników sprawiają, że systemy te są nieosiągalne. Główny cel, na którym skupiają się naukowcy w celu opracowania systemu ekspresji bezkomórkowej, zależy od takich czynników, jak szybka modyfikacja genetyczna, szybkie plony przy wysokich stężeniach i proste preparaty lizatu1.
Systemy eukariotyczne, takie jak drożdże, linie komórkowe ssaków, system ekspresji, w którym pośredniczy bakulowirus, termofilia Tetrahymena, Dictyostelium discoideum i pasożytnicze systemy ekspresji, takie jak Leishmania, zostały wykorzystane do rekombinowanej ekspresji białek7. Systemy eukariotyczne mają wspólne pokrewieństwo filogenetyczne, a zatem mają również wspólne cechy, takie jak glikozylacja, acylacja, tworzenie wiązań dwusiarczkowych, interakcja chaperonowa, proteoliza i subkomórkowa podział na przedziały. Zdarzenia wydzielania białek u eukariontów zapobiegają akumulacji i zmniejszają toksyczność dla systemów ekspresyjnych13. Preferowane jest stosowanie systemów drożdżowych, ponieważ nadają się one do ekspresji białka na dużą skalę i do uzyskiwania wysokich plonów4. Dwa białka P. falciparum PfCP-29 i Pvs25 wyprodukowano przy użyciu systemu drożdżowego4. Jednak główną wadą w syntezie większości białek były nieregularne wzorce N i O-glikozylacji, niewłaściwe fałdowanie i obcinanie białek z ich natywnej formy4.
Wykorzystanie komórek ssaków do syntezy białek rekombinowanych jest pracochłonne, a utrzymanie stabilnych linii komórek rekombinowanych jest kosztowne4. W związku z tym komórki ssaków zostały ograniczone do analizy sygnalizacji białkowej, interakcji białkowych i interakcji pasożyt-gospodarz, a także do testowania szczepionek DNA4. Opisany tutaj ludzki system ekspresji białek in vitro in vitro jest systemem opartym na komórkach HeLa opartym na ssakach, który ulega ekspresji białek w ciągu 3 godzin. Białka eksprymowane za pomocą wektora ekspresyjnego pT7CFE1-cHis mają znacznik C-końcowy ułatwiający identyfikację i oczyszczanie. System oparty na HeLa jest uzupełniony o czynniki inicjujące tłumaczenie i regulator translacji, zwiększając w ten sposób wydajność systemu tłumaczeniowego. Białka mogą być szybko translowane, przesiewane, weryfikowane i przetwarzane w celu wykorzystania w różnych zastosowaniach immunologicznych i strukturalnych15.
Systemy ekspresji bezkomórkowej eukariotycznej, takie jak kiełki pszenicy i retikulocyty królika, są obecnie używane do ekspresji różnych białek eukariotycznych, w tym białek Plasmodium 11,29. Ponadto systemy bezkomórkowe oparte na E. coli są również wykorzystywane do ekspresji białek eukariotycznych11. Tabela 1 podsumowuje różne systemy ekspresji bezkomórkowej, porównując cechy systemów, a także łatwość wykorzystania systemów do ekspresji białek. System bezkomórkowy dla człowieka w porównaniu z innymi ma zdolność do wykonywania modyfikacji post- i kotranslacyjnych i jest tańszy. Optymalizacja kodonów jest możliwa, a wszystkie reakcje można przeprowadzić w ciągu 3 godzin. System HeLa jest idealnym systemem translacyjnym do syntezy białek w warunkach laboratoryjnych.
Główną zaletą systemów ekspresji bez komórek ludzkich nad innymi systemami bezkomórkowymi jest dostępność kilku różnych linii komórkowych pochodzących z różnych organów i tkanek. W zależności od linii komórkowej można zaprojektować kilka odmian systemów bezkomórkowych. Ekstrakty pochodzące z komórek ssaków mają wyższą wydajność syntezy dużych białek niż jakiekolwiek inne systemy ekspresji bezkomórkowej. Te bezkomórkowe systemy ekspresji mogą być również wykorzystywane w zastosowaniach diagnostycznych i charakteryzacji białek, takich jak mikromacierze30. Popularne linie komórkowe HeLa są najczęściej wykorzystywane do przeprowadzania ekspresji białek33. Retikulum endoplazmatyczne w liniach komórkowych HeLa jest słabo rozwinięte, co prowadzi do braku potranslacyjnej modyfikacji glikozylacji33. Uważa się jednak, że system ten jest korzystny dla syntezy białek Plasmodium, ponieważ Plasmodium nie ma również glikozylacji po modyfikacji translacyjnej29. Protokół transkrypcji i translacji bez komórek HeLa jest łatwy do wykonania, niedrogi, a białka mogą być wyrażane w ciągu 90 minut, gotowe do oczyszczania i dalszych zastosowań.

