Name: Poziome wycinki hipokampa mózgu myszy (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-09-22T14:45:00.000+00:00
Duration: 8 min 59 s
Description: Poznaj metodę przygotowania poziomych wycinków hipokampa mózgu myszy do badań elektrofizjologicznych. Technika ta zachowuje integralność kluczowych szlaków włóknistych, umożliwiając analizę transmisji synaptycznej i plastyczności.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy jednostce Elektrofizjologii Centrum Badań nad Mózgiem i Chorobami VIB-KU Leuven pod nadzorem dr Keimpe Wierda i prof. dr Jorisa De Wita za korzystanie z ich obiektów badawczych. Ponadto dziękujemy wszystkim członkom Laboratorium Badań Kanałów Jonowych oraz Laboratorium Endometrium, Endometriozy i Medycyny Rozrodu KU Leuven za ich pomocne dyskusje i komentarze.
Ten projekt otrzymał finansowanie od Fundacji Badawczej Flandrii (G.084515N i G.0B1819N dla J.V.) oraz Rady Naukowej KU Leuven (C1-funding C14/18/106 dla J.V.). K.P. jest stypendystką FWO [PEGASUS]2 stypendystką Marie Skłodowskiej-Curie i otrzymała dofinansowanie z programu Unii Europejskiej Horyzont 2020 w zakresie badań i innowacji w ramach umowy grantowej "Maria Skłodowska-Curie" (665501) z Fundacją Badawczą Flandria (FWO) (12T0317N). K.H. jest adiunktem Fundacji Badawczej Flandria, Belgia (12U7918N).

