Name: Izolacja frakcji subjądrowych wzbogaconych w przedziały replikacji wirusa z normalnych komórek ludzkich zakażonych adenowirusem (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-11-12T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 22 s
Description: Poznaj metodę izolacji subjądrowych przedziałów replikacji wirusa z komórek ludzkich zakażonych adenowirusem. Technika gradientu prędkości umożliwia badanie mechanizmów replikacji genomu wirusa i interakcji z komórką gospodarza.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez granty z CONACyT-SEP (SEP-2008-84582; CB-2011-01-168497) oraz Promep-SEP dla R.A.G.; P.H. otrzymał stypendium CONACyT (447442).

1. Hodowla komórkowa HFF i ad-infekcja
<ol>
	<li>Rozmnażaj wirusa Ad5 WT w monowarstwach komórek HEK-293 i mianuj jako jednostki tworzące fluorescencje (FFU) na komórkach HFF, jak opisano wcześniej8.</li>
	<li>Hoduj ludzkie fibroblasty napletka (HFF) w 10 ml DMEM/10% płodowej surowicy bydlęcej (FBS) w sterylnej hodowli na 100 mm szalkach w temperaturze 37 ºC i 5% CO2 w wilgotnym inkubatorze. Określ liczbę komórek za pomocą komory Neubauera, licząc komórki w czterech zestawach 16-kwadratowych. Liczbę komórek na ml uzyskuje się, obliczając średnią liczbę komórek w czterech zestawach 16-kwadratowych i mnożąc tę liczbę przez 104. Za każdym razem, gdy jest to możliwe po infekcji, o którym mowa w kroku 1.3, należy użyć komórek HFF 1 x 107</li>.
	<li>Próbne zakażenie lub zakażenie komórek HFF adenowirusem typu 5 (Ad5) typu dzikiego (WT) (H5pg41008) w 100-milimetrowych szalkach do hodowli tkankowych przy użyciu 1 ml Ad5 w DMEM na szalkę przy MOI wynoszącym 30 jednostek formujących ognisko lub FFU na komórkę. Inkubować przez 2 godziny w wilgotnym inkubatorze do hodowli komórkowych w temperaturze 37 ºC i 5% CO2 , ostrożnie kołysząc szalkami co 15 minut, aby zapewnić jednorodne rozmieszczenie inokulum wirusa w komórkach. Po tym czasie usunąć pożywkę i dodać świeży DMEM uzupełniony 10% FBS i inkubować przez 16, 24 lub 36 godzin w wilgotnym inkubatorze do hodowli komórkowych w temperaturze 37 ºC i 5% CO2 . Przejdź do kroku 2.1.</li>
</ol>
2. Przygotowanie frakcji subjądrowych wzbogaconych o Adenovirus RC
<ol>
	<li>Zebrać zakażone Ad5 lub pozorowane zakażone komórki HFF za pomocą skrobaka do komórek i zebrać komórki w sterylnych probówkach wirówkowych. Określ numer komórki jak w kroku 1.2. Użyj 1 x 107 komórek za każdym razem po infekcji określonym w kroku 1.3.</li>
	<li>Odwirować komórki w temperaturze 220 x g, 4 °C przez 5 min.</li>
	<li>Ponownie zawiesić osad ogniwa w lodowatym PBS (137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 10 mM Na2HPO4 i 1,8 mM KH2PO4). Umyj granulki komórkowe 3 razy, używając 5 ml lodowatego PBS na pranie. W tym celu odwirować komórki w temperaturze 220 x g, w temperaturze 4 °C przez 5 minut, zdekantować i wyrzucić supernatant (SN), a następnie ponownie zawiesić osad komórek przez delikatne pipetowanie.</li>
	<li>Aby przerwać błonę plazmatyczną, należy ponownie zawiesić osad komórkowy w 700 μl lodowatego buforu hipotonicznego (10 mM HEPES pH 7,9, 10 mM KCl, 1,5 mM MgCl2, 0,5 mM DTT, 20 μg/ml fluorku fenylometylosulfonylu (PMSF), mieszaniny inhibitorów cysteiny, seryny, treoniny i proteazy aspartylowej, w tym 10 μg/ml bydlęcego inhibitora trypsyny trzustkowej, 10 μg/ml pepstatyny A i 10 μg/ml N-acetylo-L-leucylo-L-leucylo-L-argininal) i pozostawić komórki pęczniejące na lodzie przez 3 godziny.</li>
	<li>Lizować komórki za pomocą homogenizatora z luźno dopasowanym tłuczkiem teflonowym typu A. Wykonaj 80 uderzeń i monitoruj próbki co 20 pociągnięć za pomocą mikroskopii jasnego pola, aby upewnić się, że wszystkie komórki zostały poddane lizie, ale jądra nie zostały uszkodzone lub pęknięte.</li>
	<li>Odwirować homogenat komórkowy w temperaturze 300 x g, 4 °C przez 5 minut. Przechowywać SN jako frakcję cytoplazmatyczną w temperaturze -20 °C w probówce wirówkowej.</li>
	<li>Aby usunąć resztki komórkowe z jąder, należy ponownie zawiesić osad w 750 μl roztworu 1 (S1) (0,25 M sacharozy, 10 mM MgCl2 20 μg/ml PMSF, mieszaniny cysteiny, seryny, treoniny i inhibitorów proteazy aspartylowej, w tym 10 μg/ml bydlęcego inhibitora trypsyny trzustkowej, 10 μg/ml pepstatyny A i 10 μg/ml N-acetylo-L-leucylo-L-leucylo-L-argininal) i nałożyć warstwę na równą objętość roztworu 2 (S2) (0,35 M sacharozy, 0,5 mM MgCl2, 20 μg/ml PMSF, mieszaninę inhibitorów cysteiny, seryny, treoniny i proteazy aspartylowej, w tym 10 μg/ml bydlęcego inhibitora trypsyny trzustkowej, 10 μg/ml pepstatyny A i 10 μg/ml N-acetylo-L-leucylo-L-leucylo-argininal). Wirować w temperaturze 1 400 x g, 4 ºC przez 5 min.</li>
	<li>Wyrzucić SN za pomocą mikropipety. Unikaj naruszania pelletu.</li>
	<li>Zawiesić osad zawierający izolowane jądra w 750 μl S2.</li>
	<li>Aby wyizolować frakcje subjądrowe wzbogacone adenowirusem RC (RCf), należy sonicyjnie zawiesić jądra za pomocą kąpieli ultradźwiękowej, używając dwóch 5-minutowych impulsów lub do momentu, gdy wszystkie jądra zostaną zizowane, jak zaobserwowano za pomocą mikroskopii jasnego pola. W razie potrzeby należy użyć lodu w kąpieli ultradźwiękowej, aby utrzymać próbki w temperaturze 4 °C lub niższej.</li>
	<li>Warstwy sonikowanych jąder na równej objętości roztworu 3 (S3) (0,88 M sacharozy, 0,5 mM MgCl2) i odwirować przy 3 000 x g, 4 ºC przez 10 minut. Przechowywać 1,5 ml supernatantu jako frakcję nukleoplazmatyczną (Npl) w temperaturze -70 °C. Zawiesić osad w 700 μl S2 i przechowywać jako RCf w temperaturze -70 °C.</li>
</ol>
3. Analizy Western Blot RCf

