Izolacja frakcji subjądrowych wzbogaconych w przedziały replikacji wirusa z normalnych komórek ludzkich zakażonych adenowirusem

Ogólnym celem niniejszej procedury jest uzyskanie frakcji pozajądrowej wzbogaconej w kompartymenty replikacyjne tworzone w komórkach zakażonych adenowirusami, w celu szczegółowego zbadania ich składu, ultrastruktury oraz powiązanych z nimi aktywności. Metoda ta może pomóc w odpowiedzi na kluczowe pytania z zakresu wirusologii DNA, takie jak badanie mechanizmów molekularnych kontrolujących replikację i ekspresję genomu wirusowego, które z kolei zależą od kompartymentów replikacyjnych w regulacji oddziaływań wirusa z komórką gospodarza. Główną zaletą tej techniki jest to, że jest to prosta procedura oparta na gradiencie gęstości, pozwalająca na stworzenie systemu bezkomórkowego, który umożliwia badanie mechanizmów pozwalających wirusom DNA replikującym się w jądrze przejąć kontrolę nad zakażoną komórką.

Aby przeprowadzić ten test, należy najpierw przygotować adenowirus typ 5 lub Ad5 oraz ludzkie fibroblasty z napletka lub HFF zgodnie z opisem w towarzyszącym protokole tekstowym. Aby rozpocząć, zakaź 10⁷ HFF w 100 mm szalkach do hodowli tkankowej, używając 1 mL DMEM na szalkę przy MOI wynoszącym 30 jednostek tworzących ogniska lub FFU na komórkę. Inkubuj komórki przez 2 godziny w wilgotnym inkubatorze do hodowli komórkowych w temperaturze 37 °C i 5% CO2. Ostrożnie kołysz szalkami co 15 minut, aby zapewnić jednorodne rozprzestrzenienie inokulum wirusa na komórkach. Po inkubacji usuń medium i dodaj świeży DMEM.

Uzupełnić 10% FBS, a następnie inkubować komórki przez 16, 24 lub 36 godzin, używając skrobaka do komórek. Delikatnie zebrać zainfekowane komórki oraz komórki kontrolne po infekcji i przelać zawiesinę komórkową do sterylnych probówek wirówkowych na lodzie. Policzyć komórki za pomocą komory Neubauera, a następnie odwirować je z prędkością 220 ×g przez pięć minut w temperaturze 4 °C.

Następnie resuspender osad komórkowy w pięciu mililitrach lodowatego PBS, odwirować i przemyć komórki trzykrotnie w pięciu mililitrach lodowatego PBS, odrzucając nadsącz z płukania w celu przygotowania komórek do lizy. Resuspender osad komórkowy w 700 µL lodowatego buforu hipotonicznego z inhibitorami proteaz i pozostawić komórki do spęcznienia na lodzie przez trzy godziny. Za pomocą teflonowego tłoka typu A homogenizować komórki, wykonując od 10 do 20 ruchów opadających.

Okresowo, co 20 pociągnięć, sprawdzaj lizat pod mikroskopem, aby monitorować lizę komórek. Powtarzaj ten proces przez około 80 pociągnięć, aż wszystkie komórki zostaną skutecznie rozbite. Następnie odwiruj homogenat z prędkością 300 ×g w temperaturze czterech stopni Celsius za pięć minut.

Przechowuj supernatant w temperaturze -20 °C w probówce jako frakcję cytoplazmatyczną, aby oddzielić szczątki komórkowe od pozostałości jąder. Resuspender pellet w 750 µL 0,25 M roztworu sacharozy (roztwór jeden). Pipetą przenieś 750 µL 0,35 M roztworu sacharozy (roztwór dwa) do probówki do wirowania i ostrożnie nanieś resuspenderowany homogenat na roztwór dwa. Wirować poduszkę sacharozową przy 1400 ×g w temperaturze 4 °C przez 5 minut, a następnie odrzucić supernatant.

Resuspenduj osad w 750 µL roztworu dwa w celu lizy. Sonikuj zawiesinę jądrową w kąpieli ultradźwiękowej, utrzymywanej w temperaturze 4 °C lub niższej, w dwóch pięciominutowych pulsach. Sprawdzaj lizę jąder pod mikroskopem w świetle przechodzącym pomiędzy pulsami i kontynuuj sonikację do czasu całkowitej lizy jąder.

Następnie odmierz pipetą 750 µL 0,88 M roztworu sacharozy nr 3 do probówki do wirowania i nałóż roztwór lizatu jądrowego na roztwór nr 3. Wirować lizat przy 3000 ×g w temperaturze 4 °C przez 10 minut. Frakcja 1,5 ml z nadfazwy to frakcja nukleoplazmatyczna, którą przechowuje się w temperaturze -70 °C.

