Name: Osadzanie kolagenu warstwa po warstwie w urządzeniach mikroprzepływowych do stabilizacji mikrotkanek (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-09-29T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 56 s
Description: Poznaj metodę osadzania kolagenu warstwa po warstwie w mikroprzepływowych urządzeniach do stabilizacji fenotypów komórek hepatocytów. Technika ta wykorzystuje modyfikację ładunku kolagenu.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez granty z National Institutes of Health, w tym grant konsorcjum systemów mikrofizjologicznych z National Center for Advancing Translational Sciences (UH2TR000503), Ruth L. Kirschstein National Research Service Award Postdoctoral Fellowship (F32DK098905 dla WJM) oraz nagrodę za drogę do niepodległości (DK095984 dla AB) od National Institute of Diabetes and Digestive and Kidney Diseases.

1. Przygotowanie roztworu kolagenu rozpuszczalnego w natywnym
<ol>
	<li>Przygotuj lub kup 200 mg zakwaszonego, rozpuszczalnego kolagenu typu I z ogonów szczurów w dawce 1-3 mg / ml przy użyciu standardowych protokołów izolacji, takich jak zgłoszone przez Piez i wsp. 15</li>
	<li>Skaluj ilość materiału wyjściowego w oparciu o pożądaną objętość końcową zmodyfikowanych roztworów kolagenu. Z około 200 mg rozpuszczalnego kolagenu natywnego przygotować 25–30 ml metylowanych i 25–30 ml roztworów kolagenu sukcynylowanego, każdy w stężeniu 3 mg/ml.</li>
</ol>
2. Metylacja kolagenu
<ol>
	<li>Rozcieńczyć 100 mg natywnego, zakwaszonego (pH 2-3) roztworu kolagenu do stężenia 0,5 mg/ml lodowatą sterylną wodą i utrzymywać roztwór na lodzie, aby zapobiec żelowaniu.</li>
	<li>Dostosuj pH roztworu kolagenu do 9–10 za pomocą kilku kropli 1 N NaOH i mieszaj w temperaturze pokojowej przez 30 minut. Obserwuj, jak wytrąca się osad kolagenu, powodując, że roztwór staje się mętny.</li>
	<li>Odkręcać wytrącony roztwór kolagenu o stężeniu 3 000 × g przez 25 minut. Na dnie probówek powinien być widoczny przezroczysty, żelowy osad. Odessać i odpowiednio zutylizować płyn szwadronowy.</li>
	<li>Zawiesić wytrącony kolagen w 200 ml metanolu z 0,1 N HCl i pozostawić reakcję metylacji z mieszaniem w temperaturze pokojowej przez 4 dni. Kolagen nie rozpuści się, ale powinien rozpaść się na bardzo małe, widoczne kawałki, które spowodują, że roztwór będzie mętny.</li>
	<li>Po metylacji odwirować roztwór o stężeniu 3 000 × g przez 25 minut, aby osadzać metylowany kolagen. Odessać i usunąć zakwaszony supernatant metanolu.</li>
	<li>Rozpuścić metylowany kolagen w 25 ml sterylnego PBS, uzyskując stężenie około 3 mg/ml, przy wielokrotnym pipetowaniu, i przefiltrować roztwór przez sitko do komórek 60 μm. Dostosować pH roztworu do 7,3–7,4, stosując przyrosty co 20 μl 1 N NaOH.</li>
	<li>Oceń stężenie roztworu za pomocą dostępnego w handlu zestawu ELISA do pomiaru kolagenu szczura lub zestawu do oznaczania hydroksyproliny. Rozcieńczyć roztwór do 3 mg/ml jałowym PBS.</li>
	<li>Wysterylizuj roztwór metylowanego kolagenu, przenosząc go do szklanej butelki z zakrętką, ostrożnie nakładając 3 ml chloroformu na dno butelki, pozwól butelce ustawić O/N na 4 °C, a następnie aseptycznie usuń i przechowuj górną warstwę, którą jest metylowany kolagen.</li>
	<li>Roztwór należy przechowywać w temperaturze 4 °C do użycia w ciągu 1 miesiąca.</li>
</ol>
3. Sukcynylacja kolagenu
<ol>
	<li>Rozcieńczyć pozostałe 100 mg natywnego, zakwaszonego (pH 2-3) roztworu kolagenu do stężenia 0,5 mg/ml lodowatą sterylną wodą i utrzymywać roztwór na lodzie, aby zapobiec żelowaniu.</li>
	<li>Dostosuj pH roztworu kolagenu do 9–10 za pomocą kilku kropli 1 N NaOH i mieszaj w temperaturze pokojowej przez 30 minut. Kolagen powinien się wytrącić, powodując, że roztwór stanie się mętny.</li>
	<li>Rozpuścić 40 mg bezwodnika bursztynowego (0,4 mg na mg kolagenu) w 10 ml acetonu (1/20 objętości roztworu kolagenu). Powoli (w odstępach co około 0,5 ml) dodawać tę mieszaninę do roztworu kolagenu, mieszając, stale monitorując pH. Utrzymuj pH powyżej 9,0, dodając 1 lub 2 krople 1 N NaOH, gdy pH zbliża się do 9,0.</li>
	<li>Kontynuuj mieszanie w temperaturze pokojowej przez 120 minut po dodaniu całego bezwodnika bursztynowego do acetonu. Obserwuj roztwór, aby stał się klarowny, gdy sukcynylowany kolagen rozpuszcza się. Okresowo sprawdzaj pH, aby upewnić się, że utrzymuje się powyżej 9,0.</li>
	<li>Dostosować pH roztworu do 4,0 z przyrostami co 20 μl 1 N HCl. Ponownie obserwować, że roztwór jest mętny, gdy sukcynylowany kolagen wytrąca się.</li>
	<li>Po sukcynylacji odwirować roztwór o stężeniu 3 000 × g przez 25 minut, aby osadzać sukcynylowany kolagen. Odessać i usunąć zakwaszony supernatant z nieprzereagowanym bezwodnikiem bursztynowym.</li>
	<li>Rozpuścić sukcynylowany kolagen w 25 ml sterylnego PBS, uzyskując stężenie około 3 mg/ml, przy wielokrotnym pipetowaniu, i przefiltrować roztwór przez sitko do komórek 60 μm. Dostosować pH roztworu do 7,3–7,4, stosując przyrosty co 20 μl 1 N NaOH.</li>
	<li>Ocenić stężenie roztworu za pomocą komercyjnego zestawu ELISA do badania szczurów kolagenowych lub zestawu do oznaczania hydroksyproliny. Rozcieńczyć roztwór do 3 mg/ml jałowym PBS.</li>
	<li>Wysterylizuj sukcynylowany roztwór kolagenu, przenosząc go do szklanej butelki z zakrętką, ostrożnie nakładając 3 ml chloroformu na dno butelki, pozwól butelce ustawić O/N na 4 °C, a następnie aseptycznie usuń i przechowuj górną warstwę, którą jest kolagen sukcynylowany.</li>
	<li>Roztwór należy przechowywać w temperaturze 4 °C do użycia w ciągu 1 miesiąca.</li>
</ol>
4. Weryfikacja modyfikacji kolagenu
<ol>
	<li>Przygotować 1 ml próbek z każdego z natywnych, metylowanych i sukcynylowanych roztworów kolagenu i rozcieńczyć do stężenia 0,1 mg/ml sterylną czystą wodą do miareczkowania jonów wodorowych. Dalej rozcieńczyć bufor co najmniej 1000-krotnie przez dializę z wodą przez membranę odcinającą o natężeniu 10 kDa, używając 3 podmian roztworu przez co najmniej 4 godziny każda.</li>
