Name: Stałe nanocząstki lipidowe (SLN) do zastosowań wewnątrzkomórkowych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-11-17T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 19 s
Description: Poznaj metodę syntezy biokompatybilnych nanocząstek lipidowych metodą inwersji temperaturowej fazy. Naucz się charakteryzować ich właściwości fizyczne i badać interakcje z komórkami in vitro.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Badania opisane w tej publikacji były wspierane przez Dział Badań i Rozwoju Badawczego Laboratorium Fizyki Stosowanej Johns Hopkins, Biuro Transferu Technologii oraz Program Stypendialny Stuarta S. Janneya, a także Narodowy Instytut Serca, Płuc i Krwi Narodowych Instytutów Zdrowia w ramach Nagrody Numer R21HL127355.

1. Przetwarzanie SLN
<ol>
	<li>Synteza SLN 
	Uwaga: Do przygotowania SLN o rozmiarze poniżej 20 nm należy zastosować metodę PIT 1,17,20 1.
	<ol>
		<li>Należy stosować technikę aseptyczną, bioreagenty lub odczynniki klasy do hodowli komórkowych oraz materiały sterylne (np. pipety, szpachelki, fiolki itp.).</li>
		<li>Do syntezy SLN należy użyć komory z laminarnym przepływem powietrza (Rycina 2).</li>
		<li>Do fiolki (15 ml) należy wprowadzić 0,6 mg barwnika fluorescencyjnego (Nile Red (NiR), stężenie NiR wynosi około 0,3 mg/ml) oraz 0,10 g heneikosanu (lipid, stężenie lipidów 5% masowych) i poddać wspólnemu topnieniu w temperaturze 90 °C przy mieszaniu.</li>
		<li>Należy dodać 0,11 g polioksyetylenowego (10) oleylu eteru (surfaktant, stężenie surfaktanta 5,5% masowych). Powstałą mieszaninę należy poddać wspólnemu topnieniu w temperaturze 90 °C przy mieszaniu.</li>
		<li>Do mieszaniny należy dodać 1,79 g sterylnej wody, podgrzać do 90 °C i mieszać do czasu utworzenia przezroczystej nanoemulsji. 
		Uwaga: Pod wpływem ciągłego mieszania i kontrolowanego chłodzenia powstają SLN. Warunki te powodują inwersję emulsji woda-w-oleju na emulsję olej-w-wodzie. Cząsteczki lipofilowe, takie jak NiR, przenikają do kropli lipidowych.</li>
		<li>Równolegle należy przygotować nanoemulsję bez dodatku barwnika fluorescencyjnego, która będzie służyć jako próbka kontrolna. Do fiolki (15 ml) należy wprowadzić 0,10 g heneikosanu i 0,11 g polioksyetylenowego (10) oleylu eteru, poddać wspólnemu topnieniu w temperaturze 90 °C i mieszać.
		<ol>
			<li>Do mieszaniny należy dodać 1,79 g sterylnej wody, podgrzać do 90 °C i mieszać do czasu utworzenia przezroczystej nanoemulsji.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Każdą nanoemulsję należy dodatkowo wysterylizować za pomocą sterylnego filtra 0,2 µm.</li>
	</ol>
	<img alt="Schemat nanoemulsji z układem grzewczym i mieszającym dla procesu formulacji oraz inwersji faz." src="/files/ftp_upload/53102/53102fig2.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 2"> 
	Rycina 2. Schemat syntezy SLN. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53102/53102fig2large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a></li>
	<li>Rozmiar cząstek i polidyspersyjność
	<ol>
		<li>Do pomiaru rozmiaru cząstek i polidyspersyjności SLN 1 należy użyć dynamicznego rozpraszania światła (DLS), wykorzystując kuwetę szklaną oraz przyrząd przeznaczony do pomiaru rozmiaru cząstek.</li>
		<li>Przed pomiarem próbek należy zmierzyć rozmiar cząstek dwóch znanych standardów, postępując zgodnie z protokołem producenta dotyczącym przygotowania i pomiaru standardów.</li>
		<li>Kuwetę szklaną należy napełnić 1,5 ml roztworu standardowego i przeprowadzić pomiar roztworu standardowego w tych samych warunkach pomiarowych co w przypadku próbek. 
		Uwaga: Powyższy krok powtórzono dla każdego standardu.</li>
		<li>Przygotowane próbki należy zmierzyć, stosując następujące parametry eksperymentalne: czas pomiaru 100 s, współczynnik załamania światła wody (1,33), lepkość wody w temperaturze 20 °C (1,002 mPa·sec). 
		Uwaga: Technika ta wykorzystuje światło o przesuniętej częstotliwości do pomiaru rozmiaru nanocząstek.</li>
		<li>Należy podać średnicę cząstek oraz polidyspersyjność rozkładu rozmiarów cząstek.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Temperatura topnienia i utajone ciepło topnienia
	<ol>
		<li>Do zbadania właściwości termicznych SLN 1 należy użyć różnicowego kalorymetru skaningowego (DSC) wyposażonego w autoprobnik i źródło chłodzenia ciekłym azotem.</li>
		<li>Przygotowane SLN należy pipetować do aluminiowego tygla o pojemności 40 µl i masie około 25 mg, a następnie szczelnie zamknąć tygiel za pomocą uniwersalnej praski zaciskowej, aby zminimalizować utratę wilgoci podczas skanowania DSC.</li>
		<li>Każdą nanoemulsję należy mierzyć w zakresie od 5 do 80 °C.</li>
		<li>Na podstawie wykresu DSC należy określić temperaturę topnienia oraz utajone ciepło topnienia, gdzie dolina reprezentuje temperaturę topnienia, a całka z powierzchni pod krzywą na wykresie DSC podzielona przez ilość materiału reprezentuje utajone ciepło topnienia.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Interakcja SLN z fibroblastami i komórkami dendrytycznymi
<ol>
	<li>Hodowla pierwotnych ludzkich fibroblastów
	<ol>
		<li>Hodować pierwotne ludzkie fibroblasty zgodnie z instrukcjami producenta w płynnym medium do hodowli ludzkich fibroblastów skóry (medium 106), uzupełnionym zestawem suplementu wzrostowego z niską zawartością surowicy (LSGS). Komórki utrzymywać w atmosferze wilgotnej w temperaturze 37 °C, 5% CO2 i pasażować po osiągnięciu 80% konfluencji.</li>
		<li>Do analizy MTT oraz obrazowania wysiać komórki na płytkę 96-dołkową w zagęszczeniu 2 x 104 komórek na dołek i pozostawić do równowagi w temperaturze 37 °C przez noc (O/N) przed ekspozycją na SLN.</li>
