Osadzanie kolagenu warstwa po warstwie w urządzeniach mikroprzepływowych do stabilizacji mikrotkanek

Ogólnym celem niniejszej procedury jest osadzenie cienkiej warstwy kolagenu na komórkach w urządzeniu mikrofluidycznym. Osiąga się to najpierw poprzez modyfikację zakwaszonego kolagenu natywnego za pomocą metylacji w celu utworzenia cząsteczek kolagenu o dodatnim ładunku całkowitym. Drugim krokiem jest modyfikacja zakwaszonego kolagenu natywnego poprzez ation w celu utworzenia cząsteczek kolagenu o ujemnym ładunku całkowitym.

Następnie przygotowuje się urządzenia mikrofluidyczne i zasiewa je hepatocytami, którym pozwala się przytwierdzić i rozprzestrzenić przez noc. Ostatnim krokiem jest osadzenie kompleksu kolagenowego poprzez naprzemienne narażanie komórek na dodatnio i ujemnie naładowane roztwory kolagenu w celu utworzenia 10 warstw kolagenu na powierzchni warstwy komórkowej. W końcowej fazie wykorzystuje się mikroskopię fazową i immunofluorescencyjną oraz testy na albuminę i mocznik, aby wykazać rozwój i utrzymanie polarności komórek oraz funkcji wydzielniczej.

Głównymi zaletami tej techniki są możliwość hodowli hepatocytów w urządzeniach mikrofluidycznych przy użyciu metod podobnych do tych stosowanych w hodowlach na płytkach od ponad 20 lat, brak konieczności projektowania złożonych urządzeń oraz bardzo cienka warstwa osadzonej macierzy, rzędu 100 nanometrów. Pomysł na tę metodę pojawił się podczas burzy mózgów na temat tego, jak przenieść techniki hodowli komórek class Capy z płytek do urządzeń mikrofluidycznych.

Metoda kanapki kolagenowej sprawdza się w otwartych systemach mikroskopowych, jednak stosowane hydrożele są niekompatybilne z zamkniętymi urządzeniami mikroprzepływowymi o ograniczonej wysokości kanałów. Rozcieńcz 100 mg natywnego zakwaszonego roztworu kolagenu do stężenia 0,5 mg/mL za pomocą lodowatej, sterylnej wody i umieść roztwór w lodzie, aby zapobiec żelowaniu. Następnie dostosuj pH roztworu kolagenu do wartości między 9 a 10, dodając kilka kropli 1 N wodorotlenku sodu, i delikatnie mieszaj roztwór w temperaturze pokojowej przez 30 minut.

W miarę wytrącania się kolagenu roztwór zacznie mętnieć; należy odwirować roztwór z wytrąconym kolagenem z prędkością 3000 ×g przez 25 minut. Następnie na dnie probówek powinien być widoczny przejrzysty, żelopodobny osad; należy odessać nadsącz, a następnie resuspender wytrącony kolagen w 200 ml metanolu z 0,1 N kwasem solnym. Należy pozwolić na zajście reakcji metylacji podczas mieszania w temperaturze pokojowej przez cztery dni. Po metylacji roztwór należy odwirować z prędkością 3000 ×g przez 25 minut, aby uzyskać pellet metylowanego kolagenu, a następnie odessać i zutylizować zakwaszony nadsącz metanolowy. Następnie metylowany kolagen należy rozpuścić w 25 ml sterylnego PBS i przefiltrować roztwór przez sito komórkowe o oczkach 60 µm.

Dostosować pH roztworu do poziomu 7,3–7,4, dodając 20 µL 1 N wodorotlenku sodu w kolejnych krokach. Określić stężenie roztworu kolagenu za pomocą komercyjnego zestawu ELISA do kolagenu szczurzego lub zestawu do oznaczania hydroksyproliny. Następnie rozcieńczyć roztwór do stężenia 3 mg/mL w sterylnym PBS.

Zsterylizuj roztwór kolagenu zmetylowanego, przenosząc go do szklanej butelki z nakrętką. Ostrożnie wlej 3 ml chloroformu, tworząc warstwę na dnie butelki, a następnie pozostaw butelkę na noc w temperaturze 4 °C. Następnego ranka.

W warunkach aseptycznych usuń górną warstwę kolagenu zmetylowanego. Przechowuj kolagen zmetylowany w temperaturze czterech stopni Celsjusza i wykorzystaj go w ciągu jednego miesiąca. Kolejne 100 mg roztworu natywnego kolagenu zakwaszonego rozcieńcz do stężenia 0,5 mg/mL lodowatą, sterylną wodą i umieść roztwór w lodzie, aby zapobiec dation, zgodnie z wcześniejszymi instrukcjami; dostosuj pH roztworu kolagenu za pomocą wodorotlenku sodu i mieszaj roztwór w temperaturze pokojowej, aby wytrącić kolagen.

Następnie rozpuść 40 mg bezwodnika cynukonowego w 10 ml acetonu. Powoli dodawaj tę mieszaninę w przyrostach 0,5 ml do roztworu kolagenu, mieszając i stale monitorując pH roztworu. Utrzymuj pH powyżej 9,0, dodając jedną lub dwie krople 1 N wodorotlenku sodu, gdy pH zbliża się do 9,0; kontynuuj mieszanie w temperaturze pokojowej przez 120 minut.