UWAGA: Do analizy Western Blot frakcji Npl i RCf należy odłożyć 640 μl dla Npl i 300 μl dla RCf z całkowitej objętości uzyskanej w kroku 2.11.

<ol>
	<li>Zmieszać 15 μl każdej frakcji subjądrowej w buforze Laemmli 2x (4% SDS, 20% glicerol, 10% 2-merkaptoetanol, 0,004% błękitu bromofenolowego, 0,125 M Tris HCl pH 6,8) i gotować w temperaturze 95 °C przez 5 minut. Załadować próbki do 10% żelu denaturującego do elektroforezy w żelu poliakryloamidowym z 10% dodecylosiarczanem siarczanu sodu (SDS-PAGE) i oddzielić białka przez 1,5 godziny, przy 20 miliamperach (mA).</li>
	<li>Przenieś białka przez elektroblotowanie przez 1,5 godziny w temperaturze 400 mA na membrany z polifluorku winylidenu (PVDF).</li>
	<li>Zablokuj membranę na 2 godziny w temperaturze pokojowej, używając 3% odtłuszczonego mleka w proszku w PBS.</li>
	<li>Inkubować O/N w temperaturze 4 ºC z pierwszorzędowym przeciwciałem przeciwko wirusowemu białku wiążącemu DNA E2A (B6-89) w rozcieńczeniu 1:500 w PBS/0,3% odtłuszczonym mleku w proszku.</li>
	<li>Umyj membranę 3 razy za pomocą PBS/0,1% Tween 20 przez 10 min.</li>
	<li>Inkubować błonę z mysim przeciwciałem drugorzędowym anty IgG sprzężonym z peroksydazą chrzanową (HRP) w rozcieńczeniu 1:10 000 w PBS przez 2 godziny w RT.</li>
	<li>Umyj membranę 3 razy za pomocą PBS/0,1% Tween 20 przez 10 minut.</li>
	<li>Wywołaj membranę przy użyciu ulepszonej chemiluminescencji i filmów rentgenowskich.</li>
</ol>
4. Wykrywanie wirusowego DNA w RCf
UWAGA: Do izolacji DNA zarówno z frakcji Npl, jak i RCf, użyj 210 μl dla Npl i 100 μl dla RCf całkowitej objętości uzyskanej w kroku 2.11.
<ol>
	<li>Inkubować frakcje subjądrowe przez 1 godzinę w temperaturze 55 ºC z 1 mg/ml proteinazy K i 0,5% Tween 20.</li>
	<li>Dezaktywować proteinazę K przez inkubację próbek przez 10 minut w temperaturze 95 °C.</li>
	<li>Odwirować próbki przy 20 000 x g, w temperaturze pokojowej przez 2 minuty.</li>
	<li>Zbierz numer seryjny. Wytrącić DNA w 1/10 objętości 3M octanu sodu i jednej objętości izopropanolu, O/N w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Odwirować próbki przy masie 20 000 x g, w temperaturze pokojowej przez 10 minut.</li>
	<li>Wyrzucić SN za pomocą mikropipety. Przemyć granulat 70% etanolem i odwirować w temperaturze 20 000 x g, 4 °C przez 5 minut.</li>
	<li>Ponownie zawiesić DNA w 10 μl 10 mM Tris-HCl pH 7,4</li>
	<li>Określić ilościowo DNA za pomocą spektrofotometru, mierząc gęstość optyczną (OD) przy 260 nm.</li>
	<li>Aby amplifikować DNA wirusa, należy użyć 100 ng DNA z każdej frakcji subjądrowej w standardowej reakcji PCR z użyciem polimerazy DNA Taq w 25 μl objętości reakcji ze starterami, które umożliwiają amplifikację regionu w jednostce transkrypcji Major Late, od nukleotydu 7273 do nukleotydu 7353 (81 pz) (Fw: GAGCGAGGTGTGGGTGAGC; Rv: GGATGCGACGACACTGACTTCA). Stosować następujące warunki cyklu: początkowa denaturacja przez 3 minuty w temperaturze 95 ºC, a następnie 20 cykli amplifikacji (1 min w temperaturze 95 °C, wyżarzanie przez 1 minutę w temperaturze 62 ºC i przedłużenie przez 30 sekund w temperaturze 72 ºC) i końcowy etap przedłużania przez 3 minuty w temperaturze 72 ºC.</li>
	<li>Uruchom produkt PCR w 2% żelach agarozowych, pod napięciem 90 V. Wybarwić bromkiem etydyny w końcowym stężeniu 0,5 μg/ml i zobrazować DNA, aby potwierdzić wzbogacenie wirusowego DNA w RCf. Z bromkiem etydyny należy obchodzić się ze szczególną ostrożnością i zawsze należy nosić rękawiczki, ponieważ związek ten jest silnym mutagenem. Bromek etydyny należy utylizować zgodnie z wytycznymi instytucji.</li>
</ol>
5. Późne wykrywanie wirusowego mRNA w RCf
UWAGA: Do izolacji RNA zarówno z frakcji Npl, jak i RCf, użyj 640 μl dla Npl i 300 μl dla RCf z całkowitej objętości uzyskanej w kroku 2.11.
<ol>
	<li>Wyizolować RNA z frakcji subjądrowych za pomocą Trizolu zgodnie z instrukcjami producenta. Ponownie zawiesić RNA w 50 μl wody uzdatnionej DEPC (ditylpirowęglanem).</li>
	<li>Określić ilościowo RNA za pomocą spektrofotometru w celu zmierzenia OD przy 260 nm (otrzymuje się około 3 μg). Przechowywać RNA w podwielokrotnościach o stężeniu 50 ng/μl w temperaturze -70 °C.</li>