		<li>W punkcie czasowym zero rozcieńczyć SLN w medium kompletnym zgodnie ze wskazaniami (Rysunek 4), z uwzględnieniem stężenia lipidów, i dodać 10 μl na dołek do każdego powtórzenia w płytce 96-dołkowej.</li>
		<li>Komórki utrzymywać w temperaturze 37 °C, 5% CO2 podczas okresu inkubacji.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Test toksyczności MTT
	<ol>
		<li>Po 24 h inkubacji z SLN określić żywotność komórek za pomocą testu MTT, zgodnie z protokołem producenta.</li>
		<li>Przemyć komórki raz i dodać do każdego dołka świeże medium (100 μl/dołek). Dołki kontrolne z komórkami martwymi przygotować poprzez inkubację w 70% roztworze metanolu przez 10 min, a następnie zastąpić go świeżym medium.</li>
		<li>Dodać odczynnik MTT (10 μl na dołek) do każdego dołka mikropłytki i inkubować przez noc (O/N) w temperaturze 37 °C.</li>
		<li>Po inkubacji przez noc rozpuścić wewnątrzkomórkowe kryształy formazanu za pomocą dostarczonego roztworu detergentu (100 μl na dołek) zgodnie z protokołem producenta.</li>
		<li>Po 3 h inkubacji w temperaturze pokojowej (RT) zmierzyć wartości absorbancji przy długości fali 570 nm za pomocą czytnika mikropłytek. 
		Uwaga: stosowany odczynnik MTT powinien zawierać mniej niż 1% (w/v) bromku 3-(4,5-dimetyltiazolyl-2)-2,5-difenylotetrazoliowego.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Mikroskopia fluorescencyjna
	<ol>
		<li>W określonych punktach czasowych po podaniu SLN fibroblastom, przemyć fibroblasty dwukrotnie sterylnym roztworem soli fizjologicznej z buforem fosforanowym (PBS) i utrwalić przez 10 min w zimnym 70% metanolu.</li>
		<li>Po 10 min zastąpić metanol roztworem PBS i wykonać zdjęcia przy użyciu mikroskopu odwróconego, stosując zestaw filtrów przepustowych (BP) 690/50 nm.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Hodowla komórek dendrytycznych szpiku kostnego myszy
	<ol>
		<li>Indukować komórki dendrytyczne pochodzące z szpiku kostnego myszy (BMDC) zgodnie z wcześniejszym opisem 23,24. W skrócie: zawiesiny pojedynczych komórek szpiku kostnego C57BL/10 wysiać na szalki Petriego 100 mm w zagęszczeniu 2 x 106/szalkę z rekombinowanym mysim czynnikiem stymulującym kolonie granulocytów i makrofagów (GM-CSF, 300 U/ml) oraz rekombinowaną mysią IL-4 (czynnik stymulujący komórki B, 200 U/ml). Wymieniać medium co 3 dni.</li>
		<li>W 7. dniu dodać do szalek SLN obciążone NiR w końcowym stężeniu 0,5 i 5,0 µg/ml lipidów i utrzymywać komórki w inkubatorze w temperaturze 37 °C, 5% CO2 przez pożądany czas ekspozycji.</li>
		<li>Zebrać komórki z szalek poprzez odessanie całego medium do probówki 50 ml, a następnie dokładnie przemyć szalkę (aby odczepić słabo przylegające komórki) 5 ml buforu fosforanowego (PBS) zawierającego 4 mM kwas etylendiaminotetraoctowy (EDTA). Otrzymaną zawiesinę komórkową zebrać do tej samej probówki 50 ml.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Ocena wbudowania SLN za pomocą cytometrii przepływowej
	<ol>
		<li>Określić stężenie zawiesiny komórkowej uzyskanej w punkcie 2.4.3 i przenieść 3x105 komórek do probówki FACS o dnie okrągłym 12 mm x 75 mm.</li>
		<li>Przemyć komórki, dodając 1 ml PBS, a następnie wirować probówki przez 5 min przy 400 x g w temperaturze 4 °C.</li>
		<li>Odlać nadsącz i resuspendować osad w 100 µl PBS/2 mM EDTA/0,1% albuminy surowicy bydlęcej (BSA) (bufor barwiący) zawierającego przeciwciało monoklonalne anty-CD11c-FITC (stężenie końcowe 0,25 μg/ml). Inkubować przez 30 min na lodzie w ciemności.</li>
		<li>Przemyć komórki 1 ml PBS, a następnie wirować probówki przez 5 min przy 400 x g w temperaturze 4 °C.</li>
		<li>Odlać nadsącz i resuspendować każdy osad w 400 µl buforu barwiącego. Komórki są teraz gotowe do analizy próbek za pomocą cytometru przepływowego (ewentualnie wyposażonego w lasery niebieski i czerwony).</li>
		<li>Za pomocą oprogramowania do analizy cytometrii przepływowej ocenić poziom wbudowania SLN przez komórki DC poprzez bramkowanie populacji komórek CD11c+ (pozytywnych dla FITC) i porównanie intensywności fluorescencji związanej z SLN (mierzonej w kanałach PerCP-Cy5.5 lub APC).</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Calderon-Colon, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthesis+of+sub-10+nm+solid+lipid+nanoparticles+for+topical+and+biomarker+detection+applications%5BTitle%5D)+AND+%22J+Nanopart+Res%22%5BJournal%5D)">Synthesis of sub-10 nm solid lipid nanoparticles for topical and biomarker detection applications.</a> J Nanopart Res. 16 (2252), 1-10 (2014).</li>
<li>Patwekar, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Review+on+nanoparticles+used+in+cosmetics+and+dermal+products%5BTitle%5D)+AND+%22World+Journal+of+Pharmacy+and+Pharmaceutical+Sciences%22%5BJournal%5D)">Review on nanoparticles used in cosmetics and dermal products.</a> World Journal of Pharmacy and Pharmaceutical Sciences. 3 (8), 1407-1421 (2014).</li>
<li>Martins, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Solid+lipid+nanoparticles+as+intracellular+drug+transporters%3A+An+investigation+of+the+uptake+mechanism+and+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Pharmaceutics%22%5BJournal%5D)">Solid lipid nanoparticles as intracellular drug transporters: An investigation of the uptake mechanism and pathway.</a> International Journal of Pharmaceutics. 430, 216-227 (2012).</li>
<li>Yadav, N., Khatak, S., Sara, U. V. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Solid+Lipid+Nanoparticles+-+A+Review%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Applied+Pharmaceuticals%22%5BJournal%5D)">Solid Lipid Nanoparticles - A Review.</a> International Journal of Applied Pharmaceuticals. 5 (2), 8-18 (2013).</li>