<table><tbody><tr><td>2-etapowy system ekspresji bez komórek ludzkich in vitro</td><td>Thermo Fisher</td><td>88856</td><td>Wycofany. Zawsze przechowywać w temperaturze -80 stopni Celsjusza. Nie rozmrażać w ciepłej wodzie</td></tr><tr><td>1-etapowy system translacyjny sprzężony in vitro</td><td>Thermo fischer</td><td>88860</td><td>Zawsze przechowywać w temperaturze -80 stopni C. Nie rozmrażać w ciepłej wodzie</td></tr><tr><td>System oczyszczania ProBond</td><td>Invitrogen</td><td>K850-01</td><td>Przechowywać w RT</td></tr><tr><td>Probond Żywica chelatująca nikiel</td><td>Invitrogen</td><td>R801-01</td><td>Przechowywać w temperaturze 4oC.</td></tr><tr><td>A+</td><td>Międzystanowy bank</td><td></td> krwi ludzkiej <td>Sklep w 4 & st. C.</td></tr></tbody></table>

oparte na hela systemy ekspresji bezkomórkowej do ekspresji białek plasmodium rhoptry

HeLa Based Cell Free Expression Systems for Expression of Plasmodium Rhoptry Proteins

Malaria powoduje znaczną globalną zachorowalność i śmiertelność. Obecnie nie jest dostępna żadna rutynowa szczepionka. Jedną z głównych przyczyn braku szczepionki jest wyzwanie związane z identyfikacją odpowiednich kandydatów na szczepionki. Białka malarialne ulegające ekspresji za pomocą systemów ekspresji opartych na komórkach prokariotycznych i eukariotycznych są słabo glikozylowane, na ogół nierozpuszczalne i ulegają nieprawidłowemu fałdowaniu, co prowadzi do zmniejszenia immunogenności. Kiełki pszenicy, lizat retikulocytów królika i systemy ekspresji wolne od komórek lizatu coli Escherichia są obecnie wykorzystywane do ekspresji białek malarii. Jednak długość czasu odciągania i niewłaściwa glikozylacja białek nadal pozostają wyzwaniem. Demonstrujemy ekspresję białek Plasmodium in vitro przy użyciu systemów ekspresji bezkomórkowej opartych na HeLa, określanych jako "systemy ekspresji wolnej od komórek ludzkich in vitro". 2 systemy ekspresji bezkomórkowej oparte na HeLa transkrybują mRNA w 75 minut, a 3 μl transkrybowanego mRNA wystarczają do translacji białek w 90 minut. 1-etapowy system ekspresji to system ekspresji sprzężony z transkrypcją i translacją; Transkrypcja i wspólne tłumaczenie odbywa się w ciągu 3 godzin. Proces można również przedłużyć o 6 godzin, dostarczając dodatkową energię. W 2-etapowym systemie ekspresji mRNA jest najpierw transkrybowane, a następnie dodawane do mieszanki translacyjnej w celu ekspresji białka. Opisujemy, jak wyrażać białka malarii; hydrofobowe białko transbłonowe PF3D7_0114100 Maür's Cleft – 2 (PfMC-2TM), hydrofilowe białko PF3D7_0925900 i powtórzenia pancernika zawierające PF3D7_1361800 białkowe, przy użyciu systemu ekspresji wolnej od komórek opartego na HeLa. Białka ulegają ekspresji w mikroobjętościach przy użyciu 2-etapowych i 1-etapowych strategii ekspresji. Opisano również metodę oczyszczania z powinowactwem w celu oczyszczenia 25 μl białek ulegających ekspresji za pomocą systemu wolnej ekspresji komórek ludzkich in vitro. Wydajność białka określa się za pomocą testu Bradforda, a ekspresję i oczyszczone białka można potwierdzić za pomocą analizy western blot. Ekspresja białek rekombinowanych może być stosowana do immunizacji, testów immunologicznych i sekwencjonowania białek.

