Name: Identyfikacja białek wiążących małe ligandy za pomocą zróżnicowanego promieniowego działania kapilarnego testu ligandowego (DRaCALA) (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-03-19T14:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 26 s
Description: Odkryj metodę DRaCALA do identyfikacji białek wiążących małe ligandy w bakteriach Escherichia coli. Technika ta umożliwia szybkie i czułe badanie interakcji białko-ligand w fizjologii bakteryjnej.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Praca jest wspierana przez grant projektu NNF (NNF19OC0058331) dla YEZ oraz program Unii Europejskiej Horyzont 2020 w zakresie badań i innowacji w ramach umowy o grant Marie Skłodowska-Curie (nr 801199) dla MLS.
<img alt="Równanie 1" src="/files/ftp_upload/62331/62331img1.jpg">

1. Przygotowanie lizatów całych komórek
<ol>
	<li>Zaszczep szczepy z kolekcji E. coli K-12 ASKA ORFeome15 do 1,5 mL pożywki LB (Lysogeny broth) zawierającej 25 µg/mL chloramfenikolu w płytkach głębokich z 96 dołkami. Inkubuj przez noc (O/N) przez 18 h w temperaturze 30 °C przy wstrząsaniu z prędkością 160 rpm. Następnego dnia dodaj izopropyl-β-d-1-tiogalaktopiranozyd (IPTG) (stężenie końcowe 0,5 mM) do kultur inkubowanych przez noc, aby indukowć ekspresję białek w temperaturze 30 °C przez 6 h.</li>
	<li>Odwirować komórki przy 500 x g przez 10 min. Zamrozić osady w temperaturze -80 °C do czasu użycia. W celu lizy komórek dodać 150 µL buforu lizującego L1 (40 mM Tris pH 7.5, 100 mM NaCl, 10 mM MgCl2, uzupełnionego o 2 mM fenylometylosulfonylofluorek (PMSF), 40 µg/mL DNazy 1 oraz 0,5 mg/mL lizozymu) w celu resuspensji osadu.</li>
	<li>Zamrozić komórki w temperaturze -80 °C przez 30 min, a następnie rozmrozić w temperaturze 37 °C przez 20 min. Powtórzyć ten cykl trzykrotnie, aby zlizować komórki. Przechowywać lizaty w temperaturze -80 °C przed użyciem.</li>
</ol>
2. Oczyszczanie Relseq i GppA
UWAGA: Rekombinowane białka Relseq z Streptococcus equisimilis oraz GppA z E. coli K-12 są wykorzystywane odpowiednio do syntezy znakowanego promieniotwórczo pppGpp i ppGpp.
<ol>
	<li>Hodowla i zbieranie komórek nadekspresujących każde z białek.
	<ol>
		<li>Hodować szczep E. coli BL21 DE3 do fazy wykładniczej (gęstość optyczna (OD) ~0,3-0,4) w bulionie LB, a następnie odwirować 1 mL kultury przy 6000 x g przez 5 min. Odlać supernatant i resuspender komórki w 100 µL lodowatego bulionu TSB (bulion LB uzupełniony o 0,1 g/mL PEG3350, 0,05 mL/mL dimetylosulfotlenek, 20 mM MgCl2).</li>
		<li>Zmieszać plazmidy zawierające białka relseq i gppA z przyłączonymi znacznikami histydynowymi (po 100 ng każdego) z powyższymi zawiesinami komórkowymi w TSB i inkubować na lodzie przez 30 min. Poddać komórki szokowi termicznemu w temperaturze 42 °C przez 40 s. Umieścić mieszaninę na lodzie na 2 min, a następnie dodać 1 mL bulionu LB w temperaturze pokojowej, aby umożliwić regenerację komórek przez 1 h w temperaturze 37 °C przy wytrząsaniu z prędkością 160 rpm.</li>
		<li>Wysiać zregenerowane komórki na płytki z agarem LB z dodatkiem odpowiednich antybiotyków (Relseq: 100 µg/mL ampicyliny; GppA: 30 µg/mL kanamycyny). Następnego dnia zaszczepić kolonie w bulionie LB, aby rozpocząć nocne (O/N) prekultury obu szczepów w temperaturze 37 °C.</li>
		<li>Po 18 h zaszczepić 500 mL pożywki LB za pomocą 10 mL kultur nocnych i dodać odpowiednie antybiotyki. Hodować kultury przy wytrząsaniu z prędkością 160 rpm w temperaturze 37 °C. Gdy OD600nm osiągnie wartość 0,5-0,7, indukować ekspresję białek poprzez dodanie 0,5 mM IPTG i hodowlę przez 3 h w temperaturze 30 °C przy wytrząsaniu z prędkością 160 rpm.</li>
		<li>Zebrać komórki, wirując przy 6084 x g przez 10 min w temperaturze 4 °C. Resuspender osad w 20 mL lodowatego 1x roztworu soli fizjologicznej w buforze fosforanowym (PBS) i ponownie wirować przy 1912 x g przez 20 min w temperaturze 4 °C. Odlać supernatant i zamrozić osady w temperaturze -20 °C do czasu użycia.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Oczyszczanie powinowactwa za pomocą kwasu niklowo-nitrylotrioctowego (Ni-NTA) 
	UWAGA: Od tego momentu należy upewnić się, że próbki są zimne.
	<ol>