<li>Weber, S., Zimmer, A., Solid Pardeike, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipid+Nanoparticles+%28SLN%29+and+Nanostructured+Lipid+Carriers+%28NLC%29+for+pulmonary+application%3A+a+review+of+the+state+of+the+art%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Pharm+Biopharm%22%5BJournal%5D)">Lipid Nanoparticles (SLN) and Nanostructured Lipid Carriers (NLC) for pulmonary application: a review of the state of the art.</a> Eur J Pharm Biopharm. 86 (1), 7-22 (2014).</li>
<li>Mahajan, A., Kaur, S., Grewal, N. K., Kaur, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Solid+Lipd+Nanoparticles+%28SLNs%29+-+As+Novel+Lipd+based+Nanocarriers+for+Drugs%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Advanced+Research%22%5BJournal%5D)">Solid Lipd Nanoparticles (SLNs) - As Novel Lipd based Nanocarriers for Drugs.</a> International Journal of Advanced Research. 2 (1), 433-441 (2014).</li>
<li>Buse, J., El-Aneed, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Properties%2C+engineering+and+applications+of+lipid-based+nanoparticle+drug-delivery+systems%3A+current+research+and+advances%5BTitle%5D)+AND+%22Nanomedicine+%28Lond%29%22%5BJournal%5D)">Properties, engineering and applications of lipid-based nanoparticle drug-delivery systems: current research and advances.</a> Nanomedicine (Lond). 5, 1237-1260 (2010).</li>
<li>Malam, Y., Loizidou, M., Seifalian, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Liposomes+and+nanoparticles%3A+nanosized+vehicles+for+drug+delivery+in+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Pharmacol+Sci%22%5BJournal%5D)">Liposomes and nanoparticles: nanosized vehicles for drug delivery in cancer.</a> Trends Pharmacol Sci. 30 (11), 592-599 (2009).</li>
<li>Lim, S. B., Banerjee, A., Onyuksel, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improvement+of+drug+safety+by+the+use+of+lipid-based+nanocarriers%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+controlled+release+%3A+official+journal+of+the+Controlled+Release+Society%22%5BJournal%5D)">Improvement of drug safety by the use of lipid-based nanocarriers.</a> Journal of controlled release : official journal of the Controlled Release Society. 163, 34-45 (2012).</li>
<li>Ali Khan, A., Mudassir, J., Mohtar, N., Darwis, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advanced+drug+delivery+to+the+lymphatic+system%3A+lipid-based+nanoformulations%5BTitle%5D)+AND+%22International+journal+of+nanomedicine%22%5BJournal%5D)">Advanced drug delivery to the lymphatic system: lipid-based nanoformulations.</a> International journal of nanomedicine. 8, 2733-2744 (2013).</li>
<li>Oussoren, C., Storm, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Liposomes+to+target+the+lymphatics+by+subcutaneous+administration%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+drug+delivery+reviews%22%5BJournal%5D)">Liposomes to target the lymphatics by subcutaneous administration.</a> Advanced drug delivery reviews. 50, 143-156 (2001).</li>
<li>Shang, L., Nienhaus, K., Nienhaus, G. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineered+nanoparticles+interacting+with+cells%3A+size+matters%5BTitle%5D)+AND+%22J+Nanobiotechnology%22%5BJournal%5D)">Engineered nanoparticles interacting with cells: size matters.</a> J Nanobiotechnology. 12, 5(2014).</li>
<li>Joshi, M. D., Muller, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipid+nanoparticles+for+parenteral+delivery+of+actives%5BTitle%5D)+AND+%22European+journal+of+pharmaceutics+and+biopharmaceutics+%3A+official+journal+of+Arbeitsgemeinschaft+fur+Pharmazeutische+Verfahrenstechnik+e.V%22%5BJournal%5D)">Lipid nanoparticles for parenteral delivery of actives.</a> European journal of pharmaceutics and biopharmaceutics : official journal of Arbeitsgemeinschaft fur Pharmazeutische Verfahrenstechnik e.V. 71, 161-172 (2009).</li>
<li>Torchilin, V. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Micellar+nanocarriers%3A+pharmaceutical+perspectives%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmaceutical+research%22%5BJournal%5D)">Micellar nanocarriers: pharmaceutical perspectives.</a> Pharmaceutical research. 24, 1-16 (2007).</li>
<li>Ashley, C. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+targeted+delivery+of+multicomponent+cargos+to+cancer+cells+by+nanoporous+particle-supported+lipid+bilayers%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+materials%22%5BJournal%5D)">The targeted delivery of multicomponent cargos to cancer cells by nanoporous particle-supported lipid bilayers.</a> Nature materials. 10, 389-397 (2011).</li>
<li>Patchan, M., et al. Nanotech; Nanotechnology 2013: Bio Sensors Instruments, Medical, Environment and Energy; Chapter 3: Materials for Dru., and Gene Delivery. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aPatchan%2C+M+%22Nanobandage+for+controlled+release+of+topical+therapeutics%22">Nanobandage for controlled release of topical therapeutics</a>. 3, 255-258 (2013).</li>
<li>Forgiarini, A., Esquena, J., Gonzalez, C., C, S. Formation and stability of nano-emulsions in mixed nonionic surfactant systems. Trends in colloid and interface science XV. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aForgiarini%2C+A+%22Progress+in+Colloid+and+Polymer+Science%22">Progress in Colloid and Polymer Science</a>. Koutsoukos, P. 118, Springer Berlin. Heidelberg. 184-189 (2001).</li>
