Oczyszczanie i wizualizacja kompleksów rybonukleoproteinowych wirusa grypy A

Ta procedura rozpoczyna się od usunięcia wszelkich zanieczyszczeń z grypy. Roztwór wirusa przez wirowanie. Błona wirusowa jest następnie przerywana detergentem, a uwalnianie do NPS VR jest rozdzielane na gradiencie glicerolu.

Frakcje wirowania z gradientu są zbierane i uruchamiana jest podwielokrotność każdej frakcji. Na stronie SDS żele barwione błękitem kumasi w celu określenia frakcji pików zawierających frakcje V nps zawierające V NPS są następnie zagęszczane przez wirowanie, a oczyszczone VRP są nakładane na miedzianą siatkę próbek TEM, która jest następnie barwiona ujemnie w celu wizualizacji VRP za pomocą transmisyjnej mikroskopii elektronowej. Cześć, jestem WinCo Wu i pracuję w laboratorium dr Nellie Pane na Wydziale Zoologii Uniwersytetu Kolumbii Brytyjskiej.

Nazywam się Lindsay Weaver i pracuję w Pane Lab. Dzisiaj pokażemy Państwu procedurę oczyszczania z grypy, wirusowych kompleksów białkowych jądra żeber. Stosujemy tę procedurę w naszym laboratorium do badania importu jądrowego wirusa grypy, wirusa A w komórkach hodowli tkankowej.

Więc zacznijmy. Aby rozpocząć eksperyment od 750 mikrolitrów buforu MNT w jednej probówce wirówkowej z poliwęglanu Beckman o wymiarach 11 na 34 milimetry. Następnie dodaj 500 mikrolitrów dwumiligramowego na mililitr roztworu wirusa grypy, A do probówki pipety w górę iw dół kilka razy, aby wymieszać wirusa z buforem MNT.

Po wymieszaniu umieścić probówkę w wirniku A TLA one 20,2 i odwirować w wirówce Beckman Optima max E na 10 minut w temperaturze 109 000 razy G w czterech stopniach Celsjusza. Po zakończeniu wirowania usuń supernatant, a następnie zreusuj, zawieś granulkę w wirze buforowym o pojemności 500 mikrolitrów. Zawieszone granulki energicznie wytrząsać, a następnie wstrząsać w temperaturze 31 stopni Celsjusza przez 20 minut w termomikserze einor.

Po zakończeniu wstrząsania przystąp do wirowania z prędkością osadu gradientu glicerolu. Aby przygotować gradient glicerolu, umieść następujące ilości glicerolu w probówce wirówkowej Beckman UltraClear o wymiarach 13 milimetrów na 51 milimetrów, jeden mililitr 70% objętości GLICEROL 0,75 mililitra 50% glicerolu 0,375 mililitra, 40% glicerolu i 1,8 mililitra, 33% glicerolu. Te roztwory glicerolu są wytwarzane przez zmieszanie czystego glicerolu z buforem NM.

Przygotuj również probówkę balansową zawierającą zarówno glicerol, jak i bufor. Następnie ponownie zwiruj przerwaną próbkę wirusa i załaduj ją na gradient glicerolu. Umieść probówkę w wahadłowym wirniku kubełkowym Beckman MLS 50 i odwiruj gradient przez trzy godziny i 45 minut przy 217 000 razy G w czterech stopniach Celsjusza.

Po zakończeniu wirowania ręcznie zbierz 250 mikrolitrów podwielokrotności gradientu, zaczynając od góry probówki. Utrzymuj frakcje na lodzie lub w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Po zebraniu frakcji jesteśmy gotowi do ich analizy za pomocą elektroforezy w żelu poliakrylamidowym SDS.

Aby rozpocząć analizę strony SDS, usuń 20 mikrolitrów z każdej frakcji do świeżej probówki. Następnie dodaj pięć mikrolitrów pięciokrotnego bufora próbki strony SDS i podgrzej próbkę do 95 stopni Celsjusza przez pięć minut Po podgrzaniu krótko odwiruj próbki i załaduj je do 10% żelu poliakrylamidowego z markerami masy cząsteczkowej w jednym z dołków. Następnie przepuść próbki przez żel, aż barwnik ładujący błękit brom fenolowy dotrze blisko dna żelu.

