Mikroprzepływowa produkcja liposomów wrażliwych na temperaturę zawierających lizolipidy
March 3rd, 2020
Protokół przedstawia zoptymalizowane parametry przygotowania termoczułych liposomów za pomocą urządzenia mikrofluidycznego do mikromiksera w jodełkę. Umożliwia to również kokapsułkowanie doksorubicyny i zieleni indocyjaninowej do liposomów oraz fototermiczne uwalnianie doksorubicyny w celu kontrolowanego/wyzwalanego uwalniania leku.
Mikrofluidyka to nowa technika wytwarzania liposomów o rozmiarach przestrajalnych nanocząstek, charakteryzująca się dużą powtarzalnością i skalowalnością. Protokół ten umożliwia ciągłą produkcję liposomów wrażliwych na niską temperaturę w celu jednoczesnego obciążenia z lekiem chemioterapeutycznym, takim jak doksorubicyna, i barwnikiem fluorescencyjnym, takim jak zieleń indocyjaninowa. Przygotowanie komórek wykorzystuje przede wszystkim podejście odgórne, takie jak uwodnienie i wytłaczanie filmu lipidowego.
Przygotowanie dużych i powtarzalnych partii do zastosowań klinicznych pozostaje wyzwaniem. Główną zaletą mikrofluidyki jest zdolność do obsługi małych objętości cieczy z dużą sterowalnością w czasie i przestrzeni, przy jednoczesnej pracy w sposób ciągły i zautomatyzowany. Procedurę zademonstrują Calvin Cheung Guanglong Ma i Amalia Ruiz, doktoranci z mojego laboratorium.
Aby zmontować pompy strzykawkowe, należy użyć sieciowego pompa-pompa, aby połączyć port do komputera dodatkowej pompy strzykawkowej z portem do sieci głównej pompy strzykawkowej. Użyj sieciowego z komputera do pompy, aby podłączyć port do komputera pompy głównej do portu szeregowego RS-232 komputera. Aby zmontować mikroprzepływowy mikromikser w jodełkę, użyj nakrętki i tulejki, aby podłączyć rurki do każdego z wlotów i wylotów urządzenia.
Następnie użyj drugiej nakrętki i tulejki oraz zespołu złącza, aby przekształcić końcówkę rurki dla obu wlotów na żeński luer. Aby skonfigurować oprogramowanie sterujące pompą, użyj przycisku konfiguracji pompy strzykawkowej, aby przypisać adres głównej pompy strzykawkowej i dodatkowej pompy strzykawkowej odpowiednio do Ad:01 i Ad:02, a następnie otwórz oprogramowanie sterujące pompą na komputerze. Dwie pompy strzykawkowe powinny zostać wykryte automatycznie, a następnie powinien usłyszeć sygnał dźwiękowy.
Wybierz HSW Norm-Ject Średnica 5 cm³ równa się 12,45, aby przypisać średnicę do 12,45 milimetra. Ustaw szybkość na 0,25 mililitra na minutę dla pompy pierwszej i 0,75 mililitra na minutę dla pompy drugiej. Ustaw objętość na dowolną wartość powyżej pięciu mililitrów i wybierz tryb infuzji dla obu pomp.
Następnie kliknij ustaw, aby potwierdzić ustawienia. Aby przygotować mieszaninę lipidów ICG LTSL10 lub LTSL10, użyj jednej pięciomililitrowej strzykawki typu luer lock, aby pobrać jeden mililitr mieszaniny lipidów i kolejnej pięciomililitrowej strzykawki typu luer lock, aby pobrać co najmniej trzy mililitry roztworu siarczanu amonu. Wsunąć kołnierz cylindra strzykawki do uchwytu strzykawki pompy, aby zainstalować załadowane strzykawki na pompach strzykawkowych w pozycji pionowej i przymocować kołnierz tłoka strzykawki do bloku popychacza pompy i owinąć drugi koniec taśmy grzewczej i sondy temperatury z termostatem wokół strzykawki zawierającej roztwór lipidów.