<li>Nantarat, T., Chansakaow, S., Leelapornpisid, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimization%2C+characterization+and+stability+of+essential+oils+blend+loaded+nanoemulsions+by+PIC+technique+for+anti-tyrosinase+activity%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Pharmacy+and+Pharmaceutical+Sciences%22%5BJournal%5D)">Optimization, characterization and stability of essential oils blend loaded nanoemulsions by PIC technique for anti-tyrosinase activity.</a> International Journal of Pharmacy and Pharmaceutical Sciences. 7, 308-312 (2015).</li>
<li>Sevcikova, P., Vltavska, P., Kasparkova, V., Formation Krejci, J. Characterization and Stability of Nanoemulsions Prepared by Phase Inversion. Proceeding MACMESE'11 Proceedings of the 13th WSEAS international conference on Mathematical and computational methods in science and engineering, , 132-137 (2011).</li>
<li>Forgiarini, A., Esquena, J., Gonzalez, C., Solans, C. Studies of the relation between phase behavior and emulsification methods with nanoemulsion formation. Trends in colloid and interface science XIV. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aForgiarini%2C+A+%22Progress+in+Colloid+and+Polymer+Science%22">Progress in Colloid and Polymer Science</a>. Buckin, V. 115, Springer. Berlin Heidelberg. 36-39 (2000).</li>
<li>Forgiarini, A., Esquena, J., Gonzalez, C., Solans, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Formation+of+nano-emulsions+by+low-energy+emulsification+methods+at+constant+temperature%5BTitle%5D)+AND+%22Langmuir%22%5BJournal%5D)">Formation of nano-emulsions by low-energy emulsification methods at constant temperature.</a> Langmuir. 17 (7), 2076-2083 (2001).</li>
<li>Cabone, C., Tomasello, B., Ruozi, B., Renis, M., Puglisi, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+and+optimization+of+PIT+solid+lipid+nanoparticles+via+statistical+factorial+design%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Med+Chem%22%5BJournal%5D)">Preparation and optimization of PIT solid lipid nanoparticles via statistical factorial design.</a> Eur J Med Chem. 49, 110-117 (2012).</li>
<li>Raimondi, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mammalian+Target+of+Rapamycin+Inhibition+and+Alloantigen-Specific+Regulatory+T+Cells+Synergize+To+Promote+Long-Term+Graft+Survival+in+Immunocompetent+Recipients%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Mammalian Target of Rapamycin Inhibition and Alloantigen-Specific Regulatory T Cells Synergize To Promote Long-Term Graft Survival in Immunocompetent Recipients.</a> J Immunol. 184, 624-636 (2010).</li>
<li>Jhunjhunwala, S., Raimondi, G., Thomson, A. W., Little, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Delivery+of+rapamycin+to+dendritic+cells+using+degradable+microparticles%5BTitle%5D)+AND+%22J+Control+Release%22%5BJournal%5D)">Delivery of rapamycin to dendritic cells using degradable microparticles.</a> J Control Release. 133 (13), 191-197 (2009).</li>
<li>Kapse-Mistry, S., Govender, T., Srivastava, R., Yergeri, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanodrug+delivery+in+reversing+multidrug+resistance+in+cancer+cells.%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Nanodrug delivery in reversing multidrug resistance in cancer cells.</a> Front Pharmacol. 5 (159), 1-22 (2014).</li>
<li>Musacchio, T., Torchilin, V. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+developments+in+lipid-based+pharmaceutical+nanocarriers%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Biosci+%28Landmark+Ed%29%22%5BJournal%5D)">Recent developments in lipid-based pharmaceutical nanocarriers.</a> Front Biosci (Landmark Ed). 1 (16), 1388-1412 (2011).</li>
<li>Cerpnjak, K., Zvonar, A., Gašperlin, M., Vrečer, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipid-based+systems+as+a+promising+approach+for+enhancing+the+bioavailability+of+poorly+water-soluble+drugs%29%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Pharm%22%5BJournal%5D)">Lipid-based systems as a promising approach for enhancing the bioavailability of poorly water-soluble drugs).</a> Acta Pharm. 63 (4), 27-445 (2013).</li>
<li>Rodrìguez-Gascòn, A., Pozo-Rodrìguez, A., Solinìs, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+nucleic+acid+vaccines%3A+use+of+self-amplifying+RNA+in+lipid+nanoparticles%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Nanomedicine%22%5BJournal%5D)">Development of nucleic acid vaccines: use of self-amplifying RNA in lipid nanoparticles.</a> Int J Nanomedicine. 9, 1833-1843 (2014).</li>
<li>Almeida, A. J., Souto, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Solid+lipid+nanoparticles+as+a+drug+delivery+system+for+peptides+and+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Drug+Deliv+Rev%22%5BJournal%5D)">Solid lipid nanoparticles as a drug delivery system for peptides and proteins.</a> Adv Drug Deliv Rev. 59, 478-490 (2007).</li>
<li>Pardeshi, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Solid+lipid+based+nanocarriers%3A+an+overview%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Pharm%22%5BJournal%5D)">Solid lipid based nanocarriers: an overview.</a> Acta Pharm. 62, 433-472 (2012).</li>
<li>Attama, A. A., Momoh, M. A., Builders, P. F. Lipid Nanoparticulate Drug Delivery Systems: A Revolution in Dosage Form Design and Development. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aAttama%2C+AA+%22Recent+Advances+in+Novel+Drug+Carrier+Systems%22">Recent Advances in Novel Drug Carrier Systems</a>. Sezer, A. D. , 107-140 (2012).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