		<li>Aby resuspender osad, dodać 40 mL lodowatego buforu do lizy L2 (50 mM Tris pH 7,5, 150 mM NaCl, 5% glicerolu, 10 mM imidazolu, 10 mM β-merkaptoetanolu uzupełnionego o inhibitory proteaz (tabletka bez EDTA; patrz Tabela Materiałów)). Zlizować komórki za pomocą sonikacji (amplituda 60%, 2 s włączone/ 4 s wyłączone przez 8 min czasu pracy). Oczyścić lizat poprzez wirowanie przy 23 426 x g przez 40 min w temperaturze 4 °C i wykorzystać supernatant do dalszego oczyszczania.</li>
		<li>Podczas powyższego wirowania przygotować żywicę Ni-NTA.
		<ol>
			<li>Przenieść 500 µL homogenizowanej żywicy Ni-NTA do pionowej polipropylenowej kolumny chromatograficznej, pozostawić na 15 min do osadzenia się i odpływu roztworu do przechowywania. Przemyć żywicę dwukrotnie 15 mL wodą ultrapure, a następnie przemyć kolumnę 15 mL buforu do lizy L2.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Nałożyć oczyszczony supernatant z lizatu komórkowego z kroku 1 na kolumnę i pozwolić mu przepłynąć. Przemyć kolumnę 30 mL buforu do płukania (50 mM Tris pH 7,5, 150 mM NaCl, 5% glicerolu, 20 mM imidazolu).</li>
		<li>Eluować białka trzykrotnie za pomocą 400 µL buforu do elucji (50 mM Tris pH 7,5, 150 mM NaCl, 5% glicerolu, 500 mM imidazolu). Następnie powtórzyć elucję za pomocą kolejnych 300 µL buforu do elucji. Połączyć eluowane białka do końcowej objętości 700 µL.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Filtracja żelowa
	<ol>
		<li>Przygotować bufor do filtracji żelowej (50 mM Tris, pH 7,5; 200 mM NaCl; 5% glicerolu). Przemyć kolumnę do wykluczania molekularnego jedną objętością kolumny (25 mL) buforu do filtracji żelowej.</li>
		<li>Nałożyć powyższą próbkę o objętości 700 µL, używając pętli 500 µL, prowadzić przepływ z prędkością 0,5 mL/min i zebrać 2-3 frakcje, każda o objętości 0,5 mL, zawierające odpowiednie białka.</li>
		<li>Połączyć i zagęścić frakcje zawierające każde z białek za pomocą kolumny wirówkowej i zmierzyć stężenie białka za pomocą testu Bradforda.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Synteza pppGpp i ppGpp znakowanych 32P
<ol>
	<li>Przygotuj reakcję Relseq w małej skali w probówce z nakrętką (patrz Tabela 1). 
	UWAGA: Prace z odczynnikami radioaktywnymi należy prowadzić wyłącznie w licencjonowanym miejscu i przy użyciu środków ochrony osobistej.</li>
</ol>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody >
		<tr >
			<td ></td>
			<td colspan="2">Objętość (μL)</td>
		</tr >
		<tr >
			<td ></td>
			<td >Mała skala</td>
			<td >Duża skala</td>
		</tr >
		<tr >
			<td >Woda ultrapure</td>
			<td ></td>
			<td ></td>
		</tr >
		<tr >
			<td >Bufor Relseq 10x*</td>
			<td >2</td>
			<td >50</td>
		</tr >
		<tr >
			<td >ATP (stężenie końcowe 8 mM)</td>
			<td ></td>
			<td ></td>
		</tr >
		<tr >
			<td >Relseq (stężenie końcowe 4 μM)</td>
			<td ></td>
			<td ></td>
		</tr >
		<tr >
			<td >32P-α-guanozynotrifosforan (GTP) (stężenie końcowe 120 nM) (OSTROŻNIE)</td>
			<td >0.2</td>
			<td >5</td>
		</tr >
		<tr >
			<td >łącznie</td>
			<td >20</td>
			<td >500</td>
		</tr >
	</tbody >
</table>
Tabela 1: Informacje dotyczące montażu reakcji syntezy w małej i dużej skali dla 32P-znakowanego pppGpp. *10x bufor Relseq zawiera 250 mM Tris-HCl, pH 8,6; 1M NaCl; 80 mM MgCl2. Skrót: pppGpp = guanozynopentafosforan.
<ol start="2">
	<li>Inkubuj probówkę w termomikserze w temperaturze 37 °C przez 1 h, następnie w 95 °C przez 5 min, a potem umieść na lodzie przez 5 min. Odwiruj wytrącone białko przy 15 700 x g przez 5 min i przenieś supernatant (zsyntetyzowane 32P-pppGpp) do nowej probówki z nakrętką.</li>
	<li>Aby zsyntetyzować 32P-ppGpp z 32P-pppGpp, przenieś połowę produktu 32P-pppGpp do nowej probówki z nakrętką i dodaj 1 µM GppA. Inkubuj probówkę w 37 °C przez 10 min, w 95 °C przez 5 min, a następnie umieść na lodzie przez 5 min.</li>
	<li>Odwiruj wytrącone białko przy 15 700 x g przez 5 min i przenieś supernatant (zsyntetyzowane 32P-ppGpp) do nowej probówki z nakrętką.</li>
	<li>Przeanalizuj 32P-pppGpp oraz 32P-ppGpp, nanosząc 1 µL próbek na płytkę do chromatografii cienkowarstwowej (TLC) (płytki celulozowe modyfikowane polietyleniminą), stosując 1,5 M KH2PO4, pH 3,4, jako fazę ruchomą. 
	UWAGA: Jako kontrolę zastosuj guanozyno-5'-trifosforan znakowany $\alpha$-32P (32P-$\alpha$-GTP).</li>
	<li>Całkowicie wysusz płytkę TLC, umieść ją pomiędzy przezroczystymi plastikowymi folderami i naświetlaj ekranem fosforowym przez 5 min. Zwizualizuj i skwantyfikuj sygnały za pomocą fosforobrazera. 
