Identyfikacja białek wiążących małe ligandy za pomocą zróżnicowanego promieniowego działania kapilarnego testu ligandowego (DRaCALA)

Małe cząsteczki sygnałowe celują w różne białka efektorowe, aby kontrolować zjadliwość bakterii i biologię człowieka. Jednak te białka efektorowe są trudne do zidentyfikowania. Jako narzędzie biologii systemowej, DRaCALA umożliwia wykonalną, szybką i bardzo czułą identyfikację nieznanych białek efektorowych przy użyciu biblioteki OVium.

DRaCALA może być wykorzystana do badania każdej małej cząsteczki sygnałowej, o ile można ją znakować izotopem promieniotwórczym lub barwnikami fluorescencyjnymi. Zacznij od zaszczepienia E. coli w 1,5 mililitra LB uzupełnionego 25 mikrogramami na mililitr chloramfenikolu w każdym dołku 96-dołkowych płytek głębinowych do nocnej inkubacji w temperaturze 30 stopni Celsjusza i 160 obrotów na minutę. Następnego ranka potraktuj nocne kultury 500 mikromolowym IPTG przez sześć godzin w temperaturze 30 stopni Celsjusza, aby wywołać ekspresję białka.

Pod koniec inkubacji osadzać komórki przez odwirowanie, usuwać supernatant i zamrażać próbki w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza. Aby rozpocząć lizę, ponownie zawieś granulki w 150 mikrolitrach buforu do lizy, po jednym na dołek na 30-minutową inkubację w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza, a następnie rozmrażaj komórki przez 20 minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Lizat należy następnie przechowywać w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza przed użyciem.

Aby zakończyć lizę komórek z nadekspresjami białek, ponownie zawieś próbki w 40 mililitrach lodowatego buforu do lizy dwa i poddaj próbki sonikacji przy amplitudzie 60% w ciągu dwóch sekund na cztery sekundy przerwy na osiem minut, a następnie usuń lizaty przez odwirowanie. Podczas wirowania próbek dodać 500 mikrolitrów homogenizowanej żywicy niklowo-NTA do stojącej kolumny do chromatografii polipropylenowej. Po 15 minutach przemyj osiadłą żywicę dwa razy 15 mililitrami ultraczystej wody i jeden raz 15 mililitrami buforu do lizy dwa.

Pod koniec wirowania załadować oczyszczony supernatant lizatu na kolumnę. Gdy cały lizat przepłynie przez kolumnę, przemyj kolumnę 30 mililitrami buforu płuczącego. Aby wymyć białka, dodaj 400 mikrolitrów objętości buforu elucyjnego do kolumny i powtórz elucję trzy razy.

Kolejna objętość buforu elucyjnego o pojemności 300 mikrolitrów, aby powtórzyć elucję trzy razy i połączyć eluowane białka w końcową objętość 700 mikrolitrów. W przypadku filtracji żelowej eluowanej próbki, po umyciu kolumny wykluczającej wielkość 25 mililitrami świeżo przygotowanego żelowego buforu filtracyjnego, należy załadować całą objętość eluowanego białka na kolumnę za pomocą pętli o pojemności 500 mikrolitrów. Uruchom z prędkością 500 mikrolitrów na minutę i zbierz dwie do trzech frakcji objętościowych odpowiednich białek o pojemności 500 mikrolitrów.

Następnie użyj indywidualnych kolumn wirowych, aby zagęścić każde białko i użyj zestawu testowego Bradforda, aby zmierzyć stężenie białka zgodnie ze standardowymi protokołami. Aby zsyntetyzować pentafosforan guanozyny znakowany fosforem 32, należy zmontować reakcję Relseq na małą skalę w zakręcanej probówce, jak opisano w tabeli, i inkubować reakcję w ThermoMixerze przez godzinę w temperaturze 37 stopni Celsjusza i pięć minut w temperaturze 95 stopni Celsjusza, a następnie pięć minut na lodzie. Pod koniec inkubacji odwirować wytrącone białko przez odwirowanie i przenieść zsyntetyzowany fosforan guanozyny znakowany 32 pentafosforanem guanozyny zawierający supernatant do nowej probówki z nakrętką.

Do syntezy tetrafosforanu guanozyny fosforu 32 dodać jeden mikromolowy GppA do połowy produktu pentafosforanu guanozyny znakowanego fosforem 32 w nowej probówce z nakrętką i inkubować reakcję przez 10 minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza, pięć minut w temperaturze 95 stopni Celsjusza i pięć minut na lodzie. Pod koniec inkubacji odwirować osad przez odwirowanie i przenieść znakowany fosforem 32 tetrafosforan guanozyny zawierający supernatant do nowej probówki. Aby przeanalizować wyizolowane białka docelowe, uruchom jeden mikrolitr każdej próbki na płytce chromatografii cienkowarstwowej, używając 1,5 molowego fosforanu monopotasowego jako fazy ruchomej.