Po dodaniu wszystkich sześciu porcji roztworu cyjanku i wodorku, należy zaobserwować, że mieszanina staje się klarowna w miarę rozpuszczania się kolagenu bursztynianowego; należy kontynuować okresowe sprawdzanie pH, aby upewnić się, że pozostaje ono powyżej 9,0. Gdy cały kolagen bursztynianowy się rozpuści, należy dostosować pH roztworu do wartości 4,0, dodając kwas solny o stężeniu 1 N w przyrostach 20 µL. Należy zaobserwować, że roztwór ponownie staje się mętny w wyniku wytrącania się kolagenu bursztynianowego.

Następnie odwiruj roztwór z prędkością 3000 ×g przez 25 minut. Aby wytrącić kolagen bursztynianowy w formie osadu i usunąć zakwaszony nadsącz z nieprzereagowanym bezwodnikiem bursztynianowym, rozpuść kolagen bursztynianowy poprzez wielokrotne pipetowanie w 25 ml sterylnego PBS, aby uzyskać końcowe stężenie około 3 mg/ml. Następnie przefiltruj roztwór przez sito komórkowe o oczkach 60 µm, a potem dostosuj pH roztworu do wartości między 7,3 a 7,4.

Stosując przyrosty 20 µL roztworu wodorotlenku sodu o standardowym stężeniu, określ stężenie roztworu za pomocą komercyjnego zestawu ELISA do kolagenu szczurzego lub zestawu do oznaczania hydroksyproliny. Następnie rozcieńcz roztwór do stężenia 3 mg/mL. Używając sterylnego PBS, wysterylizuj ten roztwór kolagenu w ten sam sposób, co roztwór kolagenu zmetylowanego.

Pracę rozpoczynamy od wykonania urządzenia mikrofluidycznego przy użyciu standardowej techniki, które posiada komory do hodowli komórek z kanałami o wysokości 100 mikronów, szerokości od 0,4 do 1,5 milimetrów i długości od 1 do 10 milimetrów, przeznaczonymi do wzrostu komórek. Należy użyć oczyszczacza plazmowego do utlenienia powierzchni urządzenia oraz szkiełka przedmiotowego. Następnie należy docisnąć oba elementy do siebie, aby utworzyć wiązanie.

Po wysterylizowaniu urządzenia poprzez naświetlanie promieniami UV przez co najmniej 30 minut, należy wypełnić komorę fibonektyną w sterylnym PBS w stężeniu 15 µg/mL i inkubować w temperaturze 37 °C przez 45 minut. Następnie należy zasiać w urządzeniu komórki zgodnie z opisem w towarzyszącym protokole tekstowym.

W laminarnym dygestorium do hodowli tkankowych należy przygotować objętości roztworów kolagenu zmetylowanego i niezmetylowanego wystarczające do 10 aplikacji każdego z roztworów na urządzenie, a także kilka dodatkowych mililitrów pożywki. Roztwory należy przechowywać w lodzie. Należy naprzemiennie przepłukiwać urządzenia 20 µL roztworów kolagenu zmetylowanego i niezmetylowanego.

Należy odczekać jedną minutę pomiędzy każdą aplikacją. Urządzenie należy przepłukać łącznie 10 razy dla każdego roztworu. Należy pracować szybko, aby zminimalizować czas, w którym komórki pozostają bez medium; podczas narastania warstw kolagenu można zaobserwować jego powolne gromadzenie się przy wlocie i wylocie urządzenia mikroprzepływowego.

Jeśli opór przepływu cieczy wzrośnie, należy przepłukać urządzenie raz lub dwa razy pożywką, a następnie kontynuować nakładanie warstw. Po naniesieniu wszystkich warstw urządzenie należy dwukrotnie przepłukać świeżą pożywką i przenieść z powrotem do inkubatora. Metylacja i acetylacja zmieniają charakterystykę ładunku cząsteczek kolagenu.

Acetylacja usuwa grupy naładowane dodatnio i zastępuje je grupami naładowanymi ujemnie, natomiast metylacja usuwa grupy naładowane ujemnie, tworząc cząsteczki o dodatnim ładunku netto, co umożliwia warstwową depozycję dwóch wariantów kolagenu na powierzchniach naładowanych, takich jak komórki. Pierwotne hepatocyty wysiane na szkle pokrytym fibronektyną wewnątrz urządzenia mikrofluidycznego mogą zostać pokryte w ten sposób warstwowo. Montaż macierzy kolagenowej, depozycja 10 dwuwarstw na komórkach tworzy warstwę kolagenu o grubości około 140 nanometrów hepatocytów bez górnej warstwy kolagenowej naniesionej warstwowo.

Z czasem macierz traci swój zróżnicowany fenotyp, kurczy się i odrywa od powierzchni urządzeń mikrofluidycznych. W przeciwieństwie do nich, hepatocyty pokryte ultracienką strukturą kolagenową zachowują zróżnicowaną morfologię, żywotność powyżej 90% oraz polaryzację przez 14 dni. Oprócz żywotności, morfologii i polaryzacji komórek, technika warstwowego nakładania kolagenu (layer by layer) przywraca i stabilizuje również funkcje pierwotnych hepatocytów, co zostało tutaj wykazane. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać dobrą wiedzę na temat tego, jak metylować i sukcynianować kolagen w celu stworzenia roztworów kolagenowych o ładunku dodatnim i ujemnym oraz jak wykorzystać je w procesie osadzania warstwowego do tworzenia cienkich struktur kolagenowych na komórkach w urządzeniach mikrofluidycznych.