	<li>Dostosuj pH roztworów do 7,3 z niewielkimi ilościami NaOH i HCl. Używając pH 7,3 jako dowolnego odniesienia, wykonaj miareczkowanie jonów wodorowych na każdej z próbek, jak opisano w Tanford16, aby utworzyć krzywe miareczkowania dla natywnych, metylowanych i sukcynylowanych roztworów kolagenu.</li>
	<li>Wykreślić zmianę pH na objętość dodanego kwasu w funkcji liczby związanych jonów H+ na cząsteczkę. Zakres "aminowy" o wysokim pH powinien wykazywać przesunięcie kolagenu sukcynylowanego w kierunku punktu neutralnego (utrata grup aminowych), a zakres "karboksylowy" o niskim pH powinien wykazywać przesunięcie w lewo w kolagenie metylowanym (utrata grup karboksylowych) i przesunięcie w prawo w kolagenie sukcynylowym (przyrost grup karboksylowych), w porównaniu z kolagenem natywnym.</li>
	<li>Ocenić skuteczność reakcji sukcynylacji, oznaczając % grup aminowych w kolagenie natywnym zastąpionym sukcynylacją przy użyciu metody kolorymetrycznej kwasu 2,4,6-trinitrobenzenosulfonowego (TNBA), zgodnie ze standardowymi protokołami17,18.</li>
</ol>
5. Produkcja urządzeń mikroprzepływowych i zasiewanie komórek
<ol>
	<li>Wytwarzaj urządzenia mikroprzepływowe przy użyciu standardowych metod9. Użyj repliki formowania PDMS z wzorców SU-8 na krzemie zdefiniowanym za pomocą fotolitografii, aby stworzyć mikroprzepływowe komory do hodowli komórek z kanałami o wysokości 100 μm, szerokości 0,4–1,5 mm i długości 1–10 mm do wzrostu komórek.</li>
	<li>Użyj myjki plazmowej, aby utlenić powierzchnie urządzenia i szkiełka podstawowego, a następnie dociśnij do siebie, aby skleić. Po wysterylizowaniu urządzenia przez wystawienie na działanie światła UV przez co najmniej 30 minut, napełnić komorę 50 μg/ml fibronektyny w sterylnym PBS i inkubować w temperaturze 37 °C przez 45 minut.</li>
	<li>Zasiej urządzenie komórkami, takimi jak pierwotne hepatocyty szczura lub człowieka, które wymagają żelu kolagenowego do stabilizacji fenotypu lub stanu różnicowania. Używamy 20 μl świeżo wyizolowanych pierwotnych hepatocytów szczura7,19 lub dostępnych w handlu kriokonserwowanych pierwotnych ludzkich hepatocytów wysiewanych w ilości 14×106 komórek/ml na urządzenie.</li>
	<li>Pozwól komórkom przyczepić się przez 4–6 godzin, a następnie wypłucz nieprzyłączone komórki i zastąp pożywkę galwaniczną pożywką wzrostową. Inkubuj O/N, aby zapewnić pełne rozprzestrzenianie się komórek i utworzyć zlewającą się monowarstwę komórek.</li>
</ol>
6. Osadzanie kolagenu warstwa po warstwie
<ol>
	<li>W kapturze do hodowli tkanek z przepływem laminarnym przygotuj wystarczającą ilość metylowanych i sukcynylowanych roztworów kolagenu na 10 aplikacji każdego roztworu na urządzenie, a także kilka ml pożywki. Utrzymuj roztwory na lodzie. Używamy 20 μl (10-15 razy więcej niż całkowita objętość urządzenia) kolagenu na warstwę na urządzenie.</li>
	<li>Zaczynając od roztworu metylowanego (polikationowego), naprzemiennie przepłukuj urządzenia 20 μl metylowanych, a następnie sukcynylowanych roztworów kolagenu, odczekując 1 minutę między każdą aplikacją. Przepłucz urządzenie w sumie 10 razy na roztwór, co powinno zająć około 20 minut. Pracuj szybko, aby zminimalizować czas, w którym komórki są bez nośnika.</li>
	<li>Obserwuj, jak kolagen powoli gromadzi się na wlocie/wylocie w zależności od jego wielkości. Jeśli opór przepływu płynu wzrośnie, przepłucz urządzenie raz lub dwa razy media, a następnie kontynuuj nakładanie warstw.</li>
	<li>Po nałożeniu wszystkich warstw należy dwukrotnie przepłukać urządzenie świeżą pożywką i ponownie umieścić je w inkubatorze. W zależności od typu komórki, zmiany morfologiczne wywołane macierzą zewnątrzkomórkową, takie jak zwiększona polaryzacja hepatocytów, powinny być widoczne w ciągu kilku godzin.</li>
	<li>Przygotować reprezentatywne urządzenia do transmisyjnej mikroskopii elektronowej przy użyciu metod standardowych9 w celu sprawdzenia obecności zespołu macierzy kolagenowej na wierzchu hodowanych komórek.</li>
</ol>
7. Stabilizacja fenotypu i funkcji komórki
<ol>
	<li>Zobrazuj morfologię, żywotność i polaryzację komórki przy użyciu standardowych metod dla typu komórki. W przypadku hepatocytów zbieraj obrazy przez 14 dni za pomocą mikroskopii fazowej, barwienia LIVE/DEAD w celu zapewnienia żywotności i barwnika CMFDA do polaryzacji wierzchołkowej, aby zademonstrować efekty odkładania kolagenu.</li>
	<li>W celu uzyskania morfologii komórek przepłucz urządzenie przez wlot pipetą z 20 μl PBS w celu wypłukania, wstrzyknij 20 μl PBS i zobrazuj urządzenie za pomocą mikroskopii z kontrastem fazowym.</li>
	<li>W przypadku barwienia LIVE/DEAD przepłukać urządzenie przez wlot pipetą z 20 μl PBS w celu wypłukania, wstrzyknąć 20 μl roztworu barwiącego LIVE/DEAD z DAPI przygotowanym zgodnie z instrukcjami producenta, inkubować przez 30 min w temperaturze 37 °C, ponownie przepłukać urządzenie 20 μl PBS, i zobrazuj urządzenie za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej.</li>
	<li>W przypadku barwienia kanałów żółciowych przepłukać urządzenie przez wlot pipetą z 20 μl PBS w celu wypłukania, wstrzyknąć 20 μl roztworu barwiącego CMFDA o stężeniu 2 μM z DAPI przygotowanym zgodnie z instrukcjami producenta, inkubować przez 30 minut w temperaturze 37 °C, ponownie przepłukać urządzenie 20 μl PBS, i zobrazuj urządzenie za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej.</li>
	<li>Zbierz zużytą pożywkę i zmierz produkty przemiany materii w odpowiednich punktach czasowych w czasie trwania hodowli, aby określić funkcję komórki. W przypadku hepatocytów zmierz ilość albuminy i mocznika w zużytym pożywce.</li>
	<li>Wykonaj analizy funkcjonalne punktów końcowych samych komórek, takie jak ocena poziomu aktywności enzymów, barwienie przeciwciał lub analiza RNA. W przypadku hepatocytów indukuj i mierz aktywność enzymu cytochromu P450 lub enzymu sprzęgającego fazy II S-transferazy glutationowej.</li>
</ol>

