Poziome wycinki hipokampa mózgu myszy

Protokół ten ułatwia przygotowanie poziomych wycinków mózgu hipokampa do ich wykorzystania w różnych zastosowaniach naukowych. Technika ta zachowuje integralność wszystkich szlaków włókien hipokampa w jednym wycinku półkuli. Ten protokół slice idealnie nadaje się do oceny zmian neurologicznych, które zachodzą w patologiach mózgu, które rozwijają się i manifestują w zakręcie zębatym.

Najważniejszym aspektem tego protokołu jest znalezienie równowagi między jak najszybszym wykonaniem a delikatnym obchodzeniem się z tkanką mózgową. Aby przygotować jeden litr ACSF, powoli wymieszaj wszystkie stałe chemikalia, jak wskazano, w 800 mililitrach wody pod ciągłym mieszaniem za pomocą mieszadła magnetycznego, a następnie powoli wlej odpowiednie ilości siarczanu magnezu i chlorku wapnia. Następnie użyj osmometru ciśnienia pary, aby sprawdzić osmolarność w zakresie od 305 do 315 miliosmoli i w sposób ciągły bąbelkować roztwór ACSF w temperaturze pokojowej karbogenem, aby ustawić pH między 7,3 a 7,4.

Aby przygotować 250 mililitrów roztworu w plasterkach o wysokiej zawartości sacharozy, dodaj związki do 25 mililitrów wstępnie pokrojonego roztworu, jak wskazano w tabeli i sprawdź, czy osmolarność wynosi od 320 do 325 miliosmol. Następnie bąbelkować roztwór plastrów o wysokiej zawartości sacharozy przez 10 do 15 minut karbogenem, aby ustawić pH między 7,3 a 7,4 i przechowywać roztwór plastrów o wysokiej zawartości sacharozy przez 20 do 30 minut w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza, aż zostanie częściowo zamrożony. Aby przygotować miejsce do sekcji, napełnij komorę rekonwalescencji karbogenicznym roztworem ACSF i umieść komorę w łaźni wodnej o temperaturze 32 stopni Celsjusza.

Ustaw wibratomat na odpowiedni program cięcia i napełnij uchwyt lodem, zamontuj go na wibratomie i przymocuj ostrze do ramienia wibratomu. Za pomocą szpatułki zmiażdż i wymieszaj częściowo zamrożony roztwór plastrów o wysokiej zawartości sacharozy, aż do uzyskania niejednorodnej brei. Następnie bąbelkować roztwór karbogenem i użyć roztworu do uwodnienia kawałka bibuły filtracyjnej na schłodzonym 90-milimetrowym naczyniu hodowlanym i napełnić 35-milimetrową naczynię hodowlaną lodem.

Aby pobrać mózg, użyj nożyczek preparacyjnych, aby rozciąć skórę głowy dwu- do sześciotygodniowego samca myszy i otworzyć kalwarię wzdłuż szwu strzałkowego. Użyj zakrzywionych kleszczy, aby usunąć czaszkę, aż cały mózg, w tym opuszki węchowe, będzie widoczny, i użyj szpatułki, aby ostrożnie zgarnąć nienaruszoną tkankę mózgową. Umieść mózg w 35-milimetrowym naczyniu hodowlanym i użyj pipety Pasteura wypełnionej roztworem plastrów o wysokiej zawartości sacharozy, aby delikatnie usunąć wszelkie włosy lub cząsteczki krwi z tkanki.

Użyj szpatułki, aby przenieść oczyszczony mózg na kawałek nasączonej bibuły filtracyjnej i użyj ostrza, aby przeciąć mózg wzdłużnie na pół. Umieść obie półkule na świeżo przyciętej stronie przyśrodkowej i użyj ostrza, aby wykonać równoległe cięcie na grzbietowej górze każdej półkuli, aby usunąć obszar grzbietowy każdego kawałka mózgu. Umieść obie półkule na świeżo ściętej stronie grzbietowej z brzuszną częścią mózgu skierowaną do góry i umieść kroplę super kleju na płytce próbki.