Owinąć koniec taśmy grzewczej do strzykawki zawierającej roztwór wodny, podłączyć strzykawkę zawierającą mieszaninę lipidów do wlotu etanolu i podłączyć strzykawkę zawierającą roztwór siarczanu amonu do wlotu roztworu wodnego. Wyregulować położenie tłoka, aby usunąć wszelkie pęcherzyki powietrza ze strzykawek, jeśli to konieczne, a następnie zatykać i odłączać taśmę grzewczą w odstępach 10-sekundowych, aż temperatura strzykawek osiągnie około 51 stopni. Gdy termostat pokaże odpowiednią temperaturę, kliknij przycisk Uruchom wszystko w oprogramowaniu sterującym pompą, aby uruchomić pompy strzykawkowe i sprawdzić, czy przepływ płynu jest wolny od pęcherzyków powietrza i wszelkich wycieków.
Pobrać próbki liposomów do fiolki i wstrzymać lub przerwać infuzję, gdy którakolwiek ze strzykawek jest prawie pusta. Zebrane roztwory liposomów wyżarzać w łaźni wodnej o temperaturze 60 stopni Celsjusza przez 1-1/2 godziny przed przeniesieniem roztworów do probówek dializacyjnych w celu dializy na jednym litrze 240-milimolowego siarczanu amonu przez co najmniej cztery godziny w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Następnie przechowuj oczyszczone liposomy w temperaturze czterech stopni Celsjusza.
W celu zdalnego obciążenia liposomów za pomocą transbłonowego gradientu pH, należy załadować 25 mililitrów HBS na wierzch kolumny chromatograficznej wykluczającej rozmiar i pozwolić całemu eluentowi przepłynąć przez kolumnę. Załaduj jeden mililitr dializowanych liposomów do kolumny. Gdy cały roztwór lipidowy przejdzie przez kolumnę, dodaj 1,5 mililitra świeżego HBS do kolumny.
Gdy cały bufor przejdzie przez kolumnę, dodaj trzy mililitry świeżego HBS do kolumny i zbierz eluent. Następnie dodać roztwór DOX w stosunku molowym DOX:fosfolipid 1:20 do jednego mililitra roztworu liposomów wymiany buforowej w fiolce Biju i umieścić fiolkę w łaźni wodnej o temperaturze 37 stopni Celsjusza na 1-1/2 godziny. Po załadowaniu oczyść liposomy za pomocą chromatografii wykluczającej wielkość, jak właśnie pokazano.
Aby wyzwalać uwalnianie zawartości liposomu wywołane ogrzewaniem laserowym, ustaw łaźnię wodną na 37 stopni Celsjusza. Gdy temperatura się ustabilizuje, dodaj 200 mikrolitrów liposomów załadowanych DOX do każdej studzienki przezroczystej 96-dołkowej płytki i umieść płytkę w łaźni wodnej z dnem zanurzonym w wodzie. Następnie ustaw prąd systemu laserowego na 2,27 ampera i umieść kolimator systemu laserowego pięć centymetrów pionowo nad powierzchnią 96-dołkowej płytki.
Włącz laser i użyj światłowodowej sondy temperatury, aby monitorować temperaturę raz na minutę. Po pięciu i 10 minutach odessaj 10 mikrolitrów liposomów załadowanych DOX z każdej studzienki przezroczystej 96-dołkowej płytki i dodaj 190 mikrolitrów HBS do trzech pojedynczych dołków czarnej 96-dołkowej płytki. Aby ocenić całkowite uwolnienie leku, wymieszaj 10 mikrolitrów liposomów ze 170 mikrolitrami HBS i 20 mikrolitrami 1% roztworu detergentu Triton X-100 w trzech oddzielnych dołkach czarnej 96-dołkowej płytki.