<ol><li>Pedersen, J. A., Swartz, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanobiology+in+the+third+dimension%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Biomed+Eng%22%5BJournal%5D)">Mechanobiology in the third dimension.</a> Ann Biomed Eng. 33 (11), 1469-1490 (2005).</li>
<li>Glowacki, J., Mizuno, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Collagen+scaffolds+for+tissue+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Biopolymers%22%5BJournal%5D)">Collagen scaffolds for tissue engineering.</a> Biopolymers. 89 (5), 338-344 (2008).</li>
<li>Vescio, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo-like+drug+responses+of+human+tumors+growing+in+three-dimensional+gel-supported+primary+culture%5BTitle%5D)+AND+%22PNAS%22%5BJournal%5D)">In vivo-like drug responses of human tumors growing in three-dimensional gel-supported primary culture.</a> PNAS. 84, 5029-5033 (1987).</li>
<li>Chandrasekaran, S., Guo, N. -h, Rodrigues, R. G., Kaiser, J., Roberts, D. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pro-adhesive+and+chemotactic+activities+of+thrombospondin-1+for+breast+carcinoma+cells+are+mediated+by+%CE%B13%CE%B21+integrin+and+regulated+by+insulin-like+growth+factor-1+and+CD98%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Pro-adhesive and chemotactic activities of thrombospondin-1 for breast carcinoma cells are mediated by α3β1 integrin and regulated by insulin-like growth factor-1 and CD98.</a> J Biol Chem. 274 (16), 11408-11416 (1999).</li>
<li>Chen, S. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multilineage+differentiation+of+rhesus+monkey+embryonic+stem+cells+in+three%E2%80%90dimensional+culture+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Multilineage differentiation of rhesus monkey embryonic stem cells in three‐dimensional culture systems.</a> Stem Cells. 21 (3), 281-295 (2003).</li>
<li>Whelan, M. C., Senger, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Collagen+I+initiates+endothelial+cell+morphogenesis+by+inducing+actin+polymerization+through+suppression+of+cyclic+AMP+and+protein+kinase+A%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Collagen I initiates endothelial cell morphogenesis by inducing actin polymerization through suppression of cyclic AMP and protein kinase A.</a> J Biol Chem. 278 (1), 327-334 (2003).</li>
<li>Dunn, J. C., Tompkins, R. G., Yarmush, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+in+vitro+function+of+adult+hepatocytes+in+a+collagen+sandwich+configuration%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol+Prog%22%5BJournal%5D)">Long-term in vitro function of adult hepatocytes in a collagen sandwich configuration.</a> Biotechnol Prog. 7 (3), 237-245 (1991).</li>
<li>Decher, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fuzzy+Nanoassemblies%3A+Toward+Layered+Polymeric+Multicomposites%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Fuzzy Nanoassemblies: Toward Layered Polymeric Multicomposites.</a> Science. 277, 1232-1237 (1997).</li>
<li>McCarty, W. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+ultrathin+collagen+nanolayer+assembly+for+3-D+microtissue+engineering%3A+Layer-by-layer+collagen+deposition+for+long-term+stable+microfluidic+hepatocyte+culture%5BTitle%5D)+AND+%22TECHNOLOGY%22%5BJournal%5D)">A novel ultrathin collagen nanolayer assembly for 3-D microtissue engineering: Layer-by-layer collagen deposition for long-term stable microfluidic hepatocyte culture.</a> TECHNOLOGY. 2 (01), 67-74 (2014).</li>
<li>Swierczewska, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+response+to+nanoscale+elastin-like+polypeptide+polyelectrolyte+multilayers%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Biomater%22%5BJournal%5D)">Cellular response to nanoscale elastin-like polypeptide polyelectrolyte multilayers.</a> Acta Biomater. 4 (4), 827-837 (2008).</li>
<li>Kim, Y., Larkin, A. L., Davis, R. M., Rajagopalan, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+design+of+in+vitro+liver+sinusoid+mimics+using+chitosan-hyaluronic+acid+polyelectrolyte+multilayers%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Eng+Pt+A%22%5BJournal%5D)">The design of in vitro liver sinusoid mimics using chitosan-hyaluronic acid polyelectrolyte multilayers.</a> Tissue Eng Pt A. 16 (9), 2731-2741 (2010).</li>
<li>Larkin, A. L., Rodrigues, R. R., Murali, T., Rajagopalan, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Designing+a+Multicellular+Organotypic+3D+Liver+Model+with+a+Detachable%2C+Nanoscale+Polymeric+Space+of+Disse%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Eng+Pt+C%22%5BJournal%5D)">Designing a Multicellular Organotypic 3D Liver Model with a Detachable, Nanoscale Polymeric Space of Disse.</a> Tissue Eng Pt C. 19 (11), 875-884 (2013).</li>
<li>Kidambi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patterned+Co%E2%80%90Culture+of+Primary+Hepatocytes+and+Fibroblasts+Using+Polyelectrolyte+Multilayer+Templates%5BTitle%5D)+AND+%22Macromol+Biosci%22%5BJournal%5D)">Patterned Co‐Culture of Primary Hepatocytes and Fibroblasts Using Polyelectrolyte Multilayer Templates.</a> Macromol Biosci. 7 (3), 344-353 (2007).</li>
<li>Janorkar, A. V., Rajagopalan, P., Yarmush, M. L., Megeed, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+use+of+elastin-like+polypeptide-polyelectrolyte+complexes+to+control+hepatocyte+morphology+and+function+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">The use of elastin-like polypeptide-polyelectrolyte complexes to control hepatocyte morphology and function in vitro.</a> Biomaterials. 29 (6), 625-632 (2008).</li>
<li>Piez, K. A., Eigner, E. A., Lewis, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Chromatographic+Separation+and+Amino+Acid+Composition+of+the+Subunits+of+Several+Collagens%2A%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">The Chromatographic Separation and Amino Acid Composition of the Subunits of Several Collagens*.</a> Biochemistry. 2 (1), 58-66 (1963).</li>
<li>Tanford, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+interpretation+of+hydrogen+ion+titration+curves+of+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Protein+Chem%22%5BJournal%5D)">The interpretation of hydrogen ion titration curves of proteins.</a> Adv Protein Chem. 17, 69-165 (1962).</li>
<li>Cayot, P., Tainturier, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+quantification+of+protein+amino+groups+by+the+trinitrobenzenesulfonic+acid+method%3A+a+reexamination%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Biochem%22%5BJournal%5D)">The quantification of protein amino groups by the trinitrobenzenesulfonic acid method: a reexamination.</a> Anal Biochem. 249 (2), 184-200 (1997).</li>
<li>Kakade, M. L., Liener, I. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determination+of+available+lysine+in+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Biochem%22%5BJournal%5D)">Determination of available lysine in proteins.</a> Anal Biochem. 27 (2), 273-280 (1969).</li>
<li>Seglen, P. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+isolated+rat+liver+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Preparation of isolated rat liver cells.</a> Methods Cell Biol. 13, 29-83 (1976).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Ultracienkie zespoły czystego kolagenu mogą być osadzane na naładowanych komórkach lub powierzchniach materiałów za pomocą osadzania warstwa po warstwie zmodyfikowanych kolagenów. Wyniki tego badania pokazują, że metylacja i sukcynylacja kolagenu natywnego tworzą polikationowe i polianionowe roztwory kolagenu (ryc. 1), które można stosować techniką warstwa po warstwie do osadzania ultracienkich zespołów macierzy kolagenowej na komórkach (ryc. 2) lub innych naładowanych powierzchniach mat...