	<li>Sprawdzić oczyszczone RNA pod kątem braku zanieczyszczenia DNA, przeprowadzając kontrolną reakcję PCR przy braku odwrotnej transkryptazy (RT), używając 5 ng całkowitego RNA i w warunkach cyklu opisanych w kroku 4.9.
	<ol>
		<li>Jeśli zanieczyszczenie DNA nie jest obecne, nie należy wytwarzać amplikonu. Jeśli występuje zanieczyszczenie DNA, należy inkubować próbki z 10 U DNazą I, 10 U inhibitora Rnazy, 0,1 M Tris-HCl pH 8,3, 0,5 M KCl i 15 mM MgCl2 przez 30 minut w temperaturze 37 °C. Przystąpić do ponownej izolacji RNA, jak w kroku 5.1.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Aby przeanalizować mRNA wirusa związane z RCf, amplifikuj 100 ng RNA z każdej frakcji subjądrowej za pomocą RT-PCR przy użyciu starterów przeznaczonych do wykrywania adenowirusowego późnego mRNA z różnych rodzin genów (Tabela 1).
	<ol>
		<li>Do odwrotnej transkrypcji (RT) należy użyć 100 ng RNA z każdej frakcji subjądrowej w standardowej reakcji RT z użyciem enzymu M-MuLV RT w 20 μl objętości reakcji przez 1 godzinę w temperaturze 42 ºC i 10 minut w temperaturze 70 ºC.</li>
		<li>Do amplifikacji należy użyć 1 μl cDNA w reakcjach PCR, jak w kroku 4.9. Stosować następujące warunki cyklu: początkowa denaturacja przez 3 minuty w temperaturze 95 °C, a następnie 25 cykli amplifikacji (1 min w temperaturze 95 °C, wyżarzanie przez 1 minutę w temperaturze określonej w tabeli 1 i przedłużenie przez 30 sekund w temperaturze 72 °C) i końcowy etap przedłużania przez 3 minuty w temperaturze 72 °C.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Uruchom produkty RT-PCR w 2% żelach agarozowych, przy napięciu 90 V. Zabarwić żele bromkiem etydyny o końcowym stężeniu 0,5 μg/ml i zwizualizować, aby potwierdzić późne asocjację mRNA wirusa z RCf. Postępuj z bromkiem etydyny, jak wskazano w kroku 4.10.</li>
</ol>
6. Immunofluorescencyjna wizualizacja RCf
UWAGA: Przeprowadź tę procedurę w komorze z przepływem laminarnym, aby uniknąć zanieczyszczenia próbek jakimikolwiek cząstkami pyłu, i przefiltruj wszystkie roztwory przed użyciem.
<ol>
	<li>Umieścić 5 μl frakcji RCf otrzymanej w kroku 2.10 bezpośrednio na szkiełku pokrytym silanem.</li>
	<li>Pozostaw miejsce do wyschnięcia na około 5 minut w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Ponownie nawodnić się, powoli i pośrednio pipetując 500 μl PBS w kropli obok plamki RCf i pozwalając mu płynąć, przechylając szkiełko. Odcedź nadmiar PBS z boku.</li>
	<li>Blokować, pokrywając próbkę 500 μl PBS/5% albuminy surowicy bydlęcej (BSA) przez 2 godziny w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Przemyć szkiełko 3 razy, delikatnie i pośrednio pipetując 500 μl PBS na próbkę. Przechyl suwak, aby odsączyć nadmiar PBS.</li>
	<li>Inkubować próbkę z pierwszorzędowym przeciwciałem przeciwko wirusowemu białku wiążącemu DNA E2A (B6-89) w rozcieńczeniu 1:500 w PBS przez 2 godziny w temperaturze pokojowej. Przykryj nakrapianą próbkę 20 μl roztworu przeciwciała i inkubuj w wilgotnej komorze, aby uniknąć wysuszenia.</li>
	<li>Przemyć próbkę 3 razy za pomocą PBS/0,02% Tween 20, delikatnie i pośrednio pipetując 500 μl PBS na próbkę. Przechyl suwak, aby spuścić nadmiar roztworu myjącego.</li>
	<li>Inkubować próbki z mysim przeciwciałem drugorzędowym anty IgG sprzężonym z fluoroforem, który jest wzbudzany przy 488 nm w rozcieńczeniu 1:2,000 w PBS, przez 1 godzinę w temperaturze 4 °C. Przykryj plamistą próbkę 20 μl roztworu przeciwciała i inkubuj w wilgotnej komorze, aby uniknąć wysuszenia.</li>
	<li>Przemyć próbkę 3 razy za pomocą PBS/0,02% Tween 20, delikatnie i pośrednio pipetując 500 μl PBS na próbkę. Przechyl suwak, aby spuścić nadmiar roztworu myjącego.</li>
	<li>Przykryć nakrapianą próbkę na szkiełku nakrywkowym szkiełkiem nakrywkowym, używając 2 μl PBS/10% glicerolu jako podłoża mocującego. Uszczelnij bezbarwnym lakierem do paznokci i przechowuj w temperaturze -20 ºC.</li>
	<li>Analizuj próbki za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego, z obiektywem 63x i aperturą numeryczną 1,4 (NA) przy długości fali 488 nm.</li>
</ol>