	​UWAGA: Gdy stosunek 32P-pppGpp i 32P-ppGpp przekracza 85%, można przygotować i przeprowadzić reakcję w większej skali (500 µL, co wystarczy do przesiewu 20 płytek 96-dołkowych), korzystając z Tabeli 1.</li>
</ol>
4. Przesiewanie DRaCALA w celu identyfikacji białek docelowych (p)ppGpp
<ol>
	<li>Rozmrozić i przenieść 20 µL lizatów pełnych komórek do 96-dołkowej płytki mikrotytrującej z dnem w kształcie litery V. Dodać 2,5 U/dołek endonukleazy z Serratia marcescens i inkubować w 37 °C przez 15 min w celu zmniejszenia lepkości lizatu. Umieścić lizaty na lodzie na 20 min.</li>
	<li>Wymieszać 32P-pppGpp i 32P-ppGpp w stosunku 1:1, a następnie dodać 1x bufor do lizy L1, aby końcowe stężenie (p)ppGpp wynosiło 4 nM. 
	UWAGA: Ze względu na podobieństwo chemiczne pppGpp i ppGpp, zastosowanie mieszaniny obu związków uprości proces przesiewowy.</li>
	<li>Używając pipety wielokanałowej i końcówek z filtrem, dodać i wymieszać 10 µL mieszaniny (p)ppGpp z lizatem komórkowym. Inkubować w temperaturze pokojowej (RT) przez 5 min.</li>
	<li>Przemyć narzędzie do przenoszenia próbek 96 x pin, umieszczając je w 0,01% roztworze niejonowego detergentu na 30 s, a następnie osuszyć na papierowym ręczniku przez 30 s. Powtórzyć mycie narzędzia 3 razy.</li>
	<li>Umieścić narzędzie do przenoszenia próbek w powyższych 96-dołkowych płytkach z próbkami i odczekać 30 s. Podnieść narzędzie pionowo w górę, a następnie przyłożyć je pionowo do błony nitrocelulozowej na 30 s. 
	​UWAGA: W przypadku pominięcia plamki, nanieść 2 µL odpowiednich próbek za pomocą pipety i końcówek z filtrem. Zaleca się wykonanie podwójnej plamki z tej samej próbki, zgodnie z poniższą instrukcją.</li>
	<li>Suszyć błonę przez 5 min w RT. Umieścić błonę w przezroczystym plastikowym folderze i naświetlać na ekranie fosforowym przez 5 min. Wizualizować za pomocą fosforimageru.</li>
</ol>
5. Ilościowe oznaczenie i identyfikacja potencjalnych białek docelowych
<ol>
	<li>Użyj oprogramowania analitycznego powiązanego z fosforimagerem, aby otworzyć plik .gel z wizualizowanych płytek. Użyj funkcji Array analysis, aby zdefiniować 96 plamek, ustawiając siatkę o wymiarach 12 kolumn x 8 rzędów.</li>
	<li>Zdefiniuj duże okręgi tak, aby obejmowały zewnętrzną krawędź całych plamek (patrz Rysunek 1B). Eksportuj Volumn+Background oraz Area zdefiniowanych dużych okręgów i zapisz je w arkuszu kalkulacyjnym. 
	UWAGA: Jeśli jest to konieczne, przesuń każdy poszczególny okrąg tak, aby idealnie pokrywał się z plamką, i zmień rozmiar każdego okręgu tak, aby był nieco większy od rzeczywistej plamki.</li>
	<li>Zmniejsz rozmiar zdefiniowanych okręgów tak, aby obejmowały małe wewnętrzne kropki. Eksportuj Volumn+Background oraz Area zdefiniowanych małych okręgów i zapisz je w arkuszu kalkulacyjnym.</li>
	<li>Oblicz ułamki wiązania w arkuszu kalkulacyjnym, korzystając z równania przedstawionego na Rysunku 1B, a następnie nanieś dane na wykres. Zidentyfikuj potencjalne białka wiążące w studzienkach wykazujących wysokie ułamki wiązania w porównaniu z większością pozostałych studzienek.</li>
</ol>
<img alt="Synteza i analiza białek E. coli; SDS-PAGE i TLC; schemat przepływu kwantyfikacji za pomocą fosforymageru." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62331/62331fig02.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 2"> 
Rycina 2: Ogólny schemat procesu przesiewowego DRaCALA. Indukowana jest produkcja białek z kolekcji ASKA Escherichia coli, a następnie komórki są lizowane. W tym samym czasie oczyszczane są rekombinowane białka Relseq-His i GppA-His, które służą do syntezy pppGpp i ppGpp znakowanych 32P z 32P-α-GTP. Radioaktywnie znakowane cząsteczki (p)ppGpp są następnie mieszane z lizatami, a za pomocą narzędzia 96-pinowego mieszaniny nanosi się na membranę nitrocelulozową w celu późniejszej ekspozycji na ekran do przechowywania fosforu, obrazowania i kwantyfikacji sygnałów radioaktywnych. Skróty: DRaCALA = Differential Radial Capillary Action of Ligand Assay; (p)ppGpp = guanozyno-penta- i tetrafosforany; RT = temperatura pokojowa; IPTG = izopropyl-β-D-1-tiogalaktopiranozyd; GTP = guanozyno-5'-trifosforan; SDS-PAGE = elektroforeza w żelu poliakrylamidowym z dodecylosiarczanem sodu; TLC = cienkowarstwowa chromatografia. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62331/62331fig02large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>

