Name: Mikroprzepływowa produkcja liposomów wrażliwych na temperaturę zawierających lizolipidy (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-03-03T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 51 s
Description: Poznaj mikroprzepływową produkcję termosensytywnych liposomów zawierających lizolipidy do kontrolowanego uwalniania leków. Ta metoda umożliwia współenkapsulację doksorubicyny i indocyjaniny zielonej z fototermicznym wyzwalaniem.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy Prostate Cancer UK (CDF-12-002 Fellowship) oraz Engineering and Physical Sciences Research Council (EPSRC) (EP/M008657/1) za dofinansowanie.

1. Konfiguracja sprzętu
<ol>
	<li>Zmontuj pompy strzykawkowe i SHM w następujący sposób.
	<ol>
		<li>Połącz port „To Computer” wtórnej pompy strzykawkowej (Pompa 02, dla roztworu wodnego) z portem „To Network” głównej pompy strzykawkowej (Pompa 01, dla etanolowego roztworu lipidów) za pomocą kabla sieciowego pompa-pompa (Rysunek 1, żółty).</li>
		<li>Połącz port „To Computer” pompy głównej z portem „RS232 Serial” komputera za pomocą kabla sieciowego PC-pompa (Rysunek 1, niebieski).</li>
		<li>Podłącz przewody do każdego z wlotów i wylotów SHM, używając nakrętki i tulei. Przekształć końcówkę przewodów dla obu wlotów na gniazdo Luer za pomocą drugiej nakrętki i tulei oraz zgromadzenia łączącego. Dłuższe przewody wlotowe ułatwiają podłączenie do strzykawek (Rysunek 2).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Skonfiguruj oprogramowanie do sterowania pompą.
	<ol>
		<li>Przypisz adresy głównej pompy strzykawkowej i wtórnej pompy strzykawkowej odpowiednio na „Ad:01” i „Ad:02”, używając przycisku „Setup” pompy strzykawkowej. Należy to zrobić tylko przy pierwszym uruchomieniu.</li>
		<li>Otwórz oprogramowanie do sterowania pompą na komputerze. Obie pompy strzykawkowe powinny zostać wykryte automatycznie, co zostanie potwierdzone sygnałem dźwiękowym. W przeciwnym razie kliknij Pumps, a następnie Search for pumps, aby odświeżyć połączenie (Rysunek 3).</li>
		<li>Ustaw parametr Diameter na 12.45 (mm), wybierając opcję „HSW Norm-Ject 5 cc (Dia=12.45)”.</li>
		<li>Ustaw parametr Rate na 0.25 mL/min dla Pompy 01 (etanolowy roztwór lipidów) oraz 0.75 mL/min dla Pompy 02 (roztwór wodny). Prędkości przepływu odpowiadają całkowitemu przepływowi (TFR) wynoszącemu 1 mL/min oraz stosunkowi przepływów (FRR) fazy wodnej do etanolowej równemu 3.</li>
		<li>Ustaw parametr Volume na dowolną wartość powyżej 5 mL. 
		UWAGA: Docelowa objętość infuzji jest ustawiona na wartość większą niż objętość załadowanego płynu, uwzględniając objętość martwą przewodów.</li>
		<li>Wybierz tryb INF (infuzja) dla obu pomp.</li>
		<li>Naciśnij Set, aby zatwierdzić ustawienia.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Przygotowanie LTSL
<ol>
	<li>Przygotować mieszaninę lipidową LTSL10 lub LTSL10-ICG (patrz Tabela 1).</li>
	<li>Pobrać 1 mL mieszaniny lipidowej i co najmniej 3 mL roztworu (NH4)2SO4 za pomocą dwóch strzykawek 5 mL z blokadą Luer lock.</li>
	<li>Zamontować obie strzykawki w pompach strzykawkowych w pozycji pionowej, przesuwając kołnierz tulei strzykawki do uchwytu strzykawki w pompie, a kołnierz tłoka do bloku pchacza pompy (Rysunek 4).</li>
	<li>Owinąć koniec taśmy grzewczej wokół strzykawki z roztworem wodnym. Owinąć drugi koniec taśmy grzewczej oraz sondę temperatury termostatu wokół strzykawki z roztworem lipidowym. W celu ułatwienia procesu montażu zaleca się przećwiczenie tego kroku na pustych strzykawkach (Rysunek 5A).</li>
	<li>Podłączyć obie strzykawki do żeńskich adapterów Luer odpowiednich wlotów mikromiksera SHM. Upewnić się, że strzykawka z mieszaniną lipidową jest podłączona do wlotu etanolowego, a strzykawka z roztworem (NH4)2SO4 do wlotu wodnego. Dostosować pozycję tłoka, aby usunąć pęcherzyki powietrza ze strzykawek (Rysunek 5B). 
	UWAGA: Upewnić się, że strzykawki są nadal stabilnie osadzone w uchwytach pomp.</li>
	<li>Podgrzać strzykawki powyżej 51 °C za pomocą taśmy grzewczej w 10-sekundowej sesji grzania. Odczekać, aż termostat zaktualizuje temperaturę strzykawek. Powtarzać ten krok w dalszej części procedury, aby utrzymać temperaturę podczas infuzji. 
	OSTRZEŻENIE: Wyłączyć taśmę grzewczą po 10 s, aby zapobiec przekroczeniu zadanej temperatury i umożliwić termostatowi aktualizację rzeczywistej temperatury. Z taśmą grzewczą należy obchodzić się ostrożnie, ponieważ jej temperatura rośnie bardzo szybko. Ciągłe grzanie może uszkodzić sprzęt i strzykawki ze względu na opóźnienie termostatu w aktualizacji mierzonej temperatury.</li>
	<li>Gdy temperatura przekroczy 51 °C, uruchomić pompy strzykawkowe, klikając Run All w oprogramowaniu sterującym pompami (Rysunek 3).</li>
	<li>Upewnić się, że przepływ cieczy jest wolny od pęcherzyków powietrza i wycieków. Odrzucić początkową objętość (około 0,5 mL) cieczy wypływającej z wylotu jako odpad. 
	UWAGA: Ta początkowa objętość odpadu nie jest stała i zależy od objętości wewnętrznej układu, czyli objętości, jaką musi przebyć ciecz od strzykawek przez rurki i SHM do wylotu.</li>
	<li>Pozostałą ciecz zebrać jako próbki liposomów do probówki do mikrowirówki lub fiolki typu bijou.</li>
	<li>Wstrzymać/zatrzymać infuzję, gdy ciecz w którejkolwiek ze strzykawek będzie prawie całkowicie zużyta. 
	UWAGA: Pompy należy zatrzymać ręcznie, ponieważ mogą one nie wykryć precyzyjnie momentu opróżnienia strzykawek.</li>
	<li>Umieścić zebrane roztwory liposomów w kąpieli wodnej o temperaturze 60 °C w celu wyżarzania przez 1,5 h. 
	UWAGA: Ten krok jest niezbędny do umożliwienia ładowania leku do liposomów.</li>
	<li>Przenieść roztwory do tub dializacyjnych. Dializować roztwory przeciwko 1 L 240 mM (NH4)2SO4 w temperaturze 37 °C przez co najmniej 4 h w celu uzyskania oczyszczonych liposomów. 
	UWAGA: W tym miejscu można przerwać protokół. Na tym etapie stężenie fosfolipidów w liposomach wynosi 5 mM. Oczyszczone liposomy można przechowywać w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Aby oczyścić SHM do ponownego użycia, przepłukać SHM sekwencyjnie wodą dejonizowaną, etanolem, a następnie osuszyć azotem.</li>
</ol>
3. Zdalne ładowanie DOX do LTSL za pomocą transbłonowego gradientu pH
<ol>
	<li>Wymień bufor zewnętrzny LTSL na sól buforowaną HEPES (HBS), wykorzystując chromatografię wykluczania cząsteczkowego (SEC), aby ustanowić transmembraneowy gradient pH.
	<ol>
		<li>W celu przygotowania kolumny dodaj łącznie 25 ml buforu HBS na górę kolumny SEC. Pozwól, aby cały eluent przepłynął przez kolumnę, a następnie zutylizuj eluat.</li>
		<li>Do kolumny należy dodać 1 ml dializowanych liposomów, przygotowanych w kroku 2.12, a następnie usunąć eluat.</li>
		<li>Dodać 1,5 ml buforu HBS do kolumny, a następnie usunąć eluat.</li>
		<li>Dodaj 3 ml HBS do kolumny i zbierz 3 ml eluatu. 
		UWAGA: W tym miejscu można przerwać protokół. Liposomy są zbierane na tym etapie i mają stężenie fosfolipidów wynoszące 1,67 mM. Liposomy po wymianie buforu można przechowywać w 4 °C.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Inkubować LTSL z doksorubicyną (DOX), a następnie oczyścić LTSL.
