Osadzanie kolagenu warstwa po warstwie w urządzeniach mikroprzepływowych do stabilizacji mikrotkanek

Ogólnym celem tej procedury jest zdeponowanie cienkiego zespołu kolagenu na komórkach w urządzeniu mikroprzepływowym. Osiąga się to poprzez najpierw modyfikację zakwaszonego kolagenu natywnego poprzez metylację w celu wytworzenia dodatnio naładowanych cząsteczek kolagenu netto. Drugim krokiem jest modyfikacja zakwaszonego kolagenu natywnego poprzez ation w celu wytworzenia ujemnie naładowanych cząsteczek kolagenu netto.

Następnie urządzenia mikroprzepływowe są przygotowywane i wysiewane hepatocytami, które mogą się przyczepiać i rozprzestrzeniać przez noc. Ostatnim krokiem jest zdeponowanie zespołu kolagenu poprzez naprzemienne wystawienie komórek na działanie dodatnio i ujemnie naładowanych roztworów kolagenu w celu utworzenia 10 dwuwarstw kolagenu na wierzchu warstwy komórkowej. Ostatecznie mikroskopia fazowa i immunofluorescencyjna oraz testy albuminy i mocznika są stosowane w celu wykazania rozwoju i utrzymania polarności komórek i funkcji wydzielniczych.

Główną zaletą tej techniki jest to, że umożliwia hodowlę hepatocytów w mikrourządzeniach przy użyciu technik podobnych do tych stosowanych w hodowlach płytkowych od ponad 20 lat. Nie wymaga skomplikowanych konstrukcji urządzeń, a osadzona matryca jest bardzo cienka rzędu 100 nanometrów. Po raz pierwszy wpadliśmy na pomysł tej metody podczas burzy mózgów na temat tego, jak przełożyć techniki hodowli komórek Capy z płytek na urządzenia mikroprzepływowe.

Metody przekładkowe kolagenu sprawdzają się w systemach mikroskopowych typu open top, ale stosowane hydrożele są niekompatybilne z zamkniętymi mikrourządzeniami o ograniczonej wysokości kanałów. Rozcieńczyć 100 miligramów natywnego zakwaszonego roztworu kolagenu do stężenia 0,5 miligrama na mililitr lodem, zimną, sterylną wodą i umieścić roztwór na lodzie, aby zapobiec alacji. Następnie dostosuj pH roztworu kolagenu do poziomu od 9 do 10 za pomocą kilku kropli jednego normalnego wodorotlenku sodu i delikatnie mieszaj roztwór w temperaturze pokojowej przez 30 minut.

Gdy kolagen wytrąci się, roztwór zacznie mętnieć, odwiruj wytrącony roztwór kolagenu, który 3000 razy G przez 25 minut. Następnie na dnie probówek powinien być widoczny przezroczysty żelowy osad, odessać snat, a następnie ponownie zawiesić wytrącony kolagen w 200 mililitrach metanolu z 0,1 normalnym kwasem solnym, aby zaszła reakcja metylacji, mieszając w temperaturze pokojowej przez cztery dni po wirówce metylowej, roztwór o stężeniu 3000 razy G przez 25 minut w celu osadzenia metylowanego kolagenu, Następnie odessać i usunąć zakwaszony supinian metanolu. Następnie rozpuść metylowany kolagen w 25 mililitrach sterylnego PBS i przefiltruj roztwór przez sitko do komórek o wielkości 60 mikronów.

Dostosuj pH roztworu do 7,3 do 7,4, stosując 20 mikrolitrów przyrostu jednego normalnego wodorotlenku sodu. Oceń stężenie roztworu kolagenu za pomocą dostępnego w handlu zestawu ELIZA do kolagenu szczurzego lub zestawu do oznaczania hydroksyproliny. Następnie rozcieńczyć roztwór do trzech miligramów na mililitr sterylnym PBS.

Wysterylizuj metylowany roztwór kolagenu, przenosząc go do szklanej butelki z zakrętką. Ostrożnie ułóż trzy mililitry chloroformu na dnie butelki i pozwól butelce zastygnąć przez noc w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Następnego ranka.

W aseptyce usuń górną warstwę metylowanego kolagenu. Przechowuj metylowany kolagen w temperaturze czterech stopni Celsjusza i zużyj go w ciągu jednego miesiąca. Rozcieńczyć kolejne 100 miligramów natywnego zakwaszonego roztworu kolagenu do stężenia 0,5 miligrama na mililitr lodem, zimną, sterylną wodą i umieścić roztwór na lodzie, aby zapobiec dacji, jak pokazano wcześniej, dostosować pH roztworu kolagenu wodorotlenkiem sodu i wymieszać roztwór w temperaturze pokojowej, aby wytrącić kolagen.

Następnie rozpuść 40 miligramów sześciu bezwodników cynowych w 10 mililitrach acetonu. Powoli dodawaj tę mieszaninę w odstępach co 0,5 mililitra do roztworu kolagenu, mieszając i stale monitorując pH roztworu. Utrzymać pH powyżej 9,0, dodając jedną lub dwie krople jednego normalnego wodorotlenku sodu, gdy pH zbliża się do 9,0, ciągle mieszając w temperaturze pokojowej przez 120 minut.

