Oparte na HeLa systemy ekspresji bezkomórkowej do ekspresji białek Plasmodium Rhoptry

Ogólnym celem poniższego eksperymentu jest translacja białek plasmodium przy użyciu bezkomórkowych systemów ekspresyjnych opartych na hela oraz oczyszczenie białek z mikroobjętości translowanego produktu. Osiąga się to poprzez klonowanie genów plasmodium w celu przygotowania rekombinowanych plazmidów do dwuetapowej i jednoetapowej translacji in vitro, bezkomórkowej ekspresji rekombinowanych białek drzewa RT malarii. Aby dokonać translacji rekombinowanych białek, przygotowany plazmid inkubuje się z mieszanką transkrypcyjną.

W przypadku korzystania z dwuetapowego systemu ekspresji, który transkrybuje mRNA, powstałe mRNA jest następnie dodawane do mieszanki translacyjnej w celu translacji białek. Podczas korzystania z jednoetapowego systemu ekspresji, rekombinowany plazmid jest inkubowany z lizatem komórek hela w celu transkrypcji i translacji rekombinowanych białek. Rekombinowane białka są następnie oczyszczane z mikroobjętości produktu translacji.

Wyniki wskazują na udaną ekspresję i oczyszczanie w oparciu o analizę western blot. Główną przewagą tej techniki nad innymi, takimi jak system ekspresji kiełków pszenicy i system lizatu retikulocytów królika, jest to, że system ten może wyrażać białka w ciągu trzech godzin. Nie jest wymagana optymalizacja kodowania.

Jest niedrogi i łatwy w użyciu. Wiele antygenów może być poddawanych badaniom przesiewowym na mikromacierzach, co umożliwia wykrywanie antygenów do celów terapii i diagnozy. Ogólnie rzecz biorąc, osoby nowe w tej metodzie będą miały trudności, ponieważ jest to ekspresja bezkomórkowa, która powoduje ekspresję białek w mikroobjętościach, co sprawia, że oczyszczanie białek jest niezwykle trudne.

Po raz pierwszy wpadliśmy na pomysł, aby użyć tego systemu, ponieważ nie mogliśmy eksplodować ekspresji białek za pomocą E. coli, a inne systemy ekspresji okazały się zbyt drogie i czasochłonne. Zdecydowaliśmy się zbadać system ekspresji bezkomórkowej oparty na hela jako system alternatywny. Przygotować 20 mikrolitrów mieszaniny transkrypcyjnej zawierającej rekombinowany wektor plazmidowy DNA zgodnie z opisem w protokole tekstowym do dwuetapowej ekspresji białek ludzkich in vitro.

Korzystanie z matryc DNA. Wymieszaj składniki w mikroprobówce wirówkowej i inkubuj przez 75 minut w temperaturze 30 stopni Celsjusza w łaźni wodnej. Następnie weź dwa mikrolitry mieszaniny transkrypcyjnej i dodaj ją do 23 mikrolitrów mieszaniny translacyjnej zawierającej lizat komórek hela.

Inkubuj powstałą mieszaninę w temperaturze 30 stopni Celsjusza przez 90 minut. Przetłumaczone produkty należy przechowywać w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza. Następnie przygotuj 25 mikrolitrów mieszaniny transkrypcyjnej i translacyjnej zawierającej rekombinowany wektor plazmidowy, DNA i lizat, jak opisano w protokole tekstowym dla jednoetapowej ekspresji białka translacyjnego in vitro dla matryc DNA.

Inkubować tę mieszaninę reakcyjną przez 90 minut do sześciu godzin w temperaturze 30 stopni Celsjusza i przechowywać produkty translacji w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza. Aby oczyścić wyrażone białka rekombinowane, dodać 75 mikrolitrów jednego buforu oczyszczającego X do 25 mikrolitrów produktu translacji, aby uzyskać 100 mikrolitrów mieszaniny oczyszczającej. Żywicę niklową przemyć dwukrotnie, dodając 300 mikrolitrów wody destylowanej i 300 mikrolitrów buforu wiążącego.

Ponownie zawiesić żywicę i odwirować przy 14 000 G na jedną minutę, aby usunąć nadmiar etanolu. Następnie dodać 100 mikrolitrów przygotowanego roztworu oczyszczającego do 100 mikrolitrów żywicy chelatującej nikiel i inkubować mieszaninę na końcu. Zakończ wytrząsarkę na 60 minut w temperaturze pokojowej.

