Name: Oczyszczanie i wizualizacja kompleksów rybonukleoproteinowych wirusa grypy A (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-02-09T00:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 35 s
Description: Poznaj metodę oczyszczania i wizualizacji kompleksów rybonukleoproteinowych wirusa grypy A przy użyciu wirusów z rodzaju Influenza. Technika ta umożliwia badanie struktury wirusów metodą mikroskopii elektronowej.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Praca ta była wspierana z grantów przyznanych przez Canada Foundation for Innovation (CFI), Canadian Institute of Health Research (CIHR) oraz Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada (NSERC).

Część 1: Dezintegracja wirionu grypy A
<ol>
<li>Do jednej poliwęglanowej probówki wirówkowej Beckman (11 mm x 34 mm), przeznaczonej do rotora TLA-120.2 stosowanego w ultrawirówce Beckman Optima Max-E, należy dodać 750 µl buforu MNT (20 mM MES, 150 mM NaCl, 30 mM Tris, pH 7.5).</li>
<li>Do tej probówki należy dodać 500 µl wirusa grypy A (szczep H3N2 X-31 A/AICHI/68; 2 mg/ml). Wirus należy wymieszać z buforem MNT, kilkakrotnie pipetując roztwór w górę i w dół.</li>
<li>Próbkę należy wirować przez 10 minut przy 109,000 x g w temperaturze 4 °C w wirówce Beckman Optima Max-E z wykorzystaniem rotora TLA-120.2.</li>
<li>Należy usunąć nadsącz i resuspender osad w 500 µl buforu do lizy (100 mM KCl, 5 mM MgCl2, 5% (w/v) glicerolu, 50 mM oktyloglukozyd, 10 mg/ml lizolecytyny, 1.5 mM ditiotreitolu, 100 mM MES, pH 5.5).</li>
<li>Próbkę należy energicznie wymieszać w wortexie, a następnie inkubować przy 31 °C przez 20 minut w termomikserze Eppendorf.</li>
</ol>
Część 2: Centryfugacja w gradiencie glicerolu metodą sedymentacji prędkościowej
<ol>
<li>Przygotować gradient glicerolu, wprowadzając następujące ilości glicerolu do probówki do ultrawirówki Beckman ultraclear (13 mm x 51 mm): 1 ml 70% (v/v) glicerolu, 0,75 ml 50% glicerolu, 0,375 ml 40% glicerolu oraz 1,8 ml 33% glicerolu. Roztwory glicerolu przygotowuje się poprzez zmieszanie czystego glicerolu z buforem NM (150 mM NaCl, 50 mM MES, pH 5.5). Przygotować również probówkę równoważącą zawierającą zarówno glicerol, jak i bufor.</li>
<li>Ponownie wymieszać próbkę z rozbitymi wirusami za pomocą vortexa, a następnie nanieść ją na gradient glicerolu.</li>
<li>Wirować gradient przez 3,75 godziny przy 217,000 x g i 4 °C w rotorze z ruchomymi kątami Beckman MLS-50.</li>
<li>Po zakończeniu wirowania ręcznie zebrać frakcje gradientu o objętości 250 µl, zaczynając od góry probówki. Frakcje przechowywać na lodzie lub w temperaturze 4 °C.</li>
</ol>
Część 3: Analiza frakcji gradientu glicerolu za pomocą elektroforezy w żelu poliakryloamidowym SDS
<ol>
<li>Przenieś 20 µl z każdej frakcji do nowej probówki.</li>
<li>Dodaj 5 µl 5x buforu do próbek SDS-PAGE.</li>
<li>Podgrzej do 95 °C przez 5 minut.</li>
<li>Krótko odwiruj próbki, a następnie nanieś je na 10% żel poliakrylamidowy, umieszczając markery masy cząsteczkowej w jednej z dziurek.</li>
<li>Elektroforezuj próbki w żelu, aż barwnik ładunkowy błękit bromofenolowy dotrze niemal do dolnej krawędzi żelu.</li>
<li>Zabarw żel błękitem Coomassie.</li>
</ol>
Część 4: Koncentrowanie frakcji vRNP
<ol>
<li>Wybrać frakcje glicerolu zawierające głównie NP, połączyć je i rozdzielić do dwóch poliwęglanowych probówek do wirowania Beckman (11 mm x 34 mm).</li>
<li>Napełnić każdą probówkę wodą Ultrapure traktowaną diethylopirokarbonianem (DEPC), a następnie kilkukrotnie pipetować w górę i w dół w celu wymieszania.</li>
<li>Wirować przez 4,5 godziny przy 157 000 x g w temperaturze 4°C, używając rotora Beckman TLA-120.2.</li>
<li>Usunąć nadnadpłyn i resuspender osad w 50 µl wody traktowanej DEPC.</li>
<li>W razie potrzeby można zmierzyć A280 skoncentrowanych vRNP. Ponieważ NP jest głównym składnikiem obecnym w połączonych frakcjach, można obliczyć przybliżoną molarność NP, korzystając z jego współczynnika ekstynkcji wynoszącego 55 350 M-1 cm-1 (wyznaczonego za pomocą ProtParam3).</li>