	<ol>
		<li>Do 1 ml roztworu liposomów po wymianie buforu (1,67 mmol) znajdującego się w fiolce typu bijou dodać roztwór DOX, zachowując stosunek molowy DOX do fosfolipidów wynoszący 1:20. Można to osiągnąć poprzez dodanie 48.4 µL roztworu DOX o stężeniu 1 mg/ml (83.4 µmol).</li>
		<li>Umieść fiolkę bijou w 37 °C kąpiel wodna przez 1,5 h w celu umożliwienia załadunku DOX do liposomów.</li>
		<li>Wymieszać 10 µL liposomów z 170 µL z HBS i 20 µL roztworu 1% (v/v) Triton X-10 w czarnej płytce 96-dołkowej. Powtórzyć dla trzech dołków. Dołki te odpowiadają zawartości DOX „przed oczyszczaniem”.</li>
		<li>W przypadku przygotowania LTSL10-ICG, wymieszać 40 µL liposomów z 160 µL DMSO w przezroczystej płytce 96-dołkowej. Powtórz procedurę dla trzech dołków. Dołki te odpowiadają zawartości ICG „przed oczyszczaniem”.</li>
		<li>Oczyścić roztwór liposomów zgodnie z opisem w kroku 3.1. 
		UWAGA: Aby móc ponownie wykorzystać kolumnę do przyszłych oczyszczeń, należy usunąć z niej wolną doksorubicynę (DOX), dodając 1 ml rozcieńczonego 0,5 M roztworu NaOH przed wykonaniem kroku 3.1.1. Wolna DOX o czerwonym kolorze zmieni barwę na fioletowo-niebieską i zostanie szybko wymyta z kolumny.</li>
		<li>Wymieszać 30 µL roztworu oczyszczonych liposomów z 150 µL z HBS i 20 µL roztworu 1% (v/v) Triton X-10 w czarnej płytce 96-dołkowej. Powtórzyć dla trzech dołków. Dołki te odpowiadają zawartości DOX „po oczyszczaniu”.</li>
		<li>W przypadku LTSL10-ICG wymieszać 40 µL roztworu oczyszczonych liposomów z 160 µL DMSO w przezroczystej płytce 96-dołkowej. Powtórz czynność dla trzech dołków. Dołki te odpowiadają zawartości ICG „po oczyszczeniu”.</li>
		<li>Zmierz intensywność fluorescencji DOX w dołkach przed (krok 3.2.3) i po (krok 3.2.5) oczyszczaniu, używając czytnika mikropłytek (λPrzykładowy tekst do tłumaczenia nie został dostarczony. Proszę o przesłanie treści źródłowej w języku angielskim, którą należy przetłumaczyć na język polski zgodnie z wytycznymi dla treści naukowych JoVE. = 485 nm, λem = 590 nm).</li>
		<li>Oblicz wydajność enkapsulacji DOX (DOX EE), wyznaczając stosunek intensywności fluorescencji przed i po oczyszczaniu. 
		<img alt="Wzór na wydajność enkapsulacji doksorubicyny, DOX EE% = FI po/przed oczyszczaniem × 10, równanie." src="/files/ftp_upload/60907/60907eq1.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Równanie 1"></li>
		<li>Zmierz absorbancję ICG w dołkach przed i po oczyszczaniu, używając czytnika mikropłytek (60 do 10 nm).</li>
		<li>Oblicz wydajność enkapsulacji ICG (ICG EE), wyznaczając stosunek absorbancji przy 792 nm przed i po oczyszczaniu, uwzględniając czynnik rozcieńczenia (3-krotny) podczas procesu oczyszczania. 
		<img alt="Wzór na wydajność enkapsulacji ICG; równanie absorbancji; analiza oczyszczania." src="/files/ftp_upload/60907/60907eq2a.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Równanie 2"></li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. Dynamiczne rozpraszanie światła (DLS)
<ol>
	<li>Dodać 50 µL roztworu liposomów (krok 2.12) do 450 µL wody dejonizowanej.</li>
	<li>Umieścić kuwetę w urządzeniu DLS i przeprowadzić pomiar zgodnie z instrukcjami producenta.</li>
	<li>Zapisać średnią wartość średnicy Z-average oraz polidyspersyjność dla trzech pomiarów dla każdej próbki.</li>
</ol>
5. Różnicowa kalorymetria skanująca (DSC)
<ol>
	<li>Skoncentrować 1 mL próbek liposomów (krok 2.12) do 0,5 mL (końcowe stężenie lipidów 10 mM) za pomocą jednostki filtra wirówkowego. Używając rotora z kątem stałym, wirować z prędkością 750 x g przez około 15 min.</li>
	<li>Przenieść 20 µL roztworu (NH4)2SO4 oraz próbek liposomów do dwóch odpowiednich tygli DSC. Zamknąć tygle hermetycznymi pokrywkami DSC za pomocą zestawu prasy do próbek DSC.</li>
	<li>Zmierzyć próbkę w zakresie od 30 °C do 60 °C przy szybkości nagrzewania 1 °C/min za pomocą różnicowego kalorymetru skanującego.</li>
	<li>Przeanalizować dane za pomocą odpowiedniego oprogramowania. Przyjąć temperaturę przejścia fazowego (Tm) jako początek przejścia fazowego (piku topnienia), wyznaczony przez punkt przecięcia z osią x stycznej do punktu o maksymalnym nachyleniu.</li>
</ol>
6. Uwalnianie doksorubicyny
<ol>
	<li>Podgrzej HBS do wyznaczonej temperatury (37 lub 42 °C) przy użyciu łaźni wodnej. Przygotować łaźnię z lodowatej wody do hartowania próbek.</li>
	<li>Dodaj 100 µL oczyszczonych liposomów obciążonych DOX (krok 3.2.5) do 1,9 ml buforu HBS w probówce do mikrocentryfugi. Umieść probówkę w kąpieli wodnej o wyznaczonej temperaturze.</li>
	<li>Natychmiast wycofać 200 µL próbek z probówki i szybko umieścić ją w kąpieli wodno-lodowej, aby zahamować dalsze uwalnianie leku. Próbka ta odpowiada początkowemu punktowi czasowemu (t = 0).</li>
	<li>Wycofać 200 µL próbek w kolejnych punktach czasowych (t = 5, 10, 15, 30, 60 min) i szybko umieścić ją w kąpieli z lodowatej wody, aby zatrzymać uwalnianie leku.</li>
	<li>Wymieszać 50 µL próbki z każdego punktu czasowego za pomocą 150 µL buforu HBS w czarnej płytce 96-dołkowej. Zmierzyć intensywność fluorescencji DOX przy użyciu czytnika płytek.</li>
	<li>Dodaj 20 µL 1% (v/v) Triton X-10 do wybranych losowo studzienek przygotowanych w kroku 6.5. Pomiar natężenia fluorescencji DOX w tych studzienkach należy przeprowadzić za pomocą czytnika płytek. Wartości te odpowiadają punktowi czasowemu pełnego uwalniania (t = ∞; 10% uwalniania).</li>
	<li>Oblicz i wykreśl procent uwolnionej doksorubicyny (DOX) poprzez interpolację intensywności fluorescencji dla każdego punktu czasowego (I(t)) w odniesieniu do wartości początkowej (I(0)) oraz wartości całkowitego uwolnienia (I(∞)). 
	<img alt="Wzór na uwalnianie doksorubicyny; równanie dla badań uwalniania leku, I(t), I(0), I(∞), procent." src="/files/ftp_upload/60907/60907eq3.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Równanie 3"></li>
</ol>
7. Nagrzewanie laserowe i wyzwalane uwalnianie
<ol>
	<li>Ustaw temperaturę łaźni wodnej na 37 °C i odczekaj do jej stabilizacji.</li>
	<li>Dodaj 20 µL naładowanych DOX LTSL10-ICG ([ICG] = 10 µg/mL) do przezroczystej płytki 96-dołkowej, a następnie umieść ją w łaźni wodnej, dbając o to, aby dno było zanurzone w wodzie.</li>
	<li>Ustaw natężenie prądu systemu laserowego na 2,27 A. Umieść kolimator systemu laserowego 5 cm pionowo nad powierzchnią płytki 96-dołkowej, co odpowiada strumieniowi energii 0,5 W/cm2 [Rysunek 6]. 
	UWAGA: System laserowy należy obsługiwać zgodnie z odpowiednimi środkami bezpieczeństwa pracy z laserem.</li>
	<li>Włącz laser i monitoruj temperaturę w każdej minucie za pomocą światłowodowej sondy temperatury.</li>
	<li>W 5. i 10. minucie pobierz 10 µL naświetlanych laserem liposomów z przezroczystej płytki 96-dołkowej i wymieszaj z 190 µL HBS w trzech dołkach czarnej płytki 96-dołkowej.</li>
	<li>Wymieszaj 10 µL liposomów ze 170 µL HBS i 20 µL 1% (v/v) roztworu Triton X-10 w trzech dołkach czarnej płytki 96-dołkowej. Dołki te odpowiadają zawartości DOX „uwolnionej w 10%”. Zmierz intensywność fluorescencji DOX i oblicz stopień uwalniania DOX zgodnie z opisem w kroku 6.7.</li>
</ol>