Walidacja ekspresyjnych białek rekombinowanych poprzez badanie reaktywności ze specyficznymi przeciwciałami jest ważnym pierwszym krokiem w potwierdzeniu prawidłowego fałdowania wyekspresowanych białek. Rekombinowane białka malaryczne zostały wyekspresowane z wykorzystaniem jednoetapowego i dwuetapowego systemu ekspresji in vitro w ludzkich systemach bezkomórkowych. Białka rekombinowane oczyszczono metodą powinowactwa z wykorzystaniem chelatowania niklu. Następnie zastosowano antysera przeciwko całym roptriom merozoitów ...

Ekspresja białek malarycznych w systemach komórkowych pozostaje wyzwaniem. Pokazujemy dwuetapowe i jednoetapowe systemy ekspresji komórkowej IVT (translacja in vitro) do ekspresji rekombinowanych białek rhoptrii malarii z komórek HeLa. Do oczyszczania białek rhoptrii używamy systemu oczyszczania opartego na powinowactwie do żywicy Ni.

Oparte na HeLa systemy ekspresji bezkomórkowej do ekspresji białek Plasmodium Rhoptry

Malaria causes significant global morbidity and mortality. No routine vaccine is currently available. One of the major reasons for lack of a vaccine is ...

Ogólnym celem następującego eksperymentu jest translacja białek Plasmodium z wykorzystaniem bezkomórkowych systemów ekspresyjnych opartych na liniach HeLa oraz oczyszczanie białek z mikrobiobjętości produktu translacji. Cel ten osiąga się poprzez klonowanie genów Plasmodium w celu przygotowania plazmidów rekombinowanych do dwuetapowej i jednoetapowej translacji in vitro oraz bezkomórkowej ekspresji rekombinowanych białek RT tree malarii. W celu translacji białek rekombinowanych przygotowany plazmid inkubuje się z mieszanką do transkrypcji.W przypadku zastosowania dwuetapowego systemu ekspresji, w którym zachodzi transkrypcja mRNA, otrzymany mRNA dodaje się następnie do mieszaniny translacyjnej w celu translacji białek. Podczas korzystania z jednoetapowego systemu ekspresji, rekombinowany plazmid inkubuje się z lizatem komórek HeLa w celu transkrypcji i translacji białek rekombinowanych. Następnie białka rekombinowane są oczyszczane z mikrob objętości produktu translacji.Wyniki wykazują pomyślną ekspresję i oczyszczanie w oparciu o analizę western blotting. Główną zaletą tej techniki w porównaniu z innymi, takimi jak system ekspresyjny zarodków pszenicy oraz system lizatu retikulocytów królika, jest możliwość ekspresji białek w ciągu trzech godzin. Optymalizacja kodonów nie jest wymagana.Metoda ta jest niedroga i łatwa w użyciu. Na mikroarrays można przesiewać wiele antygenów, co umożliwia ich wykrywanie do celów terapeutycznych i diagnostycznych. Zazwyczaj osoby rozpoczynające pracę z tą metodą napotykają trudności, ponieważ jest to ekspresja bezkomórkowa, w której białka są syntetyzowane w mikrobioobjętościach, co sprawia, że ich oczyszczanie jest niezwykle trudne.Kiedy po raz pierwszy pojawił się pomysł wykorzystania tego układu, wynikało to z faktu, że nie mogliśmy uzyskać ekspresji białek w E. coli, a inne systemy ekspresyjne okazały się zbyt kosztowne i czasochłonne. Zdecydowaliśmy się zbadać bezkomórkowy system ekspresyjny oparty na komórkach HeLa jako alternatywne rozwiązanie. Przygotować 20 µL mieszaniny transkrypcyjnej zawierającej rekombinowany plazmidowy wektor DNA, zgodnie z opisem w protokole tekstowym dla dwuetapowej in vitro ekspresji białek ludzkich.Wykorzystując matryce DNA, wymieszać składniki w probówce do mikrocentryfugi i inkubować przez 75 minut w temperaturze 30 °C w łaźni wodnej. Następnie pobrać 2 µL mieszaniny do transkrypcji i dodać do 23 µL mieszaniny do translacji zawierającej lizat komórek HeLa.Inkubować otrzymaną mieszaninę w temperaturze 30 °C przez 90 minut. Przetłumaczone produkty przechowywać w temperaturze -20 °C. Następnie przygotować 25 µL mieszaniny do transkrypcji i translacji zawierającej rekombinowany wektor plazmidowy, DNA oraz lizat HE, zgodnie z opisem w protokole tekstowym dotyczącym jednokrocznej sprzężonej translacji in vitro białek ludzkich z matryc DNA.Inkubuj tę mieszaninę reakcyjną przez od 90 minut do sześciu godzin w temperaturze 30 °C, a produkty translacji przechowuj w temperaturze -20 °C. Aby oczyścić otrzymane białka rekombinowane, dodaj 75 µl 1X buforu do oczyszczania do 25 µL produktu translacji, aby otrzymać 100 µL mieszaniny do oczyszczania. Przemyj żywicę niklową dwukrotnie, dodając 300 µL wody