Wszystkie eksperymenty na zwierzętach w tym badaniu zostały zatwierdzone przez komisję oceny etycznej KU Leuven (Belgia) (P021/2012).
1. Przygotowanie roztworu plastrów o wysokiej zawartości sacharozy i sztucznego płynu mózgowo-rdzeniowego (ACSF)
<ol>
	<li>Przed dniem eksperymentalnym
	<ol>
		<li>Przygotować 1 l 10-krotnego roztworu wstępnego z laboratoryjną wodą typu 1 zawierającą (w mM): 25 KCl, 20 CaCl2, 10MgSO4, 12,5 KH2PO4 (Tabela 1). Aby zapobiec wytrącaniu się fosforanu wapnia, należy powoli mieszać chemikalia w zlewce wstępnie napełnionej 800 mlH2O, ciągle mieszając mieszadłem magnetycznym. Roztwór należy przechowywać w temperaturze 4 °C lub pokojowej (RT).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>W dniu eksperymentu
	<ol>
		<li>Przygotować 1 l 1x ACSF z laboratoryjną wodą typu 1 zawierającą (w mM): 125 NaCl, 2,5 KCl, 2 CaCl2, 1 MgSO4, 1,25 NaH2PO4, 26 NaHCO3, 25 Glucose (Tabela 2). Użyj osmometru ciśnienia pary, aby sprawdzić osmolarność w zakresie 305–315 mOsm (pH ~ 7,55–7,6). 
		UWAGA: Aby zapobiec wytrącaniu się fosforanu wapnia, należy powoli wymieszać wszystkie stałe substancje chemiczne w zlewce wstępnie napełnionej 800 mlH2O, ciągle mieszając mieszadłem magnetycznym. Na samym końcu dodaćMgSO4 i CaCl2, powoli ociekając w niezbędnej ilości z 1 M roztworów podstawowych.</li>
		<li>Ciągle bąbelkować 1x roztwór ACSF w temperaturze pokojowej z karbogenem, aby ustawić pH w zakresie 7,3–7.4, 
		UWAGA: Jeśli pH jest nieco za wysokie lub za niskie, wystarczą niewielkie korekty siły karbonowania. Jeśli pH jest wyższe niż 7,45 z karbonowaniem, dostosuj je, dodając kilka kropli 1 M NaH2PO4 roztworu.</li>
		<li>Przygotować 250 ml (na mózg) 1x roztworu plastrów o wysokiej zawartości sacharozy w zlewce zawierającej 25 ml 10-krotnego roztworu w plastrach i (w mM): 252 sacharozy, 26 NaHCO3 i 10 glukozy (Tabela 3). Sprawdź, czy osmolarność wynosi 320–325 mOsm (pH ~ 7,55–7,6).</li>
		<li>Pęcherzykować roztwór plastrów o wysokiej zawartości sacharozy przez 10–15 minut z karbogenem, aby kontrolować pH w zakresie 7,3–7.4. 
		UWAGA: Jeśli pH jest wyższe niż 7,45 z karbonacją, dostosuj je, dodając kilka kropli roztworu 1 M KH2PO4</li>.
		<li>Przechowuj roztwór plastrów o wysokiej zawartości sacharozy przez 20–30 minut w ultrazamrażarce (-80 °C), aż zostanie częściowo zamrożony.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Przygotowanie miejsca do przeprowadzenia sekcji mózgu
<ol>
	<li>Podczas schładzania roztworu w plasterkach sacharozy należy przygotować następujące składniki.
	<ol>
		<li>Rozgrzać łaźnię wodną do temperatury 32 °C.</li>
		<li>Napełnij komorę odzysku (<klasa silna="xfig">Rysunek 2A) roztworem karbonogennego ACSF i umieść komorę w łaźni wodnej. Stale nakładać karbogen na główną butlę ACSF i ACSF w komorze odzyskiwania.</li>
		<li>Zaprowadź zwierzę do pokoju doświadczalnego. 
		UWAGA: Wiek, płeć i szczep zwierzęcia muszą być określone przez indywidualnego eksperymentatora i zależą od konkretnego pytania badawczego. Jednakże parametry zwierzęcia powinny pozostać stałe w ramach jednego badania, aby zagwarantować porównywalność między różnymi dniami doświadczalnymi. Protokół ten został opracowany do użytku samców myszy C57BL/6J w wieku 2-6 tygodni. Jeśli będą wykorzystywane starsze zwierzęta, może być konieczne odpowiednie dostosowanie roztworów do warstw i odzyskiwania4,27 (np. rozwiązania oparte na NMDG+23,28) w celu zachowania zdrowia mózgu ostrych plastrów.</li>
		<li>Przygotuj komorę anestezjologiczną.</li>
		<li>Rozłóż bibułkę, plastikową pipetę Pasteura z szerokim otworem (rozciętą), 90 mm naczynie hodowlane wypełnione lodem, kwadrat bibuły filtracyjnej na schłodzonej misce hodowlanej, mocne nożyczki do dekapitacji, nożyczki do preparacji, zakrzywione kleszcze, szpatułkę, naczynie hodowlane 35 mm, cienką szczoteczkę, ostrze, płytkę próbki (w zestawie z wibratomem), super klej, końcówkę pipety, cztery paski bibuły filtracyjnej (~ 2 cm x 0,5 cm) (<silna klasa="xfig">Rysunek 2A).</li>
		<li>Ustaw wibratom: Najpierw zaprogramuj wibratom na prawidłowe ustawienia (prędkość przesuwu ostrza: 0,08 mm/s, amplituda cięcia: 1,4 mm, częstotliwość cięcia: 85 Hz) i zamocuj żyłkę karbogeniczną w komorze plastrowania. Następnie umieść komorę na plastry w uchwycie, napełnij uchwyt otaczający komorę na plastry lodem i przymocuj wszystko do wibratomu. Na koniec umieść żyletkę w uchwycie ostrza wibratomu (<silna klasa="xfig">Rysunek 2B).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Po zamrożeniu roztworu o wysokiej zawartości sacharozy wykonaj następujące czynności.
	<ol>
		<li>Po 20–30 minutach wyjmij roztwór plastrów o wysokiej zawartości sacharozy z ultrazamrażarki o temperaturze -80 °C i trzymaj zlewkę na lodzie.</li>
		<li>Umieść roztwór o wysokiej zawartości sacharozy obok wibratomu na swojej ławce, zmiażdż i wymieszaj częściowo zamrożony roztwór szpatułką, aby uzyskać ładną breję i zacznij bulgotać karbogenem.</li>
		<li>Za pomocą plastikowej pipety Pasteura nabierz trochę roztworu plastrów o wysokiej zawartości sacharozy, aby namoczyć kwadratową bibułę filtracyjną na schłodzonej naczyniu hodowlanym o średnicy 90 mm.</li>
		<li>Napełnić naczynie hodowlane o średnicy 35 mm (lub inny równoważny mały pojemnik, który jest odpowiedni do przechowywania całego mózgu) do 75% roztworem plastrów o wysokiej zawartości sacharozy (wystarczającym do pokrycia całego mózgu) i schłodzić szalkę hodowlaną na lodzie umieszczonym obok zlewki z resztą roztworu. Skarbonować roztwór w naczyniu hodowlanym o średnicy 35 mm.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Sekcja i umiejscowienie mysiego mózgu
<ol>
	<li>Znieczulić zwierzę 5% izofluranem. Określ odpowiednią głębokość znieczulenia, ściskając łapę. Nie powinien wystąpić odruch wycofania łapy.</li>
	<li>Przenieś zwierzę na bibułę i odetnij mu głowę silnymi nożyczkami lub gilotyną dla małych zwierząt.</li>
	<li>Użyj nożyczek preparacyjnych, aby rozciąć skórę głowy.</li>
	<li>Rozetnij kalwarię wzdłuż szwu strzałkowego i usuń ją za pomocą zakrzywionych kleszczy, aż cały mózg, w tym opuszki węchowe, będzie widoczny. 
	UWAGA: Uważaj, aby nie uszkodzić mózgu ostrymi krawędziami kalwarii lub kleszczykami.</li>
	<li>Użyj szpatułki, aby ostrożnie zgarnąć mózg (opuszki węchowe powinny pozostać przyczepione).</li>
	<li>Przenieś mózg do schłodzonego naczynia hodowlanego o średnicy 35 mm i usuń wszystkie włosy lub cząsteczki krwi z tkanki, delikatnie myjąc mózg pipetą Pasteura wypełnioną ACSF (krew ma działanie cytotoksyczne na tkankę mózgową29).</li>
	<li>Przenieś mózg za pomocą szpatułki na nasączoną bibułę filtracyjną na schłodzonej naczyniu hodowlanym 90 mm (<silna klasa="xfig">Rysunek 2A).</li>
	<li>Użyj ostrza, aby przeciąć mózg na pół, oddzielając dwie półkule, i umieść obie półkule na świeżo odciętej środkowej stronie.</li>
	<li>Użyj ostrza, aby usunąć grzbietową część (5%-10%) mózgu z każdej półkuli z równoległym cięciem do grzbietowej górnej części (Rysunek 2C)30 i umieść obie półkule po świeżo odciętej stronie z brzuszną częścią mózgu skierowaną do góry.</li>
	<li>Umieść kroplę super kleju na płytce próbki i odpowiednio rozprowadź końcówką pipety, aby pomieścić obie półkule.</li>
	<li>Użyj paska z bibuły filtracyjnej, aby podnieść jedną półkulę z siłami kapilarnymi, dotykając strony brzusznej paskiem z bibuły filtracyjnej, nie uszkadzając w ten sposób tkanki.</li>
	<li>Użyj innego paska z bibuły filtracyjnej, aby ostrożnie częściowo wysuszyć grzbietową stronę mózgu przed umieszczeniem półkuli grzbietową stroną do dołu na kleju na płytce próbki. Powtórz tę samą procedurę z drugą półkulą. 
	UWAGA: Półkule powinny być ustawione w linii poziomej w lustrzanym odbiciu na płycie wibratomowej, przy czym boki rostralne są skierowane na zewnątrz, a boki ogonowe zwrócone do siebie (ale nie stykają się) pośrodku. Przyśrodkowe strony obu półkul powinny być skierowane w stronę ostrza wibratomu, a boczne boki w stronę eksperymentatora (<silna klasa="xfig">Rysunek 2D).</li>
	<li>Umieść płytkę próbki w komorze krojenia i szybko, ale ostrożnie, przykryj ją lodowatym roztworem plastrów o wysokiej zawartości sacharozy. Gdy tylko roztwór dotknie kleju, zestali się i prawidłowo przyklei półkule do płytki próbki.</li>
	<li>Upewnij się, że półkule są odpowiednio pokryte roztworem plastrów o wysokiej zawartości sacharozy i potwierdź, że roztwór jest bąbelkowany karbogenem. 
	UWAGA: Cała procedura preparacji powinna być wykonana tak szybko, jak to możliwe. Proszę upewnić się, że mózg nie pozostaje bez dopływu tlenu przez bardzo długi czas. Od dekapitacji do zanurzenia mózgu w roztworze o wysokiej zawartości sacharozy powinno upłynąć tylko około 1–1,5 minuty. Jest to najważniejszy wymóg dla preparatów z ostrymi plastrami mózgu, aby zagwarantować wysoką jakość wycinka.</li>
</ol>
4. Poziome krojenie mózgu
<ol>
	<li>Umieść ostrze wibratomu przed przyśrodkową stroną półkul i opuść je na tę samą wysokość, co brzuszne strony półkul, które są teraz skierowane do góry. Opuść ostrze za pomocą regulatora wibratomu do 600 μm dalej w kierunku grzbietowym i rozpocznij krojenie. Ostrze powinno uderzyć w tkankę (jeśli nie, odwróć ostrze i opuść je nieco bardziej). Kroj, aż pierwsze dwa plasterki zostaną całkowicie oddzielone od dwóch półkul.</li>
	<li>Odwróć ostrze i opuść o kolejne 300 μm i ponownie pokrój.</li>
	<li>Kiedy hipokamp stanie się widoczny (w razie potrzeby użyj atlasu mózgu mouse31, aby uzyskać pomoc) (Rysunek 2E) zbierz plastry za pomocą poszerzonej plastikowej pipety Pasteura. Zbieraj plastry, aż skorupa ogoniasta stanie się widoczna obok hipokampa. Zazwyczaj do mózgu myszy można zebrać od 8 do 12 plastrów o wielkości 300 μm (4 – 6 na półkulę).</li>
	<li>Użyj plastikowej pipety Pasteura, aby zebrać plastry i przenieść je do komory rekuperacji w łaźni wodnej (<silna klasa="xfig">Rysunek 2F) (zbieraj plastry po każdej rundzie krojenia, aby zapobiec ich unoszeniu się w komorze krojenia). 
	UWAGA: Pracuj tak szybko, jak to możliwe i upewnij się, że roztwór plastrów o wysokiej zawartości sacharozy jest lodowaty i karbonogenowany podczas całej procedury. W razie potrzeby uzupełnij lód otaczający komorę na plastry.</li>
</ol>
5. Odzyskiwanie wycinków mózgu do zapisów elektrofizjologicznych
<ol>
	<li>Pozostawić plastry w komorze regeneracyjnej wypełnionej ACSF w łaźni wodnej o temperaturze 32 °C na 1 godz. 
	UWAGA: Komory odzysku są również dostępne na rynku.</li>
	<li>Wyjmij komorę regeneracyjną z łaźni wodnej.</li>
	<li>Umieść plastry w temperaturze pokojowej na co najmniej kolejne 30 minut w celu wyzdrowienia przed rozpoczęciem dalszej aplikacji.</li>
</ol>
6. Zapisy fEPSP w przyśrodkowej ścieżce perforacji (MPP) hipokampa
<ol>
	<li>Wyciągnąć pipety rejestrujące z kapilar ze szkła borokrzemianowego za pomocą poziomego ściągacza do pipet, aby otrzymać pipety o wielkości ~2 MΩ po napełnieniu roztworem ACSF i zanurzeniu w komorze zapisu wypełnionej ACSF.</li>
	<li>Napełnij roztwór do kąpieli ACSF i roztwór ACSF zawierający odpowiednie substancje chemiczne (np. bicukulinę) w sterowanym grawitacyjnie wielolufowym systemie perfuzyjnym, który jest podłączony do komory rejestrującej. Ciągłe karbonowanie wszystkich roztworów.</li>
	<li>Włączyć pompę perystaltyczną lub próżniową, która jest podłączona do rurki ssącej, która kończy się naprzeciwko linii perfuzyjnej w komorze nagrywania. Otwórz beczkę wypełnioną ACSF i zacznij ustalać ciągły przepływ (1-2 krople na sekundę). Sprawdź, czy elektroda referencyjna jest zanurzona w roztworze ACSF.</li>
	<li>Włącz komputer konfiguracyjny, amplifier, mikromanipulator, stymulator, światło mikroskopu, kamerę i monitor (jeśli dotyczy).</li>
	<li>Otwórz odpowiednie oprogramowanie do zapisów elektrofizjologicznych (istnieje kilku różnych dostawców sprzętu i oprogramowania dla sprzętu elektrofizjologicznego).</li>
	<li>Przenieś jedną półkulę wycinka mózgu z komory odzyskiwania do komory rejestracyjnej zestawu wycinków i ustaw ją we właściwej orientacji z warstwą komórek ziarnistych zakrętu zębatego i warstwą molekularną w polu widzenia. Upewnij się, że elektroda stymulacyjna może dotrzeć do MPP w wycinku od kierunku kory śródwęchowej i że elektroda rejestrująca ma dostęp do MPP dokładnie po przeciwnej stronie niż kierunek CA3.</li>
	<li>Ustabilizuj wycinek w komorze nagrywającej za pomocą spinacza do papieru (<silna klasa="xfig">Rysunek 3A) lub dostępnej na rynku siatki do wycinania mózgu. 
	UWAGA: Pomocne może być wyłączenie perfuzji podczas przenoszenia i pozycjonowania plasterka. Nie powinno to jednak zająć zbyt dużo czasu, aby zagwarantować jakość wycinka mózgu.</li>
	<li>Obniż i umieść elektrody rejestrujące i stymulujące w MPP w dolnej jednej trzeciej warstwy molekularnej w pobliżu warstwy komórek ziarnistych (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 3B), zwrócone do siebie w odległości około 100–150 μm. Elektroda stymulująca powinna minimalnie stykać się z powierzchnią, podczas gdy elektroda rejestrująca powinna lekko infiltrować górną warstwę warstwy.</li>
	<li>Zastosuj bodziec o niskiej intensywności (30–50 μA przez 0,1 ms) do wycinka mózgu, aby uzyskać sygnał fEPSP. W razie potrzeby dostosuj położenie elektrod (np. niski lub nietypowy kształt sygnału fEPSP).</li>
	<li>Rozpocznij nagrywanie krzywych wejścia-wyjścia: stosuj rosnącą intensywność bodźców do wycinka mózgu w odstępach 30 sekund.</li>