<ol><li>Needham, D., Park, J., Wright, A. M., Tong, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Materials+characterization+of+the+low+temperature+sensitive+liposome+%28LTSL%29%3A+effects+of+the+lipid+composition+%28lysolipid+and+DSPE-PEG2000%29+on+the+thermal+transition+and+release+of+doxorubicin%5BTitle%5D)+AND+%22Faraday+Discussions%22%5BJournal%5D)">Materials characterization of the low temperature sensitive liposome (LTSL): effects of the lipid composition (lysolipid and DSPE-PEG2000) on the thermal transition and release of doxorubicin.</a> Faraday Discussions. 161, 515-534 (2013).</li>
<li>Ickenstein, L. M., Arfvidsson, M. C., Needham, D., Mayer, L. D., Edwards, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disc+formation+in+cholesterol-free+liposomes+during+phase+transition%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta+-+Biomembranes%22%5BJournal%5D)">Disc formation in cholesterol-free liposomes during phase transition.</a> Biochimica et Biophysica Acta - Biomembranes. 1614 (2), 135-138 (2003).</li>
<li>Valencia, P. M., Farokhzad, O. C., Karnik, R., Langer, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidic+technologies+for+accelerating+the+clinical+translation+of+nanoparticles%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Nanotechnology%22%5BJournal%5D)">Microfluidic technologies for accelerating the clinical translation of nanoparticles.</a> Nature Nanotechnology. 7 (10), 623-629 (2012).</li>
<li>Chen, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+discovery+of+potent+siRNA-containing+lipid+nanoparticles+enabled+by+controlled+microfluidic+formulation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Chemical+Society%22%5BJournal%5D)">Rapid discovery of potent siRNA-containing lipid nanoparticles enabled by controlled microfluidic formulation.</a> Journal of the American Chemical Society. 134 (16), 6948-6951 (2012).</li>
<li>Forbes, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+and+scale-independent+microfluidic+manufacture+of+liposomes+entrapping+protein+incorporating+in-line+purification+and+at-line+size+monitoring%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Pharmaceutics%22%5BJournal%5D)">Rapid and scale-independent microfluidic manufacture of liposomes entrapping protein incorporating in-line purification and at-line size monitoring.</a> International Journal of Pharmaceutics. 556, 68-81 (2019).</li>
<li>Dittrich, P. S., Manz, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lab-on-a-chip%3A+microfluidics+in+drug+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Drug+Discovery%22%5BJournal%5D)">Lab-on-a-chip: microfluidics in drug discovery.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 5 (3), 210-218 (2006).</li>
<li>Capretto, L., Carugo, D., Mazzitelli, S., Nastruzzi, C., Zhang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidic+and+lab-on-a-chip+preparation+routes+for+organic+nanoparticles+and+vesicular+systems+for+nanomedicine+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Drug+Delivery+Reviews%22%5BJournal%5D)">Microfluidic and lab-on-a-chip preparation routes for organic nanoparticles and vesicular systems for nanomedicine applications.</a> Advanced Drug Delivery Reviews. 65 (11-12), 1496-1532 (2013).</li>
<li>Cheung, C. C. L., Al-Jamal, W. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sterically+stabilized+liposomes+production+using+staggered+herringbone+micromixer%3A+Effect+of+lipid+composition+and+PEG-lipid+content%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Pharmaceutics%22%5BJournal%5D)">Sterically stabilized liposomes production using staggered herringbone micromixer: Effect of lipid composition and PEG-lipid content.</a> International Journal of Pharmaceutics. 566, 687-696 (2019).</li>
<li>Suh, Y. K., Kang, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Review+on+Mixing+in+Microfluidics%5BTitle%5D)+AND+%22Micromachines%22%5BJournal%5D)">Review on Mixing in Microfluidics.</a> Micromachines. 1 (3), 82-111 (2010).</li>
<li>Jahn, A., Vreeland, W. N., Gaitan, M., Locascio, L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Controlled+Vesicle+Self-Assembly+in+Microfluidic+Channels+with+Hydrodynamic+Focusing%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Chemical+Society%22%5BJournal%5D)">Controlled Vesicle Self-Assembly in Microfluidic Channels with Hydrodynamic Focusing.</a> Journal of the American Chemical Society. 126 (9), 2674-2675 (2004).</li>
<li>Stroock, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chaotic+Mixer+for+Microchannels%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Chaotic Mixer for Microchannels.</a> Science. 295 (5555), 647-651 (2002).</li>
<li>Belliveau, N. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidic+Synthesis+of+Highly+Potent+Limit-size+Lipid+Nanoparticles+for+In+Vivo+Delivery+of+siRNA%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Therapy+-+Nucleic+Acids%22%5BJournal%5D)">Microfluidic Synthesis of Highly Potent Limit-size Lipid Nanoparticles for In Vivo Delivery of siRNA.</a> Molecular Therapy - Nucleic Acids. 1 (8), 37(2012).</li>
<li>Patra, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Under+the+influence+of+alcohol%3A+The+effect+of+ethanol+and+methanol+on+lipid+bilayers%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Under the influence of alcohol: The effect of ethanol and methanol on lipid bilayers.</a> Biophysical Journal. 90 (4), 1121-1135 (2006).</li>
<li>Komatsu, H., Rowe, E. S., Rowe, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+Cholesterol+on+the+Ethanol-Induced+Interdigitated+Gel+Phase+in+Phosphatidylcholine%3A+Use+of+Fluorophore+Pyrene-Labeled+Phosphatidylcholine%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Effect of Cholesterol on the Ethanol-Induced Interdigitated Gel Phase in Phosphatidylcholine: Use of Fluorophore Pyrene-Labeled Phosphatidylcholine.</a> Biochemistry. 30 (9), 2463-2470 (1991).</li>
<li>Lu, J., Hao, Y., Chen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+Cholesterol+on+the+in+Lysophosphatidylcholine+Formation+of+an+Interdigitated+Gel+Phase+and+Phosphatidylcholine+Binary%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Effect of Cholesterol on the in Lysophosphatidylcholine Formation of an Interdigitated Gel Phase and Phosphatidylcholine Binary.</a> Journal of Biochemistry. 129 (6), 891-898 (2001).</li>
<li>Vanegas, J. M., Contreras, M. F., Faller, R., Longo, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+unsaturated+lipid+and+ergosterol+in+ethanol+tolerance+of+model+yeast+biomembranes%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Role of unsaturated lipid and ergosterol in ethanol tolerance of model yeast biomembranes.</a> Biophysical Journal. 102 (3), 507-516 (2012).</li>
<li>Haran, G., Cohen, R., Bar, L. K., Barenholz, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transmembrane+ammonium+sulfate+gradients+in+liposomes+produce+efficient+and+stable+entrapment+of+amphipathic+weak+bases%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta+%28BBA%29+-+Biomembranes%22%5BJournal%5D)">Transmembrane ammonium sulfate gradients in liposomes produce efficient and stable entrapment of amphipathic weak bases.</a> Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Biomembranes. 1151 (2), 201-215 (1993).</li>
<li>Sadeghi, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Influence+of+cholesterol+inclusion+on+the+doxorubicin+release+characteristics+of+lysolipid-based+thermosensitive+liposomes%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Pharmaceutics%22%5BJournal%5D)">Influence of cholesterol inclusion on the doxorubicin release characteristics of lysolipid-based thermosensitive liposomes.</a> International Journal of Pharmaceutics. 548 (2), 778-782 (2018).</li>
<li>Lawaczeck, R., Kainosho, M., Chan, S. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+formation+and+annealing+of+structural+defects+in+lipid+bilayer+vesicles%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta+%28BBA%29+-+Biomembranes%22%5BJournal%5D)">The formation and annealing of structural defects in lipid bilayer vesicles.</a> Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Biomembranes. 443 (3), 313-330 (1976).</li>
<li>Komatsu, H., Okada, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ethanol-induced+aggregation+and+fusion+of+small+phosphatidylcholine+liposome%3A+participation+of+interdigitated+membrane+formation+in+their+processes%5BTitle%5D)+AND+%22BBA+-+Biomembranes%22%5BJournal%5D)">Ethanol-induced aggregation and fusion of small phosphatidylcholine liposome: participation of interdigitated membrane formation in their processes.</a> BBA - Biomembranes. 1235 (2), 270-280 (1995).</li>
<li>Marsh, D., Bartucci, R., Sportelli, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipid+membranes+with+grafted+polymers%3A+physicochemical+aspects%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta+%28BBA%29+-+Biomembranes%22%5BJournal%5D)">Lipid membranes with grafted polymers: physicochemical aspects.</a> Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Biomembranes. 1615 (1-2), 33-59 (2003).</li>
<li>Hood, R. R., Vreeland, W. N., DeVoe, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidic+remote+loading+for+rapid+single-step+liposomal+drug+preparation%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+Chip%22%5BJournal%5D)">Microfluidic remote loading for rapid single-step liposomal drug preparation.</a> Lab on a Chip. 14 (17), 3359-3367 (2014).</li>
<li>Dalwadi, G., Benson, H. A. E., Chen, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+diafiltration+and+tangential+flow+filtration+for+purification+of+nanoparticle+suspensions%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmaceutical+Research%22%5BJournal%5D)">Comparison of diafiltration and tangential flow filtration for purification of nanoparticle suspensions.</a> Pharmaceutical Research. , (2005).</li>
<li>Roces, C., Kastner, E., Stone, P., Lowry, D., Perrie, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+Quantification+and+Validation+of+Lipid+Concentrations+within+Liposomes%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmaceutics%22%5BJournal%5D)">Rapid Quantification and Validation of Lipid Concentrations within Liposomes.</a> Pharmaceutics. 8 (3), 29(2016).</li>
<li>Kim, S. -H., Kim, J. W., Kim, D. -H., Han, S. -H., Weitz, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced-throughput+production+of+polymersomes+using+a+parallelized+capillary+microfluidic+device%5BTitle%5D)+AND+%22Microfluidics+and+Nanofluidics%22%5BJournal%5D)">Enhanced-throughput production of polymersomes using a parallelized capillary microfluidic device.</a> Microfluidics and Nanofluidics. 14 (3-4), 509-514 (2013).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Przedstawiony protokół opisuje przygotowanie liposomów wrażliwych na niską temperaturę (LTSL) przy użyciu naprzemiennego mikromiksera w jodełkę (SHM). Preparat LTSL10 umożliwia wywołane temperaturą impulsowe uwalnianie doksorubicyny w ciągu 5 minut przy klinicznie osiągalnej temperaturze hipertermicznej 42 °C. Zieleń indocyjaninowa (ICG) może być również współładowana do ogrzewania fototermicznego wyzwalanego uwalnianiem DOX. Metoda opiera się na: (i) samoorganizacji fosfolipidów w liposomach w homogenizowanym środowisku...