destylowanej oraz 300 µL buforu wiążącego.Resuspend żywicę i wiruj przy 14 000 G przez jedną minutę, aby usunąć nadmiar etanolu. Następnie dodaj 100 µL przygotowanego roztworu oczyszczającego do 100 µL żywicy chelatującej nikiel i inkubuj mieszaninę na wytrząsarce w temperaturze pokojowej przez 60 minut.Odwirować mieszaninę przy 14 000 G przez jedną minutę i zebrać nadsącz do nowej probówki oznaczonej jako flow through. Przemyć żywicę 100 µL jednokrotnego buforu do płukania, następnie odwirować przy 14 000 G przez jedną minutę i zebrać nadsącz do nowej probówki oznaczonej jako wash. Powtórzyć ten krok dwukrotnie po pierwszym płukaniu.Dodaj 100 µL buforu elucyjnego 1x do żywicy i inkubuj na wytrząsarce przez 15 minut. Następnie wiruj przy 14 000 G przez jedną minutę. Powtórz etap elucji dwukrotnie.Zebrać supernatant do nowej probówki do mikrowirówki i opisać jako eluat po elucji. Przemyć żywicę dwukrotnie w taki sam sposób jak wcześniej, a następnie przechowywać w temperaturze 4 °C. Próbki z przemyć przepływowych oraz eluaty przechowywać w temperaturze -20 °C lub niższej w celu przeprowadzenia analizy western blotting.Najpierw przygotować oddzielne probówki z ekstraktami z P. falsy, P. arum i E. coli, wyrażonymi rekombinowanymi białkami R3, przygotowanymi białkami rekombinowanymi oraz produktami białkowymi oczyszczonymi metodą powinowactwa. Następnie do każdej probówki dodać bufor do próbek elektroforetycznych zawierający merkaptoetanol, aby uzyskać końcową objętość 20 µL. Aby uzyskać solubilizowane próbki białek, gotować probówki przez dwie minuty.Naniesć próbki rozpuszczonego białka na żele SDS-PAGE 10% w celu rozdzielenia białek po przeprowadzeniu elektroforezy. Przenieść rozdzielone białka z żeli SDS-PAGE na membranę nitrocelulozową metodą elektroforezy przy natężeniu prądu 35 mA na żel w półsuchej komorze do western blottingu przez dwie godziny. Po transferze zablokować membranę nitrocelulozową, wykorzystując 2% roztwór odtłuszczonego mleka. Inkubować membranę nitrocelulozową z przeciwciałami poliklonalnymi wymienionymi w protokole tekstowym w przypadku kontroli negatywnych.Należy również inkubować papier nitrocelulozowy w roztworze normalnej surowicy mysiej i króliczej rozcieńczonej 1:100 oraz w zużytym supernatancie hodowli komórek szpiczaka SB2. Po inkubacji papieru nitrocelulozowego w temperaturze 4 °C przez noc, przemyć go czterokrotnie buforem do transferu i inkubować z gatunkowo specyficznymi przeciwciałami wtórnymi, sprzężonymi z peroksydazą chrzanową, rozcieńczonymi 1:1000 w 2% mleku. Następnie ponownie przemyć papier nitrocelulozowy czterokrotnie buforem do transferu.Na koniec inkubować przemyty papier nitrocelulozowy z roztworem wywołującym barwę, A plus B, przez 30 minut w ciemności. Pomyślną ekspresję białek plasmodium z wykorzystaniem in vitro ludzkich systemów ekspresyjnych bezkomórkowych potwierdzono za pomocą specyficznych przeciwciał króliczych RT, jak wykazano wcześniej. Ekspresowane białka rekombinowane nie były rozpoznawane przez antysera przeciwko białkom parasitosis vae z p FALs parem i P Yoi Lee, co dowodzi specyficzności antyser choroby króliczej 6 76 wobec ekspresowanych białek. Normalne surowica królicza nie reagowała z białkami rekombinowanymi. Przetłumaczono przy użyciu dwuetapowego in vitro ludzkiego systemu ekspresyjnego bezkomórkowego oraz jednoetapowego sprzężonego systemu translacji in vitro.Przedstawiono tutaj skuteczne oczyszczanie białek przetłumaczonych z 25 µL produktów translacji. W szczególności pokazano skuteczne oczyszczanie białka błonowego mara's cleft. Przedstawiono również skuteczne oczyszczanie hipotetycznego białka z genów kodujących białka RT drzewa plasmodium.Na koniec przedstawiono pomyślną puryfikację powtórzeń armadillo zawierających białko RT tree plasmodium. Wydajność białka po puryfikacji wynosi 3,5 µg na 25 µL po jego opracowaniu. Technika ta utorowała drogę badaczom w dziedzinie parazytologii do charakterystyki białek u pasożytów, badania oddziaływań białko-białko, badań nad inhibicją przeciwciał oraz opracowywania szczepionek w dziedzinie parazytologii.Po obejrzeniu tego filmu powinieneś zrozumieć, jak wykorzystać bezkomórkowy system ekspresji białek HEALER do ekspresji białek Plasmodium w ciągu trzech godzin. Dowiesz się również, jak oczyszczać białka z mikrobiobjętości produktu translacji.