Chociaż mikrofluidyka pozwala na znakomitą kontrolę mikrośrodowiska komórkowego, hodowla komórek, zwłaszcza pierwotnych, w urządzeniach mikroprzepływowych może być wyzwaniem. Wiele tradycyjnych technik hodowli komórkowych zostało opracowanych w celu podtrzymania i ustabilizowania funkcji komórek podczas hodowli na płytkach do hodowli tkankowej, ale przełożenie tych technik na urządzenia mikroprzepływowe jest często trudne. 
Jedną z takich technik jest hodowla komórek na lub umieszczonych pomiędzy żelami kolagenowymi jako model fizjologicznego środowiska komórek 3D. 1 Kolagen typu I jest jednym z najczęściej używanych białek do zastosowań w biomateriałach ze względu na jego wszechobecność w macierzy zewnątrzkomórkowej, naturalną obfitość, solidne miejsca przyczepiania komórek i biokompatybilność. 2 Wiele komórek czerpie korzyści z hodowli 3D z kolagenem, w tym między innymi komórki rakowe3,45, komórki śródbłonka mikronaczyniowego6 i hepatocyty7. Podczas gdy stosowanie żeli kolagenowych jest łatwe w otwartych formatach, takich jak płytki do hodowli tkankowych, ograniczone wymiary kanałów i zamknięty charakter urządzeń mikroprzepływowych sprawiają, że stosowanie płynów, które żelują bez zablokowania całego kanału, jest niepraktyczne.
Aby przezwyciężyć ten problem, połączyliśmy technikę osadzania warstwa po warstwie8 z chemicznymi modyfikacjami roztworów kolagenu natywnego, aby stworzyć ultracienkie zespoły kolagenu na komórkach hodowanych w urządzeniach mikroprzepływowych. Warstwy te mogą stabilizować morfologię i funkcję komórek podobnie jak żele kolagenowe i mogą być osadzane na komórkach w urządzeniach mikroprzepływowych bez blokowania kanałów spolimeryzowaną matrycą. Celem tej metody jest modyfikacja kolagenu natywnego w celu wytworzenia polikationowych i polianionowych roztworów kolagenu oraz stabilizacja komórek w kulturze mikroprzepływowej poprzez osadzanie cienkich zespołów macierzy kolagenowej na komórkach. Technika ta została wykorzystana do stabilizacji morfologii i funkcji pierwotnych hepatocytów w urządzeniach mikroprzepływowych. 9
Chociaż wcześniej opisywano osadzanie warstwa po warstwie za pomocą naturalnych i syntetycznych polielektrolitów10 w celu pokrycia hepatocytów w kulturze płytkowej11,12 oraz jako warstwę siewną dla hepatocytów w urządzeniach mikroprzepływowych13,14, ta metoda opisuje osadzanie czystej warstwy kolagenu na wierzchu hepatocytów, naśladując techniki hodowli kolagenu 3D. W tym protokole używamy hepatocytów jako przykładowych komórek, które można utrzymywać za pomocą warstw kolagenu 3D. Wiele innych typów komórek, które czerpią korzyści z hodowli 3D w kolagenie, może podobnie korzystać z hodowli po osadzaniu warstwa po warstwie ultracienkiego zespołu macierzy kolagenowej.

