Mikroprzepływowa produkcja liposomów wrażliwych na temperaturę zawierających lizolipidy

Protokół przedstawia zoptymalizowane parametry przygotowania termoczułych liposomów za pomocą urządzenia mikrofluidycznego do mikromiksera w jodełkę. Umożliwia to również kokapsułkowanie doksorubicyny i zieleni indocyjaninowej do liposomów oraz fototermiczne uwalnianie doksorubicyny w celu kontrolowanego/wyzwalanego uwalniania leku.

Mikrofluidyka to nowa technika wytwarzania liposomów o rozmiarach przestrajalnych nanocząstek, charakteryzująca się dużą powtarzalnością i skalowalnością. Protokół ten umożliwia ciągłą produkcję liposomów wrażliwych na niską temperaturę w celu jednoczesnego obciążenia z lekiem chemioterapeutycznym, takim jak doksorubicyna, i barwnikiem fluorescencyjnym, takim jak zieleń indocyjaninowa. Przygotowanie komórek wykorzystuje przede wszystkim podejście odgórne, takie jak uwodnienie i wytłaczanie filmu lipidowego.

Przygotowanie dużych i powtarzalnych partii do zastosowań klinicznych pozostaje wyzwaniem. Główną zaletą mikrofluidyki jest zdolność do obsługi małych objętości cieczy z dużą sterowalnością w czasie i przestrzeni, przy jednoczesnej pracy w sposób ciągły i zautomatyzowany. Procedurę zademonstrują Calvin Cheung Guanglong Ma i Amalia Ruiz, doktoranci z mojego laboratorium.

Aby zmontować pompy strzykawkowe, należy użyć sieciowego pompa-pompa, aby połączyć port do komputera dodatkowej pompy strzykawkowej z portem do sieci głównej pompy strzykawkowej. Użyj sieciowego z komputera do pompy, aby podłączyć port do komputera pompy głównej do portu szeregowego RS-232 komputera. Aby zmontować mikroprzepływowy mikromikser w jodełkę, użyj nakrętki i tulejki, aby podłączyć rurki do każdego z wlotów i wylotów urządzenia.

Następnie użyj drugiej nakrętki i tulejki oraz zespołu złącza, aby przekształcić końcówkę rurki dla obu wlotów na żeński luer. Aby skonfigurować oprogramowanie sterujące pompą, użyj przycisku konfiguracji pompy strzykawkowej, aby przypisać adres głównej pompy strzykawkowej i dodatkowej pompy strzykawkowej odpowiednio do Ad:01 i Ad:02, a następnie otwórz oprogramowanie sterujące pompą na komputerze. Dwie pompy strzykawkowe powinny zostać wykryte automatycznie, a następnie powinien usłyszeć sygnał dźwiękowy.

Wybierz HSW Norm-Ject Średnica 5 cm³ równa się 12,45, aby przypisać średnicę do 12,45 milimetra. Ustaw szybkość na 0,25 mililitra na minutę dla pompy pierwszej i 0,75 mililitra na minutę dla pompy drugiej. Ustaw objętość na dowolną wartość powyżej pięciu mililitrów i wybierz tryb infuzji dla obu pomp.

Następnie kliknij ustaw, aby potwierdzić ustawienia. Aby przygotować mieszaninę lipidów ICG LTSL10 lub LTSL10, użyj jednej pięciomililitrowej strzykawki typu luer lock, aby pobrać jeden mililitr mieszaniny lipidów i kolejnej pięciomililitrowej strzykawki typu luer lock, aby pobrać co najmniej trzy mililitry roztworu siarczanu amonu. Wsunąć kołnierz cylindra strzykawki do uchwytu strzykawki pompy, aby zainstalować załadowane strzykawki na pompach strzykawkowych w pozycji pionowej i przymocować kołnierz tłoka strzykawki do bloku popychacza pompy i owinąć drugi koniec taśmy grzewczej i sondy temperatury z termostatem wokół strzykawki zawierającej roztwór lipidów.

Owinąć koniec taśmy grzewczej do strzykawki zawierającej roztwór wodny, podłączyć strzykawkę zawierającą mieszaninę lipidów do wlotu etanolu i podłączyć strzykawkę zawierającą roztwór siarczanu amonu do wlotu roztworu wodnego. Wyregulować położenie tłoka, aby usunąć wszelkie pęcherzyki powietrza ze strzykawek, jeśli to konieczne, a następnie zatykać i odłączać taśmę grzewczą w odstępach 10-sekundowych, aż temperatura strzykawek osiągnie około 51 stopni. Gdy termostat pokaże odpowiednią temperaturę, kliknij przycisk Uruchom wszystko w oprogramowaniu sterującym pompą, aby uruchomić pompy strzykawkowe i sprawdzić, czy przepływ płynu jest wolny od pęcherzyków powietrza i wszelkich wycieków.