W tym badaniu zbadano syntezę SLN i ich zastosowanie w zastosowaniach celowania wewnątrzkomórkowego. Te biokompatybilne nanocząstki okazały się obiecujące jako nośniki do wielu zastosowań, w tym dostarczania leków, wyciszania genów i technologii szczepionek 25-30. Ultramałe SLN zsyntetyzowano w łatwym procesie, a następnie zbadano ich interakcje z pierwotnymi komórkami skóry i pierwotnymi komórkami odpornościowymi. SLN zostały zaprojektowane tak, aby zawierały enkapsulację barwnika fluorescencyjnego (NiR), któ...

Nośniki oparte na nanocząsteczkach wykazują duży potencjał w zastosowaniach dotyczących targetowania wewnątrzkomórkowego, zapewniając mechanizm specyficznej modyfikacji sygnalizacji komórkowej i ekspresji genów. Nośniki te mogą być obciążone lekami, białkami i kwasami nukleinowymi zaprojektowanymi w celu wpłynięcia na odpowiedzi komórkowe i osiągnięcia pożądanego efektu w tkankach docelowych. W celu uzyskania korzyści terapeutycznych i diagnostycznych zbadano wiele rodzajów nanonośników, w tym lipidy, polimery, krzem oraz materiały magnetyczne. Systemy te są atrakcyjne ze względu na ich potencjał w zakresie lokalnego dostarczania leków, zwiększenia stężenia terapeutycznego w tkankach docelowych oraz redukcji toksyczności systemowej.
Stałe nanocząsteczki lipidowe (SLNs) są dobrze przebadanym przykładem systemu dostarczania nanocząsteczek, który w ostatnich latach wyłonił się jako obiecujący nośnik leków. SLNs mogą być łatwo formułowane do wielu zastosowań, w tym do biosensingu 1, kosmetyki 2 oraz dostarczania terapeutyków 3-7. Ich użyteczność wynika z faktu, że składają się w całości z wchłanialnych, nietoksycznych lipidów, co skutkuje zwiększoną biokompatybilnością. Podczas syntezy do nośników SLN można włączyć leki lipofilowe, co zwiększa rozpuszczalność leku i jego przydatność do podawania drogą parenteralną. Nośniki SLN pomagają również stabilizować enkapsulowane terapeutyki, ograniczając ich degradację i usuwanie z organizmu oraz maksymalizując działanie terapeutyczne. Nośniki te są szczególnie odpowiednie do preparatów długo działających o kontrolowanym uwalnianiu ze względu na ich stabilność w temperaturze ciała 3,4,8,9. Co istotne, enkapsulacja leków w nanocząsteczkach lipidowych zmienia wewnętrzne profile farmakokinetyczne cząsteczek leku. Stanowi to potencjalną zaletę, umożliwiając kontrolowane uwalnianie leków o wąskim indeksie terapeutycznym. Szybkość uwalniania terapeutyków włączonych do SLN może być dostrojona w zależności od szybkości degradacji lipidów lub szybkości dyfuzji leku w matrycy lipidowej.
SLN są często projektowane tak, aby gromadzić się w określonych tkankach docelowych. Na przykład ich rozmiar (zazwyczaj powyżej 10 nm) zwiększa retencję w krwiobiegu, w którym nieszczelne naczynia krwionośne tkanki nowotworowej ułatwiają ich osadzanie. Dodatkowo wykazano, że droga podania cząsteczek zmienia biodystrybucję, co stwarza możliwość celowania w konkretne struktury fizjologiczne, takie jak węzły chłonne 10,11. Po osadzeniu się w tkankach docelowych, osiągnięcie odpowiednich interakcji komórkowych i ostateczna internalizacja nanocząsteczek są trudne ze względu na zdolność błon komórkowych do selektywnej kontroli przepływu jonów i cząsteczek do wnętrza komórki i na zewnątrz 12. Aby ułatwić pobieranie komórkowe, możliwe jest modyfikowanie nanonośników specyficznymi ligandami, w tym peptydami, małymi cząsteczkami i przeciwciałami monoklonalnymi13,14. Wcześniej opisano kilka mechanizmów, obejmujących zarówno penetrację pasywną, jak i transport aktywny nanocząsteczek przez błonę komórkową 3,12,15. Ogólnie wykazano, że interakcje między komórką a nanocząsteczką są zależne od właściwości fizykochemicznych nanocząsteczek, w tym ich rozmiaru, kształtu, ładunku powierzchniowego i chemii powierzchni, a także od parametrów specyficznych dla komórki, takich jak typ komórki lub faza cyklu komórkowego 12.
Wcześniejsze badanie wykazało możliwość syntezy SLN o rozmiarach poniżej 10 nm do zastosowań w terapii miejscowej 16 oraz detekcji biomarkerów 1 z wykorzystaniem metody temperatury inwersji fazowej (PIT) 17. Jest to łagodna metoda syntezy, w której 2 skład pozostaje stały, podczas gdy temperatura jest stopniowo zmieniana. Ciągłe mieszanie podgrzanego roztworu podczas jego chłodzenia do RT prowadzi do powstania nanoemulsji. Proces ten skutkuje syntezą SLN o mniejszym rozmiarze cząstek1 niż raportowano wcześniej przy użyciu różnych metod syntezy nanocząsteczek lipidowych17-22. Uzyskana skala rozmiarów, mniejsza niż 20 nm, stanowi zaletę w zastosowaniach związanych z celowaniem wewnątrzkomórkowym ze względu na zwiększoną powierzchnię właściwą i potencjał do wzmocnienia oddziaływań komórkowych.
Schemat SLN, zaprojektowanych do dostarczania barwnika fluorescencyjnego lub leku, przedstawiono na Rysunku 1. SLN składają się z lipidowego wnętrza (np. liniowego alkanu), co umożliwia inkorporację związków lipofilowych (np. barwników lub leków), oraz zewnętrznej warstwy surfaktanta (np. liniowego surfaktanta niejonowego) otoczonej wodą. W niniejszym badaniu SLN załadowano barwnikiem fluorescencyjnym i wykorzystano jako model do badania oddziaływań między cząstkami a komórkami. Pierwotne ludzkie fibroblasty skóry oraz dendrytyczne komórki mysie eksponowano na SLN załadowane barwnikiem w określonym czasie, aby scharakteryzować oddziaływania pod kątem toksyczności i poboru cząstek. W celu ustalenia odpowiednich poziomów dawek wykorzystano test 3-(4,5-dimetylotiazol-2-yl)-2,5-difenylofenylotetrazolium bromku (MTT). Do zbadania poboru cząstek in vitro zastosowano dwie metody: mikroskopię fluorescencyjną oraz cytometrię przepływową.
<img alt="Schemat nanocząsteczki lipidowej; lipid, surfaktant, barwnik Nile Red w roztworze wodnym, tworzenie miceli." src="/files/ftp_upload/53102/53102fig1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 1"> 
Rycina 1. Schemat SLN przedstawiający główne składniki. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53102/53102fig1large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>