<ol><li>Kalia, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nucleotide%2C+c-di-GMP%2C+c-di-AMP%2C+cGMP%2C+cAMP%2C+%28p%29ppGpp+signaling+in+bacteria+and+implications+in+pathogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Chemical+Society+Reviews%22%5BJournal%5D)">Nucleotide, c-di-GMP, c-di-AMP, cGMP, cAMP, (p)ppGpp signaling in bacteria and implications in pathogenesis.</a> Chemical Society Reviews. 42 (1), 305-341 (2013).</li>
<li>Camilli, A., Bassler, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacterial+small-molecule+signaling+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Bacterial small-molecule signaling pathways.</a> Science. 311 (5764), 1113-1116 (2006).</li>
<li>Luo, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+cAMP+capture+compound+mass+spectrometry+as+a+novel+tool+for+targeting+cAMP-binding+proteins%3A+from+protein+kinase+A+to+potassium%2Fsodium+hyperpolarization-activated+cyclic+nucleotide-gated+channels%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+%26+Cellular+Proteomics%22%5BJournal%5D)">The cAMP capture compound mass spectrometry as a novel tool for targeting cAMP-binding proteins: from protein kinase A to potassium/sodium hyperpolarization-activated cyclic nucleotide-gated channels.</a> Molecular & Cellular Proteomics. 8 (12), 2843-2856 (2009).</li>
<li>Nesper, J., Reinders, A., Glatter, T., Schmidt, A., Jenal, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+capture+compound+for+the+identification+and+analysis+of+cyclic+di-GMP+binding+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Proteomics%22%5BJournal%5D)">A novel capture compound for the identification and analysis of cyclic di-GMP binding proteins.</a> Journal of Proteomics. 75 (15), 4874-4878 (2012).</li>
<li>Laventie, B. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Capture+compound+mass+spectrometry--a+powerful+tool+to+identify+novel+c-di-GMP+effector+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visual+Experiments%22%5BJournal%5D)">Capture compound mass spectrometry--a powerful tool to identify novel c-di-GMP effector proteins.</a> Journal of Visual Experiments. (97), e51404(2015).</li>
<li>Roelofs, K. G., Wang, J., Sintim, H. O., Lee, V. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+radial+capillary+action+of+ligand+assay+for+high-throughput+detection+of+protein-metabolite+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Differential radial capillary action of ligand assay for high-throughput detection of protein-metabolite interactions.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (37), 15528-15533 (2011).</li>
<li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evolutionary+adaptation+of+the+essential+tRNA+methyltransferase+TrmD+to+the+signaling+molecule+3+%27%2C5+%27-cAMP+in+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Evolutionary adaptation of the essential tRNA methyltransferase TrmD to the signaling molecule 3 ',5 '-cAMP in bacteria.</a> Journal of Biological Chemistry. 292 (1), 313-327 (2017).</li>
<li>Corrigan, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+identification+of+conserved+bacterial+c-di-AMP+receptor+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Systematic identification of conserved bacterial c-di-AMP receptor proteins.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (22), 9084-9089 (2013).</li>
<li>Roelofs, K. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+identification+of+cyclic-di-GMP+binding+proteins+in+Vibrio+cholerae+reveals+a+novel+class+of+cyclic-di-GMP-binding+ATPases+associated+with+type+II+secretion+systems%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathogen%22%5BJournal%5D)">Systematic identification of cyclic-di-GMP binding proteins in Vibrio cholerae reveals a novel class of cyclic-di-GMP-binding ATPases associated with type II secretion systems.</a> PLoS Pathogen. 11 (10), 1005232(2015).</li>
<li>Fang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GIL%2C+a+new+c-di-GMP-binding+protein+domain+involved+in+regulation+of+cellulose+synthesis+in+enterobacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Microbiology%22%5BJournal%5D)">GIL, a new c-di-GMP-binding protein domain involved in regulation of cellulose synthesis in enterobacteria.</a> Molecular Microbiology. 93 (3), 439-452 (2014).</li>
<li>Corrigan, R. M., Bellows, L. E., Wood, A., Grundling, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ppGpp+negatively+impacts+ribosome+assembly+affecting+growth+and+antimicrobial+tolerance+in+Gram-positive+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">ppGpp negatively impacts ribosome assembly affecting growth and antimicrobial tolerance in Gram-positive bacteria.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (12), 1710-1719 (2016).</li>
<li>Zhang, Y., Zbornikova, E., Rejman, D., Gerdes, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+%28p%29ppGpp+binding+and+metabolizing+proteins+of+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Mbio%22%5BJournal%5D)">Novel (p)ppGpp binding and metabolizing proteins of Escherichia coli.</a> Mbio. 9 (2), 02188(2018).</li>
<li>Yang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+nucleotide+pGpp+acts+as+a+third+alarmone+in+Bacillus%2C+with+functions+distinct+from+those+of+%28p%29+ppGpp%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">The nucleotide pGpp acts as a third alarmone in Bacillus, with functions distinct from those of (p) ppGpp.</a> Nature Communications. 11 (1), 5388(2020).</li>
<li>Orr, M. W., Lee, V. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+radial+capillary+action+of+ligand+assay+%28DRaCALA%29+for+high-throughput+detection+of+protein-metabolite+interactions+in+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Differential radial capillary action of ligand assay (DRaCALA) for high-throughput detection of protein-metabolite interactions in bacteria.</a> Methods in Molecular Biology. 1535, 25-41 (2017).</li>
<li>Kitagawa, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Complete+set+of+ORF+clones+of+Escherichia+coli+ASKA+library+%28A+complete+Set+of+E.+coli+K-12+ORF+archive%29%3A+Unique+resources+for+biological+research%5BTitle%5D)+AND+%22DNA+Research%22%5BJournal%5D)">Complete set of ORF clones of Escherichia coli ASKA library (A complete Set of E. coli K-12 ORF archive): Unique resources for biological research.</a> DNA Research. 12 (5), 291-299 (2005).</li>
<li>Hochstadt-Ozer, J., Cashel, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+regulation+of+purine+utilization+in+bacteria.+V.+Inhibition+of+purine+phosphoribosyltransferase+activities+and+purine+uptake+in+isolated+membrane+vesicles+by+guanosine+tetraphosphate%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">The regulation of purine utilization in bacteria. V. Inhibition of purine phosphoribosyltransferase activities and purine uptake in isolated membrane vesicles by guanosine tetraphosphate.</a> Journal of Biological Chemistry. 247 (21), 7067-7072 (1972).</li>
<li>Zhang, Y. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((p%29ppGpp+regulates+a+bacterial+nucleosidase+by+an+allosteric+two-domain+switch%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">p)ppGpp regulates a bacterial nucleosidase by an allosteric two-domain switch.</a> Molecular Cell. 74 (6), 1239-1249 (2019).</li>
<li>Wang, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Affinity-based+capture+and+identification+of+protein+effectors+of+the+growth+regulator+ppGpp%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">Affinity-based capture and identification of protein effectors of the growth regulator ppGpp.</a> Nature Chemical Biology. 15 (2), 141-150 (2019).</li>
</ol>

