Name: Izolacja wektorów wirusowych związanych z adenowirusem za pomocą jednoetapowego i częściowo zautomatyzowanego protokołu chromatografii powinowactwa do heparyny (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-04-05T14:20:00.000+00:00
Duration: 9 min 12 s
Description: Naucz się izolować wektory adeno-związane z wirusami za pomocą chromatografii powinowactwa do heparyny. Ta metoda zapewnia wysoką czystość i aktywność biologiczną wektorów w zaledwie sześć dni.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Jesteśmy wdzięczni za współpracę, spostrzeżenia i pomoc techniczną udzieloną przez dr Mónicę Zuzarte, z Instytutu Badań Klinicznych i Biomedycznych w Coimbrze (iCBR) oraz Centrum Innowacyjnej Biomedycyny i Biotechnologii (CIBB), w odniesieniu do analizy TEM rAAV. Wyrażamy nasze uznanie dla dr Dominique Fernandes z Centrum Neuronauki i Biologii Komórki Uniwersytetu w Coimbrze (CNC-UC) oraz Instytutu Badań Interdyscyplinarnych Uniwersytetu w Coimbrze (IIIUC), za jej nieocenioną pomoc techniczną i spostrzeżenia dotyczące eksperymentów z pierwotnymi kulturami neuronalnymi. Plazmidy pRV1, pH21 i pFdelta6, niezbędne do tego badania, zostały hojnie dostarczone przez dr Christinę McClure ze Szkoły Nauk Medycznych, Kolegium Nauk Przyrodniczych i Medycyny Uniwersytetu w Aberdeen, za co jesteśmy wdzięczni. Prace te zostały sfinansowane ze środków Europejskiego Funduszu Rozwoju Regionalnego (EFRR) w ramach Regionalnego Programu Operacyjnego Centro 2020; za pośrednictwem COMPETE 2020 - Programu Operacyjnego na rzecz Konkurencyjności i Internacjonalizacji oraz portugalskich funduszy krajowych za pośrednictwem FCT - Fundação para a Ciência e a Tecnologia, w ramach projektów: UIDB/04539/2020, UIDP/04539/2020, LA/P/0058/2020, ViraVector (CENTRO-01-0145-FEDER-022095), Imagene (PTDC/BBB-NAN/0932/2014 | POCI-01-0145-FEDER-016807), ReSet - IDT-COP (CENTRO-01-0247-FEDER-070162), Fighting Sars-CoV-2 (CENTRO-01-01D2-FEDER-000002), BDforMJD (CENTRO-01-0145-FEDER-181240), ModelPolyQ2.0 (CENTRO-01-0145-FEDER-181258), MJDEDIT (CENTRO-01-0145-FEDER-181266); przez Amerykańsko-Portugalski Fundusz Badań Biomedycznych (APBRF) oraz Fundusz Badań nad Chorobami Richarda Chin i Lily Lock Machado-Joseph, ARDAT na podstawie umowy o udzielenie dotacji nr 945473 Wspólnego Przedsięwzięcia IMI2 wspieranej przez UE i EFPIA; Projekt GeneT-Teaming 101059981 wspierany przez program Unii Europejskiej Horyzont Europa. M.M.L. był wspierany przez 2021.05776.BD; C.H. był wspierany przez 2021.06939.BD; A.C.S. był wspierany przez 2020.07721.BD; a D.D.L. był obsługiwany przez 2020.09668.BD. Rysunek 1 został utworzony przy użyciu BioRender.com.

Purification of AAV Vectors by Single-Step Heparin Affinity Chromatography

Autorzy deklarują brak konfliktu interesów.

Szybko rozwijający się zestaw narzędzi wektorowych AAV stał się jednym z najbardziej obiecujących systemów dostarczania genów dla szerokiego zakresu typów komórek różnymi drogami podawania. W niniejszej pracy naszym celem było opracowanie ulepszonego protokołu wytwarzania, oczyszczania i charakterystyki mozaikowych wektorów rAAV, które mogłyby udowodnić swoją wartość w badaniach przedklinicznych. W tym celu opisano tutaj generowanie wektorów mozaiki rAAV1/2 i rAAV2/9, ale procedurę można również zastosować do oczyszczania standardowych wektorów rAAV2 (dane nie pokazane).