<li>Podzielić oczyszczone vRNP na aliquoty i przechowywać je w zamrażarce w temperaturze -80 °C do późniejszego użycia.</li>
</ol>
Część 5: Barwienie negatywne vRNP
<ol>
<li>Rozcieńczyć 1 µl oczyszczonego vRNP w 9 µl świeżo przygotowanego i dwukrotnie filtrowanego buforu MNT (20 mM MES, 150 mM NaCl, 30 mM Tris, pH 7.5). Do rozcieńczania vRNP oraz przemywania siatki z preparatem (krok 5.5) można użyć innych buforów, jednak nie należy stosować PBS, jeśli do barwienia negatywowego używany jest octan uranylu.</li>
<li>Poddać działaniu wyładowań żarowych (glow-discharge) siatkę do preparatów (miedzianą TEM), uprzednio pokrytą warstwą parlodionu i filmu węglowego, przez 30 sekund.</li>
<li>Trzymając świeżo poddaną działaniu wyładowań siatkę z preparatem za pomocą pęsety, nanieść na nią kroplę 5 µl rozcieńczonego vRNP.</li>
<li>Pozostawić kroplę preparatu na siatce na 8 minut.</li>
<li>W czasie oczekiwania położyć na blacie niewielki pasek Parafilmu i nanieść na niego 2 krople po 10 µl każda buforu MNT (do przemywania siatki) oraz kroplę 80 µl świeżo przygotowanego roztworu barwiącego (1% molibdanu amonu lub 1% octanu uranylu).</li>
<li>Po 8 minutach adsorpcji odessać część roztworu próbki z siatki z preparatem za pomocą kawałka papieru filtracyjnego (wyciętego w trójkąty). Nie dopuścić do wyschnięcia siatki z preparatem.</li>
<li>Przemyć siatkę z preparatem w 2 kroplach po 10 µl każda buforu MNT przez łącznie 1 minutę. Należy to zrobić, ostrożnie opuszczając siatkę z preparatem do kropli, a następnie odessąwszy część roztworu próbki za pomocą kawałka papieru filtracyjnego (nie dopuszczając do wyschnięcia siatki z preparatem).</li>
<li>Natychmiast po odessaniu ostatniej kropli buforu z siatki z preparatem, całkowicie zanurzyć siatkę w kropli barwnika i odczekać 1 minutę.</li>
<li>Całkowicie odessać roztwór barwiący z siatki z preparatem za pomocą kawałka papieru filtracyjnego.</li>
<li>Pozostawić siatkę z preparatem do wyschnięcia na powietrzu przez kilka minut przed obserwacją pod transmisyjnym mikroskopem elektronowym.</li>
</ol>
Część 6: Reprezentatywne wyniki:
<img src="/files/ftp_upload/old/1105_2009_1_22_1/1105_Figure2.png" alt="Schemat elektroforezy w żelu SDS-PAGE; analiza prążków białkowych, oznaczenia ścieżek, markery masy cząsteczkowej." width="600" height="215" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 2">
Rycina 1
Ponieważ białko NP grypy A (~56 kDa) jest głównym białkiem występującym w wirusowych kompleksach rybonukleoproteinowych, prążek NP jest zazwyczaj najsilniejszym prążkiem w frakcjach zawierających vRNP (Rysunek 1). Oprócz NP każda vRNP grypy zawiera również kopię kompleksu trymerycznej polimerazy RNA (masy cząsteczkowe 82, 86 i 86,5 kDa). Mogą one być widoczne lub niewidoczne po barwieniu błękitem Coomassie, ponieważ ich zawartość jest niska w porównaniu z NP. Polimerazy można jednak wykryć, jeśli zamiast barwienia błękitem Coomassie przeprowadzi się barwienie żelu srebrem. Białko macierzy grypy M1 (~28 kDa) powinno występować w minimalnym stopniu w frakcjach, w których znajdują się frakcje szczytowe białka NP.
<img src="/files/ftp_upload/old/1105_2009_1_22_2/1105_3.png" alt="Mikroskopia elektronowa struktur biomolekularnych; skala nanometryczna, analiza strukturalna." width="600" height="360" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 3">
Rysunek 2
vRNP barwione negatywnie, wizualizowane za pomocą transmisyjnego mikroskopu elektronowego, powinny ukazywać vRNP przypominające cząstki w kształcie pręta o zmiennej długości, wynoszącej w przybliżeniu od 30 nm do 120 nm (Rysunek 2a). Oligomeryczne NP są zorganizowane w łańcuch cząsteczek NP, który jest dalej sfałdowany w strukturę podwójnej helisy, dlatego na obu końcach tych pręcikowatych cząstek można niekiedy dostrzec pętle (Rysunek 2b).