<ol><li>Doucas, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adenovirus+replication+is+coupled+with+the+dynamic+properties+of+the+PML+nuclear+structure%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+%26+Dev%22%5BJournal%5D)">Adenovirus replication is coupled with the dynamic properties of the PML nuclear structure.</a> Genes & Dev. 10, 196-207 (1996).</li>
<li>Schmid, M., Speiseder, T., Dobner, T., Gonzalez, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+virus+replication+compartments%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">DNA virus replication compartments.</a> J. Virol. 88, 1404-1420 (2014).</li>
<li>Boon, J. A., Diaz, A., Ahlquist, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytoplasmic+viral+replication+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+host+microbe%22%5BJournal%5D)">Cytoplasmic viral replication complexes.</a> Cell host microbe. 8, 77-85 (2010).</li>
<li>Paul, D., Hoppe, S., Saher, G., Krijnse-Locker, J., Bartenschlager, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Morphological+and+biochemical+characterization+of+the+membranous+hepatitis+C+virus+replication+compartment%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Morphological and biochemical characterization of the membranous hepatitis C virus replication compartment.</a> J. Virol. 87, 10612-10627 (2013).</li>
<li>Busch, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+Nucleoli%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Cell+Res%22%5BJournal%5D)">Isolation of Nucleoli.</a> Exp Cell Res. 24, Suppl 9. 150-163 (1963).</li>
<li>Lam, Y. W., Lyon, C. E., Lamond, A. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Large-scale+isolation+of+Cajal+bodies+from+HeLa+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Biol.+Cell%22%5BJournal%5D)">Large-scale isolation of Cajal bodies from HeLa cells.</a> Mol. Biol. Cell. 13, 2461-2473 (2002).</li>
<li>Lam, Y. W., Trinkle-Mulcahy, L., Lamond, A. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+nucleolus%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">The nucleolus.</a> J Cell Sci. 118, 1335-1337 (2005).</li>
<li>Groitl, P., Dobner, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Construction+of+adenovirus+type+5+early+region+1+and+4+virus+mutants%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Med%22%5BJournal%5D)">Construction of adenovirus type 5 early region 1 and 4 virus mutants.</a> Methods Mol Med. 130, 29-39 (2007).</li>
<li>Reich, N. C., Sarnow, P., Duprey, E., Levine, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monoclonal+antibodies+which+recognize+native+and+denatured+forms+of+the+adenovirus+DNA-binding+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Virology%22%5BJournal%5D)">Monoclonal antibodies which recognize native and denatured forms of the adenovirus DNA-binding protein.</a> Virology. 128, 480-484 (1983).</li>
<li>Leppard, K. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+effects+on+adenovirus+late+gene+expression+of+deleting+the+E1b+55K+protein%5BTitle%5D)+AND+%22J+Gen+Virol%22%5BJournal%5D)">Selective effects on adenovirus late gene expression of deleting the E1b 55K protein.</a> J Gen Virol. 74 (Pt 4), 575-582 (1993).</li>
<li>Gonzalez, R., Huang, W., Finnen, R., Bragg, C., Flint, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adenovirus+E1B+55-kilodalton+protein+is+required+for+both+regulation+of+mRNA+export+and+efficient+entry+into+the+late+phase+of+infection+in+normal+human+fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Adenovirus E1B 55-kilodalton protein is required for both regulation of mRNA export and efficient entry into the late phase of infection in normal human fibroblasts.</a> J. Virol. 80, 964-974 (2006).</li>
<li>Castillo-Villanueva, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Mre11+Cellular+Protein+Is+Modified+by+Conjugation+of+Both+SUMO-1+and+SUMO-2%2F3+during+Adenovirus+Infection%5BTitle%5D)+AND+%22ISRN+Virology%22%5BJournal%5D)">The Mre11 Cellular Protein Is Modified by Conjugation of Both SUMO-1 and SUMO-2/3 during Adenovirus Infection.</a> ISRN Virology. 2014, 14(2014).</li>
<li>Morris, S. J., Scott, G. E., Leppard, K. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adenovirus+late-phase+infection+is+controlled+by+a+novel+L4+promoter%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Adenovirus late-phase infection is controlled by a novel L4 promoter.</a> J. Virol. 84, 7096-7104 (2010).</li>
<li>Wright, J., Leppard, K. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+human+adenovirus+5+L4+promoter+is+activated+by+cellular+stress+response+protein+p53%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">The human adenovirus 5 L4 promoter is activated by cellular stress response protein p53.</a> J. Virol. 87, 11617-11625 (2013).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Aby wyjaśnić mechanizmy molekularne, które regulują aktywność komórkową przez infekcję wirusową, zrozumienie składu i aktywności związanej z RC byłoby kluczowe. Dlatego, aby przeprowadzić szczegółową analizę RC, stworzyliśmy system bezkomórkowy, który wykorzystuje rozmiar i skład biochemiczny tych struktur indukowanych przez wirusa, aby wyizolować frakcje subjądrowe wzbogacone RC za pomocą prostej procedury, która opiera się na gradientach prędkości z poduszkami sacharozy. Krytyczne etapy procedury, które wymagają standa...