hela-based-cell-free-expression-systems-for-expression-plasmodium

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Systemy ekspresji wolnej od komórek oparte na komórkach HeLa do ekspresji białek Plasmodium z rhoptry

Opisano model in vitro sekwestracji w malarii mózgowej1. Krwinki czerwone zakażone Plasmodium falciparum są selekcjonowane pod kątem wiązania się z unieśmiertelnionymi ludzkimi komórkami śródbłonka mikrokrążenia mózgowego. Wyselekcjonowane pasożyty wykazują wyraźny fenotyp. Proces selekcji można zastosować w przypadku różnych szczepów P. falciparum oraz linii komórek śródbłonka.

Wybór pasożytów Plasmodium falciparum pod kątem cytoadhezji do ludzkich komórek śródbłonka mózgu

W erze genomiki post-humanistycznej dostępność białek rekombinowanych w natywnych konformacjach jest kluczowa dla badań i rozwoju w obszarze strukturalnym, funkcjonalnym oraz terapeutycznym. W niniejszej pracy opisujemy system ekspresji białek w skali testowej i przemysłowej z wykorzystaniem ludzkich komórek embrionalnej nerki 293T, który może być stosowany do produkcji różnorodnych białek rekombinowanych.

Wygodna i uniwersalna platforma ekspresyjna do produkcji białek wydzielanych z komórek ludzkich

Ekspresja białek rekombinowanych przez systemy ssaków staje się atrakcyjną metodą wytwarzania kompleksów białkowych dla biologii strukturalnej. W tym artykule przedstawiamy prosty, ale bardzo wydajny system ekspresji wykorzystujący hodowane w zawiesinie komórki ssaków do oczyszczania kompleksów białkowych do badań strukturalnych.