<ol><li>Kemler, I., Whittaker, G., Helenius, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nuclear+import+of+microinjected+influenza+virus+ribonucleoproteins%5BTitle%5D)+AND+%22Virology%22%5BJournal%5D)">Nuclear import of microinjected influenza virus ribonucleoproteins.</a> Virology. 202, 1028-1033 (1994).</li>
<li>Wu, W. W. H., Weaver, L. L., Panté, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultrastructural+analysis+of+the+nuclear+localization+sequences+on+influenza+a+ribonucleoprotein+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Ultrastructural analysis of the nuclear localization sequences on influenza a ribonucleoprotein complexes.</a> J Mol Biol. 374, 910-916 (2007).</li>
<li>Gasteiger, E. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aGasteiger%2C+E+%22The+Proteomics+Protocols+Handbook%22">The Proteomics Protocols Handbook</a>. Walker, J. M. , Humana Press. 571-607 (2005).</li>
<li>Wu, W. W. H., Sun, Y. H. B., Panté, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nuclear+import+of+influenza+A+viral+ribonucleoprotein+complexes+is+mediated+by+two+nuclear+localization+sequences+on+viral+nucleoprotein%5BTitle%5D)+AND+%22Virol+J%22%5BJournal%5D)">Nuclear import of influenza A viral ribonucleoprotein complexes is mediated by two nuclear localization sequences on viral nucleoprotein.</a> Virol J. 4, 49-49 (2007).</li>
<li>Babcock, H. P., Chen, C., Zhuang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+single-particle+tracking+to+study+nuclear+trafficking+of+viral+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Using single-particle tracking to study nuclear trafficking of viral genes.</a> Biophys J. 87, 2749-2758 (2004).</li>
</ol>

Oczyszczanie vRNP opiera się na procedurze opisanej przez Kemlera et al. (1994).1 My oraz inni autorzy wykorzystywali ten protokół do izolacji vRNP w celu badania ich importu do jądra komórkowego.2,4,5
Zaleca się stosowanie końcówek i probówek wolnych od RNaz podczas manipulowania vRNP, ponieważ genom wirusa składa się z RNA, co sprawia, że ulega on łatwej degradacji w obecności RNaz. Ponadto wszystkie bufory powinny być przygotowane w wodzie wolnej od RNaz. Opi...