<table><tbody><tr><td>Czerwień Nilowa (NiR)</td><td>Sigma</td><td>19123</td><td>Bioodczynnik, odpowiedni do fluorescencji, &ge; 98,0%</td></tr> <tr><td>Heneikozan</td><td>Aldrich</td><td>286052</td><td>98%</td></tr><tr><td>Brij O10</td><td>Sigma</td><td>P6136</td><td>Brij 97, C18-1E10, Polioksyetylenowy (10) eter oleylowy</td></tr><tr><td>Woda</td><td>Sigma</td><td>W3500</td><td>Sterylnie filtrowany, BioReagent, odpowiedni do hodowli komórkowych</td></tr><tr><td>Filtr strzykawkowy 0,2 i mikro; m Membrana Supor o niskim poziomie wiązania białek Nauki</td><td>przyrodnicze</td><td>PN4612</td><td>Niepirogenny</td></tr><tr><td>Nanotrac Ultra&nbsp;</td><td>Numer seryjny</td> <td>Microtrac</td> U1985IS <td>Przyrząd</td></tr><tr><td>do różnicowego kalorymetru skaningowego</td><td>Mettlet-Toledo</td><td></td><td>Instrument</td></tr><tr><td>Pierwotne ludzkie fibroblasty&nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td>C-004-5C</td><td>Neonatal (HDFn)</td></tr><tr><td>Medium 106</td><td>Life Technologies</td><td>M-106-500</td><td>Sterylna, płynna pożywka do hodowli ludzkich fibroblastów skórnych.</td></tr><tr><td>Zestaw suplementów do wzrostu w surowicy (zestaw LSGS)</td><td>Life Technologies</td><td>S-003-K</td><td>Wszystkie elementy kompletnego</td></tr><tr><td>zestawu do oznaczania proliferacji komórek LSGS MTT</td><td>Trevigen</td><td>4890-025-K</td><td>Czuły zestaw do pomiaru proliferacji komórek w oparciu o redukcję soli tetrazolowej, bromku 3-[4,5-dimetylotiazol-2-ylo]-2,5-difenylotetrazolu (MTT)</td></tr><tr><td>Czytnik mikropłytek Safire2</td><td>Tecan</td><td>----</td><td>Przyrząd</td></tr><tr><td>Sól fizjologiczna buforowana fosforanami&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>P5493</td><td>Dla biologii molekularnej</td></tr><tr><td>Rekombinowana mysia GM-CSF&nbsp;</td><td>Peprotech</td><td>315-03</td><td>>97%, firmy SDS-PAGE w warunkach redukcyjnych i uwidoczniony przez srebrną plamę.</td></tr><tr><td>Rekombinowana mysia IL-4&nbsp;</td><td>Peprotech</td><td>214-14</td><td>>97%, firmy SDS-PAGE w warunkach redukcyjnych i uwidoczniony przez srebrną plamę.</td></tr></tbody></table>