Usuń żel z aparatu na stronie SDS i zabarwij żel niebieskim kumasi. Na podstawie wyników barwienia zidentyfikuj frakcje, które zawierają głównie grypę. Białko nukleowy.

NP grypy A ma wielkość około 56 kilodaltonów i jest głównym białkiem występującym w kompleksach rybonukleoprotein wirusa. Tak więc pasmo NP jest na ogół najsilniejszym pasmem we frakcjach zawierających ps VRN. W następnej części skoncentrujemy te frakcje VRNP.

Połącz frakcje glicerolu zawierające głównie NP i rozprowadź je w dwóch probówkach wirówkowych z poliwęglanu Beckman o wymiarach 11 milimetrów na 34 milimetry, napełnij każdą probówkę węglanem etylu lub ultraczystą wodą oczyszczoną DEPC. Następnie kilkakrotnie pipetuj w górę i w dół, aby wymieszać. Umieść probówki w wirniku Beckman TLA one 20,2 i wiruj przez cztery i pół godziny w temperaturze 157 000 razy G w czterech stopniach Celsjusza.

Po zakończeniu wirowania usuń supernatant i ponownie zawieś osad. W 50 mikrolitrach podwielokrotności wody uzdatnionej DEPC, oczyszczony V NPS odłożył jedną porcję i przechowywał pozostałe w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza. Teraz jesteśmy gotowi do przystąpienia do negatywnego barwienia VRP.

Rozcieńczyć jeden mikrolitr oczyszczonego VRNP w dziewięciu mikrolitrach świeżo przygotowanego i dwukrotnie przefiltrowanego buforu buforowego PBS, rozładować miedzianą siatkę próbki TEM przez 30 sekund. Siatka ta była wcześniej pokryta folią Parlow Dion i folią węglową. Używając pęsety do przytrzymania świeżo rozżarzonej siatki próbki wyładowczej, nałóż pięciomikrolitrową kroplę rozcieńczonego VRNP na siatkę próbki.

Poczekaj, aż kropla wchłonie się na siatkę przez osiem minut, czekając. Umieść mały pasek perfum na tacy, a następnie nałóż na perfumy dwie krople zawierające 10 mikrolitrów buforu PBS każda, a także 80 mikrolitrów kropli świeżo przygotowanego roztworu barwiącego, który składa się z 1% daktylu amonowego. Teraz umyj siatkę próbki, ostrożnie zanurzając ją w dwóch kroplach PBS na łączny czas jednej minuty.

Następnie użyj kawałka bibuły filtracyjnej, aby odsączyć część roztworu próbki z siatki próbki, nie dopuszczając do wyschnięcia siatki próbki. Natychmiast po odsączeniu ostatniej kropli buforu z siatki próbki, całkowicie zanurz siatkę próbki w kropli plamy. I zaraz, zaraz.

Po jednej minucie użyj nowego kawałka bibuły filtracyjnej, aby całkowicie odsączyć roztwór plamy z siatki próbki. Pozostaw siatkę próbki do wyschnięcia na powietrzu przez kilka minut przed obserwacją. Pod transmisyjnym mikroskopem elektronowym znajdują się reprezentatywne obrazy transmisyjnej mikroskopii elektronowej ujemnie wybarwionych V nps.

Jak widać tutaj, V NPS przypominają cząstki w kształcie pręta o zmiennej długości, które mają długość od około 30 do 120 nanometrów. Oligomeryczny NP jest zorganizowany jako łańcuch cząsteczek NP, który jest dalej fałdowany w strukturę powtórzeń podwójnej helisy. Tak więc czasami można zobaczyć pętle na obu końcach tych cząstek w kształcie pręta.

Właśnie pokazaliśmy, jak oczyścić i uwidocznić grypę. Wirusowe kompleksy nukleoproteinowe żeber Podczas wykonywania tej procedury. Ważne jest, aby nie używać PBS podczas rozcieńczania VR mps, jeśli używasz octanu do mocuaru do barwienia negatywnego.

Więc to wszystko. Dziękujemy za oglądanie i życzymy powodzenia w eksperymentach.