<table><tbody><tr><td>kolagen typu I, ogon szczura</td><td>Life Technologies</td><td>A1048301</td><td>opcja dla skoncentrowanego kolagenu z ogona szczura</td></tr> typu <tr><td>I, ogon szczura</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C3867-1VL</td><td>opcja dla skoncentrowanego kolagenu</td></tr><tr><td>typu I z ogona szczura,</td> opcja <td>ogona szczura EMD Millipore</td><td>08-115</td><td>dla skoncentrowanego kolagenu z ogona szczura</td></tr> typu <tr>I, <td>systemy</td><td></td> <td>badawczo-rozwojowe ogona szczura3440-100-01</td><td>opcja dla skoncentrowanego bezwodnika bursztynowego kolagenu z ogona szczura</td></tr><tr><td></td><td>Sigma-Aldrich</td><td>239690-50G</td><td>odczynnik do sukcynylacji</td></tr><tr><td>bezwodny metanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>322415-100ML</td><td>odczynnik do metylacji</td></tr><tr><td>wodorotlenek sodu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5881-500G</td><td>Odczynnik do wytrącania pH</td></tr><tr><td>kwas solny</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>320331-500ML</td><td>Odczynnik do wytrącania pH</td></tr><tr><td>kolagen szczurzy typu I Opcja ELISA</td><td>Chondrex</td><td>6013</td><td>do wykrywania zawartości kolagenu</td></tr><tr><td>Zestaw do oznaczania hydroksyproliny</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>MAK008-1KT</td><td>opcja do wykrywania zawartości kolagenu</td></tr><tr><td>Zestaw do oznaczania hydroksyproliny</td><td>Opcja Quickzyme Biosciences</td><td>QZBtotcol1</td><td>do wykrywania zawartości kolagenu</td></tr></tbody></table>

osadzanie kolagenu warstwa po warstwie w urządzeniach mikroprzepływowych do stabilizacji mikrotkanek

Layer-by-layer Collagen Deposition in Microfluidic Devices for Microtissue Stabilization

Chociaż mikrofluidyka zapewnia znakomitą kontrolę mikrośrodowiska komórkowego, hodowla komórek w urządzeniach mikroprzepływowych może być challenging. 3D hodowla komórek w żelach kolagenowych typu I pomaga ustabilizować morfologię i funkcję komórki, co jest niezbędne do tworzenia mikroprzepływowych modeli tkanek w mikrourządzeniach. Przełożenie tradycyjnych technik hodowli 3D na płytki do hodowli tkankowych na urządzenia mikroprzepływowe jest często trudne ze względu na ograniczone wymiary kanału. W tej metodzie opisujemy technikę modyfikacji natywnego kolagenu typu I w celu wygenerowania polikationowych i polianionowych roztworów kolagenu, które można stosować z osadzaniem warstwa po warstwie w celu stworzenia ultracienkich zespołów kolagenowych na komórkach hodowanych w urządzeniach mikroprzepływowych. Te cienkie warstwy kolagenu stabilizują morfologię i funkcję komórki, jak pokazano na przykładzie hepatocytów pierwotnych, co pozwala na długotrwałą hodowlę mikrotkanek w urządzeniach mikroprzepływowych.

Naturalny kolagen można modyfikować poprzez metylację i succynylację, aby stworzyć polikationowe i polianionowe roztwory kolagenu do zastosowania w osadzaniu warstwa po warstwie. Succynylacja modyfikuje grupy ε-aminowe naturalnego kolagenu grupami succynylowymi, a metylacja modyfikuje grupy karboksylowe naturalnego kolagenu grupą metylową (Rycina 1A). Modyfikacje te w łańcuchach bocznych aminokwasów białka kolagenu zmieniają krzywe miareczkowania pH roztworów. Succynylacja zmniejsza liczbę grup aminowych...