	<li>Ustaw intensywność bodźca na 50% maksymalnej odpowiedzi fEPSP i rozpocznij podstawowe zapisy fEPSP, stosując 50% intensywność bodźca przez 20–40 minut w odstępach 30 s do wycinka mózgu.</li>
	<li>Jeśli linia wyjściowa wydaje się być stabilna, należy przeprowadzić dodatkowe zapisy (np. protokoły LTP/LTD i/lub aplikacje leków). (Do indukcji LTP w MPP zastosowano tutaj protokół składający się z czterokrotnych impulsów 1 s 100 Hz zastosowanych w odstępie 5 minut. Bicuculline zastosowano 10 minut przed i w trakcie fazy kondycjonowania.) 
	UWAGA: Wszystkie nagrania powinny być wykonywane w aktualnym trybie cęgowym z odpowiednim filtrowaniem dolnoprzepustowym (<5 kHz) i częstotliwościami próbkowania (>10 kHz).</li>
	<li>Wyodrębnij dane w odpowiednim formacie pliku i przeanalizuj parametry fEPSP, takie jak salwa światłowodowa, amplituda fEPSP i nachylenie fEPSP.</li>
</ol>
7. Zapisy obrazowania wapnia wycinków mózgu
<ol>
	<li>Przenieś jedną półkulę wycinka mózgu do 12-dołkowej komory i załaduj ją na 30 minut do 1 godziny odpowiednim barwnikiem wapniowym. Roztwor ładujący należy w sposób ciągły karbonować, wkładając rurkę karbonizacyjną przez samodzielnie wykonany otwór (z gorącą igłą 18G) w pokrywie płytki 12-dołkowej. 
	UWAGA: Ten krok nie jest konieczny w przypadku preparatów z wycinkami mózgu pochodzących od genetycznie zmodyfikowanych zwierząt, które endogennie eksprymują fluorescencyjny reporter, taki jak GCaMP.</li>
	<li>Przygotuj konfigurację nagrywania zgodnie z opisem w krokach 6.2–6.5. 
	UWAGA: Do eksperymentów z obrazowaniem mikrofluorymetrycznym nie jest potrzebny wzmacniacz ani mikromanipulator. Użycie stymulatora jest zależne od eksperymentu. Niezbędne jest specjalne oprogramowanie do eksperymentów z obrazowaniem fluorescencyjnym.</li>
	<li>Dostosuj oprogramowanie do prawidłowych ustawień obrazowania: obejmuje to ustawienie wzmacniacza kamery i binningu, ustawienie długości fali, czasu ekspozycji i protokołu czasowego. Ustawienia mogą się różnić w zależności od konkretnych eksperymentów. (Dla przykładowych ścieżek użyto 1 x 1 binning, 2,4x wzmocnienia przedwzmacniacza, wzmocnienia kamery 300 EM, ekspozycji 50 ms przy 488 nm powtarzanej co 500 ms przez czas trwania eksperymentu.)</li>
	<li>Po załadowaniu barwnikiem wapniowym przenieś półkulę wycinka mózgu z 12-dołka do komory zapisu i umieść ją na stoliku mikroskopu.</li>
	<li>Ustabilizuj wycinek w komorze zapisu za pomocą spinacza do papieru (<silna klasa="xfig">Rysunek 3A) lub dostępnej na rynku siatki do wycinania mózgu, podobnej do tej opisanej w kroku 6.7.</li>
	<li>Upewnij się, że obszar zainteresowania znajduje się w odpowiednim polu mikroskopowym i jest ostry.</li>
	<li>Użyj oprogramowania do obrazowania fluorescencyjnego, aby wybrać kilka obszarów zainteresowania (ROI) na swoim plasterku. 
	UWAGA: Przydatne może być wybranie całego pola widzenia, aby śledzić ogólne wahania jasności spowodowane fotowybielaniem.</li>
	<li>Rozpocznij nagrywanie i zastosuj eksperymentalne leki testowe w wybranych punktach czasowych. 
	UWAGA: Zaleca się zastosowanie roztworu o wysokiej zawartości K+ na końcu każdego eksperymentu, aby zweryfikować neuronalny charakter komórek i jakość plasterka.</li>
	<li>Wyodrębnij dane w odpowiednim formacie pliku i przeanalizuj zmiany sygnału fluorescencji, które zachodzą w ROI w całym pomiarze. Zwroty z inwestycji mogą być również dostosowywane podczas analizy off-line. 
	UWAGA: Inne protokoły opisujące zapisy fEPSP i mikrofluorymetrię wapnia w wycinkach mózgu są dostępne w literaturze24,32,33,34,35.</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Chociaż powszechnie stosowane w społeczności neuronaukowej, preparaty do wycinania mózgu mają również kilka wad. Na przykład połączenia wejściowe i wyjściowe z obszarami zainteresowania mózgu nie są już połączone w wycinku mózgu. Co więcej, po wyizolowaniu tkanka zaczyna z czasem powoli ulegać degradacji, a proces ten może zmienić warunki fizjologiczne wycinka mózgu. Ten temat jest szczególnie niepokojący, ponieważ większość zapisów wycinków mózgu trwa od kilku minut do godzin, co skutkuje długimi dniami eksperymentalnymi z nagraniami wykonywanymi na tkance, która została wyizolowana do 6-8 godzin przed rozpoczęciem eksperymentu. Co więcej, płyn mózgowo-rdzeniowy i krążenie krwi zostają przerwane podczas przygotowywania plastrów, co może prowadzić do braku ważnych związków endogennych w wycinku mózgu. A co najbardziej oczywiste, sama procedura krojenia może spowodować mechaniczne uszkodzenie tkanek, które może zagrozić uzyskanym wynikom. Jednak rzeczywiste korzyści płynące z preparatów typu brain slice nadal przeważają nad ich wadami, dlatego stanowią one wysoko cenioną i stosowaną technikę w badaniach neurobiologicznych.
Ostre wycinki mózgu w hipokampie stanowią potężną, a zatem szeroko stosowaną technikę badania procesów neuronalnych od poziomu molekularnego do złożonych badań obwodów mózgu. Opiera się to na idealnej neuroanatomii hipokampa, którą można łatwo zachować w preparacie plastrów18. W związku z tym wycinki mózgu hipokampa są wykorzystywane w wielu różnych projektach naukowo-badawczych, w tym w badaniach przesiewowych leków17, badaniach właściwości neuronalnych i synaptycznych związanych z funkcjami poznawczymi40,41 oraz badaniach patologicznych stanów mózgu 14,42,43. Jednak szerokie spektrum różnych zastosowań powoduje również szeroką gamę dostępnych protokołów przygotowania plastrów, które mogą różnić się różnymi parametrami, takimi jak m.in. warunki rozwarstwienia i orientacja płaszczyzny cięcia. W związku z tym należy określić dokładne pytanie badawcze projektu naukowego, aby wybrać odpowiedni protokół przygotowania plastrów.
Rozdrabniacz tkanek jest jedną z najstarszych technik stosowanych w celu przygotowania wycinków mózgu z hipokampa44,45. Do głównych zalet tej metody przygotowania należy niski koszt rozdrabniacza oraz szybkie i łatwe użycie46. Jednak rozdrabniacze tkanek powodują naprężenia mechaniczne, które powodują zmiany morfologiczne i śmierć komórki47. Dla porównania, wibratom jest dość drogim urządzeniem, a czas przygotowania plastra znacznie się wydłuża, co może mieć wpływ na jakość plastra. Jednak wibratom zwykle oferuje łagodniejszy sposób oddzielania plastrów od tkanki i pozwala utrzymać mózg w przyjemnym chłodzie i dotlenieniu przez całą procedurę izolacji, poprawiając w ten sposób właściwości plasterków46. Dlatego kilka grup standardowo stosuje tę technikę i opracowało protokoły przygotowania ostrych wycinków mózgu hipokampa za pomocą wibratomu 16,30,48. Podczas gdy niektóre protokoły zawierają tylko kilka szczegółów dotyczących samego krojenia, ale raczej koncentrują się na konkretnym zastosowaniu takiego przygotowania plastrów48, inne zawierają szczegółowe protokoły krojenia, które różnią się płaszczyzną cięcia lub innymi szczegółami protokołu (np. osadzanie agarozy lub roztwory do odzysku plastrów) podane w tym artykule27,30.
Opisany tutaj protokół przedstawia prostą metodę przygotowania wysokiej jakości ostrych poziomych wycinków mózgu myszy z hipokampa z młodych zwierząt. Protokół jest szczególnie przydatny do zachowania ścieżki perforacyjnej (przyśrodkowej i bocznej), która przedstawia szlak wejściowy hipokampa, który wystaje z kory śródwęchowej do hipokampa 8,49,50. Strzałkowe, czołowe, a także izolowane preparaty przekroju poprzecznego hipokampa nie zachowują prawidłowo ścieżki perforacji, która pochodzi głównie z warstw II i V kory śródwęchowej i rzutuje na kilka obszarów w obrębie hipokampa18. Ze względu na anatomiczne umiejscowienie kory śródwęchowej w stosunku do hipokampa, poziome wycinki mózgu są niezbędne w celu utrzymania w pełni nienaruszonych włókien ścieżki perforacji w preparacji plastra31. Dodatkowo, poziome krojenie idealnie zachowuje omszałe włókna, które wystają z zakrętu zębatego do neuronów CA3 w hipokampie 9,30,50. Dlatego ta metoda przygotowania ma dużą wartość dla badań, które badają szlaki wejściowe hipokampa i procesy związane z DG. Ponadto protokół ten pozwala na zbadanie ścieżki pobocznej Schaffera50. Jednak preparaty krzyżowe i koronalne z wycinków mózgu są częściej stosowane podczas badania projekcji włókien CA3 do CA1, prawdopodobnie ze względu na ich nieco szybszy czas przygotowania, który może zwiększyć szansę na uzyskanie wysokiej jakości plastrów. Niemniej jednak, poziome preparaty warstw hipokampa stanowią potężne narzędzie badawcze, ponieważ pozwalają na zachowanie i zbadanie wszystkich szlaków włókien hipokampa w obrębie jednej półkuli warstwowej. Może to być szczególnie przydatne, gdy badane są odpowiedzi obwodów, na przykład w zapisach testów wieloelektrodowych.
Głównym problemem podczas przygotowywania plasterków mózgu jest prawidłowa konserwacja tkanki mózgowej. Osiąga się to poprzez kilka krytycznych etapów naszego protokołu, w tym szybką preparację, ciągłe i wystarczające natlenienie i chłodzenie tkanki oraz ochronę tkanki mózgowej za pomocą ochronnej metody cięcia roztworem do krojenia o niskiej zawartości sodu i wysokiej zawartości sacharozy39,51. Pomimo faktu, że opisany tutaj protokół daje wskaźnik sukcesu około 90%, potencjalnie dodatkowe kroki ochronne mogą być wymagane podczas pracy z tkankami pochodzącymi ze starszych lub genetycznie zróżnicowanych zwierząt lub podczas próby zachowania określonej populacji komórek. Opisano już kilka metod ochrony wrażliwych preparatów tkanki mózgowej. Metody te obejmują stosowanie roztworów do krojenia na bazie NMDG w celu zmniejszenia przenikania sodu52, stosowanie wysokich poziomów magnezu w roztworze do krojenia w celu zablokowania aktywności receptora NMDA53 oraz przedłużone stosowanie roztworów ochronnych również w okresie rekonwalescencji23. Wszystkie te środki spowodują zmniejszenie ekscytotoksyczności. Ponadto perfuzja przezsercowa z lodowatymi roztworami ochronnymi ACSF jest często stosowana i konieczna podczas pracy ze starszymi zwierzętami27.
Ostre wycinki mózgu w hipokampie są idealnie dopasowane i szeroko stosowane do badań elektrofizjologicznych z powodów takich jak sygnały o dużej amplitudzie, które można uzyskać ze stosunkowo grubego (300–500 μm) ostrego wycinka mózgu, co gwarantuje wysoki stosunek sygnału do szumu11. Standardowo stosowane zastosowania elektrofizjologiczne obejmują zewnątrzkomórkowe zapisy pola i wewnątrzkomórkowe zapisy całych komórek w trybie cęgów napięciowych lub prądowych. W celu uzyskania wysokiej jakości danych elektrofizjologicznych, zdrowie plastra jest sprawą pierwszorzędną i może być zagwarantowane poprzez ścisłe przestrzeganie przedstawionego protokołu. Ponieważ jednak przygotowanie plastrów jest bardzo czułą techniką, przed rozpoczęciem każdego eksperymentu należy rutynowo przeprowadzać kontrolę jakości. Kilka parametrów może być wykorzystywanych do kontroli jakości wycinka i są standardowo oceniane za pomocą krzywych wejścia-wyjścia oraz bazowych nagrań fEPSP lub EPSC19. Niemniej jednak należy zauważyć, że nieoptymalne właściwości elektrofizjologiczne mogą wynikać z błędów eksperymentalnych, takich jak ustawienie elektrody, orientacja, a nawet uszkodzenie, i nie reprezentują wyłącznie zdrowia przygotowanego plastra. Dlatego zaleca się przeprowadzenie dodatkowych kontroli jakości, takich jak prosta wizualizacja i ocena komórek pod obiektywem 40x lub barwienie jądra DAPI. Takie kontrole jakości mogą być wykorzystane do potwierdzenia stałego stanu plastrów przez kilka sesji przygotowania plastrów.
Mikrofluorymetria wapnia jest rzadziej stosowaną techniką badania wycinków mózgu w hipokampie. Jednak technika ta ma dodatkową wartość w stosunku do standardowych zewnątrzkomórkowych i wewnątrzkomórkowych zapisów elektrod, ponieważ pozwala na wizualizację i ilościowe określenie wewnątrzkomórkowych strumieni wapnia, które mają duże znaczenie w sygnalizacji neuronalnej i synaptycznej. Zmiany wewnątrzkomórkowych stężeń wapnia biorą udział w uwalnianiu pęcherzyków neuroprzekaźników, generowaniu potencjału postsynaptycznego, regulacji plastyczności synaptycznej i przewodnictwie nerwów aksonalnych 54,55,56. Jako ilustrację tej techniki (ryc. 4) użyliśmy dostępnego na rynku barwnika wapniowego. Nie ulega wątpliwości, że traktowanie wycinków tkanek barwnikami wapniowymi może powodować trudności, takie jak wydłużenie czasu eksperymentu, a także nieefektywne obciążenie niżej położonych komórek neuronalnych. Jednak różne warianty tej techniki mogą być wykorzystane do obejścia tych wyzwań technicznych. Na przykład możliwe jest połączenie pomiarów wapnia i zapisów klamer w wycinkach hipokampa. W ten sposób barwnik fluorescencyjny wapnia może zostać załadowany do określonej komórki za pomocą pipety krostowej, co pozwala na pomiary dynamiki wapnia w jednej konkretnej komórce będącej przedmiotem zainteresowania57. Alternatywnie, można zastosować genetycznie zmodyfikowane zwierzęta wykazujące ekspresję wskaźnika wapnia, GCaMP58, w całym mózgu lub napędzane przez specyficzny dla komórki promotor. Co ciekawe, tkanka mózgowa zwierząt z GCaMP z bezpośrednim łącznikiem z białkiem będącym przedmiotem zainteresowania może dostarczyć możliwości określenia wzorca ekspresji neuronalnej lub zbadania udziału w iskrach i falach wapniowych.
Podsumowując, dostarczamy wytyczne dotyczące skutecznego przygotowania zdrowych i żywotnych poziomych wycinków mózgu hipokampa od myszy do zapisów elektrofizjologicznych i obrazowych. Ta metodologia jest bardzo przydatna w dostępie do zmian neurologicznych, które zachodzą w patologiach mózgu opisanych w zakręcie zębatym.