Ekspresja białek rekombinowanych w biologii strukturalnej w komórkach zawiesinowych HEK 293F: nowatorskie i dostępne podejście

Manipulowanie czasową ekspresją genów w różnicujących się embrionalnych komórkach macierzystych (ESC) można osiągnąć za pomocą indukowalnych systemów genetycznych. Jednak wytwarzanie tych linii komórkowych jest kosztowne i czasochłonne. Protokół ten zapewnia szybką ekspresję transgenu w różnicujących się komórkach pochodzących z ES, a następnie analizę dalszego różnicowania układu krwiotwórczego.

Zakażenie retrowirusowe mysich embrionalnych komórek ciała zarodkowego pochodzących z embrionalnych komórek macierzystych do analizy różnicowania układu krwiotwórczego

Opisujemy tutaj opłacalny system ekspresji granzymu wykorzystujący komórki HEK293T, który daje wysokie plony czystej, w pełni glikozylowanej i enzymatycznie aktywnej proteazy.

Wysokowydajny i ekonomiczny system ekspresji ludzkich granzymów w komórkach ssaków

Laboratoryjna produkcja białek eukariotycznych z odpowiednią modyfikacją potranslacyjną stanowi istotną barierę. Oto solidny protokół z szybkim ustanowieniem i przekształceniem w ekspresję białek przy użyciu systemu ekspresji ssaków. System ten wspomaga selektywne znakowanie aminokwasów, selektywne znakowanie białek i małocząsteczkowych modulatorów składu glikanów.

Wysoka ekspresja rekombinowanych białek ludzkich z przejściową transfekcją komórek HEK293 w zawiesinie

Nielityczne systemy ekspresji komórek owadów są niedostatecznie wykorzystywane do produkcji, transportu/lokalizacji komórkowej i analizy funkcjonalnej białek rekombinowanych. W tym miejscu opisujemy metody generowania wektorów ekspresyjnych i późniejszej przejściowej ekspresji białek w dostępnych na rynku liniach komórkowych lepidoptera. Przedstawiono również kolokalizację akwaporyn Bemisia tabaci z subkomórkowymi białkami markerowymi fluorescencyjnymi.

Przejściowa ekspresja i lokalizacja komórkowa rekombinowanych białek w hodowanych komórkach owadów

Tutaj prezentujemy protokoły wykorzystania systemu ekspresji białek komórek owadów i bakulowirusa do produkcji dużych ilości białek wydzielanych przez rośliny do krystalizacji białek. Wektor ekspresyjny bakulowirusa został zmodyfikowany za pomocą GP67 lub peptydu sygnałowego hemoliny owadów w celu ekspresji wydzielania białek roślinnych w komórkach owadów.

Modyfikowanie wektorów ekspresyjnych bakulowirusa w celu wytwarzania wydzielanych białek roślinnych w komórkach owadów

Leishmania Translational Extract (LTE) to eukariotyczny system ekspresji białek bez komórek, pochodzący od jednokomórkowego pasożyta, Leishmania tarentolae. Ten zoptymalizowany protokół sprawia, że produkcja LTE jest prosta i opłacalna. Nadaje się do różnych zastosowań skoncentrowanych na wielorównoległej ekspresji i badaniu złożonych białek eukariotycznych i ich interakcji.

Produkcja i optymalizacja LTE, bezkomórkowego systemu ekspresji białek pochodzących z Leishmania tarentolae do produkcji białek rekombinowanych

Genetyka chemiczna polega na zastąpieniu reszty strażnika aminokwasem zawierającym inny łańcuch boczny w docelowym locus. W tym przypadku wygenerowaliśmy zmutowanego pasożyta zawierającego hipomorficzny allel cdpk1 i zidentyfikowaliśmy szlaki kompensacyjne przyjęte przez pasożyta na tle mutacji.

Zrozumienie rozwoju szlaków kompensacyjnych u zmutowanego pasożyta malarii zawierającego hipomorficzny allel kinaz roślinopodobnych

Poznaj bezkomórkowe systemy ekspresji białek Plasmodium z komórek HeLa do ekspresji białek rhoptry malarii. Metoda obejmuje jedno- i dwuetapową translację in vitro z chromatografią afinityczną na żywicy niklowej.

Oparte na HeLa systemy ekspresji bezkomórkowej do ekspresji białek Plasmodium Rhoptry

Przeglądaj więcej filmów