Tworzenie funkcjonalnych mikrotkanek w urządzeniach mikroprzepływowych wymaga stabilizacji fenotypów komórek poprzez dostosowanie tradycyjnych technik hodowli komórkowych do ograniczonych wymiarów przestrzennych w mikrourządzeniach. Modyfikacja kolagenu umożliwia osadzanie się warstwa po warstwie ultracienkich zespołów kolagenowych, które mogą stabilizować komórki pierwotne, takie jak hepatocyty, jako mikroprzepływowe modele tkankowe.

Osadzanie kolagenu warstwa po warstwie w urządzeniach mikroprzepływowych do stabilizacji mikrotkanek

Although microfluidics provides exquisite control of the cellular microenvironment, culturing cells within microfluidic devices can be challenging. 3D ...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest osadzenie cienkiej warstwy kolagenu na komórkach w urządzeniu mikrofluidycznym. Osiąga się to najpierw poprzez modyfikację zakwaszonego kolagenu natywnego za pomocą metylacji w celu utworzenia cząsteczek kolagenu o dodatnim ładunku całkowitym. Drugim krokiem jest modyfikacja zakwaszonego kolagenu natywnego poprzez ation w celu utworzenia cząsteczek kolagenu o ujemnym ładunku całkowitym.Następnie przygotowuje się urządzenia mikrofluidyczne i zasiewa je hepatocytami, którym pozwala się przytwierdzić i rozprzestrzenić przez noc. Ostatnim krokiem jest osadzenie kompleksu kolagenowego poprzez naprzemienne narażanie komórek na dodatnio i ujemnie naładowane roztwory kolagenu w celu utworzenia 10 warstw kolagenu na powierzchni warstwy komórkowej. W końcowej fazie wykorzystuje się mikroskopię fazową i immunofluorescencyjną oraz testy na albuminę i mocznik, aby wykazać rozwój i utrzymanie polarności komórek oraz funkcji wydzielniczej.Głównymi zaletami tej techniki są możliwość hodowli hepatocytów w urządzeniach mikrofluidycznych przy użyciu metod podobnych do tych stosowanych w hodowlach na płytkach od ponad 20 lat, brak konieczności projektowania złożonych urządzeń oraz bardzo cienka warstwa osadzonej macierzy, rzędu 100 nanometrów. Pomysł na tę metodę pojawił się podczas burzy mózgów na temat tego, jak przenieść techniki hodowli komórek class Capy z płytek do urządzeń mikrofluidycznych.Metoda kanapki kolagenowej sprawdza się w otwartych systemach mikroskopowych, jednak stosowane hydrożele są niekompatybilne z zamkniętymi urządzeniami mikroprzepływowymi o ograniczonej wysokości kanałów. Rozcieńcz 100 mg natywnego zakwaszonego roztworu kolagenu do stężenia 0,5 mg/mL za pomocą lodowatej, sterylnej wody i umieść roztwór w lodzie, aby zapobiec żelowaniu. Następnie dostosuj pH roztworu kolagenu do wartości między 9 a 10, dodając kilka kropli 1 N wodorotlenku sodu, i delikatnie mieszaj roztwór w temperaturze pokojowej przez 30 minut.W miarę wytrącania się kolagenu roztwór zacznie mętnieć; należy odwirować roztwór z wytrąconym kolagenem z prędkością 3000 ×g przez 25 minut. Następnie na dnie probówek powinien być widoczny przejrzysty, żelopodobny osad; należy odessać nadsącz, a następnie resuspender wytrącony kolagen w 200 ml metanolu z 0,1 N kwasem solnym. Należy pozwolić na zajście reakcji metylacji podczas mieszania w temperaturze pokojowej przez cztery dni. Po metylacji roztwór należy odwirować z prędkością 3000 ×g przez 25 minut, aby uzyskać pellet metylowanego kolagenu, a następnie odessać i zutylizować zakwaszony nadsącz metanolowy. Następnie metylowany kolagen należy rozpuścić w 25 ml sterylnego PBS i przefiltrować roztwór przez sito komórkowe o oczkach 60 µm.Dostosować pH roztworu do poziomu 7,3–7,4, dodając 20 µL 1 N wodorotlenku sodu w kolejnych krokach. Określić stężenie roztworu kolagenu za pomocą komercyjnego zestawu ELISA do kolagenu szczurzego lub zestawu do oznaczania hydroksyproliny. Następnie rozcieńczyć roztwór do stężenia 3 mg/mL w sterylnym PBS.Zsterylizuj roztwór kolagenu zmetylowanego, przenosząc go do szklanej butelki z nakrętką. Ostrożnie wlej 3 ml chloroformu, tworząc warstwę na dnie butelki, a następnie pozostaw butelkę na noc w temperaturze 4 °C. Następnego ranka.W warunkach aseptycznych usuń górną warstwę kolagenu zmetylowanego. Przechowuj kolagen zmetylowany w temperaturze czterech stopni Celsjusza i wykorzystaj go w ciągu jednego miesiąca. Kolejne 100 mg roztworu natywnego kolagenu zakwaszonego rozcieńcz do stężenia 0,5 mg/mL lodowatą, sterylną wodą i umieść roztwór w lodzie, aby zapobiec dation, zgodnie z wcześniejszymi instrukcjami; dostosuj pH roztworu kolagenu za pomocą wodorotlenku sodu i mieszaj roztwór w temperaturze pokojowej, aby wytrącić kolagen.Następnie rozpuść 40 mg bezwodnika cynukonowego w 10 ml acetonu. Powoli dodawaj tę mieszaninę w przyrostach 0,5 ml do roztworu kolagenu, mieszając i stale monitorując pH roztworu. Utrzymuj pH powyżej 9,0, dodając jedną lub dwie krople 1 N wodorotlenku sodu, gdy pH zbliża się do 9,0; kontynuuj mieszanie w temperaturze pokojowej przez 120 minut.Po dodaniu wszystkich sześciu porcji roztworu cyjanku i wodorku, należy zaobserwować, że mieszanina staje się klarowna