Następnie resuspenduj osad w 700 µL roztworu dwa. Jest to frakcja przedziału replikacyjnego 85 lub RCF jądra gospodarza, która jest również przechowywana w temperaturze -70 °C. Aby rozpocząć analizę immunofluorescencji, nanieś pięciomikrolitrową kroplę RCF na szkiełko przedmiotowe pokryte solą fizjologiczną.

Pozostaw kroplę do wyschnięcia w temperaturze pokojowej. Następnie nanieś 500 µL PBS w postaci kropli obok plamki i przechyl szkiełko, aby PBS przepłynął przez plamkę. Odlej PBS ze szkiełka.

Następnie zablokuj miejsce z próbką, dodając 500 µL PBS zawierającego 5% albuminy surowicy bydlęcej, i inkubuj przez dwie godziny w temperaturze pokojowej. Aby usunąć nadmiar roztworu blokującego, delikatnie dodaj 500 µL PBS do naniesionej na szkiełko próbki, unikając pipetowania bezpośrednio na nią. Powtórz płukanie trzy razy.

Następnie nanieś 20 µL rozcieńczonego przeciwciała pierwszorzędowego przeciwko wirusowemu białku wiążącemu DNA E two A na miejsce z próbką. Przykryj szkiełko, aby zapobiec odparowaniu, i inkubuj w wilgotnej komorze w temperaturze pokojowej przez dwie godziny. Teraz trzykrotnie i delikatnie przemyj próbkę roztworem PBS zawierającym 0,02% tween 20.

Po tych etapach płukania należy unikać pipetowania bezpośrednio na próbkę. Nanieść 20 µL przeciwciała wtórnego przeciwko mysi z fluoro 4 bezpośrednio na próbkę i inkubować w temperaturze 4 °C przez jedną godzinę. W komorze nawilżanej dodać do szkiełek 500 µL PBS z 0,02% Tween 20, ponownie unikając pipetowania bezpośrednio na próbkę.

Następnie dodaj 2 µL medium montażowego i przykryj próbkę szkiełkiem nakrywką. Brzegi szkiełek nakrywkowych zabezpiecz lakierem do paznokci. Preparat oglądaj pod mikroskopem fluorescencyjnym z obiektywem 63x przy długości fali odpowiedniej dla użytego fluoroforu; tutaj przedstawiono wynik immunofluorescencji białka wiążącego DNA E2A wirusa adenowirusa, czyli DBP.

Struktury zawierające DBP to jądrowe wirusowe RC; należy zauważyć, że E2A DBP jest zlokalizowany wewnątrz RC i jest widoczny na zielono. Dodatkowo, wzbogacenie w wirusowe DNA w frakcji RCF potwierdzono za pomocą PCR, porównując RCF i frakcję nukleoplazmatyczną (NPL) w 24. i 36. godzinie po infekcji. Wirusowe DNA znaleziono selektywnie w RCF, a nie w NPL.

Załączony tekst stanowi dodatkowy dowód na obecność adenowirusowego MNA w RCF. Po opanowaniu tej techniki, proces od momentu zbioru zainfekowanych komórek do izolacji RCF może zostać zrealizowany w ciągu sześciu godzin, pod warunkiem prawidłowego wykonania. Podczas przeprowadzania tej procedury ważne jest, aby próbki zawsze przechowywać w lodzie oraz monitorować etapy homogenizacji jąder, izolacji, sonikacji i izolacji frakcji podjądrowej za pomocą mikroskopii w jasnym polu. Postępuj zgodnie z poniższą procedurą.

W celu zbadania regulacji ekspresji genów wirusowych związanej z kompartymentami replikacji wirusowej oraz ultrastruktury tych cząstek można zastosować inne metody, takie jak R-T-P-C-R i transmisyjną mikroskopię elektronową. Technika ta ma potencjał, aby utorować drogę badaczom w dziedzinie wirologii guzów DNA do eksploracji mechanizmów molekularnych, które zmieniają regulację cyklu komórkowego i promują replikację wirusów w komórkach ludzkich. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać gruntowną wiedzę na temat izolacji kompartymentów replikacji wirusowej z jąder zainfekowanych komórek w celu przeprowadzenia badań morfologicznych, funkcjonalnych i składnikowych tych struktur indukowanych przez wirusy.

Należy pamiętać, że praca z wskaźnikiem SAN może być niebezpieczna, dlatego podczas wykonywania tej procedury zawsze należy podejmować odpowiednie środki ostrożności, takie jak stosowanie ochronników słuchu.