Mozaikowe rAAV wyprodukowano przy użyciu zoptymalizowanej metody transfekcji przy użyciu PEI jako odczynnika do transfekcji. Metoda transfekcji przejściowej została wybrana ze względu na jej większą elastyczność i szybkość, co stanowi znaczne zalety we wczesnych fazach badań przedklinicznych. Po walidacji konkretnego transgenu i serotypu system produkcji można dostroić w celu osiągnięcia lepszej skalowalności i opłacalności poprzez ustanowienie stabilnej transfekowanej linii komórkowej, która wyraża podzbiór specyficznych genów Rep/Cap , z dodatkowymi genami dostarczonymi w procesie infekcji24. W porównaniu z transfekcją wapniowo-fosforanową, PEI ma kilka zalet. Jest to stabilny i ekonomiczny odczynnik do transfekcji, który działa skutecznie w szerszym zakresie pH. Dodatkowo eliminuje konieczność wymiany pożywki komórkowej po transfekcji, co skutkuje znacznym zmniejszeniem zarówno kosztów, jak i nakładu pracy69.
Próbując obejść niektóre ograniczenia narzucone przez gradienty CsCl lub jodiksanolu, wytworzone rAAV zebrano i oczyszczono za pomocą chromatografii powinowactwa. Strategia ta oferuje uproszczone i skalowalne podejście, które można wykonać bez konieczności ultrawirowania i gradientów, uzyskując czyste i wysokie miano wirusa. Rzeczywiście, techniki chromatograficzne wykorzystujące system FPLC można zautomatyzować i zwiększyć poprzez upakowanie większej objętości żywicy w kolumnie o większej wysokości łoża. Opisany tutaj protokół można łatwo dostosować do włączenia kolumn HP HiTrap Heparin o pojemności 5 ml (dane nie pokazane). Dodatkowo, kolumny z heparyną mogą być wielokrotnie używane, co przyczynia się do opłacalności tej metody.
Oczyszczone rAAV scharakteryzowano następnie pod względem miana, czystości, cech morfologicznych i aktywności biologicznej. Co ciekawe, w barwieniu Coomassie na niebiesko wykryto prążek o około 17 kDa we frakcjach F8-F16 oprócz trzech typowych białek kapsydu wirusa. Jednak pasmo to nie jest już obecne po etapie koncentracji rAAV. Co więcej, niektóre słabe prążki o masie cząsteczkowej mniejszej niż VP3 (<62 kDa) można również wykryć po znakowaniu B1 i A69, co sugeruje, że mogą to być fragmenty białek kapsydu VP1, VP2 i VP370. Inną możliwością jest to, że są to w rzeczywistości inne białka kooczyszczające, takie jak ferrytyna lub inne białka komórkowe z polipeptydami, które mają podobne odciski palców białkowych z białkami kapsydu AAV i mogą być zaangażowane w biologię AAV, jak wcześniej sugerowano 26,71,72.
Analiza TEM i ogłuszacza ujawniła również obecność pustych cząstek na różnych poziomach w różnych produkcjach. Podobnie, inne wcześniejsze badania donosiły o wytwarzaniu zmiennych i wysokich poziomów (>65%) pustych kapsydów dla rAAV przygotowanych metodami transfekcji lub infekcji24,73. Mechanizm stojący za generowaniem rAAV rozpoczyna się od szybkiego tworzenia pustych kapsydów z nowo zsyntetyzowanych białek VP, po którym następuje powolny etap ograniczania szybkości pakowania genomu do wstępnie uformowanych kapsydów, w którym pośredniczą białka Rep74,75. Dlatego puste kapsydy są generowane w produkcji rAAV, chociaż proporcja pustych i pełnych kapsydów może się różnić w zależności od wielkości i sekwencji transgenu będącego przedmiotem zainteresowania oraz warunków hodowli komórkowej58,73. Puste kapsydy budzą pewne obawy, ponieważ ze względu na brak interesującego ich genomu nie są w stanie zapewnić efektu terapeutycznego, a także mogą potencjalnie zwiększać wrodzoną lub nabytą odpowiedź immunologiczną. Jednak niektóre doniesienia wykazały również, że poprzez dostosowanie ich stosunku, puste kapsydy AAV mogą służyć jako wysoce skuteczne wabiki dla przeciwciał neutralizujących specyficznych dla AAV, a tym samym zwiększać skuteczność transdukcji 60,76,77. Jeśli obecność pustych kapsydów jest krytycznie szkodliwa i biorąc pod uwagę nieco mniej anionowy charakter pustych cząstek w porównaniu z pełnymi wektorami, potencjalnym rozwiązaniem może być przeprowadzenie drugiego etapu oczyszczania polerowania przy użyciu technik chromatografii anionowymiennej64.