Szeroko zakrojona eksploracja hipokampa rozpoczęła się, gdy Scoville i Milner zgłosili niezdolność pacjenta (H.M.) do tworzenia nowych wspomnień deklaratywnych po chirurgicznym usunięciu hipokampa oraz pobliskich struktur płata skroniowego w ramach leczenia ciężkiej postaci epilepsji1. Od tego momentu hipokamp był intensywnie badany, poczynając od ogólnych właściwości i funkcji neuronów, aż po rozwój ciężkich zaburzeń mózgu, takich jak epilepsja i choroba Alzheimera2,3,4,5. Hipokamp jest częścią układu limbicznego, składającego się z grupy powiązanych struktur mózgu zaangażowanych w emocje i tworzenie pamięci6,7. Gęsta sieć kilku szlaków włókien zapewnia ścisłą łączność hipokampa ze strukturami mózgu wewnętrznymi i zewnętrznymi. Szlaki te obejmują przyśrodienną i boczną drogę perforującą (z kory entorynalnej do zakrętu zębatego, CA3 – CA1 i subiculum)8, drogę włókien mszystych (z zakrętu zębatego do CA3)9 oraz szlak kolaterali Schaffa/komisuralny asocjacyjny (z CA3 do CA1)10 (Rycina 1). Hipokamp jest jednym z najszerzej zbadanych obszarów mózgu ze względu na wysoce konserwatywną lamelarną organizację formowania warstw neuronów oraz możliwość stosunkowo łatwego pozyskania żywych kultur neuronów i skrawków mózgu5.
<img alt="Schemat dróg neuronów hipokampa, pokazujący połączenia CA1, CA2, CA3, DG i EC dla przepływu sygnałów." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61753/61753fig01.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1: Schemat ilustrujący poszczególne obszary hipokampa i główne drogi włókien. Poszczególne obszary hipokampa są oznaczone jednolitymi kolorowymi liniami: kora entorynalna (EC; czarny), zakręt zębaty (DG; pomarańczowy), Cornu Ammonis (CA) 3 (cyjan), 2 (żółty) i 1 (magenta) oraz subikulum (zielony). Drogi włókien przedstawiono kolorowymi liniami przerywanymi: przyśrodna (MPP, czerwony) i boczna droga perforanta (LPP, niebieski) (z kory entorynalnej do zakrętu zębatego, CA3, CA1 i subikulum), droga włókien mszystych (MF, fioletowy) (z zakrętu zębatego do CA3) oraz kolaterale Schaffera (SC, brązowy) (ipsilateralne z CA3 do CA1)/drogi komisuralne asocjacyjne (AC, jasnozielony) (kontralateralne z CA3 do CA1). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61753/61753fig01large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
Protokoły przygotowania skrawków mózgu często prowadzą do utraty połączeń z obszarów mózgu oddalonych od obszaru zainteresowania5. Co więcej, naczynia włosowate przestają być funkcjonalne5, a krążenie krwi zostaje przerwane11. Pomimo tych ograniczeń, skrawki mózgu są nadal powszechnie wykorzystywane do badania funkcji neurofizjologicznych hipokampa ze względu na szereg zalet. Po pierwsze, wypreparowanie hipokampa jest szybkie12 i nie wymaga wielu materiałów. Jedynymi niezbędnymi instrumentami są zestaw do sekcji, laboratoryjna łaźnia wodna, dostęp do karbogenu oraz wibrotom13. Innymi atutami techniki skrawków mózgowych są ominięcie bariery krew-mózg (BBB) oraz wypłukanie endogennie uwalnianych cząsteczek przed rozpoczęciem eksperymentu5, co umożliwia badanie działania leków przy stosunkowo precyzyjnej kontroli dawkowania14. Ponadto skrawki mózgu zachowują cytoarchitekturę i obwody synaptyczne w obrębie hipokampa15,16, gdzie zachowana zostaje neuroanatomia oraz lokalne środowisko z łącznością neuronalną i złożonymi interakcjami neuron-gleja4,11,17. Dodatkowo połączenia włókien hipokampa są w przeważającej mierze jednokierunkowe, a neurony hipokampa wykazują wysoką plastyczność synaptyczną, co znacznie ułatwia gromadzenie i interpretację wysokiej jakości rejestracji elektrofizjologicznych w celu zrozumienia procesów neurologicznych18,19. Co istotne, skrawki mózgu stanowią cenny zasób możliwy do zastosowania w szerokim zakresie różnych technik naukowych, od metod biologii molekularnej, przez obrazowanie, aż po pomiary elektrofizjologiczne12,20,21,22,23,24,25,26.
Jak opisano powyżej, skrawki hipokampa stanowią potężne narzędzie eksperymentalne do badania strukturalnych i funkcjonalnych cech łączności synaptycznej. Pozwala to na ocenę wpływu substancji chemicznych lub mutacji na pobudliwość i plastyczność neuronów16.
Przygotowanie ostrych przekrojów mózgu jest techniką stosunkowo wrażliwą, a optymalna jakość skrawków w dużym stopniu zależy od idealnych warunków eksperymentalnych, w tym od wieku zwierzęcia, metody eutanazji, szybkości sekcji i cięcia, roztworów i parametrów krojenia (np. prędkości cięcia) oraz warunków rekuperacji skrawków4. Dlatego też dobrze opracowany protokół ma kluczowe znaczenie i zapewnia powtarzalność wyników w różnych jednostkach badawczych13.
W niniejszym materiale przedstawiamy szczegółowy protokół przygotowania ostrych poziomych skrawków hipokampa, mający na celu zachowanie integralności bocznej i przyśrodkowej drogi perforacyjnej hipokampa oraz drogi włókien mszystych, co umożliwia badanie procesów związanych z zakrętem zębatym9. Szczegółowo opiszemy kluczowe etapy preparowania, wyodrębniania i poziomego krojenia mózgu myszy, a następnie zaprezentujemy reprezentatywne wyniki mikrofluorymetrycznych pomiarów wapnia oraz rejestracji polowych potencjałów postsynaptycznych pobudzających (fEPSPs) w warunkach bazowych oraz podczas protokołów indukcji LTP w skrawkach mózgu myszy linii C57BL/6J typu dzikiego.