Następnie zmierz intensywność fluorescencji DOX na czytniku płytkowym. Mikroprzepływowa produkcja LTSL4 powoduje powstanie lepkiego roztworu przypominającego żel, co ilustruje duża liczba uwięzionych pęcherzyków powietrza, podczas gdy przygotowanie LTSL10 powoduje powstanie klarownej, nielepkiej cieczy. Dynamiczny pomiar rozpraszania światła LTSL10 przygotowany w temperaturze 51 stopni Celsjusza pokazuje oczekiwaną średnią średnicę i dyspersję Z, co wskazuje na powodzenie eksperymentu.
Jednak gdy LTSL10 przygotowuje się w temperaturze 20 stopni Celsjusza, uzyskuje się większe i bardziej rozproszone liposomy, co daje nieoptymalny produkt. LTSL przygotowane konwencjonalną metodą hydratacji filmu lipidowego z ekstruzją wykazują skuteczność enkapsulacji DOX na poziomie 50-80%Przy wyżarzaniu, LTSL10 przygotowany metodą mikrofluidyczną powoduje znaczny wzrost wydajności enkapsulacji DOX do średniej 85%, co wskazuje na powodzenie zdalnego ładowania DOX i obecność transbłonowego gradientu pH. Profil uwalniania DOX LTSL10 został określony jako wrażliwy na temperaturę.
LTSL10 ma stosunkowo szerokie przejście fazowe, którego początek przypada na 41,6 stopni Celsjusza, osiągając szczyt przy 42,6 stopniach Celsjusza. Efektywność obciążenia ICG zależy od początkowego stężenia ICG oraz wielkości i dyspersji próbek. Co więcej, naświetlanie LTSL10 ICG laserem bliskiej podczerwieni indukuje nagrzewanie fototermiczne, powodując uwalnianie DOX.
Podczas próby wykonania tej procedury ważne jest, aby zapewnić stabilny przepływ płynu, tak aby mieszanie płynu, a tym samym tworzenie liposomów, pozostało powtarzalne. Wyżarzanie liposomów i dializa to dwa ważne kroki zapewniające stabilny preparat liposomowy o wysokiej ładowności. Testy in vivo można również przeprowadzić w celu oceny biodystrybucji LTSL10, uwalniania leku i aktywności przeciwnowotworowej.
Nasz protokół może być wykorzystany do udanej mikroprzepływowej produkcji bezcholesterolowych liposomów termoczułych zawierających lizolipidy do zastosowań związanych z dostarczaniem leków.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Przegląd
Ten protokół opisuje przygotowanie termosensytywnych liposomów za pomocą urządzenia mikrofluidycznego z ułożonym w szachownicę mieszadłem. Umożliwia współenkapsulacje doksorubicyny i indocyjaninowej zieleni, umożliwiając fototermicznie wyzwalane uwalnianie dla kontrolowanego dostarczania leków.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Mikrofluidyka
- Systemy dostarczania leków
- Nanotechnologia
Tło
- Mikrofluidyka pozwala na precyzyjną kontrolę nad przygotowaniem liposomów.
- Istnieją wyzwania w produkcji dużych, powtarzalnych partii do użytku klinicznego.
- Termosensytywne liposomy mogą poprawić efektywność dostarczania leków.
- Współładowanie z chemioterapeutykami i fluorescującymi barwnikami jest korzystne dla monitorowania.
Cel badania
- Optymalizacja parametrów przygotowania termosensytywnych liposomów.
- Wzmocnienie współenkapsulacji środków terapeutycznych.
- Wykazanie kontrolowanego uwalniania leków za pomocą metod fototermicznych.
Stosowane metody
- Urządzenie mikrofluidyczne z ułożonym w szachownicę mieszadłem.
- Ciągła produkcja liposomów.
- Współładowanie doksorubicyny i indocyjaninowej zieleni.
- Fototermicznie wyzwalane mechanizmy uwalniania.
Główne wyniki
- Udana przygotowanie termosensytywnych liposomów.
- Wykazane współładowanie doksorubicyny i indocyjaninowej zieleni.
- Osiągnięte kontrolowane uwalnianie doksorubicyny po stymulacji fototermicznej.