Badanie to dostarcza również przekonujących dowodów na to, że wygenerowane mozaikowe rAAV są w stanie skutecznie transdukować nie tylko hodowle neuronów in vitro , ale także OUN po wewnątrzczaszkowym wstrzyknięciu rAAV1/2. Ogólnie rzecz biorąc, wyniki te sugerują, że opisany protokół produkcji i oczyszczania sprawia, że wysoce czyste i biologicznie aktywne rAAV są gotowe do użycia w ciągu 6 dni, prezentując się jako wszechstronna i opłacalna metoda wytwarzania rAAV w badaniach przedklinicznych.

Wektor wirusa związanego z adenowirusem (AAV) podbija swoją drogę jako jeden z najbardziej obiecujących systemów dostarczania w obecnych badaniach nad terapią genową. Początkowo zidentyfikowany w 19651, AAV jest małym, bezotoczkowym wirusem, z dwudziestościennym kapsydem białkowym o średnicy około 25 nm, zawierającym jednoniciowy genom DNA. AAV należą do rodziny Parvoviridae i do rodzaju Dependoparvovirus ze względu na ich wyjątkową zależność od koinfekcji wirusem pomocniczym, takim jak wirus opryszczki pospolitej lub, częściej, adenowirus, w celu zakończenia cyklu litycznego2,3.
Genom 4,7 kilozasady AAV składa się z dwóch otwartych ramek odczytu (ORF) otoczonych dwoma odwróconymi powtórzeniami końcowymi (ITR), które tworzą charakterystyczne końcówki spinki do włosów w kształcie litery T4. ITR są jedynymi elementami działającymi na cis, które mają kluczowe znaczenie dla pakowania, replikacji i integracji AAV, dlatego są jedynymi sekwencjami AAV zachowanymi w rekombinowanych wektorach AAV (rAAV). W tym systemie geny niezbędne do produkcji wektora są dostarczane oddzielnie, w trans, co pozwala na upakowanie interesującego genu w kapsydzie wirusa5,6.
Każdy gen wirusa koduje różne białka za pomocą alternatywnych kodonów splicingu i startu. W Rep ORF kodowane są cztery białka niestrukturalne (Rep40, Rep52, Rep68 i Rep78), odgrywające kluczową rolę w replikacji, integracji specyficznej dla miejsca i enkapsydacji wirusowego DNA7,8. Cap ORF służy jako matryca do ekspresji trzech białek strukturalnych różniących się od siebie na ich N-końcu (VP1, VP2 i VP3), które łączą się, tworząc 60-merowy kapsyd wirusa w stosunku 1:1:104,9. Dodatkowo, alternatywny ORF zagnieżdżony w genie Cap z niekonwencjonalnym kodonem start CUG koduje białko aktywujące montaż (AAP). Wykazano, że to białko jądrowe oddziałuje z nowo zsyntetyzowanymi białkami kapsydu VP1-3 i sprzyja składaniu kapsydu10,11.
Różnice w sekwencji aminokwasów kapsydu odpowiadają za 11 naturalnie występujących serotypów AAV i ponad 100 wariantów wyizolowanych z tkanek naczelnych ludzi i innych niż ludzie7,12,13. Różnice w konformacji strukturalnie zmiennych regionów regulują odrębne właściwości antygenowe i specyficzność wiązania receptorów kapsydów z różnych szczepów. Skutkuje to wyraźnymi tropizmami tkanek i wydajnością transdukcji w różnych narządach ssaków14.