<table><tbody><tr><td>Komora anestezjologiczna</td><td>domowej roboty - Generyczny</td><td></td><td></td></tr><tr><td>parownik anestezjologiczny</td> z pleksi <td>N/A Dr&auml; ger & MSS International Ltd</td><td>Isofluran Vapor 19.3 & MSS Isofluran</td><td>do odparowania izofluranu do znieczulenia gryzoni</td></tr><tr><td>Beczki do systemu perfuzyjnego</td><td>TERUMO</td><td>Strzykawki podskórne bez igły</td><td>https://www.terumotmp.com/products/hypodermics/terumo-hypodermic-syringes-without-needle.html</td></tr><tr><td>Bicuculline methiodide</td><td>hellobio</td><td>HB0893</td><td>https://www.hellobio.com/bicuculline-methiodide.html</td></tr><tr><td>Kapilary ze szkła borokrzemianowego</td><td>Science Products</td><td>GB150F-8P</td><td>https://science-products.com/en/shop/micropipette-fabrication-1/capillary-glass-for-micropipette-pullers/borosilicate-glass-capillaries/borosilicate-filament-polished</td></tr><tr><td>Dwuwodny chlorek wapnia</td><td>Merck</td><td>102382</td><td>https://www.merckmillipore.com/BE/en/product/Calcium-chloride-dihydrate,MDA_CHEM-102382?ReferrerURL=https%3A%2F%2Fwww.google.com%2F</td></tr><tr><td>Oprogramowanie do obrazowania wapnia</td><td>Till Photonics</td><td>LiveAcquisition v2.3.0.18</td><td></td></tr><tr><td>Zbiornik karbonowy</td><td>Air Liquide</td><td>Alphagaz mix B50</td><td>Mieszanina gazów CO2/O2: 5/95, czystość 5</td></tr><tr><td>Mikroelektroda klastrowa</td><td>FHC</td><td>CE2C55</td><td>https://www.fh-co.com/product/cluster-microelectrodes/</td></tr> <tr><td>Naczynie hodowlane (35 mm)</td><td>Corning Life Sciences</td><td>353001</td><td>https://ecatalog.corning.com/life-sciences/b2c/US/en/Cell-Culture/Cell-Culture-Vessels/Dishes%2C-Culture/Falcon&reg;-Cell-Culture-Dishes/p/353001</td></tr><tr><td>Naczynie do hodowli (90 mm)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>101VR20</td><td>https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/101R20#/101R20</td></tr><tr><td>Kleszcze zakrzywione</td><td>Narzędzia do nauki</td><td>precyzyjnej 11270-20</td><td>https://www.finescience.de/de-DE/Products/Forceps-Hemostats/Dumont-Forceps/Dumont-7b-Forceps/11270-20</td></tr><tr><td>D-AP5</td><td>hellobio</td><td>HB0225</td><td>https://www.hellobio.com/dap5.html</td></tr><tr><td>D-(+)-Glukoza jednowodna</td><td>Sigma Aldrich</td><td>16301</td><td>https://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sial/16301?lang=en&region=BE</td></tr><tr><td>Cyfrowa kamera CMOS</td><td>HAMAMATSU</td><td>ORCA-SPARK C11440-36U</td><td>https://www.hamamatsu.com/eu/en/product/type/C11440-36U/index.html</td></tr><tr><td>Nożyczki preparacyjne</td><td>Narzędzia do nauki precyzyjnej</td><td>14058-09</td><td>https://www.finescience.de/de-DE/Products/Scissors/Standard-Scissors/Fine-Scissors-ToughCut&reg;/14058-09</td></tr><tr><td>DNQX</td><td>hellobio</td><td>HB0262</td><td>https://www.hellobio.com/dnqx-disodium-salt.html</td></tr><tr><td>Kamera EMCCD</td><td>Andor</td><td>iXon TM + DU-897E-CSO-#BV</td><td>https://andor.oxinst.com/products/ixon-emccd-cameras?gclid=CjwKCAjw97P5BRBQEiwAGflV6ULsKjXfhN2YZxtvsWAmF4QghyXZKuqYHVMa6KU9JyS80ATQkSKeBBoCIM0QAvD_BwE</td></tr><tr><td>EPC10 Wzmacniacz USB z podwójnym zaciskiem krosowym</td><td>HEKA Elektronik</td><td>895278</td><td>https://www.heka.com/sales/brochures_down/bro_epc10usb.pdf</td></tr><tr><td>Bibuła filtracyjna</td><td>VWR</td><td>516-0818</td><td>klasa 413</td></tr><tr><td>Drobna szczotka</td><td>Raphael Kaerell</td><td>8204</td><td>Rozmiar #1</td></tr><tr><td>18G igła</td><td>Henke Sass Wolf Fine-Ject</td><td>18G X 1 1/2" 4710012040</td><td>https://www.henkesasswolf.de/cms/de/veterinaer_produkte/produkte_vet/einmalkanuelen/hsw_henke_ject_einmalkanuelen/</td></tr> <tr><td>Isoflurane</td><td>Dechra Veterinary Products</td><td>Iso-Vet 1000mg/g</td><td>250 ml butelka</td></tr><tr><td>Loctite 406</td><td>Henkel Technologie klejenia</td><td>Loctite 406</td><td>Super klej</td></tr><tr><td>Siarczan magnezu siedmiowodny</td><td>Merck</td><td>105886</td><td>https://www.merckmillipore.com/BE/en/product/Magnesium-sulfate-heptahydrate,MDA_CHEM-105886?ReferrerURL=https%3A%2F%2Fwww.google.com%2F</td></tr><tr><td>Mikromanipulator</td><td>Luigs & Neumann</td><td>SM-10 z systemem zdalnego sterowania SM-7</td><td>https://www.luigs-neumann.org</td></tr><tr><td>Mikroskop (do obrazowania wapnia)</td><td>Olympus</td><td>BX51WI</td><td>https://www.olympus-lifescience.com/de/microscopes/upright/bx61wi/</td></tr> <tr><td>Mikroskop (do nagrań ephys)</td><td>Zeiss</td><td>Axio Examiner.A1</td><td>https://www.micro-shop.zeiss.com/de/de/system/axio+examiner-axio+examiner.a1-aufrechte+mikroskope/10185/</td></tr><tr><td>Źródło światła</td><td>mikroskopu CAIRN Research</td><td>podwójny zasilacz OptoLed</td><td>https://www.cairn-research.co.uk/product/optoled/</td></tr> <tr><td>Monochromator</td><td>Till Photonics</td><td>Polychrome V</td><td></td></tr><tr><td>Kwas N-metylo-D-asparaginowy (NMDA)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M3262</td><td>https://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/m3262?lang=en&region=BE</td></tr><tr><td>Oregon Green&reg; 488 BAPTA-1</td><td>Sondy molekularne Invitrogen</td><td>#06807</td> Osmometr <td>10x50ug</td></tr><tr><td>Osmometr</td><td>ciśnienia pary Wescor</td><td>5500</td><td>do sprawdzania osmolarności roztworów soli</td></tr><tr><td>Pompa perystaltyczna</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Masterflex C/L 77120-62</td><td>https://www.fishersci.be/shop/products/masterflex-peristaltic-c-l-dual-channel-pump-2/p-8004229</td></tr><tr><td>pH-metr</td><td>WTW</td><td>serii inoLab pH 720</td><td>https://www.geminibv.nl/wp-content/uploads/manuals/wtw-720-ph-meter/wtw-inolab-ph-720-manual-eng.pdf</td></tr><tr><td>Ściągacz do pipet</td><td>Sutter Instrument</td><td>P-1000</td><td>https://www.sutter.com/MICROPIPETTE/p-1000.html</td></tr><tr><td>Chlorek potasu</td><td>Chem-lab</td><td>CL00.1133</td><td>https://www.chem-lab.be/#/en-gb/prod/1393528</td></tr><tr><td>Diwodorofosforan potasu</td><td>Merck</td><td>104873</td><td>https://www.merckmillipore.com/BE/en/product/Potassium-dihydrogen-phosphate,MDA_CHEM-104873?ReferrerURL=https%3A%2F%2Fwww.google.com%2F</td></tr><tr><td>Żyletka do przygotowania półkul</td><td>SPI dostarcza</td><td>dozownik bezpiecznych wkładów - Pkg/10</td><td>GEM Scientific Single Edge Żyletki</td></tr><tr><td>Żyletka do wibratomu</td><td>Ted Pella Inc</td><td>121-6</td><td>dwukrawędziowe łamliwe żyletki (stal nierdzewna pokryta PTFE)</td></tr><tr><td>Komora regeneracyjna</td><td>domowej roboty - Generic</td><td>N/A</td><td>do zbierania i przechowywania plasterków mózgu (patrz szczegóły w rękopisie)</td></tr><tr><td>Nożyczki</td><td>Każda firma</td><td>Nie dotyczy</td><td>Ostrze powinno być dobrze naostrzone i mieć co najmniej 15 cm długości, aby ułatwić dekapitację</td></tr><tr><td>Srebrny drut elektrodowy</td><td>Dowolna firma</td><td></td><td>zajmująca się elektrodami rejestrującymi i referencyjnymi</td></tr><tr><td>Diwodorofosforan sodu dwuwodny</td><td>Merck</td><td>106342</td><td>https://www.merckmillipore.com/BE/en/product/Sodium-dihydrogen-phosphate-dihydrate,MDA_CHEM-106342?ReferrerURL=https%3A%2F%2Fwww.google.com%2F</td></tr><tr><td>Wodorowęglan sodu</td><td>Alfa Aesar</td><td>14707</td><td>https://www.alfa.com/en/catalog/014707/</td></tr> <tr><td>Chlorek sodu</td><td>Fisher Scientific</td><td>S/3160/60</td><td>https://www.fishersci.co.uk/shop/products/sodium-chloride-certified-ar-analysis-meets-analytical-specification-ph-eur/10428420</td></tr><tr><td>Oprogramowanie do nagrań terenowych</td><td>HEKA Elektronik</td><td>PatchMaster</td><td>https://www.heka.com/downloads/software/manual/m_patchmaster.pdf</td></tr><tr><td>Spatula</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S9147-12EA</td><td>https://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/s9147?lang=en&region=BE</td></tr><tr><td>Stymulator</td><td>A.M.P.I</td><td>ISO-FLEX</td><td></td></tr> http://www.ampi.co.il/isoflex.html <tr><td>Sacharoza</td><td>VWR International Ltd.</td><td>102745C</td><td>https://es.vwr-cmd.com/ex/downloads/magazine/lupc_userguide_uk.pdf</td></tr><tr><td>Rurki do przewodów karbogenicznych, perfuzyjnych i ssących 1</td><td>Warner Instruments</td><td>64-0167</td><td>Rurka Tygon (TY-50) do standardowych systemów zaworów</td></tr><tr><td>Rurki do przewodów karbogenicznych, perfuzyjnych i ssących 2</td><td>Fisher Scientific</td><td>800/100/200 i 800/100/280</td><td>Smiths Medical Portex Rurka LDPE z drobnym otworem</td></tr><tr><td>Pompa</td> <td>próżniowadomowej roboty - Ogólny</td> wielolufowy system perfuzyjny <td>z 8 zaworami N/A</td><td></td></tr><tr><td></td><td>domowej roboty</td><td>N / A</td><td>składa się z beczek, rurek i samodzielnie wykonanego automatycznego sterowania zaworem (specyfikacje wszystkich zakupionych części można znaleźć w tej tabeli)</td></tr><tr><td>Zawory magnetyczne (do sterowania liniami perfuzyjnymi)</td><td>NResearch Inc.</td><td>Nr kat. 161P011</td><td>https://nresearch.com/</td></tr> <tr><td>Vibratome</td><td>Leica</td><td>14912000001</td><td>Półautomatyczne ostrze wibracyjne microomei VT1200</td></tr><tr><td>Łaźnia wodna</td><td>Memmert</td><td>WNB 7</td><td>https://www.memmert.be/wp-content/uploads/2019/09/Memmert-Waterbath-WNB-7.en_.pdf</td></tr><tr><td>System oczyszczania wody</td><td>Merck</td><td>Synergy milipor</td><td>do uzyskania wysoce oczyszczonej wody</td></tr><tr><td>12-dołkowej </td><td>talerze Greiner Bio-One</td><td>CELLSTAR, 665180</td><td>http://www.greinerbioone.com/UserFiles/File/Catalogue%202010_11/UK/3680_005-Kapitel1_UK.pdf</td></tr></tbody></table>