w miarę rozpuszczania się kolagenu bursztynianowego; należy kontynuować okresowe sprawdzanie pH, aby upewnić się, że pozostaje ono powyżej 9,0. Gdy cały kolagen bursztynianowy się rozpuści, należy dostosować pH roztworu do wartości 4,0, dodając kwas solny o stężeniu 1 N w przyrostach 20 µL. Należy zaobserwować, że roztwór ponownie staje się mętny w wyniku wytrącania się kolagenu bursztynianowego.Następnie odwiruj roztwór z prędkością 3000 ×g przez 25 minut. Aby wytrącić kolagen bursztynianowy w formie osadu i usunąć zakwaszony nadsącz z nieprzereagowanym bezwodnikiem bursztynianowym, rozpuść kolagen bursztynianowy poprzez wielokrotne pipetowanie w 25 ml sterylnego PBS, aby uzyskać końcowe stężenie około 3 mg/ml. Następnie przefiltruj roztwór przez sito komórkowe o oczkach 60 µm, a potem dostosuj pH roztworu do wartości między 7,3 a 7,4.Stosując przyrosty 20 µL roztworu wodorotlenku sodu o standardowym stężeniu, określ stężenie roztworu za pomocą komercyjnego zestawu ELISA do kolagenu szczurzego lub zestawu do oznaczania hydroksyproliny. Następnie rozcieńcz roztwór do stężenia 3 mg/mL. Używając sterylnego PBS, wysterylizuj ten roztwór kolagenu w ten sam sposób, co roztwór kolagenu zmetylowanego.Pracę rozpoczynamy od wykonania urządzenia mikrofluidycznego przy użyciu standardowej techniki, które posiada komory do hodowli komórek z kanałami o wysokości 100 mikronów, szerokości od 0,4 do 1,5 milimetrów i długości od 1 do 10 milimetrów, przeznaczonymi do wzrostu komórek. Należy użyć oczyszczacza plazmowego do utlenienia powierzchni urządzenia oraz szkiełka przedmiotowego. Następnie należy docisnąć oba elementy do siebie, aby utworzyć wiązanie.Po wysterylizowaniu urządzenia poprzez naświetlanie promieniami UV przez co najmniej 30 minut, należy wypełnić komorę fibonektyną w sterylnym PBS w stężeniu 15 µg/mL i inkubować w temperaturze 37 °C przez 45 minut. Następnie należy zasiać w urządzeniu komórki zgodnie z opisem w towarzyszącym protokole tekstowym.W laminarnym dygestorium do hodowli tkankowych należy przygotować objętości roztworów kolagenu zmetylowanego i niezmetylowanego wystarczające do 10 aplikacji każdego z roztworów na urządzenie, a także kilka dodatkowych mililitrów pożywki. Roztwory należy przechowywać w lodzie. Należy naprzemiennie przepłukiwać urządzenia 20 µL roztworów kolagenu zmetylowanego i niezmetylowanego.Należy odczekać jedną minutę pomiędzy każdą aplikacją. Urządzenie należy przepłukać łącznie 10 razy dla każdego roztworu. Należy pracować szybko, aby zminimalizować czas, w którym komórki pozostają bez medium; podczas narastania warstw kolagenu można zaobserwować jego powolne gromadzenie się przy wlocie i wylocie urządzenia mikroprzepływowego.Jeśli opór przepływu cieczy wzrośnie, należy przepłukać urządzenie raz lub dwa razy pożywką, a następnie kontynuować nakładanie warstw. Po naniesieniu wszystkich warstw urządzenie należy dwukrotnie przepłukać świeżą pożywką i przenieść z powrotem do inkubatora. Metylacja i acetylacja zmieniają charakterystykę ładunku cząsteczek kolagenu.Acetylacja usuwa grupy naładowane dodatnio i zastępuje je grupami naładowanymi ujemnie, natomiast metylacja usuwa grupy naładowane ujemnie, tworząc cząsteczki o dodatnim ładunku netto, co umożliwia warstwową depozycję dwóch wariantów kolagenu na powierzchniach naładowanych, takich jak komórki. Pierwotne hepatocyty wysiane na szkle pokrytym fibronektyną wewnątrz urządzenia mikrofluidycznego mogą zostać pokryte w ten sposób warstwowo. Montaż macierzy kolagenowej, depozycja 10 dwuwarstw na komórkach tworzy warstwę kolagenu o grubości około 140 nanometrów hepatocytów bez górnej warstwy kolagenowej naniesionej warstwowo.Z czasem macierz traci swój zróżnicowany fenotyp, kurczy się i odrywa od powierzchni urządzeń mikrofluidycznych. W przeciwieństwie do nich, hepatocyty pokryte ultracienką strukturą kolagenową zachowują zróżnicowaną morfologię, żywotność powyżej 90% oraz polaryzację przez 14 dni. Oprócz żywotności, morfologii i polaryzacji komórek, technika warstwowego nakładania kolagenu (layer by layer) przywraca i stabilizuje również funkcje pierwotnych hepatocytów, co zostało tutaj wykazane. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać dobrą wiedzę na temat tego, jak metylować i sukcynianować kolagen w celu stworzenia roztworów kolagenowych o ładunku dodatnim i ujemnym oraz jak wykorzystać je w procesie osadzania warstwowego do tworzenia cienkich struktur kolagenowych na komórkach w urządzeniach mikrofluidycznych.

layer-layer-collagen-deposition-microfluidic-devices-for-microtissue

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioinżynieria

Opisujemy protokół wytwarzania urządzeń mikrofluidycznych, które umożliwiają wychwytywanie i hodowlę komórek. W tym podejściu wykorzystuje się ustrukturyzowane mikrostruktury, takie jak rowki wewnątrz kanałów mikrofluidycznych, aby stworzyć obszary o niskim naprężeniu ścinającym, w których komórki mogą zostać unieruchomione.