Wczesne metody produkcji rAAV opierały się na infekcji adenowirusowej w celach pomocniczych15,16,17,18,19. Pomimo tego, że jest wydajny i zwykle łatwy do wyprodukowania na dużą skalę, z tej infekcji wynika kilka problemów. Nawet po oczyszczeniu i etapie denaturacji termicznej w celu inaktywacji, cząsteczki adenowirusa mogą być nadal obecne w preparatach AAV, stanowiąc niepożądany problem bezpieczeństwa20. Ponadto obecność denaturowanych białek adenowirusowych jest niedopuszczalna do stosowania klinicznego. Inne strategie produkcji wykorzystują rekombinowane szczepy wirusa opryszczki pospolitej zaprojektowane w celu wprowadzenia Rep/Cap i transgenu do komórek docelowych21 lub systemu komórkowego bakulowirusa-owada22. Chociaż systemy te oferują korzyści pod względem skalowalności i kompatybilności z GMP, nadal napotykają podobne problemy.
Metoda potrójnej transfekcji do produkcji rAAV została powszechnie przyjęta, aby łatwo przezwyciężyć te problemy. Krótko mówiąc, montaż rAAV opiera się na przejściowej transfekcji komórek z trzema plazmidami kodującymi: 1) kasetę ekspresji transgenu upakowaną między ITR z genomu AAV2 typu dzikiego (pITR); 2) sekwencje Rep/Cap niezbędne do replikacji i składania wirionów (pAAV-RC); oraz 3) minimalne białka adenowirusowe (E1A, E1B, E4 i E2A) wraz z RNA związanymi z wirusem adenowirusa wymaganymi do efektu pomocniczego (pHelper)6,20,23. Podczas gdy metody transfekcji plazmidu zapewniają prostotę i elastyczność produkcji rAAV w badaniach przedklinicznych, procedury te mają ograniczenia pod względem skalowalności i odtwarzalności w przypadku stosowania do produkcji na dużą skalę. Alternatywnym podejściem jest produkcja rAAV może być osiągnięta poprzez wykorzystanie linii komórkowych producentów AAV (zarówno wzrostu adherentnego, jak i zawiesinowego), stabilnie eksprymujących geny AAV Rep / Cap lub Rep / Cap w połączeniu z konstruktami wektorowymi. W tych systemach geny pomocnicze adenowirusa są wprowadzane poprzez transfekcję plazmidu. Mimo że strategia ta poprawia skalowalność procesu hodowli komórkowej, jest technicznie złożona i czasochłonna21,24,25.
W obu przypadkach komórki producenta są następnie poddawane lizie i poddawane jednemu lub wielu etapom oczyszczania. Obecnie główne metody oczyszczania rAAV obejmują stosowanie chlorku cezu (CsCl) lub ultraszybkiego wirowania w gradicynacji o bardzo wysokiej gęstości jodoksanolu, po którym następują lub nie techniki chromatograficzne26. Pierwotny schemat oczyszczania do wytrącania wirusów wykorzystywał siarczan amonu, po którym następowały dwie lub trzy rundy ultrawirowania przez gradient CsCl. Do głównych zalet tego procesu należy możliwość oczyszczenia wszystkich serotypów oraz możliwość fizycznego oddzielenia pełnych cząstek od pustych kapsydów na podstawie ich różnej gęstości. Ta metoda jest jednak skomplikowana, czasochłonna i ma ograniczoną skalowalność, co często skutkuje niską wydajnością i niską jakością próbki27,28,29,30. Ponadto dializa z użyciem buforu fizjologicznego jest często konieczna przed badaniami in vivo ze względu na toksyczne działanie, jakie CsCl może wywierać na ssaki.
Jodixanol był również używany jako alternatywny izo-osmotyczny gradient do oczyszczania wektorów rAAV, z przewagą nad CsCl zarówno z punktu widzenia bezpieczeństwa, jak i siły wektora. Jednak, podobnie jak CsCl, metoda jodiksanolu ma pewne wady związane ze zdolnością ładowania lizatu do hodowli komórkowych (a tym samym skalowalnością oczyszczania rAAV) i pozostaje metodą czasochłonną i kosztowną30,31.