poziome wycinki hipokampa mózgu myszy

Horizontal Hippocampal Slices of the Mouse Brain

Hipokamp to wysoce zorganizowana struktura w mózgu, która jest częścią układu limbicznego i bierze udział w tworzeniu i konsolidacji pamięci, a także w manifestacji poważnych zaburzeń mózgu, w tym choroby Alzheimera i epilepsji. Hipokamp otrzymuje wysoki stopień połączeń wewnętrznych i wzajemnych, zapewniając prawidłową komunikację z wewnętrznymi i zewnętrznymi strukturami mózgu. Ta łączność jest realizowana za pośrednictwem różnych przepływów informacyjnych w postaci ścieżek światłowodowych. Plasterki mózgu są często stosowaną metodologią podczas badania neurofizjologicznych funkcji hipokampa. Wycinki mózgu z hipokampa mogą być wykorzystywane do kilku różnych zastosowań, w tym do zapisów elektrofizjologicznych, pomiarów mikroskopowych światła, a także do kilku technik molekularnych, biologicznych i histochemicznych. W związku z tym wycinki mózgu stanowią idealny system modelowy do oceny funkcji białek, do badania procesów patofizjologicznych związanych z zaburzeniami neurologicznymi, a także do celów odkrywania leków.
Istnieje kilka różnych sposobów przygotowania plastrów. Preparaty do wycinania mózgu z wibratomem pozwalają na lepsze zachowanie struktury tkanki i gwarantują wystarczające zaopatrzenie w tlen podczas krojenia, co ma przewagę nad tradycyjnym użyciem rozdrabniacza tkanek. Co więcej, różne płaszczyzny cięcia mogą być stosowane do przygotowywania wibratomu w postaci plastrów mózgu. W tym miejscu przedstawiono szczegółowy protokół udanego przygotowania poziomych wycinków hipokampa mózgów myszy wyciętych wibratomem. W przeciwieństwie do innych preparatów plastrowych, krojenie poziome pozwala utrzymać włókna ścieżki wejściowej hipokampa (ścieżki perforacyjnej) w całkowicie nienaruszonym stanie w plasterku, co ułatwia badanie interakcji śródwęchowo-hipokampowych. W tym miejscu przedstawiamy dokładny protokół preparacji, ekstrakcji i ostrego poziomego krojenia mózgu myszy oraz omawiamy wyzwania i potencjalne pułapki tej techniki. Na koniec pokażemy kilka przykładów wykorzystania wycinków mózgu w dalszych zastosowaniach.