LTSL formulacja jest klinicznie istotnym produktem liposomalnym, który został opracowany w celu dostarczania leku chemioterapeutycznego doksorubicyny (DOX) i umożliwia skuteczne uwalnianie leku w klinicznie osiągalnej łagodnej hipertermii (T ≈ 41 °C)1. Preparat LTSL składa się z 1,2-dipalmitoilo-sn-glicero-3-fosfocholiny (DPPC), lizolipidu 1-stearoilo-2-hydroksy-sn-glicero-3-fosfatydylocholiny (MSPC; M oznacza "mono") i pegylowany lipid 1,2-distearoilo-sn-glycero-3-fosphoethanolamine-N-[methoxy(glikol polietylenowy)-2000] (DSPE-PEG2000). Po osiągnięciu temperatury przemiany fazowej (Tm ≈ 41 °C) lizolipid i DSPE-PEG2000 razem ułatwiają tworzenie się porów błonowych, co skutkuje gwałtownym uwalnianiem leku2. Przygotowanie LTSL wykorzystuje przede wszystkim podejście masowe odgórne, a mianowicie uwodnienie i wytłaczanie filmu lipidowego. Wyzwaniem pozostaje powtarzalne przygotowanie dużych partii o identycznych właściwościach i w ilościach wystarczających do zastosowań klinicznych3.
Mikrofluidyka to nowa technika przygotowywania liposomów, oferująca możliwość dostosowania wielkości nanocząstek, powtarzalność i skalowalność3. Po zoptymalizowaniu parametrów produkcyjnych, przepustowość może być skalowana w górę przez zrównoleglenie, z właściwościami identycznymi z tymi przygotowanymi na skali laboratoryjnej3,4,5. Główną przewagą mikrofluidyki nad konwencjonalnymi technikami masowymi jest zdolność do obsługi małych objętości cieczy z wysoką sterowalnością w czasie i przestrzeni poprzez miniaturyzację, co pozwala na szybszą optymalizację, przy jednoczesnym działaniu w sposób ciągły i zautomatyzowany6. Produkcja liposomów za pomocą urządzeń mikroprzepływowych jest osiągana dzięki podejściu nanoprecypitacji od dołu do góry, które jest bardziej efektywne czasowo i energetycznie, ponieważ procesy homogenizacji, takie jak ekstruzja i sonikacja, są niepotrzebne7. Zazwyczaj organiczny roztwór (np. etanol) lipidów (i ładunku hydrofobowego) miesza się z mieszalnym roztworem nierozrozpuszczalnikowym (np. wodą i ładunkiem hydrofilowym). Gdy rozpuszczalnik organiczny miesza się z rozpuszczalnikiem niebędącym rozpuszczalnikiem, rozpuszczalność lipidów ulega zmniejszeniu. Stężenie lipidów ostatecznie osiąga stężenie krytyczne, przy którym uruchamiany jest proces wytrącania7. Nanoprecywaty lipidów w końcu powiększają się i zamykają w liposom. Głównymi czynnikami decydującymi o wielkości i jednorodności liposomów są stosunek między rozpuszczalnikiem niebędącym rozpuszczalnikiem a rozpuszczalnikiem (tj. stosunek natężenia przepływu między cieczą wodną a organiczną; FRR) oraz jednorodność środowiska rozpuszczalnika podczas samoorganizacji lipidów w liposomy8.
Efektywne mieszanie płynów w mikrofluidyce jest zatem niezbędne do przygotowania jednorodnych liposomów, a różne konstrukcje mieszalników zostały wykorzystane w różnych zastosowaniach9. Mikromieszalnik w jodełkę (SHM) reprezentuje jedną z nowych generacji mieszalników pasywnych, która umożliwia wysoką przepustowość (w zakresie ml/min) przy niskim współczynniku rozcieńczenia. Jest to lepsze rozwiązanie niż tradycyjne mikroprzepływowe hydrodynamiczne urządzenia do mieszania8,10. SHM ma wzorzyste rowki w jodełkę, które szybko mieszają płyny poprzez chaotyczną adwekcję9,11. Krótka skala czasu mieszania SHM (< 5 ms, mniej niż typowa skala czasu agregacji wynosząca 10–100 ms) umożliwia samoorganizację lipidów w jednorodnym środowisku rozpuszczalnika, wytwarzając nanocząstki o jednolitym rozkładzie wielkości3,12.
Przygotowanie LTSL z mikrofluidyką nie jest jednak tak proste w porównaniu z konwencjonalnymi preparatami liposomalnymi ze względu na brak cholesterolu8, bez którego dwuwarstwy lipidowe są podatne na interdigitację wywołaną etanolem13,14,15. Do tej pory wpływ resztkowego etanolu podczas mikroprzepływowej produkcji liposomów nie był dobrze poznany. Większość zgłoszonych preparatów jest z natury odporna na interdigitation (zawierające cholesterol lub nienasycone lipidy)16, które w przeciwieństwie do LTSL są zarówno nasycone, jak i wolne od cholesterolu.
Protokół przedstawiony tutaj wykorzystuje SHM do przygotowania LTSL do dostarczania leków o uwalnianym uwalnianiu w temperaturze. W prezentowanej metodzie zapewniliśmy, że przygotowane mikroprzepływowo LTSL są nanowymiarowe (100 nm) i jednorodne (dyspersyjność < 0,2) dzięki dynamicznemu rozpraszaniu światła (DLS). Ponadto okapowaliśmy DOX przy użyciu metody transbłonowego gradientu siarczanu amonu (znanej również jako ładowanie zdalne)17 jako walidację integralności dwuwarstwy lipidowej LTSL. Zdalne ładowanie DOX wymaga, aby liposom utrzymywał gradient pH w celu osiągnięcia wysokiej wydajności enkapsulacji (EE), co jest mało prawdopodobne bez nienaruszonej dwuwarstwy lipidowej. W tej przedstawionej metodzie, odróżniającej się od typowych protokołów przygotowania liposomów mikroprzepływowych, przed usunięciem etanolu wymagany jest etap wyżarzania, aby umożliwić zdalne ładowanie; tj. w celu przywrócenia integralności dwuwarstwy lipidowej.
Jak wspomniano wcześniej, hydrofilowe i hydrofobowe ładunki mogą być również wprowadzone do początkowych rozwiązań do jednoczesnej enkapsulacji ładunków podczas tworzenia LTSL. Jako dowód słuszności koncepcji, zieleń indocyjaninowa (ICG), zatwierdzony przez FDA barwnik fluorescencyjny w bliskiej podczerwieni, który jest również obiecującym środkiem fototermicznym, jest wprowadzany do początkowej mieszaniny lipidów i z powodzeniem wprowadzany do LTSL. Laser o długości fali 808 nm służy do naświetlania LTSL obciążonych DOX/ICG i skutecznego indukowania impulsowego uwalniania DOX wywołanego ogrzewaniem fototermicznym w ciągu 5 minut.
Wszystkie instrumenty i materiały są dostępne na rynku, gotowe do użycia i bez potrzeby dostosowywania. Ponieważ wszystkie parametry formułowania LTSL zostały zoptymalizowane, zgodnie z tym protokołem, naukowcy bez wcześniejszej wiedzy z zakresu mikrofluidyki mogli również przygotować LTSL, który służy jako podstawa termoczułego systemu dostarczania leków.