Po dodaniu wszystkich sześciu roztworów cynicznych i wodorkowych obserwuj, jak mieszanina staje się klarowna, gdy kolagen bursztynianowy rozpuszcza się, kontynuuj okresowe sprawdzanie pH, aby upewnić się, że pozostaje powyżej 9,0. Gdy cały kolagen bursztynianowy się rozpuści, dostosuj pH roztworu do 4,0, stosując 20 mikrolitrów jednego normalnego kwasu solnego. Obserwuj roztwór, ponownie staje się mętny, gdy wytrąca się kolagen bursztynianowy.

Następnie odwirować roztwór o temperaturze 3000 razy G przez 25 minut. Aby zdegranulować kolagen bursztynianowy, należy go usunąć i usunąć zakwaszony nach z niereaktywnym bezwodnikiem snicznym, rozpuścić kolagen bursztynianowy wielokrotnym pipetowaniem w 25 mililitrach sterylnego PBS, uzyskując końcowe stężenie około trzech miligramów na mililitr. Następnie przefiltruj roztwór przez sitko o wielkości 60 mikronów, a następnie dostosuj pH roztworu do zakresu od 7,3 do 7,4.

Używając przyrostów 20 mikrolitrów jednego normalnego wodorotlenku sodu, oceń stężenie roztworu za pomocą komercyjnego zestawu ELIZA dla szczurów kolagenowych lub zestawu do oznaczania hydroksyproliny. Następnie rozcieńczyć roztwór do trzech miligramów na mililitr. Za pomocą sterylnego PBS wysterylizuj ten roztwór kolagenu w taki sam sposób, jak metylowany roztwór kolagenu.

Zacznij od wytworzenia urządzenia mikroprzepływowego przy użyciu standardowej techniki, które ma komory do hodowli komórkowych o wysokości 100 mikronów, szerokości od 0,4 do 1,5 milimetra i kanałach o długości od jednego do 10 milimetrów do wzrostu komórek. Za pomocą myjki plazmowej należy utlenić powierzchnie urządzenia i szkiełka podstawowego. Następnie ściśnij je razem, aby utworzyć wiązanie.

Po wysterylizowaniu urządzenia przez wystawienie na działanie światła UV przez co najmniej 30 minut. Napełnij komorę 15 mikrogramami na mililitr, fibronektyną w sterylnym PBS i inkubuj w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 45 minut. Następnie zobacz urządzenie z komórkami zgodnie z opisem w dołączonym protokole tekstowym.

W kapturze do hodowli tkanek z przepływem laminarnym przygotuj wystarczającą ilość metylowanych i nasyconych roztworów kolagenu na 10 aplikacji każdego roztworu na urządzenie, a także kilka ekstremalnych mililitrów pożywki. Utrzymuj roztwory na lodzie. Naprzemiennie przepłukiwać urządzenia 20 mikrolitrami metylowanych, a następnie spulchnionych roztworów kolagenu.

Odczekanie jednej minuty między każdą aplikacją. Przepłucz urządzenie w sumie 10 razy na roztwór. Pracuj szybko, aby zminimalizować czas, w którym komórki są bez pożywki podczas wzrostu warstw kolagenu, można zaobserwować, jak kolagen powoli gromadzi się na wlocie i wylocie urządzenia mikroprzepływowego.

Jeśli opór przepływu płynu wzrośnie, przepłucz urządzenie raz lub dwa razy media, a następnie kontynuuj nakładanie warstw. Po nałożeniu wszystkich warstw należy dwukrotnie przepłukać urządzenie świeżą pożywką i ponownie umieścić je w inkubatorze. Metylacja i ation zmieniają charakterystykę ładunku cząsteczek kolagenu.

Ation usuwa dodatnio naładowane grupy i zastępuje je ujemnie naładowanymi grupami, a metylacja usuwa ujemnie naładowane grupy, tworząc netto dodatnio naładowane cząsteczki, umożliwiając osadzanie się warstwa po warstwie dwóch wariantów kolagenu na naładowanych powierzchniach, takich jak komórki. Pierwotne hepatocyty wysiane na szkle pokrytym fibronektyną w urządzeniu mikroprzepływowym mogą być pokryte tą warstwą po warstwie. Montaż macierzy kolagenowej, osadzanie 10 dwuwarstw na komórkach tworzy warstwę kolagenu o grubości około 140 nanometrów hepatocytów bez górnej warstwy kolagenu warstwa po warstwie.

Matrix traci swój zróżnicowany skurcz fenotypowy i z czasem unosi się z powierzchni urządzeń mikroprzepływowych. Natomiast hepatocyty pokryte ultra cienkim zespołem kolagenu utrzymują swoją zróżnicowaną morfologię, żywotność ponad 90% i polaryzację przez 14 dni. Oprócz morfologii żywotności komórek i polaryzacji, technika warstwy po warstwie kolagenu również odzyskuje i stabilizuje funkcję pierwotnych hepatocytów, jak wskazano tutaj, Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak metylować i bursztynianować kolagen, aby tworzyć dodatnio i ujemnie naładowane roztwory kolagenu netto oraz jak używać ich w osadzaniu warstwa po warstwie, aby stworzyć cienkie zespoły kolagenu na komórkach w urządzeniach mikroprzepływowych.