Ogólny przegląd narzędzi i krytycznych etapów niezbędnych do wykonania protokołu 
Rysunek 2 przedstawia wszystkie niezbędne narzędzia i krytyczne etapy przygotowania poziomych ostrych skrawków hipokampa mózgu, opisane w niniejszym protokole. Generalnie wymagana jest ograniczona liczba kluczowych instrumentów, w tym kilka narzędzi do sekcji i komora do regeneracji skrawków (Rysunek 2A), laboratoryjna łaźnia wodna oraz wibratom (Rysunek 2B). Rysunek 2C–E obrazuje ważne etapy i orientację mózgu oraz półkul podczas protokołu przygotowania skrawków. Rysunek 2F stanowi ilustrację oczekiwanego wyniku przygotowania poziomych skrawków mózgu.
Rejestracja fEPSP w przyśrodkowej drodze perforantnej 
Po okresie rekonwalescencji skrawki mózgu można wykorzystać do elektrofizjologicznej rejestracji fEPSP. W tym przypadku zastosowano mikroskop pionowy wyposażony w wielokanałowy system perfuzji sterowany grawitacyjnie (Rycina 3A i Rycina 3B). Szklaną mikropipetę (~ 2 MΩ) napełniono roztworem ACSF i przymocowano do pokrytej chlorkiem elektrody srebrowej, która jest podłączona do wzmacniacza operacyjnego w obwodzie z chlorowaną elektrodą kąpielową. Rejestrację i wizualizację fEPSP przeprowadzono za pomocą wzmacniacza oraz odpowiedniego oprogramowania rejestrującego, wprowadzając szklaną mikropipetę do MPP hipokampa w górnej warstwie skrawka mózgu. fEPSP indukowano poprzez stymulację za pomocą mikroelektrody z klastrem dwóch kontaktów, przy stosowaniu różnych natężeń prądu w MPP powyżej elektrody rejestrującej. Należy zauważyć, że niniejszy protokół nie ma na celu wyjaśnienia sposobu uzyskiwania zapisów z MPP, lecz jedynie wykorzystuje rejestrację w MPP jako przykład w celu zademonstrowania skuteczności opisanego tutaj protokołu przygotowania skrawków. W przypadku podejmowania prób rejestracji w MPP konieczne może być zastosowanie określonych kontroli (np. rejestracji podwójnych impulsów), aby upewnić się co do prawidłowego miejsca rejestracji i odróżnić MPP od LPP8,36,37.
Rysunek 3C przedstawia negatywny (lewy panel, plaster niskiej jakości) i pozytywny (prawy panel, plaster wysokiej jakości) przykład zapisu fEPSP. Ślad w przykładzie negatywnym wykazuje dużą amplitudę wolty włókien (FV), która jest nawet wyższa niż rzeczywista amplituda fEPSP (≈0.5 mV). W przeciwieństwie do niego, przykład plastra wysokiej jakości (prawy panel) wykazuje niski stosunek FV do fEPSP oraz wysoką amplitudę fEPSP (&gt;0.5 mV). Wolta włókien to sygnał powstający podczas depolaryzacji stymulowanych włókien neuronalnych, który zatem poprzedza potencjał postsynaptyczny (fEPSP). Relacja między właściwościami FV a fEPSP dostarcza istotnych informacji o zachowaniu właściwości aksonalnych i synaptycznych. Plastry wysokiej jakości z nienaruszonymi włóknami nerwowymi powinny wykazywać wysoki stosunek amplitudy fEPSP do FV. Z kolei plastry niskiej jakości z upośledzonymi właściwościami przewodzenia będą miały zmniejszony stosunek fEPSP do FV. Podobnie żywotność plastra mózgu można analizować, wykreślając nachylenia fEPSP w funkcji amplitud wolty włókien (Rysunek 3D).
Ponadto, w celu oceny jakości skrawka standardowo wykorzystuje się krzywe wejście-wyjście (nachylenie fEPSP oraz amplituda FV w zależności od natężenia bodźca). Krzywe te uzyskuje się poprzez przyłożenie do skrawka mózgu bodźców prądowych o rosnącym natężeniu i monitorowanie następujących po nich odpowiedzi fEPSP. Skrawki mózgu niskiej jakości wykazują obniżoną krzywą wejście-wyjście ze względu na suboptymalne właściwości przewodzenia słabo zachowanej tkanki mózgowej (Rysunek 3E,F). Co więcej, krzywe wejście-wyjście są niezbędne do określenia optymalnego zakresu natężenia stymulacji dla badania procesów synaptycznych. Idealnie natężenie bodźca powinno zostać ustawione na poziomie około 50% natężenia wywołującego odpowiedzi maksymalne. Przy wybranym w ten sposób natężeniu bodźca odpowiedzi fEPSP są wysoce czułe na wszelkie zmiany w plastyczności synaptycznej, co stwarza możliwość badania zarówno długotrwałego wzmocnienia synaptycznego (LTP), jak i długotrwałej depresji synaptycznej (LTD).
W celu zbadania plastyczności synaptycznej, transmisję synaptyczną w skrawku mózgu (nachylenie fEPSP) przy wybranej 50% intensywności bodźca monitoruje się przez dłuższy czas (zazwyczaj od 20 do 40 min) przed fazą kondycjonowania. Żywotne skrawki mózgu będą wykazywać stabilną linię bazową, natomiast skrawki z niestabilną linią bazową nie mogą być wykorzystane w dalszych protokołach kondycjonowania służących do badania plastyczności synaptycznej obwodów mózgowych (Rysunek 3G, panel górny). Rejestracje linii bazowej fEPSP mogą być również przydatne do monitorowania wpływu leków na samą transmisję synaptyczną (Rysunek 3G, panel dolny). Średnia z zarejestrowanych sygnałów linii bazowej fEPSP jest zazwyczaj wykorzystywana do normalizacji przebiegu fEPSP w czasie i standardowo przyjmuje wartość 100%.
Plastyczność synaptyczną można badać poprzez stosowanie specyficznych protokołów warunkowania w skrawkach mózgu. Protokoły te zależą od badanego obwodu mózgowego oraz interesującego nas mechanizmu (np. LTP lub LTD). W celu indukcji LTP w MPP zakrętu zębatego konieczne jest zastosowanie silnego protokołu warunkowania ze względu na silne hamowanie GABAergiczne występujące w synapsach MPP38. Donosi się, że hamowanie GABAergiczne jest jeszcze bardziej wyraźne w skrawkach mózgu przygotowanych z użyciem roztworów do krojenia o wysokiej zawartości sacharozy39. W niniejszym przypadku stosujemy protokół składający się z czterech stymulacji impulsami o częstotliwości 100 Hz i czasie trwania 1 s, podawanych w 5-minutowych odstępach, przy jednoczesnym zastosowaniu bikukuliny, która jest antagonistą receptora GABAA (Rycyna 3H). Wspólne dodanie NMDA i bikukuliny podczas okresu warunkowania prowadzi do zwiększenia LTP (Rycyna 3H). Niska jakość skrawka oraz niestabilna transmisja synaptyczna (linia bazowa fEPSP) mogą skutkować zmienioną lub nieudaną indukcją LTP i LTD. Dlatego podczas badania procesów synaptycznych bardzo ważne jest praca na wysokiej jakości preparatach skrawków oraz stosowanie rygorystycznych kryteriów wykluczenia dla skrawków niewydolnych (niski stosunek amplitudy fEPSP do wolty włókien (&lt;3), małe nachylenie fEPSP (&lt;0,5 mV/ms) lub amplituda (&lt;0,5 mV) oraz niestabilna linia bazowa fEPSP (zmiana powyżej 5%)).
Pomiary mikrofluorymetryczne wapnia w warstwie ziarnistej zakrętu zębatego 
Po regeneracji skrawek mózgu inkubowano w temperaturze pokojowej z 2 µM barwnika wrażliwego na wapń przez 1 h w nasyconym karbogenem ASCF, chroniąc go przed światłem. Skrawek przeniesiono do komory rejestracyjnej (Rysunek 3A) w pionowym mikroskopie fluorescencyjnym wyposażonym w wielokanałowy system perfuzji sterowany grawitacyjnie. Obrazy emisji fluorescencji rejestrowano co 500 milisekund po naświetleniu falą o długości 488 nm (Rysunek 4A,B). Wzbudzanie przeprowadzano za pomocą lampy ksenonowej i zamontowanego na skanerze monochromatora z siatką dyfrakcyjną, a akwizycję obrazu realizowano przy użyciu sterowanej komputerowo kamery CCD. Podczas pomiarów skrawek traktowano APV, antagonistą receptora NMDA, co doprowadziło do spadku wewnątrzkomórkowego stężenia wapnia. Stymulacja skrawka za pomocą roztworu pozakomórkowego o wysokim stężeniu potasu (50 mM) spowodowała masywny napływ wapnia z przestrzeni pozakomórkowej w wyniku depolaryzacji neuronów i otwarcia napięciowo zależnych kanałów jonowych (Rysunek 4C).
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Związek</td>
			<td>Stężenie (mM)</td>
			<td>Masa cząsteczkowa (g/mol)</td>
			<td>Ilość (g)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>25</td>
			<td>74.55</td>
			<td>1.86</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl₂2 * 2H2O</td>
			<td>20</td>
			<td>147.01</td>
			<td>2.94</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgSO₄4 * 7H2O</td>
			<td>10</td>
			<td>246.48</td>
			<td>2.46</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KH2PO4</td>
			<td>12.5</td>
			<td>136.08</td>
			<td>1.7</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 1: 10-krotny roztwór wstępny do plastrów (1 L).
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Związek</td>
			<td>Stężenie (mM)</td>
			<td>Masa cząsteczkowa (g/mol)</td>
			<td>Ilość (g)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>125</td>
			<td>58.44</td>
			<td>7.3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>2.5</td>
			<td>74.55</td>
			<td>0.19</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl22 * 2H2O</td>
			<td>2</td>
			<td>z 1 M CaCl22 roztwór</td>
			<td>2 ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgSO₄4 * 7H2O</td>
			<td>1</td>
			<td>z 1 M MgSO44 roztwór</td>
			<td>1 ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaH2PO4 * 2H2O</td>
			<td>1.25</td>
			<td>156.02</td>
			<td>0.2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaHCO₃3</td>
			<td>26</td>
			<td>84.01</td>
			<td>2.18</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glukoza * H2O</td>
			<td>25</td>
			<td>198.17</td>
			<td>4.95</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 2: 1x ACSF (1 L) (osmolarność między 305–315 mOsm).
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody >
		<tr >
			<td >Związek</td>
			<td >Stężenie (mM)</td>
			<td >Masa cząsteczkowa (g/mol)</td>
			<td >Ilość (g)</td>
		</tr >
		<tr >
			<td >10x roztwór do konserwacji skrawków</td>
			<td >N/D</td>
			<td >N/D</td>
			<td >25 mL</td>
		</tr >
		<tr >
			<td >Sacharoza</td>
			<td >252</td>
			<td >342.3</td>
			<td >21.57</td>
		</tr >
		<tr >
			<td >NaHCO3</td>
			<td >26</td>
			<td >84.01</td>
			<td >0.55</td>
		</tr >
		<tr >
			<td >Glukoza * H2O</td>
			<td >10</td>
			<td >198.17</td>
			<td >0.49</td>
		</tr >
	</tbody >
</table>
Tabela 3: 1x roztwór do skrawków z wysoką zawartością sacharozy (250 mL) (osmolarność między 320–325 mOsm).
<img alt="Przebieg procesu sekcjonowania histologicznego; obejmuje narzędzia, konfigurację mikrotomu oraz schemat orientacji cięcia mózgu." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61753/61753fig02v3.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rysunek 2"> 
Rysunek 2: Szczegółowe informacje dotyczące przygotowania poziomych skrawków mózgu z obszaru hipokampa. (A) Zdjęcie narzędzi niezbędnych do preparatyki i sekcjonowania mózgu gryzonia: (a) paski papieru filtracyjnego (np. stopień 413) o długości ±2 cm i szerokości ±0,5 cm; (b) ostrze; (c) superglue; (d) końcówka do pipety; (e) płytka do preparatu (dołączona do wibratomu); (f) 35 mm szalka hodowlana; (g) pędzelek; (h) szpatułka; (i) pęseta zakrzywiona; (j) nożyczki anatomiczne; (k) nożyczki wzmocnione (długość ostrza powyżej 10 cm); (l) plastikowa pipeta Pasteura z szerokim otworem (o średnicy od 0,6 do 0,8 cm); (m) komora regeneracyjna (wykonana własnym sposobem z zlewki 250 mL, plastikowego pierścienia, nylonowej siatki i fragmentu pipety serologicznej 10 mL); (n) 90 mm szalka hodowlana wypełniona lodem oraz (o) kwadrat papieru filtracyjnego umieszczony na schłodzonej szalce hodowlanej. (B) Zdjęcie wibratomu z (a) uchwytem komory do skrawków wypełnionym lodem; (b) komorą do skrawków; (c) linią z karbogenem oraz (d) ostrzem do sekcjonowania. (C) Schemat ilustrujący orientację cięcia strony grzbietowej jednej półkuli w celu przygotowania mózgu do sekcjonowania poziomego (patrz krok 3.9). (D) Projekcja izometryczna orientacji mózgu na płytce do preparatu wibratomu. (E) Schemat przedstawiający widok z góry na położenie dwóch półkul na płytce do preparatu. (F) Schemat pokazujący położenie hipokampa w poziomym skrawku mózgu. Oznaczone są zakręt zębaty (DG) oraz obszary Cornu Ammonis (CA)–Subiculum (SB) hipokampa. (G) Zdjęcie komory regeneracyjnej z nasyconym karbogenem ACSF zawierającej dziesięć świeżo wyciętych poziomych skrawków mózgu. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61753/61753fig02large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Układ elektrofizjologiczny z elektrodami do skrawka mózgu; wykresy przedstawiające wyniki fEPSP w stosunku do wolty włókien." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61753/61753fig3v5.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rysunek 3"> 
Rysunek 3: Rejestracje elektrofizjologiczne skrawków hipokampa mózgu. (A) Zdjęcie komory rejestracyjnej z systemem perfuzji i ssania, stosowanej pod mikroskopem pionowym. Przed rozpoczęciem rejestracji skrawka mózgu umieszcza się w komorze i unieruchamia fragmentem spinacza biurowego. (B) Zdjęcie w polu jasnym skrawka hipokampa mózgu pod mikroskopem pionowym (obiektyw 10x). Wskazano zakręt zębaty (DG) i obszar CA3, a także elektrody stymulujące (lewy dolny róg) i rejestrujące (prawy dolny róg), nakierowane na przyśrodkową drogę perforującą podczas rejestracji fEPSP. (C) Lewo: przykład rejestracji fEPSP z niskiej jakości skrawka z wyraźną woltą włókien i małą amplitudą. Prawo: przykład rejestracji fEPSP z wysokiej jakości skrawka. Szara linia wskazuje poziom bazowy. Linie przerywane wyznaczają amplitudę odcięcia 0,5 mV. (D) Wykres nachylenia fEPSP w funkcji amplitudy FV dla skrawków mózgu wysokiej jakości (czarny; n=10) i niskiej jakości (szary; n=4). Dane przedstawiono jako średnia ± SEM. (E) Wykres wejście-wyjście (nachylenie fEPSP) dla różnych intensywności stymulacji (µA) dla skrawków wysokiej jakości (czarny; n = 10) i niskiej jakości (szary; n = 4)). (F) Analogicznie jak w (E), ale dla amplitud FV w funkcji intensywności bodźca. (G) Przebieg czasowy trzech różnych rejestracji bazowych fEPSP (nachylenie fEPSP w %; znormalizowane do średniego nachylenia fEPSP z pierwszych 5 min). Górny panel przedstawia przykład dodatni (czarny) i ujemny (czerwony), gdzie ten drugi wykazuje niestabilną linię bazową z powodu pominięcia karbogenu podczas rejestracji. Dolny panel pokazuje dwa stabilne rejestry bazowe w warunkach traktowanych (po 20 min stabilnej linii bazowej receptory AMPA zostały zablokowane poprzez zastosowanie antagonisty receptora AMPA DNQX (10 µM)) (niebieski) oraz nietraktowanych (czarny). (H) Przebieg czasowy rejestracji LTP dla różnych warunków traktowania (wskazanych w dolnym panelu). Kolor czarny oznacza zastosowanie Bicuculline (20 µM) podczas kondycjonowania, a niebieski współzastosowanie Bicuculline (20 µM) i NMDA (10 µM) podczas kondycjonowania. Strzałki w górnym panelu wskazują punkty czasowe, w których zastosowano stymulację o wysokiej częstotliwości (4 x 1s 100Hz). Wykres słupkowy w dolnym panelu przedstawia średnie nachylenia fEPSP (%) przez 50–60 min po indukcji LTP dla eksperymentów pokazanych w górnym panelu (pojedyncza reprezentatywna rejestracja dla każdego warunku). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61753/61753fig3v3large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Obrazowanie i analiza fluorescencji hipokampa; schemat, obraz mikroskopowy, wykres fluorescencji." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61753/61753fig04.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rycina 4"> 
Rycina 4: Mikrofluorymetria wapnia w skrawkach mózgu z hipokampa. (A i B) Obraz fluorescencyjny (wzbudzenie przy 488 nm) (A) oraz odpowiadająca mu mapa ciepła (B) poziomego skrawka hipokampa mózgu myszy. Na panelu A zaznaczono zakręt zębaty (DG), obszar CA3 oraz przykład obszaru zainteresowania (ROI). (C) Przebieg czasowy odpowiedzi wapniowych (F488 nm) z ROI w zakręcie zębatym świeżego skrawka hipokampa podczas traktowania antagonistą receptorów NMDA APV (50 µM) oraz roztworem zawierającym wysokie stężenie pozakomórkowego potasu (K+) (50 mM). Krzywa została znormalizowana do najwyższej odpowiedzi wapniowej podczas perfuzji wysokim stężeniem K+ i skorygowana o tło w celu uwzględnienia fotowybielania. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61753/61753fig04large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>