Aby przezwyciężyć te ograniczenia, badacze zwrócili uwagę na techniki chromatograficzne. W związku z tym opracowano kilka podejść do oczyszczania, które obejmują metody chromatografii powinowacej, hydrofobowej lub jonowymiennej. Metody te opierają się na właściwościach biochemicznych danego serotypu, w tym na ich naturalnych receptorach, lub charakterystyce ładunku cząsteczki wirusa32. Na przykład odkrycie, że AAV2, AAV3, AAV6 i AAV13 preferencyjnie wiążą się z proteoglikanami siarczanu heparanu (HSPG), otworzyło możliwość wykorzystania blisko spokrewnionej heparyny w oczyszczaniu metodą chromatografii powinowactwa. Jednak miejsca wiązania z HSPG mogą się różnić w zależności od serotypów, pośrednicząc w przyczepianiu AAV i infekcji komórek docelowych na różne sposoby2,33,34,35,36. Z drugiej strony AAV1, AAV5 i AAV6 wiążą się z kwasem sjalowym (SA) sprzężonym z N, podczas gdy AAV4 używa SA2,14,34. Kierując się tym samym rozumowaniem, opracowano również jednoetapowy protokół chromatografii powinowactwa do oczyszczania rAAV5 w oparciu o zastosowanie mucyny, białka ssaków wysoce wzbogaconego w SA37. Podobnie jak w przypadku technik opartych na heparynie, oczyszczanie to jest również zależne od generowanego konkretnego serotypu. Oprócz heparyny i mucyny badano inne ligandy do chromatografii powinowactwa, takie jak przeciwciało monoklonalne A20 i przeciwciała jednodomenowe wielbłądowatych (AVB Sepharose i POROS CaptureSelect)22,23,38,39,40,41. Inne innowacyjne strategie mające na celu ulepszenie wcześniej istniejących metod oczyszczania polegają na wprowadzeniu niewielkich modyfikacji kapsydu rAAV w celu uzyskania specyficznych epitopów wiążących. Na przykład rAAV znakowane heksa-histydyną lub biotynylowane można oczyszczać za pomocą ligandów, które celują w te epitopy (odpowiednio kwas niklowo-nitrylotryoctowy i żywice awidynowe)42,43,44.
W celu poszerzenia pożądanych cech rAAV, badacze przeprowadzili krzyżowy dressing wirionów, mieszając ich kapsydy. Osiąga się to poprzez dostarczanie genu kapsydu z dwóch różnych serotypów AAV w równomolowych lub różnych proporcjach podczas produkcji, co daje początek strukturze kapsydu złożonej z mieszaniny podjednostek kapsydu z różnych serotypów34,45,46,47,48,49,50. Wcześniejsze badania dostarczają fizycznych dowodów na to, że jednoczesna ekspresja białek kapsydu z AAV2 z AAV1 (stosunek 1:1) i AAV2 z AAV9 (stosunek 1:1) powoduje generowanie mozaikowych wektorów rAAV1/2 i rAAV2/9, odpowiednio45,46,48. Główną korzyścią płynącą z generowania mozaikowych rAAV jest zdolność do integracji korzystnych cech z różnych serotypów AAV, co skutkuje synergiczną poprawą ekspresji transgenu i tropizmu, przy jednoczesnym zachowaniu innych właściwości przydatnych podczas produkcji rAAV. Co ciekawe, niektóre warianty mozaiki wykazują nawet nowe właściwości różniące się od wirusa rodzicielskiego46,47,49. Wykorzystując zdolność AAV2 do wiązania heparyny, mozaikowe wektory rAAV mogą być potencjalnie generowane i oczyszczane przez mieszanie AAV2 z innymi naturalnymi lub nowymi kapsydami AAV generowanymi przez ukierunkowaną ewolucję i / lub racjonalny projekt. Niemniej jednak wcześniejsze badania podkreśliły znaczenie kompatybilności podjednostek kapsydu podczas próby złożenia wektorów mozaikowych. Na przykład Rabinowitz i współpracownicy wykazali, że chociaż transkapsydacja AAV1, AAV2 i AAV3 doprowadziła do efektywnego współskładania kapsydów mozaiki, krzyżowanie tych serotypów z AAV4 utrudniało generowanie stabilnych wirionów34,45,47. Ponadto AAV1, AAV2 i AAV3 wykazywały niską kompatybilność z AAV5, biorąc pod uwagę zmniejszone miana wirusa uzyskane podczas mieszania tych kapsydów w różnych proporcjach. Co ciekawe, mozaika rAAV2/5 wykazywała zmniejszone właściwości wiązania heparyny, przy jednoczesnym zachowaniu zdolności wiązania mucyny, jak w przypadku rodzicielskiego AAV5. Jednak rAAV3/5 w stosunku 3:1 zachowywał podwójne wiązanie z heparyną i mucyną. Ogólnie rzecz biorąc, generowanie nowych mozaikowych rAAV o wzmocnionej transdukcji, specyficznym tropizmie lub niskiej immunogenności może znacznie skorzystać na naszym zrozumieniu składania kapsydu i interakcji receptorów, przy czym konkretne kombinacje nadal wymagają dokładnych badań i optymalizacji.