<table><tbody><tr><td>grypa A H3N2 X-31 A/AICHI/68</td><td>Charles River Laboratories</td><td>490715</td><td></td></tr><tr><td>Tris</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T1503</td><td></td></tr><tr><td>MES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M-8250</td><td></td></tr><tr><td>Glicerol</td><td>Fisher Scientific</td><td>G33-1</td><td></td></tr><tr><td>Oktyloglukozyd</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>O-8001</td><td></td></tr><tr><td>Lizolecytyna</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L-4129</td><td></td></tr><tr><td>Ditiotreitol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D-9779</td><td></td></tr><tr><td>Coomassie brilliant blue G-250</td><td>Kodak</td><td>1367796</td><td></td></tr><tr><td>woda traktowana pirokarbonianem dwuetylowym (DEPC)</td><td>Invitrogen</td><td>750024</td><td></td></tr><tr><td>Octan uranylu</td><td>Ted Pella, Inc.</td><td>19481</td><td></td></tr><tr><td>Molibden amonu</td><td>Fisher Scientific</td><td>A-674</td><td></td></tr><tr><td>Ultracentryfuga Optima MAX-E</td><td>Beckman Coulter Inc.</td><td>434491</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw wirnika MLS-50, z koszykami wahadłowymi</td><td>Beckman Coulter Inc.</td><td>367280</td><td></td></tr><tr><td>TLA-120.2 Zespół rotora, stałego kąta, tytanowy</td><td>Beckman Coulter Inc.</td><td>362046</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf Thermomixer</td><td>Lauda Brinkmann</td><td>022670000</td><td></td></tr></tbody></table>

oczyszczanie i wizualizacja kompleksów rybonukleoprotein wirusa grypy a

Purification and Visualization of Influenza A Viral Ribonucleoprotein Complexes

Genom wirusa grypy A składa się z ośmiu jednoniciowych cząsteczek RNA o orientacji ujemnej, z których każda jest osobno upakowana z wieloma kopiami nukleoproteiny (NP) wirusa grypy A w cząsteczki wirusowych rybonukleoprotein (vRNP). Wirusowe vRNP znajdują się wewnątrz otoczki wirusa. Podczas wnikania do komórki kompleksy vRNP są jednak uwalniane do cytoplazmy, gdzie uzyskują dostęp do mechanizmów transportu jądrowego gospodarza. Aby badać import jądrowy vRNP grypy oraz replikację genomu wirusa grypy, przydatne jest stosowanie izolowanych vRNP, tak aby pozostałe komponenty wirusa nie zakłócały tych procesów. W niniejszej pracy opisujemy procedurę oczyszczania vRNP z wirusa grypy A. Procedura rozpoczyna się od rozbicia wirionu grypy A za pomocą detergentów w celu uwolnienia kompleksów vRNP z otoczkowego wirionu. Następnie vRNP są oddzielane od pozostałych składników wirionu grypy A w 33-70% nieciągłym gradiencie glicerolu metodą sedymentacji prędkościowej. Frakcje otrzymane z gradientu glicerolu są następnie analizowane za pomocą SDS-PAGE po barwieniu błękitem Coomassie. Frakcje szczytowe zawierające NP są łączone i zagęszczane poprzez wirowanie. Po zagęszczeniu integralność vRNP jest weryfikowana poprzez wizualizację vRNP za pomocą transmisyjnej mikroskopii elektronowej po barwieniu negatywowym. Oczyszczanie w gradiencie glicerolu jest modyfikacją metody opisanej przez Kemleraet al.(1994)1, a barwienie negatywne zostało wykonane przez Wuet al.(2007).2

Genom wirusa grypy typu A składa się z ośmiu oddzielnych kompleksów RNA i białek, zwanych wirusowymi kompleksami rybonukleoproteinowymi (vRNP). Niniejsza praca opisuje oczyszczanie vRNP wirusa grypy A w gradiencie glicerolu oraz ich wizualizację za pomocą transmisyjnej mikroskopii elektronowej.