Adenowirusy zawierają dwuniciowy genom DNA, który replikuje się w zainfekowanym jądrze komórkowym. Kiedy wirusowe DNA dostanie się do jądra, lokalizuje się w sąsiedztwie ciał jądrowych PML1. Po wczesnej ekspresji genów wirusa, architektura jądrowa ulega radykalnej reorganizacji, indukując tworzenie mikrośrodowisk wirusa, zwanych przedziałami replikacji wirusa (RC)2. Ponieważ adenowirus (Ad) RC jest miejscem, w którym zachodzi replikacja genomu wirusa i ekspresja późnych genów wirusa, zapewniają one środowisko do rekrutacji wszystkich niezbędnych czynników wirusowych i komórkowych, które uczestniczą w tych procesach. Co ciekawe, różne białka komórkowe odpowiedzialne za komórkową odpowiedź przeciwwirusową, takie jak odpowiedź na uszkodzenie DNA, wrodzona odpowiedź immunologiczna i supresja guza, są dokooptowane do tych miejsc wirusowych2. W związku z tym Ad RC można uznać za ośrodki regulacyjne, które promują wydajną replikację wirusa, jednocześnie regulując komórkową odpowiedź przeciwwirusową, co wskazuje, że struktury te są kluczem do zrozumienia interakcji między komórkami wirusa-gospodarza. Niemniej jednak molekularne mechanizmy powstawania RC, ich skład i związane z nimi działania są słabo poznane.
Adenowirusowy RC, jak również RC z innych wirusów DNA, które replikują się w jądrze, nie są związane z błonami, w przeciwieństwie do cytoplazmatycznego RC3. Co więcej, te indukowane przez wirusa struktury prawdopodobnie składają się wyłącznie z białek i kwasów nukleinowych. RC utworzone w komórkach zakażonych wirusami RNA (zwykle nazywanych fabrykami wirusów) zostały wyizolowane, wykorzystując ich lokalizację cytoplazmatyczną i status związany z błoną, co ułatwiło ich szczegółową charakterystykę morfologiczną, funkcjonalną i biochemiczną4.
O ile nam wiadomo, wirusowe RC jądrowe nie zostały wyizolowane, być może ze względu na złożoność architektury jądrowej i brak wewnątrzjądrowych membran, które ułatwiałyby ich izolację. Ich badania opierały się na mikroskopii immunofluorescencyjnej, FISH i transmisyjnej mikroskopii elektronowej. Jednak pomimo komplikacji związanych z izolacją struktur subjądrowych, inne domeny jądrowe, takie jak jąderka i ciała Cajala, zostały wyizolowane przed 5,6. Ponieważ jąderka i RC składają się z białek i kwasów nukleinowych i mają średnicę od 0,5 do 5 μm, postawiliśmy hipotezę, że RC powinien być również podatny na izolację. Dlatego, aby dokładniej scharakteryzować skład molekularny i funkcje związane z RC, opracowaliśmy nowatorską metodę izolowania frakcji subjądrowych wzbogaconych o RC. W tym celu przygotowaliśmy frakcje subjądrowe przy użyciu gradientów prędkości i poduszek sacharozowych, podobnie jak w procedurach stosowanych do izolowania jąderek7 lub innych domen jądrowych6 i stworzyliśmy system bezkomórkowy, który umożliwia badanie składu molekularnego i związanych z nim aktywności RC. Technika ta powinna zatem przyczynić się do lepszego zrozumienia interakcji między wirusem a komórkami gospodarza i stanowi potężne narzędzie, które powinno również ułatwić szczegółową analizę RC z innych wirusów, które replikują się w jądrze i indukują tworzenie przedziałów replikacyjnych o rozmiarach podobnych do tych, które powstają w komórkach zakażonych adenowirusem, takich jak herpeswirusy, wirusy brodawczaka lub poliomawirusy.

<table><tbody><tr><td>DMEM</td><td>Gibco</td><td>12100-046</td><td>Ciepły w 37 &ordm; C kąpiel wodna przed użyciem</td></tr><tr><td>Płodowa surowica bydlęca</td><td>Gibco</td><td>12484-028</td><td></td></tr><tr><td>Sacharoza, Ultra Pure</td><td>Research Organics</td><td>0928S</td><td>Przygotować 2,55 M roztwór podstawowy i przechowywać w temperaturze 4 &ordm; </td></tr><tr><td>Homogenizator C Dounce</td><td>Kontess Glass Company</td><td>884900-0000</td><td></td></tr><tr><td>Branson 1800 Wanna ultradźwiękowa</td><td>Branson</td><td>Z769533&nbsp; SIGMA</td><td>Włącz 15 minut przed użyciem.</td></tr><tr><td>Kozie przeciwciało anty-mysie IgG1 Wtórne, koniugat Alexa Fluor 488</td><td>Life Technologies</td><td>A-21121</td><td>Stosować w rozcieńczeniu 1:2,000 w szkiełkach PBS</td></tr><tr><td>Silane-Prep</td><td>Sigma</td><td>S4651-72EA</td><td>Otwórz w komorze z przepływem laminarnym</td></tr><tr><td>SuperSignal West Pico Podłoże chemiluminescencyjne</td><td>Pierce ThermoScientific</td><td>34080</td><td></td></tr></tbody></table>

izolacja frakcji subjądrowych wzbogaconych w przedziały replikacji wirusa z normalnych komórek ludzkich zakażonych adenowirusem

Isolation of Viral Replication Compartment-enriched Sub-nuclear Fractions from Adenovirus-infected Normal Human Cells

