Izolacja frakcji subjądrowych wzbogaconych w przedziały replikacji wirusa z normalnych komórek ludzkich zakażonych adenowirusem

Ogólnym celem tej procedury jest uzyskanie frakcji niejądrowej wzbogaconej o przedziały replikacyjne utworzone w komórkach zakażonych adenowirusem w celu szczegółowego zbadania ich składu, ultrastruktury i związanych z tym aktywności. Metoda ta może pomóc w rozwiązaniu kluczowych pytań w dziedzinie wirusologii DNA, takich jak badanie mechanizmów molekularnych kontrolujących replikację i ekspresję genomu wirusa, które z kolei zależą od przedziałów replikacyjnych w celu regulacji interakcji komórek gospodarza wirusa. Główną zaletą tej techniki jest to, że jest to prosta procedura oparta na gradiencie prędkości w celu ustanowienia systemu bezkomórkowego, który jest podatny na badanie mechanizmów, które pozwalają wirusom replikującym się jądrowo DNA przejąć kontrolę nad zainfekowaną komórką.

Aby wykonać ten test, najpierw przygotuj adenowirusa typu piątego lub piątkę D i ludzkie fibroblasty napletka lub HFF, jak opisano w dołączonym protokole tekstowym, aby rozpocząć infekcję od 10 do siódmego HFF w 100-milimetrowych szalkach do hodowli tkankowej przy użyciu jednego mililitra 85 i DMM na szalkę przy MOI wynoszącym 30 jednostek tworzących ognisko lub FFU na komórkę, inkubować komórki przez dwie godziny w wilgotnym inkubatorze do hodowli komórek w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla. Ostrożnie kołysząc szalkami co 15 minut, aby zapewnić równomierne rozprowadzenie inokulum wirusa w komórkach. Po inkubacji usuń pożywkę i dodaj świeży dmem.

Uzupełniony 10% FBS, a następnie inkubować komórki przez 16, 24 lub 36 godzin za pomocą skrobaka do komórek. Delikatnie zbierz zakażone i kontrolne komórki po zakażeniu, a następnie zbierz zawiesinę komórek w sterylnych probówkach wirówkowych na lodzie. Policz komórki za pomocą komory neubauera, a następnie odwiruj komórki w temperaturze 220 razy G przez pięć minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza.

Następnie ponownie zawieś osad komórek w pięciu mililitrach lodowatej wirówki PBS i umyj komórki trzy razy w pięciu mililitrach lodowatego PBS, odrzucając supernatanty do mycia w celu podzielenia komórek. Resus, zawiesić osad komórkowy w 700 mikrolitrach lodowatego hipotonicznego buforu z inhibitorami proteazy i pozwolić komórkom pęcznieć na lodzie przez trzy godziny. Za pomocą tłuczka teflonowego typu A homogenizuj komórki za pomocą 10 do 20 ruchów w dół.

Sprawdzaj lizat pod mikroskopem okresowo co 20 uderzeń, aby monitorować lizę komórek. Powtarzaj proces przez około 80 pociągnięć, aż wszystkie komórki zostaną pomyślnie pęknięte. Następnie odwirować homogenat w temperaturze 300 razy G w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez pięć minut.

Przechowuj supernatant w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza w probówce jako frakcję cytoplazmatyczną, aby usunąć resztki komórkowe z jąder reus. Zawiesić osad w 750 mikrolitrach 0,25 molowego roztworu sacharozy, jednej pipecie, 750 mikrolitrach 0,35 molowego roztworu sacharozy, dwóch w probówce wirówkowej i ostrożnie nałożyć zawieszony homogenat na roztwór drugi. Obracać poduszkę sacharozy w temperaturze 1400 razy G w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez pięć minut, a następnie wyrzucić supernatant.

Ponownie zawiesić osad w 750 mikrolitrach roztworu dwa na. Jądra sonikują zawiesinę jądrową w kąpieli ultradźwiękowej, utrzymywanej na poziomie lub poniżej czterech stopni Celsjusza w dwóch pięciominutowych impulsach. Sprawdź lizę jądrową pod mikroskopem jasnego pola między impulsami i kontynuuj sonikację, aż jądra całkowicie się położą.

Następnie odpipetować 750 mikrolitrów 0,88 molowej sacharozy Roztwór trzy w probówce wirówkowej ułóż roztwór lizatu jądrowego na roztwór trzeci. Odwirować lizat w temperaturze 3000 razy G w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez 10 minut. Wymienione 1,5 mililitra S to jądrowa frakcja plazmowa, która jest przechowywana w temperaturze minus 70 stopni Celsjusza.