<table><tbody><tr><td>1,2-dipalmitoilo-sn-glicero-3-fosfocholina (DPPC)</td><td>Lipoid</td><td>PC 16:0/16:0 (DPPC)</td><td></td></tr><tr><td>1,2-distearoilo-sn-glycero-3-fosphoethanolamine-N-[metoksy(glikol polietylenowy)-2000] (DSPE-PEG2000)Lipoid</td><td></td> <td>PE 18:0/18:0-PEG 2000 (MPEG 2000-DSPE)</td><td></td></tr><tr><td>1-stearoilo-2-hydroksy-sn-glicero-3-fosfocholina (MSPC)</td><td>Avanti Polar Lipid</td><td>855775P-500MG</td><td>Dystrybucja przez Sigma-Adrich; znany również jako Lyso 16:0 PC (nie mylić z 14:0/18:0 PC, który jest również określany jako MSPC)</td></tr><tr><td>Kwas 4-(2-hydroksyetylo)-1-piperazynoetanosulfonowy (HEPES)Adaptery</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>H3375-100G</td><td></td></tr><tr><td>, żeńskie Luer Lock do 1/4"-28UNF</td><td>IDEX Health & Nauka</td><td>P-624</td><td>Wymaga 2 jednostek. Do adapterów wlotowych</td></tr><tr><td>, montaż złączy, 1/4"-28UNF</td><td>IDEX Health & Nauka</td>: <td>P-630</td><td>Wymaga 2 jednostek. (Jedna jednostka zawierała 2 nakrętki i 2 tuleje)</td></tr><tr><td>Siarczan amonu ((NH4)2SO4)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>31119-1KG-M</td><td></td></tr><tr><td>Fiolka Bijou</td><td>VWR</td><td>216-0980</td><td>7 mL, przezroczysta, polistyrenowa fiolka</td></tr><tr><td>Filtr odśrodkowy</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>UFC801008</td><td>10 kDa MWCO, Wirówka z filtrem odśrodkowym Amicon Ultra-4</td></tr><tr><td></td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>Heraeus Megafuge 8R</td><td>z wirnikiem</td></tr> <tr><td>o stałym kącie nachylenia HIGHConic IIICuvette</td><td>Fisher Scientific</td><td>11602609</td><td>Jednorazowa kuweta polistyrenowa, mała objętość, do pomiaru DLS</td></tr><tr><td>Zestaw do dializy - Pur-A-Lyzer Maxi</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>PURX12015-1KT</td><td>12-14 kDa</td></tr><tr><td>MWCO Dimetylosulfotlenek (DMSO)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>34943-1L-M</td><td></td></tr><tr><td>DLS Instrument</td><td>Malvern Panalytical</td><td>Zetasizer Nano ZS90</td><td></td></tr><tr><td>Chlorowodorek doksorubicyny (DOX)</td><td>Apollo Scientific</td><td>BID0120</td><td></td></tr><tr><td>Instrument DSC TA</td><td>Instruments</td><td>TA Q200 DSC</td><td></td></tr><tr><td>DSC Tzero Hermetyczne pokrywki</td><td>TA Instruments</td><td>901684.901</td><td>Do pomiaru DSC</td></tr><tr><td>DSC Tzero Pans</td><td>TA Instruments</td><td>901683.901</td><td>Do pomiaru DSC</td></tr><tr><td>Zestaw prasowy do próbek DSC Tzero</td><td>TA Instruments</td><td>901600.901</td><td>Do pomiaru</td></tr> <tr>DSC<td>Etanol</td><td>VWR</td><td>20821.330</td><td>Absolutny, &ge; 99,8%</td></tr> <tr><td>FC-808 System laserowy sprzężony z włóknem</td><td>CNI Optoelectronics Tech</td><td>FC-808-8W-181315</td><td>Kolimator światłowodowy FOC-01-B w zestawie.</td></tr><tr><td>Okucie, 1/4"-28UNF do 1/16" OD</td><td>IDEX Health & Science</td><td>P-200</td><td>Do gniazdka</td></tr><tr><td>Światłowodowa sonda temperatury</td><td>Osensa</td><td>PRB-G40</td><td></td></tr><tr><td>Szklany naprzemienny mikromikser w jodełkę (SHM)</td><td>Darwin Microfluidics</td><td>Mikser w jodełkę - taśma</td> grzewcza z wiórami <td></td>szklanymi</tr><tr><td></td><td>Omega</td><td>DHT052020LD</td><td>Może być zastąpiony innym podgrzewaczem strzykawkowym, takim jak "HTC" lub "seria SRT" w celu wolniejszego nagrzewania. Ręczne okablowanie do 3-pinowej wtyczki wymagane dla modeli 240 V</td></tr><tr><td>Indocyanine Green</td><td>Adooq</td><td>A10473-100</td><td>Dystrybuowane przez Bioquote Limited (Wielka Brytania)</td></tr><tr><td>Strzykawka Luer-lock, 5 ml</td><td>VWR</td><td>613-2043</td><td>Hanke Sass Wolf SOFT-JECT 3-częściowe strzykawki, OD 12,45 mm</td></tr><tr><td>Czytnik mikropłytek</td><td>BMG Labtech</td><td>FLUOstar Omega</td><td>Zainstalowany z filtrami 485 nm (exictation) i 590 nm (emisja)</td></tr><tr><td>Microplate, 96-dołkowy,, Płaskodenny</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>611F96BK</td><td>Do pomiaru fluorescencji w czytniku mikropłytek</td></tr><tr><td>Mikropłytka, 96-dołkowa, Przezroczysty, płaskodenny</td><td>Grenier</td><td>655101</td><td>Do pomiaru absorbancji czytnik mikropłytek</td></tr><tr><td>Nakrętka, 1/4"-28UNF do 1/16" OD</td><td>IDEX Zdrowie & Science</td><td>P-245</td><td>Do gniazdka</td></tr><tr><td>sieciowy z komputera do pompy dla Aladdin, 7ft</td><td>World Precision Instruments</td><td>NE-PC7</td><td>Opcjonalnie: Pompy strzykawkowe mogą być obsługiwane ręcznie</td></tr><tr><td>Oprogramowanie sterujące pompą - Licencja na oprogramowanie SyringePumpPro dla 2</td><td>World Precision Instruments</td><td>SYRINGE-PUMP-PRO-02</td><td>Opcjonalnie: Pompy strzykawkowe mogą być obsługiwane ręcznie</td></tr><tr><td>sieciowy między pompami do Aladdin, 7 stóp</td><td>World Precision Instruments</td><td>NE-NET7</td><td>Opcjonalnie: Pompy strzykawkowe mogą być obsługiwane ręcznie</td></tr><tr><td>Kolumna chromatografii wykluczającej rozmiar (SEC)</td><td>GE Life Science</td><td>17085101</td><td>Żywica Sephadex G-25 w kolumnach odsalających PD-10</td></tr><tr><td>Chlorek sodu (NaCl)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>31434-1KG-M</td><td></td></tr><tr><td>Wodorotlenek sodu (NaOH)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5881-500G</td><td></td></tr><tr><td>Pompy strzykawkowe i (DUAL-PUMP-NE-1000)</td><td>World Precision Instruments</td><td>ALADDIN2-220/AL1000-220</td><td></td></tr><tr><td>Termostat Regulator temperatury</td><td>Inkbird</td><td>ITC-308</td><td>Może być zastąpiony innym zestawem grzałki strzykawki / termostatem</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>X100-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Rurka, ETFE (1/16" OD)</td><td>IDEX Health & Science</td><td>1516</td><td></td></tr><tr><td>Konwerter USB na RS-232</td> World <td>Precision Instruments</td><td>CBL-USB-232</td><td>Opcjonalnie: Do komputera bez portu RS-232</td></tr><tr><td>Water Bath</td><td>Grant Instruments Ltd.</td><td>JB Nova 12</td><td></td></tr></tbody></table>