Pobrać próbki liposomów do fiolki i wstrzymać lub przerwać infuzję, gdy którakolwiek ze strzykawek jest prawie pusta. Zebrane roztwory liposomów wyżarzać w łaźni wodnej o temperaturze 60 stopni Celsjusza przez 1-1/2 godziny przed przeniesieniem roztworów do probówek dializacyjnych w celu dializy na jednym litrze 240-milimolowego siarczanu amonu przez co najmniej cztery godziny w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Następnie przechowuj oczyszczone liposomy w temperaturze czterech stopni Celsjusza.

W celu zdalnego obciążenia liposomów za pomocą transbłonowego gradientu pH, należy załadować 25 mililitrów HBS na wierzch kolumny chromatograficznej wykluczającej rozmiar i pozwolić całemu eluentowi przepłynąć przez kolumnę. Załaduj jeden mililitr dializowanych liposomów do kolumny. Gdy cały roztwór lipidowy przejdzie przez kolumnę, dodaj 1,5 mililitra świeżego HBS do kolumny.

Gdy cały bufor przejdzie przez kolumnę, dodaj trzy mililitry świeżego HBS do kolumny i zbierz eluent. Następnie dodać roztwór DOX w stosunku molowym DOX:fosfolipid 1:20 do jednego mililitra roztworu liposomów wymiany buforowej w fiolce Biju i umieścić fiolkę w łaźni wodnej o temperaturze 37 stopni Celsjusza na 1-1/2 godziny. Po załadowaniu oczyść liposomy za pomocą chromatografii wykluczającej wielkość, jak właśnie pokazano.

Aby wyzwalać uwalnianie zawartości liposomu wywołane ogrzewaniem laserowym, ustaw łaźnię wodną na 37 stopni Celsjusza. Gdy temperatura się ustabilizuje, dodaj 200 mikrolitrów liposomów załadowanych DOX do każdej studzienki przezroczystej 96-dołkowej płytki i umieść płytkę w łaźni wodnej z dnem zanurzonym w wodzie. Następnie ustaw prąd systemu laserowego na 2,27 ampera i umieść kolimator systemu laserowego pięć centymetrów pionowo nad powierzchnią 96-dołkowej płytki.

Włącz laser i użyj światłowodowej sondy temperatury, aby monitorować temperaturę raz na minutę. Po pięciu i 10 minutach odessaj 10 mikrolitrów liposomów załadowanych DOX z każdej studzienki przezroczystej 96-dołkowej płytki i dodaj 190 mikrolitrów HBS do trzech pojedynczych dołków czarnej 96-dołkowej płytki. Aby ocenić całkowite uwolnienie leku, wymieszaj 10 mikrolitrów liposomów ze 170 mikrolitrami HBS i 20 mikrolitrami 1% roztworu detergentu Triton X-100 w trzech oddzielnych dołkach czarnej 96-dołkowej płytki.

Następnie zmierz intensywność fluorescencji DOX na czytniku płytkowym. Mikroprzepływowa produkcja LTSL4 powoduje powstanie lepkiego roztworu przypominającego żel, co ilustruje duża liczba uwięzionych pęcherzyków powietrza, podczas gdy przygotowanie LTSL10 powoduje powstanie klarownej, nielepkiej cieczy. Dynamiczny pomiar rozpraszania światła LTSL10 przygotowany w temperaturze 51 stopni Celsjusza pokazuje oczekiwaną średnią średnicę i dyspersję Z, co wskazuje na powodzenie eksperymentu.

Jednak gdy LTSL10 przygotowuje się w temperaturze 20 stopni Celsjusza, uzyskuje się większe i bardziej rozproszone liposomy, co daje nieoptymalny produkt. LTSL przygotowane konwencjonalną metodą hydratacji filmu lipidowego z ekstruzją wykazują skuteczność enkapsulacji DOX na poziomie 50-80%Przy wyżarzaniu, LTSL10 przygotowany metodą mikrofluidyczną powoduje znaczny wzrost wydajności enkapsulacji DOX do średniej 85%, co wskazuje na powodzenie zdalnego ładowania DOX i obecność transbłonowego gradientu pH. Profil uwalniania DOX LTSL10 został określony jako wrażliwy na temperaturę.

LTSL10 ma stosunkowo szerokie przejście fazowe, którego początek przypada na 41,6 stopni Celsjusza, osiągając szczyt przy 42,6 stopniach Celsjusza. Efektywność obciążenia ICG zależy od początkowego stężenia ICG oraz wielkości i dyspersji próbek. Co więcej, naświetlanie LTSL10 ICG laserem bliskiej podczerwieni indukuje nagrzewanie fototermiczne, powodując uwalnianie DOX.

Podczas próby wykonania tej procedury ważne jest, aby zapewnić stabilny przepływ płynu, tak aby mieszanie płynu, a tym samym tworzenie liposomów, pozostało powtarzalne. Wyżarzanie liposomów i dializa to dwa ważne kroki zapewniające stabilny preparat liposomowy o wysokiej ładowności. Testy in vivo można również przeprowadzić w celu oceny biodystrybucji LTSL10, uwalniania leku i aktywności przeciwnowotworowej.

Nasz protokół może być wykorzystany do udanej mikroprzepływowej produkcji bezcholesterolowych liposomów termoczułych zawierających lizolipidy do zastosowań związanych z dostarczaniem leków.