Stałe nanocząstki lipidowe (SLN) do zastosowań wewnątrzkomórkowych

Ogólnym celem niniejszej procedury jest synteza ultra małych populacji biokompatybilnych nanocząsteczek, charakterystyka ich właściwości fizycznych oraz zbadanie oddziaływań między cząsteczkami a komórkami. Osiąga się to poprzez zastosowanie w pierwszej kolejności metody temperatury inwersji fazowej w celu syntezy lipidowych nanocząsteczek. W trakcie tego procesu lipid i surfaktant są wstępnie współtopione.

Po dodaniu określonej ilości wody mieszaninę podgrzewa się aż do momentu rozdzielenia faz. Następnie mieszaninę miesza się w sposób ciągły do czasu utworzenia nanoemulsji i zakończenia syntezy stałych nanocząsteczek lipidowych (sln). W kolejnym kroku wykorzystuje się dynamiczne rozpraszanie światła (DLS) do pomiaru wielkości cząstek oraz polidyspersyjności.

Różnicowa kalorymetria skaningowa (DSC) to dodatkowa technika stosowana do wyznaczania temperatury topnienia oraz ciepła utajonego topnienia w celu dalszej charakterystyki cząstek; ostatecznie do badania oddziaływań między cząstkami a komórkami można wykorzystać mikroskopię fluorescencyjną oraz cytometrię przepływową. Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami wysokoenergetycznymi, takimi jak sonikacja, mikrofluidyka i homogenizacja wysokociśnieniowa, jest to, że jest to stosunkowo łagodna technika syntezy, która jest jednocześnie prosta i skalowalna. Aby zsyntetyzować LNS, należy połączyć 0,6 mg barwnika fluorescencyjnego lub innego związku lipofilowego oraz 0,10 g liniowego alkanu lub lipidu.

W fiolce o pojemności 15 ml należy stopić składniki w temperaturze 90 °C i wymieszać, a następnie dodać 0,11 g liniowego surfaktantu niejonowego. Następnie powstałą mieszaninę należy stopić w temperaturze 90 °C i wymieszać. W kolejnym kroku do mieszaniny dodaje się 1,79 g sterylnej wody, podgrzewa do 90 °C i monitoruje wizualnie roztwór, aż do zaobserwowania dwóch faz.

Następnie mieszaj mieszaninę do momentu utworzenia się przezroczystej nanoemulsji. Równolegle przygotuj osobną nanoemulsję bez dodatku barwnika fluorescencyjnego, która będzie służyć jako próbka kontrolna. Następnie wysterylizuj każdą nanoemulsję, używając sterylnego filtra 0.2 mikrona.

Należy zastosować DLS do pomiaru wielkości cząstek i polidyspersyjności S lns za pomocą kuwety szklanej w urządzeniu przeznaczonym do pomiaru wielkości cząstek. Przed pomiarem próbek należy zmierzyć wielkość cząstek dwóch znanych wzorców, postępując zgodnie z protokołem producenta dotyczącym przygotowania i pomiaru wzorców. Następnie należy zmierzyć każdą z przygotowanych próbek. Należy ustawić czas pomiaru na 100 seconds, współczynnik załamania światła wody oraz lepkość wody w temperaturze 20 °C.

Należy określić średnicę cząstek oraz indeks polidyspersyjności rozkładu wielkości cząstek. Aby zbadać zachowanie termiczne S lns za pomocą DSC, najpierw należy pipetować S LNS do aluminiowego tygla o pojemności 40 µL, przyjmując masę około 25 mg. Tygiel należy zamknąć hermetycznie za pomocą uniwersalnej praski zaciskowej, aby zminimalizować utratę wilgoci podczas pomiaru DSC. Przed pomiarem każdej nanoemulsji w zakresie od 5 do 80 °C, należy odczytać z wykresu DSC temperaturę topnienia oraz utajone ciepło topnienia, gdzie minimum odpowiada temperaturze topnienia, a całka z pola pod krzywą reprezentuje ciepło topnienia.