Autorzy nie mają do ujawnienia konfliktu interesów.

Jednym z kluczowych etapów przeprowadzania badań przesiewowych DRaCALA jest uzyskanie dobrych lizatów całych komórek. Po pierwsze, badane białka powinny być produkowane w dużych ilościach i w formach rozpuszczalnych. Po drugie, liza komórek powinna być całkowita, a lepkość lizatu musi być minimalna. Włączenie lizozymu i zastosowanie trzech cykli zamrażania i rozmrażania często wystarcza do całkowitej lizy komórek. Jednak uwolnione chromosomalne DNA sprawia, że lizat jest lepki i generuje wysoki sygnał wiązania tła, co sk...

Bakterie wykorzystują szereg małych cząsteczek sygnałowych, aby przystosować się do nieustannie zmieniającego się środowiska1,2. Na przykład autoinduktory, N-acylohomoserynolaktony oraz ich zmodyfikowane oligopeptydy, pośredniczą w komunikacji międzykomórkowej bakterii w celu koordynacji zachowania populacji, co jest zjawiskiem znanym jako quorum sensing2. Inną grupą małych cząsteczek sygnałowych są NSM, w tym szeroko badany cykliczny adenozynomonofosforan (cAMP), cykliczny di-AMP, cykliczny diguanozynomonofosforan (cykliczny di-GMP) oraz guanozynopenta- i tetrafosforany (p)ppGpp1. Bakterie produkują te NSM w odpowiedzi na różnorodne warunki stresowe. Po wytworzeniu cząsteczki te wiążą się ze swoimi białkami docelowymi i regulują kilka różnych szlaków fizjologicznych i metabolicznych, aby poradzić sobie z napotkanym stresem i zwiększyć przeżywalność bakterii. Dlatego identyfikacja białek docelowych jest niezbędnym warunkiem do rozszyfrowania funkcji molekularnych tych małych cząsteczek.
Ostatnia dekada przyniosła gwałtowny wzrost wiedzy na temat tych małych cząsteczek sygnałowych, głównie dzięki kilku innowacjom technicznym, które ujawniły białka docelowe tych cząsteczek. Należą do nich technika związków wychwytujących3,4,5 oraz test różnicowego radialnego działania kapilarnego ligandów (DRaCALA)6, który zostanie omówiony w niniejszej pracy.
Metoda DRaCALA, opracowana przez Vincenta Lee i współpracowników w 2011 roku6, wykorzystuje zdolność membrany nitrocelulozowej do różnicowego sekwestrowania ligandów wolnych i związanych z białkami. Cząsteczki takie jak białka nie dyfundują na membranie nitrocelulozowej, natomiast małe ligandy, takie jak NSMs, są do tego zdolne. Poprzez zmieszanie NSM (np. ppGpp) z badanym białkiem i naniesienie ich na membranę, można spodziewać się dwóch scenariuszy (Rysunek 1): jeśli (p)ppGpp wiąże się z białkiem, znakowane radiologicznie (p)ppGpp zostanie zatrzymane w centrum plamki przez białko i nie będzie dyfundować na zewnątrz, co w obrazowaniu fosforowym (phosphorimager) da intensywną małą kropkę (tj. silny sygnał radiacyjny). Jednak jeśli (p)ppGpp nie wiąże się z białkiem, będzie swobodnie dyfundować na zewnątrz, tworząc dużą plamkę z jednolitym tłem sygnału radiacyjnego.
Ponadto DRaCALA pozwala wykryć oddziaływanie małej cząsteczki z nieoczyszczonym białkiem w lizacie całych komórek, pod warunkiem, że białko występuje w wystarczającej ilości. Taka prostota umożliwia zastosowanie DRaCALA do szybkiej identyfikacji białek docelowych z wykorzystaniem biblioteki ekspresyjnej ORFeome. Rzeczywiście, białka docelowe cAMP7, cyklicznego di-AMP8, cyklicznego di-GMP9,10 oraz (p)ppGpp11,12,13 zostały systematycznie zidentyfikowane przy użyciu DRaCALA. Niniejszy artykuł wideo wykorzystuje (p)ppGpp jako przykład, aby zaprezentować i opisać kluczowe kroki oraz kwestie istotne dla pomyślnego przeprowadzenia przesiewu DRaCALA. Należy zaznaczyć, że przed przystąpieniem do pracy z DRaCALA wysoce zaleca się zapoznanie z bardziej szczegółowym opisem tej metody14 jako uzupełnienie treści niniejszego artykułu.
<img alt="Schemat testu wiązania białek w stanie równowagi statycznej z ³²P-(p)ppGpp na błonie nitrocelulozowej." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62331/62331fig01.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1: Zasada DRaCALA. (A) Schemat testu DRaCALA. Szczegóły znajdują się w tekście. (B) Kwantyfikacja i obliczanie frakcji wiązania. Szczegóły znajdują się w tekście. W skrócie, plamki DRaCALA będą analizowane poprzez wyrysowanie dwóch okręgów, które obejmują całą plamkę oraz wewnętrzną ciemną kropkę (t.j. zatrzymane (p)ppGpp w wyniku wiązania badanego białka). Sygnał wiązania swoistego to sygnał radiacyjny wewnętrznego okręgu (S1) po odjęciu nieswoistego sygnału tła (obliczonego jako A1 × ((S2-S1)/(A2-A1))). Frakcja wiązania to sygnał wiązania swoistego podzielony przez całkowity sygnał radiacyjny (S2). Skróty: DRaCALA = Differential Radial Capillary Action of Ligand Assay; (p)ppGpp = guanozynopenta- i tetrafosforany; RT = temperatura pokojowa. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62331/62331fig01large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>