Podczas infekcji komórek ludzkich adenowirusem (Ad), jądro komórki gospodarza ulega radykalnej reorganizacji, co prowadzi do powstania mikrośrodowisk jądrowych poprzez rekrutację białek wirusowych i komórkowych do miejsc zajmowanych przez genom wirusa. Miejsca te, zwane przedziałami replikacyjnymi (RC), można uznać za domeny jądrowe indukowane przez wirusa, w których genom wirusa jest zlokalizowany, a białka wirusowe i komórkowe, które uczestniczą w replikacji, transkrypcji i przetwarzaniu potranskrypcyjnym, są rekrutowane. Co więcej, białka komórkowe biorące udział w odpowiedzi przeciwwirusowej, takie jak białka supresorowe nowotworu, składniki odpowiedzi na uszkodzenie DNA (DDR) i wrodzone czynniki odpowiedzi immunologicznej, są również dokooptowane do RC. Chociaż wydaje się, że RC odgrywają kluczową rolę w promowaniu skutecznego i produktywnego cyklu replikacji, nie przeprowadzono szczegółowej analizy ich składu i powiązanych działań. Aby ułatwić badanie adenowirusowych RC i potencjalnie tych z innych wirusów DNA, które replikują się w jądrze komórkowym, dostosowaliśmy prostą procedurę opartą na gradientach prędkości do wyizolowania Ad RC i stworzyliśmy system bezkomórkowy zdolny do prowadzenia badań morfologicznych, funkcjonalnych i składowych tych indukowanych przez wirusa struktur subjądrowych, a także do badania ich wpływu na interakcje gospodarz-komórka.

Ponieważ przedziały replikacyjne wirusów (RC) są indukowanymi przez wirusy strukturami podjądrowymi składającymi się z białek i kwasów nukleinowych, podobnie jak inne domeny jądrowe, okazały się one podatne na izolację za pomocą gradientów prędkości opartych na cechach biochemicznych. Krytyczne etapy protokołu frakcjonowania przedstawiono na Rysunku 1. Na każdym etapie próbki muszą być monitorowane za pomocą mikroskopii w polu jasnym, aby zapewnić integralność poszczególnych frakcji subkomórkowych. Na pr...

Oferujemy nowatorską strategię izolowania przedziałów replikacyjnych wirusa (RC) od komórek ludzkich zakażonych adenowirusem (Ad). Podejście to reprezentuje system bezkomórkowy, który może pomóc w wyjaśnieniu mechanizmów molekularnych regulujących replikację i ekspresję genomu wirusa, a także regulację interakcji wirus-gospodarz ustalonych w RC.

Izolacja frakcji subjądrowych wzbogaconych w przedziały replikacji wirusa z normalnych komórek ludzkich zakażonych adenowirusem