mikroprzepływowa produkcja liposomów wrażliwych na temperaturę zawierających lizolipidy

Microfluidic Production of Lysolipid-Containing Temperature-Sensitive Liposomes

Prezentowany protokół umożliwia wysokoprzepustowe ciągłe przygotowanie liposomów wrażliwych na niską temperaturę (LTSL), które są zdolne do ładowania leków chemoterapeutycznych, takich jak doksorubicyna (DOX). Aby to osiągnąć, mieszaninę lipidów etanolowych i roztwór siarczanu amonu wstrzykuje się do naprzemiennego mikromiksera w jodełkę (SHM). Roztwory są szybko mieszane przez SHM, zapewniając jednorodne środowisko rozpuszczalnika do samoorganizacji liposomów. Zebrane liposomy są najpierw wyżarzane, a następnie dializowane w celu usunięcia resztek etanolu. Gradient pH siarczanu amonu ustala się poprzez wymianę buforową roztworu zewnętrznego przy użyciu chromatografii wykluczania wielkości. DOX jest następnie zdalnie ładowany do liposomów z wysoką skutecznością enkapsulacji (> 80%). Otrzymane liposomy są jednorodne pod względem wielkości o średniej średnicy Z wynoszącej 100 nm. Są one zdolne do wyzwalanego temperaturą impulsowego uwalniania zamkniętego DOX w obecności łagodnej hipertermii (42 °C). Zieleń indocyjaninowa (ICG) może być również współładowana do liposomów w celu uwolnienia DOX w bliskiej podczerwieni za pomocą lasera. Podejście mikroprzepływowe zapewnia wysokowydajne, powtarzalne i skalowalne przygotowanie LTSL.

Przygotowanie LTSL za pomocą mikrofluidyki wymaga zastosowania składu lipidowego DPPC/MSPC/DSPE-PEG20 (stosunek molowy 80/10/10; LTSL10). Rysunek 7A (po lewej) przedstawia wygląd świeżo przygotowanego LTSL10 z etapu 2.9, który ma postać przejrzystego i niewiskozycznego płynu. Formuła LTSL10 została opracowana na podstawie konwencjonalnej formuły LTSL4 (DPPC/MSPC/DSPE-PEG20, stosunek molowy 86/10/4), ponieważ LTSL4 tworzy...

Protokół przedstawia zoptymalizowane parametry przygotowania termoczułych liposomów za pomocą urządzenia mikrofluidycznego do mikromiksera w jodełkę. Umożliwia to również kokapsułkowanie doksorubicyny i zieleni indocyjaninowej do liposomów oraz fototermiczne uwalnianie doksorubicyny w celu kontrolowanego/wyzwalanego uwalniania leku.