stałe nanocząstki lipidowe (sln) do zastosowań wewnątrzkomórkowych

Solid Lipid Nanoparticles (SLNs) for Intracellular Targeting Applications

Pojazdy dostarczające oparte na nanocząstkach okazały się bardzo obiecujące dla zastosowań wewnątrzkomórkowych, dostarczając mechanizm specyficznej zmiany sygnalizacji komórkowej i ekspresji genów. W poprzednim badaniu zademonstrowano syntezę ultramałych stałych nanocząstek lipidowych (SLN) do miejscowego dostarczania leków i wykrywania biomarkerów. SLN są dobrze zbadanym przykładem systemu dostarczania nanocząstek, który okazał się obiecującym sposobem dostarczania leków. W tym badaniu SLN załadowano barwnikiem fluorescencyjnym i wykorzystano jako model do badania interakcji cząstka-komórka. Metodę temperatury inwersji faz (PIT) wykorzystano do syntezy ultramałych populacji biokompatybilnych nanocząstek. Zastosowano test bromku 3-(4,5-dimetylotiazol-2-ylo)-2,5-difenylofenylotetrazolowego (MTT) w celu ustalenia odpowiednich poziomów dawkowania przed badaniami interakcji nanocząstka-komórka. Ponadto pierwotne ludzkie fibroblasty skórne i mysie komórki dendrytyczne były z czasem wystawione na działanie SLN obciążonego barwnikiem, a interakcje w odniesieniu do toksyczności i wychwytu cząstek scharakteryzowano za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej i cytometrii przepływowej. Badanie to wykazało, że ultramałe SLN, jako system dostarczania nanocząstek, nadają się do wewnątrzkomórkowego celowania w różne typy komórek.

Do syntezy SLN wykorzystano metodę PIT, a temperaturę inwersji fazowej wyznaczono przy użyciu łaźni wodnej. Próbki powoli podgrzewano i delikatnie mieszano, aż roztwór stał się klarowny. Temperatura inwersji fazowej dla SLN przygotowanych z lipidem heneikozanem wynosi 45 °C. W Tabeli 1 podsumowano wielkość cząstek, polidyspersyjność, temperaturę topnienia oraz utajone ciepło topnienia dla SLN. SLN zsyntetyzowane zgodnie z opisanymi powyżej warunkami procesu pozwoliły na otrzymanie kontrolnych SLN oraz SL...

W tym badaniu opisano metodę syntezy ultra-małych populacji biokompatybilnych nanocząstek, a także kilka metod in vitro, za pomocą których można ocenić ich interakcje komórkowe.

Stałe nanocząstki lipidowe (SLN) do zastosowań wewnątrzkomórkowych

Nanoparticle-based delivery vehicles have shown great promise for intracellular targeting applications, providing a mechanism to specifically alter ...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest synteza ultra małych populacji biokompatybilnych nanocząsteczek, charakterystyka ich właściwości fizycznych oraz zbadanie oddziaływań między cząsteczkami a komórkami. Osiąga się to poprzez zastosowanie w pierwszej kolejności metody temperatury inwersji fazowej w celu syntezy lipidowych nanocząsteczek. W trakcie tego procesu lipid i surfaktant są wstępnie współtopione.Po dodaniu określonej ilości wody mieszaninę podgrzewa się aż do momentu rozdzielenia faz. Następnie mieszaninę miesza się w sposób ciągły do czasu utworzenia nanoemulsji i zakończenia syntezy stałych nanocząsteczek lipidowych (sln). W kolejnym kroku wykorzystuje się dynamiczne rozpraszanie światła (DLS) do pomiaru wielkości cząstek oraz polidyspersyjności.Różnicowa kalorymetria skaningowa (DSC) to dodatkowa technika stosowana do wyznaczania temperatury topnienia oraz ciepła utajonego topnienia w celu dalszej charakterystyki cząstek; ostatecznie do badania oddziaływań między cząstkami a komórkami można wykorzystać mikroskopię fluorescencyjną oraz cytometrię przepływową. Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami wysokoenergetycznymi, takimi jak sonikacja, mik

solid-lipid-nanoparticles-slns-for-intracellular-targeting

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioinżynieria

Powtarzające się retro-orbitalne iniekcje kompleksów liposomów kationowych/siRNA/ITSN-1s u myszy, co 72 godziny przez 24 dni, skutecznie dostarczają duplex siRNA do mikrokrążenia płuc myszy, zmniejszając ekspresję mRNA i białka ITSN-1s o 75%. Technika ta jest wysoce powtarzalna w modelu zwierzęcym, nie ma żadnych skutków ubocznych i pozwala uniknąć ofiar śmiertelnych.