During infection of human cells by adenovirus (Ad), the host cell nucleus is dramatically reorganized, leading to formation of nuclear microenvironments ...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest uzyskanie frakcji pozajądrowej wzbogaconej w kompartymenty replikacyjne tworzone w komórkach zakażonych adenowirusami, w celu szczegółowego zbadania ich składu, ultrastruktury oraz powiązanych z nimi aktywności. Metoda ta może pomóc w odpowiedzi na kluczowe pytania z zakresu wirusologii DNA, takie jak badanie mechanizmów molekularnych kontrolujących replikację i ekspresję genomu wirusowego, które z kolei zależą od kompartymentów replikacyjnych w regulacji oddziaływań wirusa z komórką gospodarza. Główną zaletą tej techniki jest to, że jest to prosta procedura oparta na gradiencie gęstości, pozwalająca na stworzenie systemu bezkomórkowego, który umożliwia badanie mechanizmów pozwalających wirusom DNA replikującym się w jądrze przejąć kontrolę nad zakażoną komórką.Aby przeprowadzić ten test, należy najpierw przygotować adenowirus typ 5 lub Ad5 oraz ludzkie fibroblasty z napletka lub HFF zgodnie z opisem w towarzyszącym protokole tekstowym. Aby rozpocząć, zakaź 10⁷ HFF w 100 mm szalkach do hodowli tkankowej, używając 1 mL DMEM na szalkę przy MOI wynoszącym 30 jednostek tworzących ogniska lub FFU na komórkę. Inkubuj komórki przez 2 godziny w wilgotnym inkubatorze do hodowli komórkowych w temperaturze 37 °C i 5% CO2. Ostrożnie kołysz szalkami co 15 minut, aby zapewnić jednorodne rozprzestrzenienie inokulum wirusa na komórkach. Po inkubacji usuń medium i dodaj świeży DMEM.Uzupełnić 10% FBS, a następnie inkubować komórki przez 16, 24 lub 36 godzin, używając skrobaka do komórek. Delikatnie zebrać zainfekowane komórki oraz komórki kontrolne po infekcji i przelać zawiesinę komórkową do sterylnych probówek wirówkowych na lodzie. Policzyć komórki za pomocą komory Neubauera, a następnie odwirować je z prędkością 220 ×g przez pięć minut w temperaturze 4 °C.Następnie resuspender osad komórkowy w pięciu mililitrach lodowatego PBS, odwirować i przemyć komórki trzykrotnie w pięciu mililitrach lodowatego PBS, odrzucając nadsącz z płukania w celu przygotowania komórek do lizy. Resuspender osad komórkowy w 700 µL lodowatego buforu hipotonicznego z inhibitorami proteaz i pozostawić komórki do spęcznienia na lodzie przez trzy godziny. Za pomocą teflonowego tłoka typu A homogenizować komórki, wykonując od 10 do 20 ruchów opadających.Okresowo, co 20 pociągnięć, sprawdzaj lizat pod mikroskopem, aby monitorować lizę komórek. Powtarzaj ten proces przez około 80 pociągnięć, aż wszystkie komórki zostaną skutecznie rozbite. Następnie odwiruj homogenat z prędkością 300 ×g w temperaturze czterech stopni Celsius za pięć minut.Przechowuj supernatant w temperaturze -20 °C w probówce jako frakcję cytoplazmatyczną, aby oddzielić szczątki komórkowe od pozostałości jąder. Resuspender pellet w 750 µL 0,25 M roztworu sacharozy (roztwór jeden). Pipetą przenieś 750 µL 0,35 M roztworu sacharozy (roztwór dwa) do probówki do wirowania i ostrożnie nanieś resuspenderowany homogenat na roztwór dwa. Wirować poduszkę sacharozową przy 1400 ×g w temperaturze 4 °C przez 5 minut, a następnie odrzucić supernatant.Resuspenduj osad w 750 µL roztworu dwa w celu lizy. Sonikuj zawiesinę jądrową w kąpieli ultradźwiękowej, utrzymywanej w temperaturze 4 °C lub niższej, w dwóch pięciominutowych pulsach. Sprawdzaj lizę jąder pod mikroskopem w świetle przechodzącym pomiędzy pulsami i kontynuuj sonikację do czasu całkowitej lizy jąder.Następnie odmierz pipetą 750 µL 0,88 M roztworu sacharozy nr 3 do probówki do wirowania i nałóż roztwór lizatu jądrowego na roztwór nr 3. Wirować lizat przy 3000 ×g w temperaturze 4 °C przez 10 minut. Frakcja 1,5 ml z nadfazwy to frakcja nukleoplazmatyczna, którą przechowuje się w temperaturze -70 °C.Następnie resuspenduj osad w 700 µL roztworu dwa. Jest to frakcja przedziału replikacyjnego 85 lub RCF jądra gospodarza, która jest również przechowywana w temperaturze -70 °C. Aby rozpocząć analizę immunofluorescencji, nanieś pięciomikrolitrową kroplę RCF na szkiełko przedmiotowe pokryte solą fizjologiczną.Pozostaw kroplę do wyschnięcia w temperaturze pokojowej. Następnie nanieś 500 µL PBS w postaci kropli obok plamki i przechyl szkiełko, aby PBS przepłynął przez plamkę. Odlej PBS ze szkiełka.Następnie zablokuj miejsce z próbką, dodając 500 µL PBS zawierającego 5% albuminy surowicy bydlęcej, i inkubuj przez dwie godziny w temperaturze pokojowej. Aby usunąć nadmiar roztworu blokującego, delikatnie dodaj 500 µL PBS do naniesionej na szkiełko próbki, unikając pipetowania bezpośrednio na nią. Powtórz płukanie trzy razy.Następnie nanieś 20 µL rozcieńczonego przeciwciała pierwszorzędowego przeciwko wirusowemu białku wiążącemu DNA E two A na miejsce z próbką. Przykryj szkiełko, aby zapobiec odparowaniu, i inkubuj w wilgotnej komorze w temperaturze pokojowej przez dwie godziny. Teraz trzykrotnie i delikatnie przemyj próbkę roztworem PBS zawierającym 0,02% tween 20.Po tych etapach płukania należy unikać pipetowania bezpośrednio na próbkę. Nanieść 20 µL przeciwciała wtórnego przeciwko mysi z fluoro 4 bezpośrednio na próbkę i inkubować w temperaturze 4 °C przez jedną godzinę. W komorze nawilżanej dodać do szkiełek 500 µL PBS z 0,02% Tween 20, ponownie unikając pipetowania bezpośrednio na próbkę.Następnie dodaj 2 µL medium montażowego i przykryj próbkę szkiełkiem nakrywką. Brzegi szkiełek nakrywkowych zabezpiecz lakierem do paznokci. Preparat oglądaj pod mikroskopem fluorescencyjnym z obiektywem 63x przy długości fali odpowiedniej dla użytego fluoroforu; tutaj przedstawiono wynik immunofluorescencji białka wiążącego DNA E2A wirusa adenowirusa, czyli DBP.Struktury zawierające DBP to jądrowe wirusowe RC; należy zauważyć, że E2A DBP jest zlokalizowany wewnątrz RC i jest widoczny na zielono. Dodatkowo, wzbogacenie w wirusowe DNA w frakcji RCF potwierdzono za pomocą PCR, porównując RCF i frakcję nukleoplazmatyczną (NPL) w 24. i 36. godzinie po infekcji. Wirusowe DNA znaleziono selektywnie w RCF, a nie w NPL.Załączony tekst stanowi dodatkowy dowód na obecność adenowirusowego MNA w RCF. Po opanowaniu tej techniki, proces od momentu zbioru zainfekowanych komórek do izolacji RCF może zostać zrealizowany w ciągu sześciu godzin, pod warunkiem prawidłowego wykonania. Podczas przeprowadzania tej procedury ważne jest, aby próbki zawsze przechowywać w lodzie oraz monitorować etapy homogenizacji jąder, izolacji, sonikacji i izolacji frakcji podjądrowej za pomocą mikroskopii w jasnym polu. Postępuj zgodnie z poniższą procedurą.W celu zbadania regulacji ekspresji genów wirusowych związanej z kompartymentami replikacji wirusowej oraz ultrastruktury tych cząstek można zastosować inne metody, takie jak R-T-P-C-R i transmisyjną mikroskopię elektronową. Technika ta ma potencjał, aby utorować drogę badaczom w dziedzinie wirologii guzów DNA do eksploracji mechanizmów molekularnych, które zmieniają regulację cyklu komórkowego i promują replikację wirusów w komórkach ludzkich. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać gruntowną wiedzę na temat izolacji kompartymentów replikacji wirusowej z jąder zainfekowanych komórek w celu przeprowadzenia badań morfologicznych, funkcjonalnych i składnikowych tych struktur indukowanych przez wirusy.Należy pamiętać, że praca z wskaźnikiem SAN może być niebezpieczna, dlatego podczas wykonywania tej procedury zawsze należy podejmować odpowiednie środki ostrożności, takie jak stosowanie ochronników słuchu.

isolation-viral-replication-compartment-enriched-sub-nuclear

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Genom wirusa grypy typu A składa się z ośmiu oddzielnych kompleksów RNA i białek, zwanych wirusowymi kompleksami rybonukleoproteinowymi (vRNP). Niniejsza praca opisuje oczyszczanie vRNP wirusa grypy A w gradiencie glicerolu oraz ich wizualizację za pomocą transmisyjnej mikroskopii elektronowej.