Oczyszczanie i wizualizacja kompleksów rybonukleoprotein wirusa grypy A

Genom wirusa grypy A składa się z ośmiu cząsteczek jednoniciowego RNA o orientacji ujemnej, z których każda jest oddzielnie zapakowana z wieloma kopiami grypy A...

Procedura rozpoczyna się od usunięcia zanieczyszczeń z roztworu wirusa grypy poprzez wirowanie. Następnie błonę wirusową niszczy się za pomocą detergentu, a uwolnione vRNPs rozdziela się w gradiencie glicerolu.Frakcje odwirowane z gradientu są zbierane, a następnie analizowana jest alikwota każdej z nich. Żele w żelu SDS-PAGE barwi się błękitem Kumasi, aby wyznaczyć frakcje szczytowe zawierające V nps. Frakcje zawierające V NPS są następnie zagęszczane poprzez wirowanie, a oczyszczone VRP przenosi się na miedzianą siatkę do TEM, którą następnie barwi się negatywnie w celu wizualizacji VRP za pomocą transmisyjnej mikroskopii elektronowej. Cześć, nazywam się WinCo Wu i pracuję w laboratorium dr Nellie Pane w Katedrze Zoologii na Uniwersytecie Kolumbijskim w Brytyjskiej Kolumbii.Nazywam się Lindsay Weaver, wcześniej związana z laboratorium Pane. Dzisiaj zaprezentujemy procedurę oczyszczania kompleksów rybonukleoprotein wirusa grypy. Stosujemy tę procedurę w naszym laboratorium w celu badania importu jądrowego wirusa grypy typu A w komórkach hodowli tkankowych.Zacznijmy zatem. Aby rozpocząć eksperyment, należy wlać 750 µL buforu MNT do jednej probówki wirówkowej Beckman z poliwęglanu o

purification-visualization-influenza-viral-ribonucleoprotein

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Oczyszczanie i wizualizacja kompleksów ribonukleoprotein wirusowych grypy A

Metoda ta opisuje zastosowanie systemu obrazowania opartego na barwnikach w podczerwieni do wykrywania H1N1 w płyku z płukania oskrzelowo-pęcherzykowego (BAL) zakażonych myszy z wysoką czułością. Metodykę tę można przeprowadzić na płytce 96- lub 384-dołkowej, wymaga ona objętości materiału badawczego &lt;10 μl i umożliwia jednoczesny screening wielu patogenów.

Metoda wysokoprzepustowego wykrywania wirusa grypy

W niniejszym artykule przedstawiono prosty ilościowy test wychwytu powinowactwa w fazie ciekłej. Jest to niezawodna technika oparta na oddziaływaniu między kulkami magnetycznymi a białkami z markerem (np. nanociałami) z jednej strony oraz na powinowactwie między białkiem z markerem a drugim, znakowanym białkiem (np. poliovirus) z drugiej strony.

Analiza wychwytu powinowactwa w fazie ciekłej z użyciem kulek magnetycznych do badania oddziaływań białko-białko: przykład poliwirusa i nanoprzeciwciała

Wirusy grypy replikują swój genom RNA w powiązaniu z chromatyną komórki gospodarza. W niniejszej pracy przedstawiamy metodę oczyszczania nienaruszonych kompleksów wirusowych rybonukleoprotein z chromatyny zainfekowanych komórek. Oczyszczone kompleksy wirusowe można analizować zarówno za pomocą techniki Western blot, jak i metody przedłużania starterów w celu oceny zawartości białek i RNA.

Oczyszczanie powinowactwem kompleksów rybonukleoprotein wirusa grypy z chromatyny zakażonych komórek

Ten protokół koimmunoprecypitacji pozwala badać interakcję między nukleoproteiną wirusa grypy A a przeciwwirusowym białkiem Mx1 w komórkach ludzkich. W protokole podkreślono znaczenie N-etylomaleimidu dla skutecznego koimmunoprecypitacji nukleoproteiny Mx1 i wirusa grypy A.