Następnie ponownie zawieś osad w 700 mikrolitrach roztworu drugiego. Jest to frakcja 85 przedziałów replikacyjnych lub RCF jądra gospodarza, które jest również przechowywane w temperaturze minus 70 stopni Celsjusza. Aby rozpocząć analizę immunofluorescencyjną, dodaj pięciolitrową kroplę RCF do szkiełka podstawowego pokrytego solą fizjologiczną.

Pozostaw kroplę powietrza do wyschnięcia w temperaturze pokojowej. Następnie dodaj 500 mikrolitrów PBS w kropli obok miejsca i przechyl szkiełko, aby przelać PBS na miejsce. Opróżnij PBS ze szkiełka.

Następnie zablokuj miejsce próbki 500 mikrolitrami PBS zawierającego 5% albuminy surowicy bydlęcej przez dwie godziny w temperaturze pokojowej. Aby usunąć nadmiar roztworu blokującego, należy delikatnie dodać 500 mikrolitrów PBS do próbki narysowanej na szkiełku bez pipetowania bezpośrednio na próbkę. Wykonaj pranie trzy razy.

Następnie dodaj 20 mikrolitrów rozcieńczonego pierwszorzędowego przeciwciała przeciwko wirusowemu białku wiążącemu DNA E two A w miejscu próbki. Przykryj szkiełko, aby uniknąć parowania i inkubuj w wilgotnej komorze w temperaturze pokojowej przez dwie godziny. Teraz delikatnie przemyj próbkę trzykrotnie PBS zawierającym 0,02% tween 20.

Należy unikać pipetowania bezpośrednio na próbkę po tych płukaniach. Dodaj 20 mikrolitrów czterosprzężonego z fluorem czterosprzężonego przeciwciała wtórnego myszy bezpośrednio na próbkę, inkubuj w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez godzinę. W wilgotnej komorze dodaj 500 mikrolitrów PBS z 0,02%Tween 20 do szkiełek, ponownie unikając pipetowania bezpośrednio na próbkę.

Następnie dodać dwa mikrolitry roztworu montażowego i odwrócić szkiełko nakrywkowe na próbce. Uszczelnij boki szkiełek nakrywkowych lakierem do paznokci. Zobacz szkiełko pod mikroskopem fluorescencyjnym z obiektywem 63x o pożądanej długości fali specyficznej dla zastosowanego fluoru czterech, wynik immunofluorescencji adenowirusowego białka wiążącego E two A DNA lub DBP pokazano tutaj.

Struktury zawierające DBP są subjądrowymi rc wirusowymi, należy zauważyć, że DBP E two A jest zlokalizowany w RC i pojawia się na zielono. Dodatkowo wzbogacenie DNA wirusa w RCF potwierdzono za pomocą PCR porównującego RCF i nukleoplazmiczną frakcję plazmową lub NPL po 24 i 36 godzinach od zakażenia. Wirusowy GNA został wykryty wybiórczo w RCF, a nie w konsultacji dotyczącej NPL.

Tekst towarzyszący zawiera dodatkowe dowody na obecność adenowirusowego MNA w RCF Po opanowaniu tej techniki można wykonać w ciągu sześciu lat od momentu pobrania zakażonych komórek do izolacji RCF, jeśli zostanie wykonana prawidłowo. Podczas wykonywania tej procedury należy pamiętać, aby zawsze trzymać próbki na lodzie i monitorować etapy homogenizacji jądra, izolacji, sonikacji i izolacji frakcji subjądrowej za pomocą mikroskopii jasnego pola. Postępując zgodnie z tą procedurą.

Inne metody, takie jak R-T-P-C-R i transmisyjna mikroskopia elektronowa, mogą być wykonywane w celu zbadania regulacji ekspresji genów wirusa związanych z przedziałami replikacji wirusa i ultrastrukturą tych cząstek. Technika ta ma potencjał, aby utorować drogę naukowcom zajmującym się wirusologią nowotworów DNA do zbadania mechanizmów molekularnych, które zmieniają regulację cyklu komórkowego i promują replikację wirusa w komórkach ludzkich. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak wyizolować przedziały replikacji wirusa z zakażonych jąder komórkowych w celu przeprowadzenia badań morfologicznych, funkcjonalnych i składowych tych struktur indukowanych przez wirusa.

Nie zapominaj, że praca ze wskaźnikiem SAN może być niebezpieczna, a podczas wykonywania tej procedury należy zawsze brać pod uwagę utrapienia, takie jak noszenie ust do uszu.