Ten artykuł ma na celu opisanie systematycznego protokołu uzyskiwania poziomych wycinków mózgu hipokampa u myszy. Celem tej metodologii jest zachowanie integralności szlaków włókien hipokampa, takich jak ścieżka perforantu i szlak włókien omszałych, w celu oceny procesów neurologicznych związanych z zakrętem zębatym.

Poziome wycinki hipokampa mózgu myszy

The hippocampus is a highly organized structure in the brain that is a part of the limbic system and is involved in memory formation and consolidation as ...

Protokół ten ułatwia przygotowanie poziomych wycinków mózgu hipokampa do ich wykorzystania w różnych zastosowaniach naukowych. Technika ta zachowuje integralność wszystkich szlaków włókien hipokampa w jednym wycinku półkuli. Ten protokół slice idealnie nadaje się do oceny zmian neurologicznych, które zachodzą w patologiach mózgu, które rozwijają się i manifestują w zakręcie zębatym.Najważniejszym aspektem tego protokołu jest znalezienie równowagi między jak najszybszym wykonaniem a delikatnym obchodzeniem się z tkanką mózgową. Aby przygotować jeden litr ACSF, powoli wymieszaj wszystkie stałe chemikalia, jak wskazano, w 800 mililitrach wody pod ciągłym mieszaniem za pomocą mieszadła magnetycznego, a następnie powoli wlej odpowiednie ilości siarczanu magnezu i chlorku wapnia. Następnie użyj osmometru ciśnienia pary, aby sprawdzić osmolarność w zakresie od 305 do 315 miliosmoli i w sposób ciągły bąbelkować roztwór ACSF w temperaturze pokojowej karbogenem, aby ustawić pH między 7,3 a 7,4.Aby przygotować 250 mililitrów roztworu w plasterkach o wysokiej zawartości sacharozy, dodaj związki do 25 mililitrów wstępnie pokrojonego roztworu, jak wskazano w tabeli i sprawdź, czy osmolarność wynosi od 320 do 325 miliosmol. Następnie bąbelkować roztwór plastrów o wysokiej zawartości sacharozy przez 10 do 15 minut karbogenem, aby ustawić pH między 7,3 a 7,4 i przechowywać roztwór plastrów o wysokiej zawartości sacharozy przez 20 do 30 minut w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza, aż zostanie częściowo zamrożony. Aby przygotować miejsce do sekcji, napełnij komorę rekonwalescencji karbogenicznym roztworem ACSF i umieść komorę w łaźni wodnej o temperaturze 32 stopni Celsjusza.Ustaw wibratomat na odpowiedni program cięcia i napełnij uchwyt lodem, zamontuj go na wibratomie i przymocuj ostrze do ramienia wibratomu. Za pomocą szpatułki zmiażdż i wymieszaj częściowo zamrożony roztwór plastrów o wysokiej zawartości sacharozy, aż do uzyskania niejednorodnej brei. Następnie bąbelkować roztwór karbogenem i użyć roztworu do uwodnienia kawałka bibuły filtracyjnej na schłodzonym 90-milimetrowym naczyniu hodowlanym i napełnić 35-milimetrową naczynię hodowlaną lodem.Aby pobrać mózg, użyj nożyczek preparacyjnych, aby rozciąć skórę głowy dwu- do sześciotygodniowego samca myszy i otworzyć kalwarię wzdłuż szwu strzałkowego. Użyj zakrzywionych kleszczy, aby usunąć czaszkę, aż cały mózg, w tym opuszki węchowe, będzie widoczny, i użyj szpatułki, aby ostrożnie zgarnąć nienaruszoną tkankę mózgową. Umieść mózg w 35-milimetrowym naczyniu hodowlanym i użyj pipety Pasteura wypełnionej roztworem plastrów o wysokiej zawartości sacharozy, aby delikatnie usunąć wszelkie włosy lub cząsteczki krwi z tkanki.Użyj szpatułki, aby przenieść oczyszczony mózg na kawałek nasączonej bibuły filtracyjnej i użyj ostrza, aby przeciąć mózg wzdłużnie na pół. Umieść obie półkule na świeżo przyciętej stronie przyśrodkowej i użyj ostrza, aby wykonać równoległe cięcie na grzbietowej górze każdej półkuli, aby usunąć obszar grzbietowy każdego kawałka mózgu. Umieść obie półkule na świeżo ściętej stronie grzbietowej z brzuszną częścią mózgu skierowaną do góry i umieść kroplę super kleju na płytce próbki.Użyj końcówki pipety, aby rozprowadzić klej na dużym obszarze, aby pomieścić oba kawałki tkanki i dotknij kawałka paska bibuły filtracyjnej po brzusznej stronie jednej półkuli. Użyj innego paska z bibuły filtracyjnej, aby ostrożnie częściowo wysuszyć grzbietową stronę mózgu i umieść półkulę grzbietową stroną w dół na kleju na płytce próbki. Użyj dwóch dodatkowych pasków z bibuły filtracyjnej, aby ustawić drugą półkulę na kleju, jak właśnie pokazano, i umieść płytkę próbki w komorze krojenia.Następnie szybko, ale ostrożnie przykryj talerz lodowatym roztworem plastrów o wysokiej zawartości sacharozy. Aby uzyskać skrawki tkanki mózgowej, umieść ostrze wibratomu przed przyśrodkową stroną półkul i podnieś stół wibratomu tak, aby ostrze znajdowało się na tej samej wysokości, co brzuszne boki półkul, które są teraz skierowane do góry. Użyj regulatora wibratomu, aby opuścić ostrze o 600 mikronów dalej w kierunku grzbietowym i pokrój tkankę, aż pierwsze dwie warstwy zostaną całkowicie oddzielone od dwóch półkul.Po uzyskaniu pierwszych dwóch plasterków tkanki odwróć kierunek cięcia i opuść ostrze o kolejne 300 mikronów przed ponownym krojeniem. Kiedy hipokamp stanie się widoczny, użyj poszerzonej plastikowej pipety Pasteura, aby zebrać i przenieść plastry do komory regeneracyjnej w łaźni wodnej. Pozostaw plastry w komorze regeneracyjnej wypełnionej ACSF na jedną godzinę, a następnie umieść komorę odzyskiwania w temperaturze pokojowej na 30 minut przed wykonaniem zapisów elektrofizjologicznych próbek tkanek.Tutaj można zaobserwować reprezentatywne zapisy potencjału postsynaptycznego pobudzającego pole ujemne i dodatnie odpowiednio z wycinków o niskiej i wysokiej jakości. Ujemny przykładowy ślad wykazuje dużą amplitudę salwy włókien po depolaryzacji stymulowanych włókien neuronalnych, która jest nawet wyższa niż rzeczywista amplituda fEPSP, podczas gdy wysokiej jakości ślad pokazuje mały stosunek salwy włókien do fEPSP i wysoką amplitudę fEPSP. Żywotność wycinka mózgu można również przeanalizować, wykreślając pobudzające nachylenia potencjału postsynaptycznego w stosunku do amplitud włóknistych.Krzywe wejścia/wyjścia, które są zwykle używane do określania jakości wycinka, można uzyskać, stosując narastające bodźce prądowe do wycinka mózgu i monitorując następujące po nim odpowiedzi fEPSP. Ze względu na nieoptymalne właściwości przewodzenia słabo zachowanej tkanki mózgowej, niskiej jakości wycinki mózgu wykazują zmniejszone krzywe wejścia/wyjścia. Żywotne wycinki mózgu mają stabilne linie bazowe transmisji synaptycznej, podczas gdy wycinki mózgu o niestabilnej linii podstawowej nie mogą być wykorzystywane do dalszych protokołów warunkowania w celu zbadania plastyczności synaptycznej obwodów mózgu.Zapisy wyjściowe fEPSP mogą być również przydatne do monitorowania wpływu leku na samą transmisję synaptyczną. Ponadto wycinki mózgu mogą być używane w połączeniu ze wskaźnikiem wapnia do uzyskiwania zapisów obrazowania fluorescencyjnego i badania napływu wapnia w różnych warunkach warstw lub zabiegach. Upewnij się, że sekcja mózgu zostanie wykonana w ciągu nie więcej niż 1,5 minuty od poświęcenia, a to nadal gwarantuje, że tkanka mózgowa jest tylko na krótko bez chłodzenia i dopływu tlenu.Wycinki mózgu hipokampa mają wiele różnych zastosowań, od technik biologii molekularnej po elektrofizjologię. Procedura ta ułatwia intensywne badania anatomii hipokampa i procesów neurologicznych.

horizontal-hippocampal-slices-of-the-mouse-brain

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

W niniejszym artykule przedstawiono procedury przygotowywania skrawków hipokampa szczurów oraz myszy transgenicznych w celu badania zmian synaptycznych związanych ze starzeniem się mózgu i neurodegeneracyjnymi chorobami starczymi, takimi jak choroba Alzheimera.

Przygotowanie ostrych skrawków hipokampa szczurów i myszy transgenicznych do badania zmian synaptycznych podczas starzenia się i patologii amyloidowej

Ten film demonstruje szczegółowy protokół przygotowania poziomych wycinków mózgu hipokampa od myszy, skupiając się na zachowaniu integralności szlaków włókien hipokampa. Proces ten polega na starannym przecięciu i zabezpieczeniu mózgu, użyciu wibratomu do krojenia i utrzymaniu optymalnych warunków tkanek za pomocą płynu karbogenicznego, w wyniku czego powstają wycinki mózgu hipokampa gotowe do dalszych eksperymentów.

Uzyskiwanie poziomych wycinków mózgu hipokampa myszy

Film demonstruje procedurę rejestrowania potencjału pola lokalnego (LFP) w wycinkach kory hipokampowo-śródwęchowej myszy. Stymulacja elektryczna jest zapewniona w warstwie promieniowej CA3 hipokampa, co powoduje zmiany potencjału postsynaptycznego w warstwie piramidalnej CA1. Rejestrowana jest łączna zmiana potencjału błonowego neuronów CA1, zwana potencjałem pola lokalnego.

Rejestracja potencjału pola lokalnego w wycinkach kory hipokampowo-śródwęchowej myszy

Ten artykuł przedstawia kompletną metodologię przygotowania i konserwacji in vitro ostrych wycinków hipokampa od dorosłych myszy. Protokół ten pozwala na rejestrowanie bardzo stabilnego, długotrwałego wzmocnienia (LTP) przez ponad 8 godzin ze wskaźnikiem sukcesu 95%.

Ulepszone przygotowanie i konserwacja wycinków myszy z hipokampa w celu uzyskania bardzo stabilnego i powtarzalnego zapisu długotrwałego wzmocnienia

Ten artykuł wideo opisuje eksperymentalne procedury badania długoterminowej plastyczności i jej procesów asocjacyjnych, takich jak znakowanie synaptyczne, przechwytywanie i krzyżowanie w neuronach piramidowych CA1 przy użyciu ostrych wycinków hipokampa od gryzoni.

Badanie znakowania/przechwytywania synaptycznego i przechwytywania krzyżowego przy użyciu ostrych plastrów hipokampa od gryzoni

Protokół do dokładnej identyfikacji i analizy synaps w wycinkach hipokampa za pomocą immunofluorescencji jest opisany w tym artykule.

Ocena gęstości synaps w wycinkach mózgu gryzoni w hipokampie

Użyliśmy elektrod rejestrujących i stymulujących w podłużnych wycinkach mózgu hipokampa oraz podłużnie rozmieszczonych elektrod rejestrujących i stymulujących w grzbietowym hipokampie in vivo, aby wywołać zewnątrzkomórkowe potencjały postsynaptyczne i wykazać długoterminową plastyczność synaptyczną wzdłuż podłużnego międzypłytkowego CA1.

Badanie długoterminowej plastyczności synaptycznej w międzypłytkowym hipokampie CA1 za pomocą zapisu pola elektrofizjologicznego

To jest protokół do przygotowania ostrych plastrów z dorosłych i starzejących się hipokampów myszy, który wykorzystuje transcardialną perfuzję i cięcie plastrów za pomocą lodowatego NMDG-aCSF w celu zmniejszenia niedotlenienia tkanki. Uzyskane w ten sposób plastry pozostają zdrowe przez wiele godzin i nadają się do długotrwałych nagrań typu patch-clamp i nagrań terenowych.

Minimalizacja niedotlenienia w plastrach hipokampa od dorosłych i starzejących się myszy

Ten protokół opisuje przygotowanie poziomych wycinków kory hipokampowo-śródwęchowej (HEC) od myszy wykazujących spontaniczną aktywność fal ostrych. Plastry są inkubowane w uproszczonej komorze przechowawczej, a nagrania są wykonywane w warunkach zanurzonych z szybko płynącym sztucznym płynem mózgowo-rdzeniowym, aby promować dotlenienie tkanek i spontaniczne pojawienie się aktywności na poziomie sieci.

Ostre krojenie mózgu myszy w celu zbadania spontanicznej aktywności sieci hipokampa

Przedstawiamy protokół przygotowania ostrych plastrów z grzbietowo-pośredniego hipokampa myszy. Porównujemy ten preparat poprzeczny z cięciem koronalnym pod względem jakości zapisów i zachowania cech morfologicznych zarejestrowanych neuronów.

Przygotowanie ostrych wycinków z grzbietowego hipokampa do zapisu całych komórek i rekonstrukcji neuronów w zakręcie zębatym dorosłych myszy

Poznaj metodę przygotowania poziomych wycinków hipokampa mózgu myszy do badań elektrofizjologicznych. Technika ta zachowuje integralność kluczowych szlaków włóknistych, umożliwiając analizę transmisji synaptycznej i plastyczności.

Poziome wycinki hipokampa mózgu myszy

Przeglądaj więcej filmów