Długotrwałe wyciszanie intersectin-1 w płucach myszy poprzez wielokrotne dostarczanie specyficznego siRNA przez kationowe liposomy. Ocena efektów knockdown za pomocą mikroskopii elektronowej

Informujemy o inteligentnym zastosowaniu nanorurek węglowych do kinetycznej stabilizacji cząsteczek lipidowych, które zawierają samoorganizujące się nanostruktury w swoich rdzeniach. Przygotowanie cząsteczek lipidowych wymaga raczej niskich stężeń nanorurek węglowych, co pozwala na ich wykorzystanie w zastosowaniach biomedycznych, takich jak dostarczanie leków.

Łatwe przygotowanie wewnętrznie samoorganizujących się cząstek lipidowych stabilizowanych przez nanorurki węglowe

Celem tego protokołu jest użycie kationowych/anionowych liposomów z peptydem neurotargetującym jako systemu dostarczania OUN, aby umożliwić siRNA przejście przez BBB.  Optymalizacja systemu dostarczania leków, takich jak siRNA, pozwoliłaby na więcej opcji leczenia prionów i innych chorób neurodegeneracyjnych.

Dostarczanie terapeutycznego siRNA do OUN za pomocą liposomów kationowych i anionowych

Nanonośnik ciekłokrystalicznej nanocząstki (LCNP) jest wykorzystywany jako narzędzie do kontrolowanego dostarczania hydrofobowego ładunku do błony komórkowej żywych komórek.

Celowane dostarczanie przez błonę plazmatyczną hydrofobowego ładunku zamkniętego w nośniku nanocząstek ciekłokrystalicznych

Tutaj opisujemy protokół generowania kationowych nanoliposomów, który opiera się na metodzie suchego filmu i może być wykorzystany do bezpiecznego i efektywnego dostarczania transkrybowanego in vitro informacyjnego RNA.

Wytwarzanie kationowych nanoliposomów w celu efektywnego dostarczania transkrybowanego in vitro informacyjnego RNA

Ten artykuł opisuje enkapsulację falkarindiolu w pokrytych lipidami nanocząstkach o długości fali 74 nm. Komórkowy wychwyt nanocząstek przez ludzkie komórki macierzyste do kropelek lipidów jest monitorowany za pomocą obrazowania fluorescencyjnego i konfokalnego. Nanocząstki są wytwarzane metodą szybkiego wstrzykiwania rozpuszczalnika, a ich rozmiar mierzy się za pomocą techniki dynamicznego rozpraszania światła.

Wychwyt nowych nanocząstek pokrytych lipidami zawierających falkarindiol przez ludzkie mezenchymalne komórki macierzyste

Przedstawiono metody przygotowania i scharakteryzowania właściwości fizykochemicznych i bioaktywności neutralnie naładowanych, reagujących na pH nanocząstek siRNA. Omówiono kryteria skutecznego stosowania nanoleków siRNA, takie jak rozmiar, morfologia, ładunek powierzchniowy, obciążenie siRNA i wyciszanie genów.

Przygotowanie neutralnie naładowanych, reagujących na pH nanocząstek polimerowych do dostarczania cytozolowego siRNA

To badanie opisuje klasyczną hydratację przy użyciu metody cienkiego filmu lipidowego do przygotowania nanoliposomów, a następnie charakterystyki nanocząstek. Hydrofilowe i globularne białko o masie 47 kDa, taryna, jest z powodzeniem kapsułkowane jako strategia poprawiająca stabilność, unikająca szybkiego klirensu i promująca kontrolowane uwalnianie. Metoda może być dostosowana do enkapsulacji cząsteczek hydrofobowych.

Otrzymywanie i charakterystyka nanoliposomów do uwięzienia bioaktywnych hydrofilowych białek kulistych

Protokół przedstawia zoptymalizowane parametry przygotowania termoczułych liposomów za pomocą urządzenia mikrofluidycznego do mikromiksera w jodełkę. Umożliwia to również kokapsułkowanie doksorubicyny i zieleni indocyjaninowej do liposomów oraz fototermiczne uwalnianie doksorubicyny w celu kontrolowanego/wyzwalanego uwalniania leku.

Mikroprzepływowa produkcja liposomów wrażliwych na temperaturę zawierających lizolipidy

Nanocząsteczki lipidowe są opracowywane przy użyciu mikroprzepływowej platformy mieszania do enkapsulacji mRNA i DNA.

Formułowanie i charakteryzowanie nanocząstek lipidowych do dostarczania genów przy użyciu platformy mieszania mikroprzepływowego

Szczegółowy protokół syntezy nanocząsteczek lipidowych (LNP) przy użyciu technologii mieszalnika CIJ (Limited Impinging Jet), w tym dwustrumieniowego CIJ i czterostrumieniowego mieszalnika wirowego z wieloma wlotami (μMIVM), jest zademonstrowany. Mieszalniki CIJ generują powtarzalne, turbulentne środowiska mikromieszania, co skutkuje produkcją monodyspersyjnych LNP.

Synteza nanocząstek lipidowych przez przepływ turbulentny w ograniczonych mieszalnikach strumieniowych z uderzeniem

Poznaj metodę syntezy biokompatybilnych nanocząstek lipidowych metodą inwersji temperaturowej fazy. Naucz się charakteryzować ich właściwości fizyczne i badać interakcje z komórkami in vitro.

Stałe nanocząstki lipidowe (SLN) do zastosowań wewnątrzkomórkowych

Przeglądaj więcej filmów