<table><tbody><tr><td>32P-&alpha;-GTP</td><td>Perkinelmer</td><td>BLU006X250UC</td><td></td></tr><tr><td>96 x narzędzie do szpilek</td><td>V& P Scientific</td><td>VP 404</td><td>96 Replikator, w centrach 9 mm, średnica 4,2 mm, długość 24 mm</td></tr><tr><td>96-dołkowa płytka do mikromiareczkowania w kształcie litery V</td><td>Sterilin</td><td>MIC9004</td><td>Mikropłytka Sterilin V Studzienka 611V96</td></tr><tr><td>Agar</td><td>OXOID - Thermo Fisher</td><td>LP0011</td><td>Agar nr 1</td></tr><tr><td>Szczep kolekcjonerski ASKA</td><td>NBRP, SHIGEN, JAPONIA</td><td></td><td>Patrz: Badania DNA, tom 12, wydanie 5, 2005, strony 291&ndash;299. https://doi.org/10.1093/dnares/dsi012</td></tr><tr><td>Benzonaza</td><td>SIGMA</td><td>E1014-25KU</td><td>genetycznie modyfikowana endonukleaza z Serratia marcescens</td></tr><tr><td>Bradford Protein Assay Dye</td><td>Bio-Rad</td><td>5000006</td><td>Koncentrat odczynnika</td></tr><tr><td>DMSO</td><td>SIGMA</td><td>D8418</td><td>&ge; 99,9%</td></tr><tr><td>DNaza 1</td><td>SIGMA</td><td>DN25-1G</td><td></td></tr><tr><td>filtracja żelowa 10x300 kolumna</td><td>GE Healthcare</td><td>28990944</td><td>zawiera 20% etanolu jako konserwantu</td></tr><tr><td>Glicerol</td><td>PanReac AppliChem</td><td>122329.1214</td><td>Glicerol 87% do analizy</td></tr><tr><td>Hiperkaseta</td><td>Amersham</td><td>RPN 11647</td><td>20 x 40 cm</td></tr><tr><td>Imidazol</td><td>SIGMA</td><td>56750</td><td>puriss. p.a., &ge; 99,5% (GC)</td></tr><tr><td>IP Storage Ekran fosforowy</td><td>FUJIFILM</td><td>28956474</td><td>BAS-MS 2040 20x 40 cm</td></tr><tr><td>Izopropyl &beta;-d-1-tiogalaktopiranozyd (IPTG)</td><td>SIGMA</td><td>I6758</td><td>Izopropylo-&beta;-D-tiogalaktozyd</td></tr><tr><td>Bulion lizogeniczny (LB)</td><td>Invitrogen - Thermo Fisher</td><td>12795027</td><td>Miller's LB Rosół na bazie</td></tr><tr><td>lizozymu</td><td>SIGMA</td><td>L4949</td><td>z białka jaja kurzego; BioUltra, liofilizowany proszek, &ge; 98%</td></tr><tr><td>MgCl2 (chlorek magnezu)</td><td>Pipeta</td> wielokanałowa SIGMA <td>208337</td><td></td></tr><tr><td>MilliQ do wody</td><td></td><td></td><td>ultraczystej</td></tr><tr><td></td><td>Thermo Scientific</td><td>4661110</td><td>F1 - Końcówka zaciskowa; 1-10 ul, 8 x kanały</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>VWR Chemicals</td><td>27810</td><td>AnalaR NORMAPUR, ACS, Reag. Ph. Eur.</td></tr><tr><td>Ni-NTA Agaroza</td><td>Qiagen</td><td>30230</td><td></td></tr><tr><td>Nitroceluloza Błona Bibułowa</td><td>Amersham Protran</td><td>10600003</td><td>Premium 0,45 um 300 mm x 4 m</td></tr><tr><td>PBS</td><td>OXOID - Thermo Fisher</td><td>BR0014G</td><td>Sól fizjologiczna buforowana fosforanem (Dulbecco A), Tabletki</td></tr><tr><td>PEG3350 (Glikol polietylenowy 3350)</td><td>SIGMA</td><td>202444</td><td></td></tr><tr><td>fluorek fenylometylosulfonylu (PMSF)</td><td>SIGMA</td><td>93482</td><td>Roztwór fluorku fenylometanosulfonylu - 0,1 M w etanolu (T)</td></tr><tr><td>Luminoforownik</td><td>GE Healthcare</td><td>28955809</td><td>Typhoon FLA-7000 Końcówki do pipet z luminopatem</td></tr><tr><td>, filtrowane</td><td>Thermo Scientific</td><td>94410040</td><td>ClipTip 12,5 &mu; l niesterylna</td></tr><tr><td>kolumna chromatograficzna Poly-Prep Kolumna chromatograficzna</td><td>Bio-Rad</td><td>7311550</td><td>polipropylenowa</td></tr><tr><td>Inhibitor proteazy Mini</td><td>Pierce</td><td>A32955</td><td>Tabletki,</td></tr><tr><td>rurka z nakrętką</td> bez EDTA <td>Termo Scientific</td><td>3488</td><td>Probówki mikrocentyfugowe, 2,0 ml z nakrętką, niesterylne</td></tr><tr><td>SLS 96-głębokie płytki dołkowe</td><td>Greiner</td><td>780285</td><td>MASTERBLOCK, 2 ML, PP, V-Bottom, naturalna</td></tr><tr><td>kolumna wirowa</td><td>Millipore</td><td>UFC500396</td><td>Amicon Ultra -0,5 ml Filtry odśrodkowe</td></tr><tr><td>Thermomixer</td><td>Eppendorf</td><td>5382000015</td><td>Thermomixer C</td></tr><tr><td>Płytka TLC (płytki PEI-celuloza F TLC)</td><td>Merck Millipore</td><td>105579</td><td>DC PEI-celuloza F (20 x 20 cm)</td></tr><tr><td>Tris</td><td>SIGMA</td><td>BP152</td><td>Tris Baza do biologii molekularnej</td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>SIGMA</td><td>P1379</td><td>lepki niejonowy detergent</td></tr> <tr><td>i beta;-merkaptoetanol</td><td>SIGMA</td><td>M3148</td><td>99% (GC/miareczkowanie)</td></tr></tbody></table>