Mikroprzepływowa produkcja liposomów wrażliwych na temperaturę zawierających lizolipidy

The presented protocol enables a high-throughput continuous preparation of low temperature-sensitive liposomes (LTSLs), which are capable of loading ...

Mikrofluidyka to nowa technika wytwarzania liposomów o rozmiarach przestrajalnych nanocząstek, charakteryzująca się dużą powtarzalnością i skalowalnością. Protokół ten umożliwia ciągłą produkcję liposomów wrażliwych na niską temperaturę w celu jednoczesnego obciążenia z lekiem chemioterapeutycznym, takim jak doksorubicyna, i barwnikiem fluorescencyjnym, takim jak zieleń indocyjaninowa. Przygotowanie komórek wykorzystuje przede wszystkim podejście odgórne, takie jak uwodnienie i wytłaczanie filmu lipidowego.Przygotowanie dużych i powtarzalnych partii do zastosowań klinicznych pozostaje wyzwaniem. Główną zaletą mikrofluidyki jest zdolność do obsługi małych objętości cieczy z dużą sterowalnością w czasie i przestrzeni, przy jednoczesnej pracy w sposób ciągły i zautomatyzowany. Procedurę zademonstrują Calvin Cheung Guanglong Ma i Amalia Ruiz, doktoranci z mojego laboratorium.Aby zmontować pompy strzykawkowe, należy użyć sieciowego pompa-pompa, aby połączyć port do komputera dodatkowej pompy strzykawkowej z portem do sieci głównej pompy strzykawkowej. Użyj sieciowego z komputera do pompy, aby podłączyć port do komputera pompy głównej do portu szeregowego RS-232 komputera. Aby zmontować mikroprzepływowy mikromikser w jodełkę, użyj nakrętki i tulejki, aby podłączyć rurki do każdego z wlotów i wylotów urządzenia.Następnie użyj drugiej nakrętki i tulejki oraz zespołu złącza, aby przekształcić końcówkę rurki dla obu wlotów na żeński luer. Aby skonfigurować oprogramowanie sterujące pompą, użyj przycisku konfiguracji pompy strzykawkowej, aby przypisać adres głównej pompy strzykawkowej i dodatkowej pompy strzykawkowej odpowiednio do Ad:01 i Ad:02, a następnie otwórz oprogramowanie sterujące pompą na komputerze. Dwie pompy strzykawkowe powinny zostać wykryte automatycznie, a następnie powinien usłyszeć sygnał dźwiękowy.Wybierz HSW Norm-Ject Średnica 5 cm³ równa się 12,45, aby przypisać średnicę do 12,45 milimetra. Ustaw szybkość na 0,25 mililitra na minutę dla pompy pierwszej i 0,75 mililitra na minutę dla pompy drugiej. Ustaw objętość na dowolną wartość powyżej pięciu mililitrów i wybierz tryb infuzji dla obu pomp.Następnie kliknij ustaw, aby potwierdzić ustawienia. Aby przygotować mieszaninę lipidów ICG LTSL10 lub LTSL10, użyj jednej pięciomililitrowej strzykawki typu luer lock, aby pobrać jeden mililitr mieszaniny lipidów i kolejnej pięciomililitrowej strzykawki typu luer lock, aby pobrać co najmniej trzy mililitry roztworu siarczanu amonu. Wsunąć kołnierz cylindra strzykawki do uchwytu strzykawki pompy, aby zainstalować załadowane strzykawki na pompach strzykawkowych w pozycji pionowej i przymocować kołnierz tłoka strzykawki do bloku popychacza pompy i owinąć drugi koniec taśmy grzewczej i sondy temperatury z termostatem wokół strzykawki zawierającej roztwór lipidów.Owinąć koniec taśmy grzewczej do strzykawki zawierającej roztwór wodny, podłączyć strzykawkę zawierającą mieszaninę lipidów do wlotu etanolu i podłączyć strzykawkę zawierającą roztwór siarczanu amonu do wlotu roztworu wodnego. Wyregulować położenie tłoka, aby usunąć wszelkie pęcherzyki powietrza ze strzykawek, jeśli to konieczne, a następnie zatykać i odłączać taśmę grzewczą w odstępach 10-sekundowych, aż temperatura strzykawek osiągnie około 51 stopni. Gdy termostat pokaże odpowiednią temperaturę, kliknij przycisk Uruchom wszystko w oprogramowaniu sterującym pompą, aby uruchomić pompy strzykawkowe i sprawdzić, czy przepływ płynu jest wolny od pęcherzyków powietrza i wszelkich wycieków.Pobrać próbki liposomów do fiolki i wstrzymać lub przerwać infuzję, gdy którakolwiek ze strzykawek jest prawie pusta. Zebrane roztwory liposomów wyżarzać w łaźni wodnej o temperaturze 60 stopni Celsjusza przez 1-1/2 godziny przed przeniesieniem roztworów do probówek dializacyjnych w celu dializy na jednym litrze 240-milimolowego siarczanu amonu przez co najmniej cztery godziny w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Następnie przechowuj oczyszczone liposomy w temperaturze czterech stopni Celsjusza.W celu zdalnego obciążenia liposomów za pomocą transbłonowego gradientu pH, należy załadować 25 mililitrów HBS na wierzch kolumny chromatograficznej wykluczającej rozmiar i pozwolić całemu eluentowi przepłynąć przez kolumnę. Załaduj jeden mililitr dializowanych liposomów do kolumny. Gdy cały roztwór lipidowy przejdzie przez kolumnę, dodaj 1,5 mililitra świeżego HBS do kolumny.Gdy cały bufor przejdzie przez kolumnę, dodaj trzy mililitry świeżego HBS do kolumny i zbierz eluent. Następnie dodać roztwór DOX w stosunku molowym DOX:fosfolipid 1:20 do jednego mililitra roztworu liposomów wymiany buforowej w fiolce Biju i umieścić fiolkę w łaźni wodnej o temperaturze 37 stopni Celsjusza na 1-1/2 godziny. Po załadowaniu oczyść liposomy za pomocą chromatografii wykluczającej wielkość, jak właśnie pokazano.Aby wyzwalać uwalnianie zawartości liposomu wywołane ogrzewaniem laserowym, ustaw łaźnię wodną na 37 stopni Celsjusza. Gdy temperatura się ustabilizuje, dodaj 200 mikrolitrów liposomów załadowanych DOX do każdej studzienki przezroczystej 96-dołkowej płytki i umieść płytkę w łaźni wodnej z dnem zanurzonym w wodzie. Następnie ustaw prąd systemu laserowego na 2,27 ampera i umieść kolimator systemu laserowego pięć centymetrów pionowo nad powierzchnią 96-dołkowej płytki.Włącz laser i użyj światłowodowej sondy temperatury, aby monitorować temperaturę raz na minutę. Po pięciu i 10 minutach odessaj 10 mikrolitrów liposomów załadowanych DOX z każdej studzienki przezroczystej 96-dołkowej płytki i dodaj 190 mikrolitrów HBS do trzech pojedynczych dołków czarnej 96-dołkowej płytki. Aby ocenić całkowite uwolnienie leku, wymieszaj 10 mikrolitrów liposomów ze 170 mikrolitrami HBS i 20 mikrolitrami 1% roztworu detergentu Triton X-100 w trzech oddzielnych dołkach czarnej 96-dołkowej płytki.Następnie zmierz intensywność fluorescencji DOX na czytniku płytkowym. Mikroprzepływowa produkcja LTSL4 powoduje powstanie lepkiego roztworu przypominającego żel, co ilustruje duża liczba uwięzionych pęcherzyków powietrza, podczas gdy przygotowanie LTSL10 powoduje powstanie klarownej, nielepkiej cieczy. Dynamiczny pomiar rozpraszania światła LTSL10 przygotowany w temperaturze 51 stopni Celsjusza pokazuje oczekiwaną średnią średnicę i dyspersję Z, co wskazuje na powodzenie eksperymentu.Jednak gdy LTSL10 przygotowuje się w temperaturze 20 stopni Celsjusza, uzyskuje się większe i bardziej rozproszone liposomy, co daje nieoptymalny produkt. LTSL przygotowane konwencjonalną metodą hydratacji filmu lipidowego z ekstruzją wykazują skuteczność enkapsulacji DOX na poziomie 50-80%Przy wyżarzaniu, LTSL10 przygotowany metodą mikrofluidyczną powoduje znaczny wzrost wydajności enkapsulacji DOX do średniej 85%, co wskazuje na powodzenie zdalnego ładowania DOX i obecność transbłonowego gradientu pH. Profil uwalniania DOX LTSL10 został określony jako wrażliwy na temperaturę.LTSL10 ma stosunkowo szerokie przejście fazowe, którego początek przypada na 41,6 stopni Celsjusza, osiągając szczyt przy 42,6 stopniach Celsjusza. Efektywność obciążenia ICG zależy od początkowego stężenia ICG oraz wielkości i dyspersji próbek. Co więcej, naświetlanie LTSL10 ICG laserem bliskiej podczerwieni indukuje nagrzewanie fototermiczne, powodując uwalnianie DOX.Podczas próby wykonania tej procedury ważne jest, aby zapewnić stabilny przepływ płynu, tak aby mieszanie płynu, a tym samym tworzenie liposomów, pozostało powtarzalne. Wyżarzanie liposomów i dializa to dwa ważne kroki zapewniające stabilny preparat liposomowy o wysokiej ładowności. Testy in vivo można również przeprowadzić w celu oceny biodystrybucji LTSL10, uwalniania leku i aktywności przeciwnowotworowej.Nasz protokół może być wykorzystany do udanej mikroprzepływowej produkcji bezcholesterolowych liposomów termoczułych zawierających lizolipidy do zastosowań związanych z dostarczaniem leków.

