Stałe nanocząstki lipidowe (SLN) do zastosowań wewnątrzkomórkowych

Ogólnym celem tej procedury jest synteza ultra małych populacji biokompatybilnych nanocząstek, scharakteryzowanie ich właściwości fizycznych i zbadanie interakcji między komórkami cząsteczkowymi. Osiąga się to poprzez zastosowanie najpierw metody temperatury inwersji faz do syntezy nanocząstek lipidowych. Podczas tego procesu lipid i środek powierzchniowo czynny są początkowo współtopione.

Po dodaniu określonej ilości wody mieszaninę podgrzewa się do momentu rozdzielenia faz. Mieszaninę miesza się następnie w sposób ciągły, aż do powstania nanoemulsji i zakończenia syntezy stałych nanocząstek lipidowych lub sln. Następnie dynamiczne rozpraszanie światła lub DLS służy do pomiaru wielkości cząstek i polidyspersyjności.

Różnicowa kalorymetria skaningowa lub DSC jest dodatkową techniką stosowaną do określania temperatury topnienia i utajonego ciepła topnienia w celu dalszej charakterystyki cząstek, ostatecznie mikroskopia fluorescencyjna i cytometria przepływowa mogą być wykorzystane do zbadania interakcji komórek cząstek. Główną przewagą tej techniki nad istniejącymi metodami wysokoenergetycznymi, takimi jak ultrasonizacja mikropłynów i homogenizacja pod wysokim ciśnieniem, jest to, że jest to stosunkowo delikatna technika syntezy, która jest zarówno prosta, jak i skalowalna. Aby zsyntetyzować LNS, połącz 0,6 miligrama barwnika fluorescencyjnego lub innego związku lipofilowego i 0,10 grama liniowego alkanu lub lipidu.

W rdzeniu fiolki o pojemności 15 mililitrów stopić składniki w temperaturze 90 stopni Celsjusza i wymieszać, dodać 0,11 grama liniowego niejonowego środka powierzchniowo czynnego. Następnie zmiksuj powstałą mieszaninę w temperaturze 90 stopni Celsjusza i wymieszaj. Następnie dodaj 1,79 grama sterylnej wody do mieszaniny, podgrzej do 90 stopni Celsjusza i wizualnie monitoruj roztwór, aż zaobserwuje się dwie fazy.

Teraz mieszaj mieszaninę, aż powstanie przezroczysta nano emulsja. Przygotować oddzielną nanoemulsję równolegle bez dodawania barwnika fluorescencyjnego, aby służyła jako próbka kontrolna. Następnie wysterylizuj każdą nano emulsję za pomocą sterylnego filtra 0,2 mikrona.

Zastosuj DLS do pomiaru wielkości cząstek i polidyspersyjności S lns za pomocą szkła w konstrukcji przyrządu do pomiaru wielkości cząstek przed pomiarem próbek, wielkość cząstek dwóch znanych wzorców powinna być mierzona zgodnie z protokołem producenta dotyczącym przygotowania i pomiaru wzorców. Następnie należy zmierzyć próbki przygotowane dla każdej z nich. Użyj czasu pracy 100 sekund, współczynnika załamania światła wody i lepkości wody w temperaturze 20 stopni Celsjusza.

Zgłoś średnią średnicę cząstek i polidyspersyjność rozkładu wielkości cząstek, aby zbadać zachowanie termiczne S lns za pomocą DSC pierwszej pipety S LNS do aluminiowej patelni o pojemności 40 mikrolitrów i masie około 25 miligramów. Hermetycznie zamknij miskę za pomocą uniwersalnej prasy zaciskowej, aby zminimalizować utratę wilgoci podczas skanowania DSC. Przed pomiarem każdej nanoemulsji w temperaturze od pięciu do 80 stopni Celsjusza należy podać temperaturę topnienia i utajone ciepło topnienia z wykresu DSC, gdzie dolina reprezentuje temperaturę topnienia i całkę obszaru pod krzywą.