W obecnej pracy opisujemy krok po kroku protokół produkcji i oczyszczania rAAV przy użyciu zoptymalizowanej metody chromatografii powinowactwa heparyny. rAAV są wytwarzane przez transfekcję przejściową i są oczyszczane za pomocą systemu szybkiej chromatografii cieczowej białek (FPLC). Po zagęszczeniu wybranych oczyszczonych frakcji, otrzymane szczepy wirusów są charakteryzowane pod względem miana, czystości, swoistych właściwości fizycznych oraz aktywności biologicznej in vitro i in vivo. Jako dowód słuszności koncepcji demonstrujemy ulepszenia i możliwość zastosowania tego protokołu do generowania mozaikowych wektorów rAAV1/2 i rAAV2/9. Wybór każdego serotypu opierał się na ich uderzająco różnych tropizmach, co potencjalnie nadawało ich unikalne cechy również wersjom mozaikowym. Serotyp 1 AAV, z ogólnym umiarkowanym tropizmem dla ośrodkowego układu nerwowego (OUN), ma zdolność do transdukcji neuronów i gleju (w mniejszym stopniu) oraz przechodzi transport aksonalny w kierunku następczym i wstecznym in vivo2,7,8. Dodatkowo, serotyp 9 AAV został wybrany ze względu na jego naturalną zdolność do przekraczania bariery krew-mózg i celowania w OUN zarówno u noworodków, jak i dorosłych myszy51,52. Ostatecznie wybrano serotyp 2 AAV ze względu na jego zdolność do wiązania się z heparyną, co pozwala na chromatografię powinowactwa33. Oczyszczone cząstki rAAV1/2 i rAAV2/9 łączą w sobie właściwości obu rodzicielskich serotypów AAV i dlatego stanowią odpowiednie wektory do transdukcji CNS45,46,48,49.

<table><tbody><tr><td>10% powidon-jod</td><td>Medline</td><td>MDS093943</td><td></td></tr><tr><td>12-dołkowe płytki</td><td>Thermo Scientific</td><td>11889684</td><td></td></tr><tr><td>24-dołkowe VWR</td><td></td><td>734-2325</td><td></td></tr><tr><td>4',6-diamidino-2-fenyloindol (DAPI)</td><td>Invitrogen</td><td>D1306</td><td></td></tr><tr><td>96-dołkowa płytka ogłuszająca</td><td>Unchained Labs</td><td>701-2025</td><td>96-dołkowa płytka do dalszej absorpcji światła widzialnego w ultrafiolecie, statycznego rozpraszania światła i dynamicznej analizy rozpraszania światła próbek rAAV</td></tr><tr><td>Zestaw do miareczkowania AAVpro (do PCR w czasie rzeczywistym) Ver.2</td><td>Takara</td><td>6233</td><td>Do oznaczania miana AAV za pomocą RT-qPCR. Ten zestaw zawiera DNazę I, bufor do lizy, bufor rozcieńczający, kontrolę pozytywną, mieszaninę Taq II, starter do przodu, odwrócony starter, wodę</td></tr><tr><td>Glacier Fisher</td><td>Chemical</td><td>A/0360/PB17</td><td></td></tr><tr><td>&Auml; System KTA pure 25</td><td>Cytiva</td><td>29018224</td><td>FPLC sterowany przez oprogramowanie UNICORN, wersja 6.3&nbsp;</td></tr><tr><td>Przeciw mysim kozom połączonym z fosfatazą alkaliczną</td><td>Invitrogen</td><td>31328</td><td></td></tr><tr><td>Filtr odśrodkowy Amicon ultra-0,5 Filtr odśrodkowy</td><td>Merck Millipore</td><td>UFC5100</td><td></td></tr><tr><td>Filtr odśrodkowy Amicon ultra-15</td><td>Merck Millipore</td><td>UFC9100</td><td></td></tr><tr><td>Nukleaza benzonazy</td><td>Merck Millipore</td><td>E1014</td><td></td></tr><tr><td>Błękit