microfluidic-production-lysolipid-containing-temperature-sensitive

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioinżynieria

Niniejszy protokół opisuje metodę ekstruzji służącą do przygotowania pęcherzyków lipidowych o rozmiarach submikronowych i wysokim stopniu jednorodności. Metoda ta wykorzystuje system z kontrolą ciśnienia i regulowanym przepływem azotu do przygotowania liposomów. W opracowaniu przedstawiono przygotowanie lipidów1,2, ekstruzję liposomów oraz charakterystykę ich rozmiaru.

Metoda ekstruzji z kontrolowanym stałym ciśnieniem do przygotowania nano-rozmiarowych pęcherzyków lipidowych

Przekształcanie funkcjonalnych białek błonowych w gigantyczne liposomy o określonym składzie jest potężnym podejściem w połączeniu z elektrofizjologią patch-clamp. Jednak konwencjonalna produkcja gigantycznych liposomów może być niezgodna ze stabilnością białka.  Opisujemy protokoły wytwarzania gigantycznych liposomów z czystych lipidów lub małych liposomów zawierających kanały jonowe.

Preparat liposomów olbrzymich do obrazowania i elektrofizjologii patch-clamp

Prezentowany protokół opisuje analizę transportu za pośrednictwem białka błonowego na poziomie pojedynczego transportera przy użyciu dwuwarstw lipidowych bez rozpuszczalników rozciągających się na pore. Osiągnięto to poprzez stworzenie masowo produkowanych chipów z matrycami nanoporowymi, w połączeniu z wysoce równoległym pozyskiwaniem i analizą danych, co umożliwi w przyszłości tworzenie badań przesiewowych efektorów białek błonowych.

Procesy transportu błonowego analizowane przez wysoce równoległy system chipów nanoporowych w rozdzielczości pojedynczego białka

Demonstrujemy system tworzenia dwuwarstwowych lipidów, który można przechowywać, przenośny. Dwuwarstwowa błona lipidowa może powstać w ciągu 1 godziny z ponad 80% skutecznością, gdy zamrożony prekursor błony zostanie doprowadzony do temperatury otoczenia. System ten ograniczy pracochłonne procesy i wiedzę specjalistyczną związaną z kanałami jonowymi.

Zautomatyzowane tworzenie dwuwarstwowej błony lipidowej za pomocą cienkiej warstwy polidimetylosiloksanu

Liposomy zawierające amfifile jednołańcuchowe, szczególnie kwasy tłuszczowe, wykazują odmienne właściwości w porównaniu do tych zawierających diacylofosfolipidy ze względu na unikalne właściwości chemiczne amfifilów jednołańcuchowych. Tutaj opisujemy techniki przygotowania, oczyszczania i stosowania liposomów składających się z części lub całości tych amfifilów.

Przygotowanie, oczyszczanie i stosowanie liposomów zawierających kwasy tłuszczowe

Dwuwarstwowe membrany fosfolipidowe (DLBM) z solidnym wsparciem, wolne od białek, mogą być przekształcane w złożone i dynamiczne sieci nanorurek lipidowych i mogą służyć jako oddolne modele 2D retikulum endoplazmatycznego.

Spontaniczne powstawanie i rearanżacja sztucznych sieci nanorurek lipidowych jako model oddolny retikulum endoplazmatycznego

Ten protokół opisuje wytwarzanie liposomów oraz sposób, w jaki można je unieruchomić na powierzchni i zobrazować indywidualnie w masowy równoległy sposób za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej. Pozwala to na ilościowe określenie wielkości i niejednorodności składu między pojedynczymi liposomami populacji.

Ilościowy test pojedynczego liposomu oparty na mikroskopii fluorescencyjnej do wykrywania niejednorodności składu między poszczególnymi liposomami

Ten protokół opisuje efektywną metodę produkcji wysokiej jakości proteoliposomu metodą dializy dwuwarstwowej przy użyciu systemu bezkomórkowego pszenicy i liposomów. Metoda ta zapewnia odpowiednie środki do analizy funkcjonalnej białek błonowych, badań przesiewowych celów leków i opracowywania przeciwciał.

Bezkomórkowa produkcja proteoliposomów do analizy funkcjonalnej i rozwoju przeciwciał ukierunkowanych na białka błonowe

Metody produkcji nanocząsteczek lipidowych (LNP) oparte na mikroprzepływach przyciągnęły uwagę w systemach dostarczania leków (DDS), w tym w dostarczaniu RNA. Protokół ten opisuje procesy wytwarzania, produkcji LNP (LNP ładowanego siRNA) i oceny LNP przy użyciu naszego oryginalnego urządzenia mikroprzepływowego o nazwie iLiNP.

Produkcja nanocząstek lipidowych obciążonych siRNA za pomocą urządzenia mikroprzepływowego

Obecny protokół opisuje montaż liposomów wspomagany oktanolem (OLA), technikę mikroprzepływową do generowania biokompatybilnych liposomów. OLA wytwarza monorozproszone liposomy o rozmiarach mikronów z wydajną enkapsulacją, co pozwala na natychmiastowe eksperymentowanie na chipie. Przewiduje się, że protokół ten będzie szczególnie przydatny w biologii syntetycznej i badaniach nad komórkami syntetycznymi.

Wbudowany zespół liposomów wspomagany oktanolem do bioinżynierii

Poznaj mikroprzepływową produkcję termosensytywnych liposomów zawierających lizolipidy do kontrolowanego uwalniania leków. Ta metoda umożliwia współenkapsulację doksorubicyny i indocyjaniny zielonej z fototermicznym wyzwalaniem.

Mikroprzepływowa produkcja liposomów wrażliwych na temperaturę zawierających lizolipidy

Przeglądaj więcej filmów