Koimmunoprecypitacja mysiego białka Mx1 z nukleoproteiną wirusa grypy A

Oferujemy nowatorską strategię izolowania przedziałów replikacyjnych wirusa (RC) od komórek ludzkich zakażonych adenowirusem (Ad). Podejście to reprezentuje system bezkomórkowy, który może pomóc w wyjaśnieniu mechanizmów molekularnych regulujących replikację i ekspresję genomu wirusa, a także regulację interakcji wirus-gospodarz ustalonych w RC.

Izolacja frakcji subjądrowych wzbogaconych w przedziały replikacji wirusa z normalnych komórek ludzkich zakażonych adenowirusem

Demontaż rdzeni wirusa grypy A podczas wnikania wirusa do komórek gospodarza jest procesem wieloetapowym. Opisujemy metodę in vitro do analizy wczesnych etapów odsłaniania się wirusa. W tym podejściu wirowanie w gradionym tempie służy do biochemicznej analizy etapów, które inicjują odwarstwianie w określonych warunkach.

In vitro Demontaż kapsydów wirusa grypy A przez wirowanie gradientowe

Tutaj prezentujemy protokół syntezy cząsteczek wirusopodobnych za pomocą systemów ekspresji bakulowirusa lub ssaków oraz oczyszczania przez ultrawirowanie. To wysoce konfigurowalne podejście służy do identyfikacji antygenów wirusowych jako celów szczepionek w bezpieczny i elastyczny sposób.

Ekspresja i oczyszczanie cząstek wirusopodobnych do szczepienia

To badanie opisuje test mikroneutralizacji oparty na obrazowaniu, aby przeanalizować relacje antygenowe między wirusami. Protokół wykorzystuje skaner płaski i składa się z czterech etapów, w tym miareczkowania, miareczkowania, neutralizacji i kwantyfikacji neutralizacji. Test działa dobrze z obecnymi krążącymi wirusami grypy A(H1N1)pdm09, A(H3N2) i B.

Optymalizacja ilościowego testu mikroneutralizacji

Pokazano metodę opartą na żywicy anionowymiennej, dostosowaną do pobierania próbek wirusów z bioaerozolu na bazie płynnych uderzeń. W połączeniu z detekcją molekularną, metoda ta pozwala na łatwe i czułe wykrywanie wirusów w bioaerozolach.

Wykrywanie wirusów w bioaerozolach za pomocą żywicy anionowymiennej

Prezentowany tutaj jest protokół dla metody obrazowania fluorescencyjnego, multiplex immunofluorescencyjna metodawykrywania DNA, RNA i proteiny (MICDDRP), metoda zdolna do jednoczesnej fluorescencyjnej wizualizacji pojedynczych komórek białka wirusowego i kwasów nukleinowych o różnym typie i nici. Takie podejście można zastosować do różnych systemów.

Obrazowanie fluorescencyjne z multipleksem pojedynczych komórek w celu wizualizacji wirusowych kwasów nukleinowych i białek oraz monitorowania zakażeń HIV, HTLV, HBV, HCV, Zika i grypy

W artykule przedstawiono protokół przetwarzania danych wirusów grypy obrazowanych za pomocą tomografii krioelektronowej oraz późniejszego uśredniania glikoproteiny hemaglutyniny subtomogramem. Protokół ten obejmuje proces krok po kroku, od wstępnego przetwarzania obrazu po ostateczne udoskonalanie modelu.

Określanie struktury hemaglutininy w rozdzielczości subnanometrowej na podstawie tomografii krioelektronowej wirusów grypy

Poznaj metodę oczyszczania i wizualizacji kompleksów rybonukleoproteinowych wirusa grypy A przy użyciu wirusów z rodzaju Influenza. Technika ta umożliwia badanie struktury wirusów metodą mikroskopii elektronowej.

Oczyszczanie i wizualizacja kompleksów rybonukleoprotein wirusa grypy A

Przeglądaj więcej filmów