Oczyszczanie i wizualizacja kompleksów rybonukleoprotein wirusa grypy A

Kardiomiocyty dorosłych są komórkami pierwotnymi, które można wyizolować z serc zwierząt i hodować przez kilka dni. W tym okresie hodowli można zastosować adenowirusowy transfer genów w celu ekspresji genetycznie kodowanych biosensorów (GEB) lub fluorescencyjnych białek fuzyjnych. Obie metody umożliwiają badania komórkowe z wykorzystaniem mikroskopii konfokalnej.

Izolacja i manipulacja genetyczna kardiomiocytów dorosłych do obrazowania konfokalnego

Opisujemy proces izolacji wysokiej czystości DNA nukleokapsydu herpeswirusa z zainfekowanych komórek. Końcowe DNA odzyskane z roztworu charakteryzuje się wysokim stężeniem i czystością, co czyni je idealnym do sekwencjonowania wysokoprzepustowego, reakcji PCR o wysokiej wierności oraz transfekcji w celu otrzymania nowych rekombinantów wirusowych.

Przygotowanie viralnego DNA z nukleokapsydów

W niniejszym opracowaniu opisujemy protokół oparty wyłącznie na infekcji komórek, który zwiększa wydajność produkcji rekombinowanego parwowirusa ponad 100-krotnie w porównaniu z innymi stosowanymi protokołami. Protokół ten opiera się na wykorzystaniu nowego pomocniczego adenowirusa typu 5 zawierającego jednostkę transkrypcyjną VP parwowirusa (Ad-VP).

Wydajna produkcja rekombinowanego parwowirusa z wykorzystaniem systemów pochodnych adenowirusa

Wirusy grypy replikują swój genom RNA w powiązaniu z chromatyną komórki gospodarza. W niniejszej pracy przedstawiamy metodę oczyszczania nienaruszonych kompleksów wirusowych rybonukleoprotein z chromatyny zainfekowanych komórek. Oczyszczone kompleksy wirusowe można analizować zarówno za pomocą techniki Western blot, jak i metody przedłużania starterów w celu oceny zawartości białek i RNA.

Oczyszczanie powinowactwem kompleksów rybonukleoprotein wirusa grypy z chromatyny zakażonych komórek

Transfer genu adenowirusowego do naiwnych limfocytów T CD4 z transgeniczną ekspresją receptora adenowirusa Coxsackie umożliwia molekularną analizę różnicowania regulatorowych limfocytów T in vitro.

Transdukcja adenowirusowa naiwnych limfocytów T CD4 w celu zbadania różnicowania limfocytów Treg

Przedstawiono protokół generowania wektorów adenowirusowych o dużej pojemności, pozbawionych wszystkich sekwencji kodujących wirusy. Klonowanie transgenów zawartych w genomie wektora opiera się na endonukleazach naprowadzających. Amplifikacja wirusa w komórkach produkcyjnych hodowanych jako komórki adherentne i w zawiesinie opiera się na wirusie pomocniczym dostarczającym geny wirusowe w trans.

Klonowanie i produkcja na dużą skalę wektorów adenowirusowych o dużej pojemności na bazie ludzkiego adenowirusa typu 5

Tutaj prezentujemy protokół produkcji adenowirusa za pomocą systemu pAdEasy. Technologia obejmuje rekombinację plazmidów pAdTrack i pAdEasy-1, pakowanie i amplifikację adenowirusa, oczyszczanie cząstek adenowirusa z lizatu komórkowego i pożywki hodowlanej, miareczkowanie wirusa oraz testowanie funkcjonalne adenowirusa.

Skuteczna metoda produkcji adenowirusa

Wirus związany z adenowirusem jest wytwarzany w hodowli komórek zawiesinowych i oczyszczany przez wirowanie w gradiacji gęstości podwójnego jodixanolu. Uwzględniono kroki mające na celu zwiększenie całkowitej wydajności wirusa, zmniejszenie ryzyka wytrącania się wirusa i dalszą koncentrację końcowego produktu wirusowego. Oczekiwane końcowe miana osiągają10-12 cząstek wirusa/ml i nadają się do przedklinicznego stosowania in vivo.

Produkcja kultur zawiesinowych i oczyszczanie wirusa związanego z adenowirusem za pomocą wirowania w gradicynacji gradientu gęstości jodiksanolu do zastosowań in vivo

Ten manuskrypt opisuje szczegółowy protokół generowania i oczyszczania wektorów wirusowych związanych z adenowirusem przy użyciu zoptymalizowanej metody chromatografii powinowactwa opartej na heparynie. Przedstawia proste, skalowalne i ekonomiczne podejście, eliminując potrzebę ultrawirowania. Otrzymane wektory wykazują wysoką czystość i aktywność biologiczną, co dowodzi ich wartości w badaniach przedklinicznych.

Izolacja wektorów wirusowych związanych z adenowirusem za pomocą jednoetapowego i częściowo zautomatyzowanego protokołu chromatografii powinowactwa do heparyny

Poznaj metodę izolacji subjądrowych przedziałów replikacji wirusa z komórek ludzkich zakażonych adenowirusem. Technika gradientu prędkości umożliwia badanie mechanizmów replikacji genomu wirusa i interakcji z komórką gospodarza.

Izolacja frakcji subjądrowych wzbogaconych w przedziały replikacji wirusa z normalnych komórek ludzkich zakażonych adenowirusem

Przeglądaj więcej filmów