Urządzenie mikrofluidyczne z wzorami rowków do badania zachowania komórek

Tworzenie mikrotkanek przy użyciu cylindrycznych żeli kolagenowych, nazywanych modułami, które zawierają zatopione komórki, a ich powierzchnia jest pokryta komórkami śródbłonka.

Wytwarzanie mikrotkanek z wykorzystaniem modułów żelu kolagenowego zawierającego komórki

Ten system modelowy zaczyna się od wypełnionego miofibroblastami żelu fibrynowego, który może być używany do badania endogennej kolagenu (re)organizacji w czasie rzeczywistym w sposób nieniszczący. System modelowy jest bardzo przestrajalny, ponieważ może być używany z różnymi źródłami komórek, dodatkami do pożywek i może być łatwo dostosowany do konkretnych potrzeb.

Inżynieria konstruktów tkankowych na bazie fibryny z miofibroblastów oraz zastosowanie ograniczeń i szczepów do indukowania reorganizacji komórek i kolagenu

W tej pracy prezentujemy technikę szybkiego wytwarzania żywych tkanek naczyniowych poprzez bezpośrednią hodowlę kolagenu, komórek mięśni gładkich i komórek śródbłonka. Ponadto opisano nowy protokół charakterystyki mechanicznej zmodyfikowanych tkanek naczyniowych.

Inżynieria 3D cellularnych żeli kolagenowych do regeneracji tkanki naczyniowej

Prezentujemy metodę mikroprzepływowego osadzania wzorzystej genipiny i fibronektyny na podłożach PDMS, pozwalając na przedłużoną żywotność tkanek gęstych od komórek mięśni gładkich naczyń krwionośnych. Ta metoda wytwarzania tkanek jest połączona z poprzednią technologią cienkich warstw naczyń mięśniowych w celu pomiaru kurczliwości naczyń w czasie istotnym dla choroby.

Technika mikroprzepływowego osadzania genipiny do rozszerzonej hodowli cienkich warstw mięśniowych naczyń krwionośnych

Kolagen jest kluczowym składnikiem ECM i dostarcza niezbędnych wskazówek dla kilku procesów komórkowych, począwszy od migracji, a skończywszy na różnicowaniu i proliferacji. Poniżej przedstawiono protokół osadzania komórek w hydrożelach kolagenowych 3D oraz bardziej zaawansowaną technikę generowania losowych lub wyrównanych matryc kolagenowych przy użyciu mikrokanałów PDMS.

Przygotowanie żeli kolagenowych 3D i mikrokanalików do badania oddziaływań 3D in vivo

Ten manuskrypt przedstawia metodę formowania wtryskowego do inżynierii mikronaczyń, które podsumowują fizjologiczne właściwości śródbłonka. Proces oparty na mikroprzepływach tworzy opatentowane sieci naczyniowe 3D z dostosowanymi warunkami, takimi jak przepływ, skład komórkowy, geometria i gradienty biochemiczne. Opisano proces wytwarzania i przykłady potencjalnych zastosowań.

Mikrowzorowanie i montaż trójwymiarowych mikonaczyń

Ten artykuł zawiera szczegółowe metody wytwarzania i charakteryzowania pneumatycznie uruchamiającego urządzenia mikroprzepływowego do kompresji chondrocytów.

Platforma mikroprzepływowa do stymulacji chondrocytów za pomocą dynamicznej kompresji

Celem tego protokołu jest wyjaśnienie i zademonstrowanie rozwoju trójwymiarowego (3D) modelu mikroprzepływowego wysoce wyrównanej tkanki serca ludzkiego, składającej się z kardiomiocytów pochodzących z komórek macierzystych hodowanych wspólnie z fibroblastami serca (CF) w biomimetycznym hydrożelu na bazie kolagenu, do zastosowań w inżynierii tkankowej serca, badaniach przesiewowych leków i modelowaniu chorób.

Opracowywanie zorganizowanej w 3D ludzkiej tkanki serca w ramach platformy mikroprzepływowej

Ten protokół demonstruje użycie kanału mikroprzepływowego o zmieniającej się geometrii wzdłuż kierunku przepływu płynu do generowania naprężeń rozciągających (rozciągających) w celu wyrównania włókien w hydrożelu kolagenowym 3D (&lt;250 μm grubości). Wynikowe wyrównanie rozciąga się na kilka milimetrów i ma na nie wpływ szybkość odkształcania rozciągającego.

Mikroinżynieryjne hydrożele kolagenowe 3D z wyrównaniem włókien dalekiego zasięgu

W tym miejscu przedstawiamy protokół wytwarzania unikalnego dwuwarstwowego urządzenia mikroprzepływowego do badania elektromechanicznej regulacji homeostazy tkanek nabłonkowych. Urządzenie aplikuje statyczne fizjologiczne prądy elektryczne prostopadłe do płaszczyzny tkanki, wpływając na adhezję, proliferację i wytłaczanie komórki. Obrazowanie żywych komórek i pomiary naprężeń mechanicznych ujawniają mechanizmy tych procesów.

Ujawnienie elektromechanicznej kontroli homeostazy tkanek za pomocą dwuwarstwowego urządzenia mikroprzepływowego

Poznaj metodę osadzania kolagenu warstwa po warstwie w mikroprzepływowych urządzeniach do stabilizacji fenotypów komórek hepatocytów. Technika ta wykorzystuje modyfikację ładunku kolagenu.

Osadzanie kolagenu warstwa po warstwie w urządzeniach mikroprzepływowych do stabilizacji mikrotkanek

Przeglądaj więcej filmów