Izolacja wektorów wirusowych związanych z adenowirusem za pomocą jednoetapowego i częściowo zautomatyzowanego protokołu chromatografii powinowactwa do heparyny

Ten manuskrypt opisuje szczegółowy protokół generowania i oczyszczania wektorów wirusowych związanych z adenowirusem przy użyciu zoptymalizowanej metody chromatografii powinowactwa opartej na heparynie. Przedstawia proste, skalowalne i ekonomiczne podejście, eliminując potrzebę ultrawirowania. Otrzymane wektory wykazują wysoką czystość i aktywność biologiczną, co dowodzi ich wartości w badaniach przedklinicznych.

W tej pracy zamierzamy opracować ulepszony protokół produkcji, oczyszczania i charakterystyki mozaikowych wektorów wirusowych związanych z adenowirusem, które mogłyby udowodnić swoją wartość w badaniach przedklinicznych. Pomimo wysiłków zmierzających do ustanowienia stabilnych linii komórkowych producentów, transfekcja przejściowa w komórkach ssaków jest nadal dominującym przepływem pracy w produkcji AV. Następnie AV są oczyszczane przez ultraszybkie wirowanie gradientowe o dużej gęstości lub za pomocą technik chromatograficznych, które opierają się na właściwościach biochemicznych cząstek wirusa.

Powszechnie stosowane metody oczyszczania AV wykorzystują ultrawirowanie w gradicycie gęstości chlorku cezu lub jodiksanolu. Pomimo swoich zalet mają pewne ograniczenia. Są czasochłonne, mają ograniczoną skalowalność i często dają wyniki niektórym wektorom o niskiej czystości.

Teraz, aby przezwyciężyć te ograniczenia, kilku badaczy zwróciło uwagę na techniki chromatograficzne. Opisujemy krok po kroku protokół generowania mozaikowych rAAV w oparciu o zdolność wiązania heparyny przez AAV2. Metoda ta sprawia, że rAAV są wysoce czyste i biologicznie aktywne, gotowe do użycia w ciągu sześciu dni, prezentując się jako półautomatyczna, skalowalna i opłacalna strategia generowania rAAV do badań przedklinicznych.

Po wykazaniu możliwości zastosowania tej metody do generowania mozaikowych rAAV, system produkcyjny może być teraz precyzyjnie dostrojony w celu osiągnięcia lepszej skalowalności i efektywności kosztowej poprzez ustanowienie produkcyjnej linii komórkowej. Dodatkowo naszym celem jest usunięcie pustych cząstek poprzez włączenie drugiego etapu oczyszczania polerowania. Na początek płytka z komórkami HEK 293T, dodając 22 mililitry uzupełnionej pożywki hodowlanej w 10 poddanych działaniu pożywki hodowlanej o średnicy 15 centymetrów.

Inkubuj płytki przez 24 godziny, aby osiągnąć zbieżność od 70% do 80%. Do transfekcji komórek należy przygotować mieszaninę, łącząc odczynniki w probówce do mikrowirówek i wymieszać, stukając. Dodaj mieszaninę transfekcji do 4,56 mililitra nieuzupełnionego DMEM w 50-mililitrowej probówce wirówkowej i wymieszaj, stukając.

Następnie dodaj 1,37 mililitra sterylnego roztworu aminy polietylenowej, kropla po kropli. Mieszać przez stukanie i inkubować w temperaturze pokojowej przez 10 minut, aby utworzyć kompleksy DNA-polietylenoaminy. Dodaj tę mieszaninę do 231 mililitrów wstępnie podgrzanego, uzupełnionego DMEM.

Zastąp pożywkę hodowlaną w każdym naczyniu hodowlanym 22 mililitrami tej mieszaniny transfekcyjnej i inkubuj komórki przez 48 godzin. Jeśli PITR koduje reporter fluorescencyjny, należy obserwować transfekowane komórki pod mikroskopem fluorescencyjnym. Następnie zebrać pożywkę z każdej szalki, odwirować przy 800 G przez 10 minut i usunąć supernatant.

Następnie dodaj 10 mililitrów wstępnie podgrzanego PBS do płytki i użyj skrobaka do komórek, aby usunąć komórki. Zebrać zawiesinę komórkową do probówek wirówkowych zawierających osad komórkowy. Upewnij się, że wszystkie komórki zostały zebrane, myjąc pięć naczyń na raz 10 mililitrami PBS.

Ponownie odwirować, aby osadzać komórki. W przypadku ekstrakcji rAAV rozmrozić transfekowane granulki komórek i ponownie zawiesić w 100 mililitrach sterylnego buforu i pipety, aby zapewnić jednorodną zawiesinę. Następnie dodaj 12,5 mililitra świeżo przygotowanego, sterylnego 10% roztworu deoksycholanu sodu, aby wywołać lizę komórek i wymieszaj przez pipetowanie.

Dodaj 27 mikrolitrów nukleazy benzonazy i dokładnie wymieszaj, aż mieszanina przestanie być lepka. Inkubować w temperaturze 37 stopni Celsjusza, wirując co 10 minut przez godzinę. Wirować przy 3000 G przez 60 minut w temperaturze 25 stopni Celsjusza.

