Izolacja frakcji subjądrowych wzbogaconych w przedziały replikacji wirusa z normalnych komórek ludzkich zakażonych adenowirusem

Ogólnym celem tej procedury jest uzyskanie frakcji niejądrowej wzbogaconej o przedziały replikacyjne utworzone w komórkach zakażonych adenowirusem w celu szczegółowego zbadania ich składu, ultrastruktury i związanych z tym aktywności. Metoda ta może pomóc w rozwiązaniu kluczowych pytań w dziedzinie wirusologii DNA, takich jak badanie mechanizmów molekularnych kontrolujących replikację i ekspresję genomu wirusa, które z kolei zależą od przedziałów replikacyjnych w celu regulacji interakcji komórek gospodarza wirusa. Główną zaletą tej techniki jest to, że jest to prosta procedura oparta na gradiencie prędkości w celu ustanowienia systemu bezkomórkowego, który jest podatny na badanie mechanizmów, które pozwalają wirusom replikującym się jądrowo DNA przejąć kontrolę nad zainfekowaną komórką.

Aby wykonać ten test, najpierw przygotuj adenowirusa typu piątego lub piątkę D i ludzkie fibroblasty napletka lub HFF, jak opisano w dołączonym protokole tekstowym, aby rozpocząć infekcję od 10 do siódmego HFF w 100-milimetrowych szalkach do hodowli tkankowej przy użyciu jednego mililitra 85 i DMM na szalkę przy MOI wynoszącym 30 jednostek tworzących ognisko lub FFU na komórkę, inkubować komórki przez dwie godziny w wilgotnym inkubatorze do hodowli komórek w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla. Ostrożnie kołysząc szalkami co 15 minut, aby zapewnić równomierne rozprowadzenie inokulum wirusa w komórkach. Po inkubacji usuń pożywkę i dodaj świeży dmem.