Po analizie umieść wysuszoną płytkę w przezroczystym plastikowym folderze i wystawij płytkę na ekran luminoforowy do przechowywania przez pięć minut, a następnie zwizualizuj i określ ilościowo dane na imagerze luminoforowym. W celu przeprowadzenia badań przesiewowych białek docelowych metodą DRaCALA należy dodać 20 mikrolitrów rozmrożonych lizatów hurtowych do poszczególnych dołków 95-dołkowej płytki mikromiareczkowej z dnem w kształcie litery V i dodać 2,5 jednostki endonukleazy Serratia marcescens do każdej studzienki. Po 15 minutach w temperaturze 37 stopni Celsjusza umieść lizaty na lodzie na 20 minut.

Następnie wymieszaj równe objętości pentafosforanu guanozyny znakowanego fosforem 32 i tetrafosforanu guanozyny i dodaj 1X bufor do lizy jeden do mieszaniny, aby uzyskać czteronanomolowy roztwór pentafosforanu guanozyny. Za pomocą pipety wielokanałowej i przefiltrowanych końcówek do pipet wymieszać 10 mikrolitrów mieszaniny pentafosforanu guanozyny z lizatem komórkowym przez pięciominutową inkubację w temperaturze pokojowej. Pod koniec inkubacji umyj narzędzie do szpilek 96X trzy razy w 0,01% roztworze niejonowego detergentu przez 30 sekund, a następnie 30 sekund suszenia na ręczniku papierowym na pranie przed umieszczeniem narzędzia do szpilek w 96-dołkowej płytce próbki.

Po 30 sekundach podnieś szpilkę prosto do góry i umieść ją prosto w dół na membranie nitrocelulozowej na 30 sekund. Po pięciu minutach suszenia umieść membranę nitrocelulozową w przezroczystym plastikowym folderze do przechowywania, naświetlenia ekranu luminoforowego i wizualizacji za pomocą obrazowania luminoforowego, jak pokazano. Aby określić ilościowo i zidentyfikować potencjalne białka docelowe, w oprogramowaniu analitycznym powiązanym z obrazownikiem luminoforowym otwórz plik żelu z wizualizowanymi płytkami.

Aby zdefiniować punkty do analizy, użyj funkcji analizy tablicowej w celu skonfigurowania siatki 12 kolumn na osiem wierszy. Aby oznaczyć zewnętrzną krawędź punktów otworów, zdefiniuj duże okręgi, wyeksportuj objętość oraz tło i obszar zdefiniowanych dużych okręgów do arkusza kalkulacyjnego. Aby oznaczyć małe wewnętrzne kropki, zmniejsz rozmiar zdefiniowanych okręgów, wyeksportuj objętość oraz tło i obszar zdefiniowanych małych okręgów i zapisz wszystkie dane w arkuszu kalkulacyjnym.

W razie potrzeby ustaw okręgi tak, aby nakładały się na plamy, zmieniając rozmiar nieco większych niż rzeczywiste plamy. Użyj równania, aby obliczyć ułamki wiążące w arkuszu kalkulacyjnym i wykreślić dane. Następnie zidentyfikuj potencjalne białka wiążące w studzienkach, które wykazują wysokie frakcje wiążące w porównaniu z większością innych studzienek.

W tej reprezentatywnej analizie można zaobserwować płytkę ze stosunkowo niskimi sygnałami wiązania tła w większości odwiertów. Dodatni sygnał wiązania w studzience H3 wykazywał frakcję wiążącą, która była znacznie wyższa niż obserwowana w innych studzienkach z powodu nadekspresji białka wiążącego pentafosforan guanozyny Hpt. Na reprezentatywnych płytkach kilka dołków wykazało stosunkowo wyższe sygnały wiązania tła, na co wskazują stosunkowo silne kropki wewnętrzne obserwowane w wielu studzienkach, a także konsekwentnie wysokie frakcje wiążące obserwowane po kwantyfikacji.

Warto zauważyć, że niektóre cele dawały również zmienne frakcje wiążące, takie jak wyniki fałszywie dodatnie. Aby dokładniej wyjaśnić tę kwestię, naukowcy wykorzystali oczyszczone białka do ponownego przetestowania wiązania. Po zidentyfikowaniu białek docelowych można je oczyścić do jednorodności i potwierdzić siłę i swoistość interakcji za pomocą DRaCALA, izotermicznej kalorymetrii miareczkowej lub innych metod.

Identyfikacja docelowych białek małych cząsteczek sygnałowych toruje drogę do dogłębnego zrozumienia ról wynikających z wirulencji bakterii w biologii człowieka.