- Skalowalność i powtarzalność metody zostały zweryfikowane.
Wnioski
- Protokół poprawia efektywność przygotowania liposomów.
- Mikrofluidyka oferuje obiecujące podejście do systemów dostarczania leków.
- Fototermicznie wyzwalane uwalnianie może poprawić wyniki terapeutyczne.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
This protocol enables high-throughput, reproducible production of temperature-sensitive liposomes for co-loading chemotherapeutics and imaging agents, addressing scalability challenges in nanomedicine manufacturing. The microfluidic approach supports predictive formulation control and rapid iteration in early-stage drug delivery development, reducing batch-to-batch variability that impacts preclinical consistency. It positions microfluidics as a scalable platform for generating lysolipid-containing liposomes with defined size and release properties, facilitating translational progression from discovery to IND-enabling studies.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables rapid screening of lipid compositions for temperature-triggered release profiles to interrogate drug delivery hypotheses.
- Operational Value: Provides standardized liposome batches with consistent Z-average diameter (~100 nm) for reliable structure-activity relationship studies.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Supports co-loading of doxorubicin and indocyanine green to develop dual-readout assays for drug release and photothermal response.
- Operational Value: Ensures high encapsulation efficiency (>80%) and reproducible size distribution, critical for assay robustness in compound screening cascades.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Generates liposomes with defined phase transition onset (41.6°C) and peak release (42.6°C) to enable hyperthermia-triggered efficacy studies in tumor models.
- Operational Value: Facilitates remote loading via ammonium sulfate pH gradient, improving drug payload consistency for pharmacokinetic and biodistribution evaluations.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into early discovery through lead optimization by providing tunable, scalable liposome formulations that support iterative design of thermosensitive nanocarriers.
- Discovery Biology: Enables hypothesis testing of lipid composition effects on membrane permeability and drug release kinetics under mild hyperthermia.
- Screening: Delivers reproducible, monodisperse liposomes suitable for high-content screening of drug release under thermal or laser-triggered conditions.
- Analytics: Provides quantifiable outputs including Z-average diameter, encapsulation efficiency, and temperature-dependent release profiles for formulation comparison.
- Translational Research: Supports continuity into preclinical studies by producing liposomes capable of NIR laser-triggered release via ICG co-loading, enabling photodynamic therapy modeling.
- Enterprise Reuse: Establishes a continuous microfluidic platform adaptable to other lipid systems and therapeutic payloads, reducing revalidation burden across projects.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Enhances predictive confidence in liposome performance by eliminating variability from bulk methods like lipid film hydration and extrusion.
- Operational Value: Delivers high-throughput, continuous production with precise flow control, improving manufacturing throughput and reducing operator-dependent variability.
- Strategic Value: Enables faster go/no-go decisions in formulation development by providing rapid, scalable access to liposomes with defined thermal release thresholds.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted advancement by generating consistent nanocarrier batches that improve reproducibility in efficacy and safety studies.
Implementation Considerations
- Requires expertise in microfluidic system setup, including syringe pump synchronization and temperature control for lipid and aqueous phases.
- Depends on access to staggered herringbone micromixer devices and compatible tubing, fittings, and heating elements for stable lipid solution handling.
- Necessitates standardized operating procedures for annealing, dialysis, and buffer exchange steps to ensure pH-gradient formation and remote loading efficiency.
- Involves adaptation considerations when shifting lysolipid ratios or cholesterol content, which may affect phase transition behavior and liposome stability.
- Includes practical limitations such as the need to avoid air bubble formation during syringe loading and maintain precise flow ratios (0.25 mL/min and 0.75 mL/min) for reproducible mixing in the SHM device.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Introduction
1:06
Equipment Setup
2:46
Lysolipid-Containing Temperature-Sensitive Liposome (LTSL) Preparation
4:48
Remote Doxorubicin (DOX) Loading
5:48
Laser Heating and Triggered Release
7:13
Results: Representative LTSL10 Characterization, Loading, and Photothermal Heat Triggering
8:59
Conclusion