Użyj końcówki pipety, aby rozprowadzić klej na dużym obszarze, aby pomieścić oba kawałki tkanki i dotknij kawałka paska bibuły filtracyjnej po brzusznej stronie jednej półkuli. Użyj innego paska z bibuły filtracyjnej, aby ostrożnie częściowo wysuszyć grzbietową stronę mózgu i umieść półkulę grzbietową stroną w dół na kleju na płytce próbki. Użyj dwóch dodatkowych pasków z bibuły filtracyjnej, aby ustawić drugą półkulę na kleju, jak właśnie pokazano, i umieść płytkę próbki w komorze krojenia.

Następnie szybko, ale ostrożnie przykryj talerz lodowatym roztworem plastrów o wysokiej zawartości sacharozy. Aby uzyskać skrawki tkanki mózgowej, umieść ostrze wibratomu przed przyśrodkową stroną półkul i podnieś stół wibratomu tak, aby ostrze znajdowało się na tej samej wysokości, co brzuszne boki półkul, które są teraz skierowane do góry. Użyj regulatora wibratomu, aby opuścić ostrze o 600 mikronów dalej w kierunku grzbietowym i pokrój tkankę, aż pierwsze dwie warstwy zostaną całkowicie oddzielone od dwóch półkul.

Po uzyskaniu pierwszych dwóch plasterków tkanki odwróć kierunek cięcia i opuść ostrze o kolejne 300 mikronów przed ponownym krojeniem. Kiedy hipokamp stanie się widoczny, użyj poszerzonej plastikowej pipety Pasteura, aby zebrać i przenieść plastry do komory regeneracyjnej w łaźni wodnej. Pozostaw plastry w komorze regeneracyjnej wypełnionej ACSF na jedną godzinę, a następnie umieść komorę odzyskiwania w temperaturze pokojowej na 30 minut przed wykonaniem zapisów elektrofizjologicznych próbek tkanek.

Tutaj można zaobserwować reprezentatywne zapisy potencjału postsynaptycznego pobudzającego pole ujemne i dodatnie odpowiednio z wycinków o niskiej i wysokiej jakości. Ujemny przykładowy ślad wykazuje dużą amplitudę salwy włókien po depolaryzacji stymulowanych włókien neuronalnych, która jest nawet wyższa niż rzeczywista amplituda fEPSP, podczas gdy wysokiej jakości ślad pokazuje mały stosunek salwy włókien do fEPSP i wysoką amplitudę fEPSP. Żywotność wycinka mózgu można również przeanalizować, wykreślając pobudzające nachylenia potencjału postsynaptycznego w stosunku do amplitud włóknistych.

Krzywe wejścia/wyjścia, które są zwykle używane do określania jakości wycinka, można uzyskać, stosując narastające bodźce prądowe do wycinka mózgu i monitorując następujące po nim odpowiedzi fEPSP. Ze względu na nieoptymalne właściwości przewodzenia słabo zachowanej tkanki mózgowej, niskiej jakości wycinki mózgu wykazują zmniejszone krzywe wejścia/wyjścia. Żywotne wycinki mózgu mają stabilne linie bazowe transmisji synaptycznej, podczas gdy wycinki mózgu o niestabilnej linii podstawowej nie mogą być wykorzystywane do dalszych protokołów warunkowania w celu zbadania plastyczności synaptycznej obwodów mózgu.

Zapisy wyjściowe fEPSP mogą być również przydatne do monitorowania wpływu leku na samą transmisję synaptyczną. Ponadto wycinki mózgu mogą być używane w połączeniu ze wskaźnikiem wapnia do uzyskiwania zapisów obrazowania fluorescencyjnego i badania napływu wapnia w różnych warunkach warstw lub zabiegach. Upewnij się, że sekcja mózgu zostanie wykonana w ciągu nie więcej niż 1,5 minuty od poświęcenia, a to nadal gwarantuje, że tkanka mózgowa jest tylko na krótko bez chłodzenia i dopływu tlenu.

Wycinki mózgu hipokampa mają wiele różnych zastosowań, od technik biologii molekularnej po elektrofizjologię. Procedura ta ułatwia intensywne badania anatomii hipokampa i procesów neurologicznych.