identyfikacja białek wiążących małe ligandy za pomocą zróżnicowanego promieniowego działania kapilarnego testu ligandowego (dracala)

Identifying the Binding Proteins of Small Ligands with the Differential Radial Capillary Action of Ligand Assay (DRaCALA)

Ostatnia dekada przyniosła ogromny postęp w zrozumieniu małych cząsteczek sygnałowych w fizjologii bakterii. W szczególności systematycznie identyfikowano i badano docelowe białka kilku wtórnych przekaźników pochodzących z nukleotydów (NSM) w organizmach modelowych. Osiągnięcia te wynikają głównie z opracowania kilku nowych technik, w tym techniki wychwytywania związków i różnicowego promienistego działania kapilarnego testu ligandowego (DRaCALA), które wykorzystano do systematycznej identyfikacji docelowych białek tych małych cząsteczek. W artykule opisano zastosowanie NSM, penta- i tetrafosforanów guanozyny (p)ppGpp, jako przykład i demonstrację wideo techniki DRaCALA. Za pomocą DRaCAL zidentyfikowano 9 z 20 znanych i 12 nowych białek docelowych (p)ppGpp w organizmie modelowym, Escherichia coli K-12, co dowodzi mocy tego testu. Zasadniczo, projekt DRaCALA może być wykorzystywany do badania małych ligandów, które mogą być znakowane izotopami promieniotwórczymi lub barwnikami fluorescencyjnymi. Najważniejsze kroki, zalety i wady DRaCALA są omówione tutaj w celu dalszego zastosowania tej techniki.

Postępowanie zgodnie z powyższym protokołem zazwyczaj pozwala na uzyskanie dwóch typów wyników (Rysunek 3).
Rysunek 3A przedstawia płytkę z relatywnie niskimi sygnałami wiązania w tle (frakcje wiązania &lt; 0,025) w większości studzienek. Pozytywny sygnał wiązania ze studzienki H3 daje frakcję wiązania na poziomie ~0,35, co jest znacznie wyższą wartością niż ta zaobserwowana w pozostałych studzienkach. Nawet bez kwantyfikacji studzien...

Różnicowe promieniste działanie kapilarne testu ligandowego (DRaCALA) może być wykorzystane do identyfikacji małych białek wiążących ligand organizmu za pomocą biblioteki ORFeome.

Identyfikacja białek wiążących małe ligandy za pomocą zróżnicowanego promieniowego działania kapilarnego testu ligandowego (DRaCALA)

The past decade has seen tremendous progress in the understanding of small signaling molecules in bacterial physiology. In particular, the target proteins ...

Małe cząsteczki sygnałowe celują w różne białka efektorowe, aby kontrolować zjadliwość bakterii i biologię człowieka. Jednak te białka efektorowe są trudne do zidentyfikowania. Jako narzędzie biologii systemowej, DRaCALA umożliwia wykonalną, szybką i bardzo czułą identyfikację nieznanych białek efektorowych przy użyciu biblioteki OVium.DRaCALA może być wykorzystana do badania każdej małej cząsteczki sygnałowej, o ile można ją znakować izotopem promieniotwórczym lub barwnikami fluorescencyjnymi. Zacznij od zaszczepienia E. coli w 1,5 mililitra LB uzupełnionego 25 mikrogramami na mililitr chloramfenikolu w każdym dołku 96-dołkowych płytek głębinowych do nocnej inkubacji w temperaturze 30 stopni Celsjusza i 160 obrotów na minutę. Następnego ranka potraktuj nocne kultury 500 mikromolowym IPTG przez sześć godzin w temperaturze 30 stopni Celsjusza, aby wywołać ekspresję białka.Pod koniec inkubacji osadzać komórki przez odwirowanie, usuwać supernatant i zamrażać próbki w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza. Aby rozpocząć lizę, ponownie zawieś granulki w 150 mikrolitrach buforu do lizy, po jednym na dołek na 30-minutową inkubację w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza, a następnie roz

identifying-binding-proteins-small-ligands-with-differential-radial

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemia

Ten film opisuje metodę analizy interakcji białko-ligand za pomocą elektroforezy kapilarnej z przesunięciem ruchliwości. Metoda ta może być stosowana do charakteryzowania zachowania wiązania białka z różnymi naładowanymi ligandami.