Na wykresie DSC wartość podzielona przez ilość materiału reprezentuje ciepło utajone topnienia kultury. Pierwotne ludzkie fibroblasty, zgodnie z instrukcjami producenta, w medium płynnym do hodowli ludzkich fibroblastów skóry. Uzupełnione zestawem suplementów wzrostowych z niską zawartością surowicy, utrzymuj komórki w atmosferze z dodatkiem wilgoci w temperaturze 37°C, 5% CO2 i pasażuj po osiągnięciu 80% konfluencji; dla analizy MTT oraz obrazowania wysiej komórki.

W płytce 96-dołkowej przy gęstości 20 000 komórek na dołek. Pozostawić komórki do równowagi w temperaturze 37 °C przez noc; przed ekspozycją na SLN w czasie zero rozcieńczyć SLN w pożywce kompletnej, aby uzyskać pożądane stężenie lipidów, i dodać 10 µL na dołek do każdego powtórzenia w płytce 96-dołkowej. Po 24 godzinach inkubacji z SLN określić żywotność komórek za pomocą testu MTT zgodnie z protokołem producenta. Przemyć komórki raz i dodać 100 µL świeżej pożywki do każdego dołka.

Do uśmiercenia komórek w studzienkach kontrolnych należy zastosować inkubację w 70% roztworze metanolu przez 10 minut, a następnie zastąpić go świeżą pożywką. Do każdej studzienki mikropłytki należy dodać odczynnik MTT w ilości 10 µL na studzienkę i inkubować przez noc w temperaturze 37 °C. Po inkubacji nocnej formę wewnątrzkomórkową oraz kryształy należy rozpuścić za pomocą 100 µL dostarczonego roztworu detergentu. Zgodnie z protokołem producenta, komórki w roztworze detergentu należy inkubować przez trzy godziny w temperaturze pokojowej przed pomiarem wartości absorbancji.

Wykorzystanie czytnika mikropłytek w celu przygotowania do mikroskopii. Przemyć fibroblasty dwukrotnie sterylnym roztworem soli fosforanowej. Utrwalić komórki przez 10 minut w zimnym, 70%metanolu w określonych punktach czasowych po podaniu lns fibroblastom.

Po 10 minutach należy zastąpić metanol fosforanowym buforem solnym (PBS) przed wykonaniem zdjęć za pomocą mikroskopu odwróconego. Zsyntetyzowane S SLN w postaci kontrolnych S LNS charakteryzowały się średnicą cząstek wynoszącą 18,59 nm oraz polidyspersyjnością 5,83, natomiast SLM załadowane Nile red miały średnicę cząstek 16,87 nm i polidyspersyjność 4,47, co określono za pomocą testu MTT. Zmierzono efekt zależności odpowiedzi od dawki w odniesieniu do metabolizmu komórkowego, gdzie zwiększenie stężenia cząstek prowadziło do spadku żywotności komórek.

Nie zaobserwowano różnic w toksyczności pomiędzy komórkami eksponowanymi na same SLN a komórkami eksponowanymi na SLN obciążone Nile red. Równolegle sprawdzano wizualnie przyleganie komórek do polistyrenowego podłoża hodowli tkankowej. Wykonano zdjęcia obrazujące reprezentatywną morfologię komórkową oraz pobieranie fluorescencyjnych cząstek w czasie, stosując dawkę równą 5 µg/mL.

Wchłanianie cząsteczek lipidowych zaobserwowano do dwóch godzin po ekspozycji. Poziom inkorporacji nanocząsteczek określono poprzez pomiar intensywności fluorescencji Nile red w komórkach dendrytycznych pochodzących ze szpiku kostnego myszy (B MDCs) za pomocą cytometrii przepływowej. Zaobserwowano bezpośrednią korelację między stężeniem użytych SNS a poziomem fluorescencji ocenianym w B MDCs.

Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać gruntowną wiedzę na temat syntezy ultramałych populacji biokompatybilnych nanocząsteczek, charakteryzacji ich właściwości fizycznych oraz badania oddziaływań między cząsteczkami a komórkami.