Odwirować mieszaninę w temperaturze 14 000 g przez jedną minutę i zebrać supernat do świeżej probówki oznaczonej jako przepływowy. Przemyć żywicę 100 mikrolitrami jednego x buforu do płukania, a następnie odwirować w temperaturze 14 000 GS przez jedną minutę i zebrać super wymienione w świeżej probówce z oznaczeniem płukania. Powtórz ten krok dwa razy po praniu.

Dodać 100 mikrolitrów jednego buforu elucyjnego x do żywicy i inkubować na wytrząsarce końcowej przez 15 minut. Następnie odwirować w temperaturze 14 000 g przez jedną minutę. Za każdym razem wykonuj krok Elluciana dwa razy.

Zebrać supernatant do świeżej probówki z mikrowirówką i oznaczyć jako eluat po ellucianie. Umyj żywicę dwa razy jak poprzednio, a następnie przechowuj ją w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Przechowywać przepływ przez próbki do płukania i elucji w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza lub niższej, aby przeprowadzić western blot.

Najpierw należy przygotować oddzielne probówki z ekstraktami schön z P falsy parum e coli, eksprymowanymi rekombinowanymi białkami R-trzy, przygotowanymi białkami rekombinowanymi i produktami białkowymi oczyszczonymi metodą powinowactwa. Następnie dodać bufor do próbki elektroforezy zawierający merkaptoetanol do każdej probówki, aby uzyskać końcową objętość 20 mikrolitrów. Aby uzyskać rozpuszczone próbki białka, gotuj probówki przez dwie minuty.

Załaduj rozpuszczone próbki białek na 10% żele stronicowe SDS, aby oddzielić białka po uruchomieniu żeli. Przenieś oddzielone białka z żeli ze strony SDS na papier nitrocelulozowy za pomocą elektroforezy przy 35 miliamperach prądu na żel w półsuchej komorze western blotting przez dwie godziny po przeniesieniu i zablokowaniu bibułki nitrocelulozowej 2% beztłuszczowym mlekiem. Inkubować bibułę nitrocelulozową z przeciwciałami poliklonalnymi wymienionymi w protokole tekstowym dla kontroli ujemnych.

Inkubuj również bibułę nitrocelulozową w jednej do 100 rozcieńczonej normalnej surowicy myszy i królika oraz zużytej hodowli super nazwanej od SB dwóch komórek szpiczaka. Po inkubacji bibuły nitrocelulozowej w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez noc przemyć czterokrotnie buforem do bibuły i inkubować z przeciwciałami drugorzędowymi specyficznymi dla gatunku, sprzężonymi z peroksydazą chrzanu, rozcieńczonymi w stosunku 1 do 1000 w 2% mleku. Następnie ponownie umyj papier nitrocelulozowy czterokrotnie buforem do bibuły.

Na koniec inkubować przemyty bibułę nitrocelulozową z roztworem do wywoływania koloru, A plus B przez 30 minut w ciemności, pomyślna ekspresja białek plasmodium przy użyciu systemów ekspresji in vitro wolnych od komórek ludzkich została potwierdzona przez specyficzny dla drzewa RT antyer królika, jak wykazano, wcześniej eksprymowane białka rekombinowane nie były rozpoznawane przez surowice odpornościowe przeciwko białkom vae pasożytnictwa z p FALs parem i P Yoi Lee, wykazujące swoistość surowic odpornościowych królika 6 76 w stosunku do eksprymowanych białek. Normalna surowica królika nie reagowała z rekombinowanymi białkami. Translacja przy użyciu dwuetapowego systemu ekspresji in vitro bez komórek ludzkich oraz jednoetapowego sprzężonego systemu translacji in vitro.

Pokazano skuteczne oczyszczanie translowanych białek z 25 mikrolitrów translowanych produktów białkowych. W szczególności pokazano skuteczne oczyszczanie białka transbłonowego rozszczepu mara. Wykazano również udane oczyszczenie hipotetycznego białka z genów kodujących białko drzewa plazmodium RT.

Na koniec wykazano skuteczne oczyszczanie powtórzeń pancernika zawierających białko drzewa plazmodium RT. Wydajność białka po oczyszczeniu wynosi 3,5 mikrograma na 25 mikrolitrów Po jego opracowaniu. Technika ta utorowała drogę naukowcom w dziedzinie parazytologii do charakterystyki białek u pasożytów, interakcji białko-białko, badań hamujących przeciwciała i opracowywania szczepionek w dziedzinie parazytologii.

Po obejrzeniu tego filmu powinieneś zrozumieć, jak używać systemu ekspresji komórek opartego na komórkach uzdrowiciela do ekspresji białek plasmodium w ciągu trzech godzin. Będziesz miał również wiedzę, jak oczyszczać białka z mikroobjętości translowanego produktu.