Elektroforeza kapilarna z przesunięciem ruchliwości i powinowactwa: metoda analizy interakcji próbka-ligand w zależności od zróżnicowanej migracji kompleksów białko-ligand

Ten film demonstruje różnicowe promieniste działanie kapilarne testu ligandowego - techniki systematycznego, wysokoprzepustowego badania przesiewowego białek wiążących drugi przekaźnik nukleotydów wewnątrzkomórkowych. Technika ta pozwala na bezpośrednie wiązanie przekaźników z nadekspresyjnym białkiem docelowym w lizacie komórkowym - z pominięciem konieczności oczyszczania białka.

Różnicowe promieniste działanie kapilarne testu ligandowego: wysokoprzepustowa technika identyfikacji wewnątrzkomórkowych białek wiążących drugi przekaźnik nukleotydu bakteryjnego

Termoforeza w mikroskali (MST) może być szeroko stosowana do określania powinowactwa do wiązania bez oczyszczania docelowego białka z lizatów komórkowych. Protokół obejmuje nadekspresję białka połączonego z GFP, lizę komórek w warunkach niedenaturujących oraz wykrywanie sygnału MST w obecności różnych stężeń liganda.

Metoda oznaczania powinowactwa do wiązań bez oczyszczania białek za pomocą termoforezy w mikroskali

Różnicowa fluorymetria skaningowa jest powszechnie stosowaną metodą badania bibliotek małych cząsteczek pod kątem interakcji z białkami. W tym miejscu przedstawiamy prostą metodę rozszerzenia tych analiz w celu oszacowania stałej dysocjacji między małą cząsteczką a jej białkiem partnera.

Oznaczanie oddziaływań białko-ligand za pomocą różnicowej fluorymetrii skaningowej

Prezentowane protokoły opisują dwie techniki oparte na enzymatycznym metodzie immunopochłaniania (ELISA) do szybkiego badania interakcji ligand-receptor: Pierwsza metoda pozwala na określenie stałej dysocjacji między ligandem a receptorem. Druga metoda umożliwia szybkie przesiewowe badanie peptydów blokujących interakcje ligand-receptor.

Metoda wiązania i konkurencji oparta na technice ELISA do szybkiego określania interakcji ligand-receptor

Opisujemy tutaj metodę identyfikacji białek wiążących małe cząsteczki za pomocą znakowania fotopowinowactwa. Zaletą tej techniki jest to, że wiązanie i znakowanie kowalencyjne białek docelowych zachodzi w żywym środowisku komórkowym, co eliminuje ryzyko zakłócenia natywnej struktury białka i warunków wiązania podczas lizy komórki.

Identyfikacja białek wiążących małe cząsteczki w natywnym środowisku komórkowym za pomocą znakowania fotopowinowactwa żywych komórek

Protokół tutaj opisuje interakcje oczyszczonego białka kanału jonowego hEAG1 z małocząsteczkowym ligandem lipidowym fosfatydyloinozytolem 4,5-bisfosforanem (2). Pomiar pokazuje, że BLI może być potencjalną metodą badań przesiewowych ligandów kanałów jonowych małych cząsteczek.

Uchwycenie kinetyki oddziaływania białka kanału jonowego z małymi cząsteczkami za pomocą testu interferometrii biowarstwowej

Opisano szczegółowe protokoły wykonywania titracji ELISA. Ponadto przedstawiono nowy algorytm do oceny titracji ELISA i uzyskania stałej dysocjacji wiązania rozpuszczalnego ligandu z receptorem unieruchomionym na płytce mikrotytlacyjnej.

Oznaczanie titracji ELISA jako metoda wyznaczania stałej dysocjacji oddziaływań ligand-receptor

Tutaj prezentujemy protokół produkcji i oczyszczania białek znakowanych stabilnymi izotopami, a następnie charakteryzację oddziaływań białko-białko za pomocą spektroskopii magnetycznego rezonansu jądrowego (NMR) i eksperymentów termoforezy w mikroskali (MST).

Pomiar oddziaływań białek kulistych i nitkowatych za pomocą spektroskopii magnetycznego rezonansu jądrowego (NMR) i termoforezy w mikroskali (MST)

Metoda autoradiografii jest rutynowo stosowana do badania wiązania radioligandów z sekcjami tkanek w celu określenia jakościowej lub ilościowej farmakologii.

Autoradiografia jako prosta i skuteczna metoda wizualizacji i charakterystyki celów farmakologicznych

Odkryj metodę DRaCALA do identyfikacji białek wiążących małe ligandy w bakteriach Escherichia coli. Technika ta umożliwia szybkie i czułe badanie interakcji białko-ligand w fizjologii bakteryjnej.

Identyfikacja białek wiążących małe ligandy za pomocą zróżnicowanego promieniowego działania kapilarnego testu ligandowego (DRaCALA) (Wideo) | JoVE Journal

Identyfikacja białek wiążących małe ligandy za pomocą zróżnicowanego promieniowego działania kapilarnego testu ligandowego (DRaCALA)

Przeglądaj więcej filmów