Przefiltrować supernatant za pomocą 0,45-mikronowego filtra strzykawkowego PVDF do nowego sterylnego pojemnika. Aby rozpocząć, przygotuj system FPLC do oczyszczania. Dokładnie przepłucz ścieżkę przepływu cieczy sterylną, ultra czystą wodą, korzystając z instrukcji ręcznych lub niestandardowej metody.

Podłącz jednomililitrową, wstępnie zapakowaną kolumnę heparyny. Dostosuj alarm ciśnienia. I umyć pięcioma objętościami kolumny ultraczystej wody o natężeniu przepływu jednego mililitra na minutę.

Następnie zamień roztwory pomp systemowych, aby przygotować się do aplikacji próbki. Umyć pompę systemową B buforem B i napełnić pozostałą część ścieżki przepływu cieczy buforem A. Włożyć rurkę do próbki pompy do próbki do preparatu wirusowego. Alternatywnie użyj super pętli dla próbki.

Włóż rurkę wylotową do nowego pojemnika. Wykonując oczyszczanie po raz pierwszy, zdefiniuj niestandardową metodę automatycznego oczyszczania. Po włączeniu ogólnych ustawień oczyszczania, metoda zaleczy ścieżkę przepływu od wlotu próbki S1 do zaworu iniekcyjnego roztworem próbki.

Następnie zrównoważyć kolumnę z łącznie pięcioma objętościami kolumny, używając 12,5% buforu B w tempie jednego mililitra na minutę. Nanieść próbkę na kolumnę z prędkością 0,5 mililitra na minutę i zebrać przepływ przez otwór wylotowy. Przemyć kolumnę 20 objętościami buforu A w ilości jednego mililitra na minutę.

Następnie eluuj próbkę z prędkością jednego mililitra na minutę za pomocą tego schematu. Wybrać, aby zebrać eluowaną próbkę we frakcjach jednomililitrowych za pomocą kolektora frakcji. Następnie ponownie wyrównaj kolumnę z prędkością jednego mililitra na minutę z 12,5% buforu B dla pięciu objętości kolumny.

Otwórz utworzoną metodę i poczekaj na etap elucji. Zbierz ułamki za pomocą kolektora ułamków. Zbierz również porcję przepływu i przechowuj frakcje w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza.

Ocenić automatycznie zapisany chromatogram wszystkich etapów oczyszczania, w tym profilu elucji. Po zakończeniu przełączyć wloty z roztworów buforowych na wodę ultraczystą i umyć kolumnę z prędkością jednego mililitra na minutę dla pięciu objętości kolumny. Przywracając kolumnę, przełącz wloty z wody ultraczystej na 20% etanol i umyj kolumnę przez pięć objętości kolumny.

Aby skoncentrować rAAV, załaduj pożądane frakcje FPLC do 15-mililitrowej odśrodkowej jednostki filtrującej z odcięciem masy cząsteczkowej 100 kilodaltonów. Wirować przy 2000 G przez dwie minuty w temperaturze pokojowej, aby osiągnąć skoncentrowaną objętość około 500 mikrolitrów. Kontynuuj wymianę buforu, dodając jeden mililitr sterylnego PBS do filtra odśrodkowego.

Umyć filtr przez pipetowanie i odwirowywać w jednominutowych odstępach, aż do osiągnięcia objętości 500 mikrolitrów. Dalsze zagęszczanie rAAV poprzez przeniesienie tej próbki o pojemności 500 mikrolitrów do 0,5-mililitrowej jednostki filtra odśrodkowego z odcięciem 100 kilodaltonów i odwirowywanie przy 6000 G w odstępach jednominutowych, aż objętość spadnie poniżej 100 mikrolitrów. Odzyskaj skoncentrowany rAAV poprzez odwrócenie urządzenia filtrującego do nowej probówki mikrowirówki i odwirowanie w celu przeniesienia rAAV do probówki.

Porcjować rAAV do probówek mikrowirówek o niskiej retencji i przechowywać w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza. Czystość preparatów rAAV analizowano za pomocą SDS-PAGE, ujawniając wyraźne prążki białkowe kapsydu. Wizualizacja cząstek wirusa za pomocą TEM pokazała puste cząstki z centrum o dużej gęstości elektronów i pełnymi cząstkami.

Ocena właściwości zanieczyszczeń fizycznych rAAV przy użyciu platformy Stunner ujawniła nienaruszone cząstki kapsydu o wielkości około 30 nanometrów, całkowite miano kapsydu, wolne i zagregowane białko oraz jednoniciowe DNA. Testy zakaźności w komórkach neuro 2A wykazały wysoki poziom zakaźności. Pierwotne hodowle neuronów zakażone preparatami wirusowymi wykazały zachowane właściwości transferu genów.

Transdukcja in vivo móżdżku myszy wektorami rAAV spowodowała przedłużoną ekspresję GFP, co wskazuje na udaną ekspresję transgenu w mózgu ssaków.