Na wykresie DSC podzielone przez ilość materiału reprezentuje utajone ciepło topnienia kultury. Pierwotne fibroblasty ludzkie zgodnie z instrukcją producenta w płynnej pożywce do hodowli ludzkich fibroblastów skórnych. Uzupełniony zestawem suplementów o niskim wzroście surowicy, utrzymuj komórki w wilgotnej atmosferze o temperaturze 37 stopni Celsjusza, 5% dwutlenku węgla i subkulturze po osiągnięciu 80% konfluencji zarówno dla komórek nasiennych MTT, jak i analizy obrazowej.

W 96-dołkowej płytce o gęstości 20 000 komórek na studzienkę. Pozwól komórkom zrównoważyć się w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez noc przed ekspozycją na SLN w czasie zero rozcieńcz s SLM w kompletnym podłożu, aby osiągnąć pożądane stężenie lipidów i dodaj 10 mikrolitrów na studzienkę do każdej studzienki powtórzonej na płytce 96-dołkowej po 24 godzinach inkubacji z S lns, określić żywotność komórkową za pomocą testu MTT zgodnie z protokołem producenta. Umyj komórki raz i dodaj do każdej 100 mikrolitrów świeżej pożywki.

Dobrze zabij studzienki kontrolne, inkubując w 70% roztworze metanolu przez 10 minut przed zastąpieniem go świeżą pożywką. Dodaj odczynnik MTT w ilości 10 mikrolitrów na studzienkę do każdego dołka mikropłytki i inkubuj przez noc w temperaturze 37 stopni Celsjusza po całonocnej inkubacji, rozpuszczaj formę wewnątrzkomórkową i kryształy w 100 mikrolitrach dostarczonego roztworu detergentu. Zgodnie z protokołem producenta, przed uzyskaniem wartości absorbancji należy inkubować komórki w roztworze detergentu przez trzy godziny w temperaturze pokojowej.

Korzystanie z czytnika mikropłytek w celu przygotowania do mikroskopii. Umyj fibroblasty dwukrotnie sterylnym solą fizjologiczną z nasyconymi fosforanami. Utrwal komórki przez 10 minut zimnym, 70% metanolem w określonych punktach czasowych po podaniu fibroblastów z lns.

Po 10 minutach zastąp metanol solą fizjologiczną buforowaną fosforanem lub PBS przed wykonaniem obrazów za pomocą odwróconego mikroskopu. Zsyntetyzowany S SLN dał kontrolny S LNS o średniej średnicy cząstek 18,59 i polidyspersyjności 5,83 oraz SLM naładowane czerwienią Nilową o średniej średnicy cząstek 16,87 nanometra i polidyspersyjności 4,47 przy użyciu testu MTT. Wpływ odpowiedzi na dawkę na metabolizm komórkowy mierzono tam, gdzie wzrost stężenia cząstek powodował zmniejszenie żywotności komórek.

Nie zaobserwowano różnicy w toksyczności między komórkami narażonymi na sam SLN w porównaniu z komórkami obciążonymi czerwienią Nilową. SLN. Równolegle komórki badano wzrokowo pod kątem przylegania do kultury tkankowej. Polistyren i obrazy wykonano w celu zademonstrowania zarówno reprezentatywnej morfologii komórek, jak i absorpcji cząstek fluorescencyjnych w czasie, przy użyciu dawki równej pięciu mikrogramom na mililitr.

Wychwyt cząsteczek lipidów obserwowano przez dwie godziny po ekspozycji. Poziom włączenia nanocząstek określono poprzez pomiar intensywności fluorescencji czerwieni nilowej w mysich komórkach dendrytycznych pochodzących ze szpiku kostnego lub MDC B za pomocą cytometrii przepływowej. Zaobserwowano bezpośrednią korelację między stężeniem zastosowanego SNS a ilością fluorescencji ocenianej w B MDC.

Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak syntetyzować ultra małe populacje biokompatybilnych nanocząstek, charakteryzować ich właściwości fizyczne i badać interakcje między komórkami cząsteczkowymi.