bromofenolowy</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B0126</td><td></td></tr><tr><td>System wykrywania PCR w czasie rzeczywistym CFX96</td><td>Biorad</td><td>184-5096</td><td></td></tr><tr><td>System obrazowania dotykowego ChemiDoc</td><td>Bio-Rad Laboratories</td><td>1708370</td><td></td></tr><tr><td>Kurczak poliklonalne przeciwciało pierwszorzędowe anty-GFP</td><td>Abcam</td><td>ab13970</td><td></td></tr><tr><td>Coomassie Blue G250</td><td>Fisher Chemical</td><td>C/P541/46</td><td></td></tr><tr><td>Ditiothreitol (DTT)</td><td>Odczynniki</td> <td>Fisher</td><td></td>BP17225</tr><tr><td>DMEM</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D5796</td><td></td></tr><tr><td>ECF Podłoże do Western Blotting</td><td>Cytiva</td><td>RPN5785</td><td></td></tr><tr><td>FastDigest SmaI</td><td>Thermo Scientific</td><td>FD0663</td><td></td></tr><tr><td>FEI-Tecnai G2 Spirit Biotwin</td><td>FEI</td><td></td><td>Biotwin Transmisyjny mikroskop elektronowy</td></tr><tr><td>Płodowa surowica bydlęca</td><td>Biowest</td><td>S1810</td><td></td></tr><tr><td>Fluorescencyjny nośnik montażowy</td><td>Dako</td><td>S3023</td><td></td></tr><tr><td>Siatka 200 mesh powlekana węglem Formvar</td><td>&nbsp; Sprzęt do laboratoriów TAAB</td><td>F077/025</td><td></td></tr><tr><td>Aparat do odprowadzania gazów</td><td>RWD</td><td>R546W</td><td></td></tr><tr><td>Glicerol</td><td>Fisher BioReagents</td><td>10021083</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało poliklonalne przeciwko kurczakom Goat, Alexa Fluor 488</td><td>Invitrogen</td><td>A-11039</td><td></td></tr><tr><td>Igła Hamilton 30G, Igła Small Hub RN, 25 mm, PST3</td><td>Hamilton</td><td>7803-07</td><td></td></tr><tr><td>Hamilton strzykawka (10 &mikro; L)</td> <td>Hamilton</td><td>7653-01</td><td></td></tr><tr><td>HEK293T</td><td>American Type Culture Collection</td><td>CRL-11268</td><td></td></tr><tr><td>HiTrap Heparin HP 1 x 5 mL</td><td>Cytiva</td><td>17040701</td><td>Fabrycznie zapakowana kolumna heparyny</td></tr><tr><td>HiTrap Heparyna HP 5 x 1 ml</td><td>Cytiva</td><td>17040601</td><td>Fabrycznie pakowana kolumna heparyny</td></tr><tr><td>Immobilon-P PVDF Membrana</td><td>Merck Millipore</td><td>IPVH00010</td><td></td></tr><tr><td>Izofluran</td><td>Braun</td><td>469860</td><td></td></tr><tr><td>Ketamina&nbsp;</td><td>Dechra Pharmaceuticals</td><td>N/A</td><td>Nimatek</td></tr><tr><td>Probówki wirówkowe do mikrowirówek o niskiej retencji (2 ml)</td><td>Fisher Scientific</td><td>11906965</td><td></td></tr><tr><td>Lunatic & Oprogramowanie klienckie Stunner</td><td>, Unchained Labs,</td><td>N/A</td><td>Oprogramowanie do analizy klienta w wersji 8.0.1.235. Oprogramowanie do sekwencyjnej absorpcji światła ultrafioletowego i widzialnego, statycznego rozpraszania światła i dynamicznej analizy rozpraszania światła próbek rAAV</td></tr><tr><td>Metanol</td><td>Fisher Chemical</td><td>M/4000/FP21</td><td></td></tr><tr><td>Mysie przeciwciało monoklonalne anty-AAV, VP1, VP2 (A69)</td><td>American Research Products</td><td>03-61057</td><td></td></tr><tr><td>Mysie przeciwciało monoklonalne anty-AAV, VP1, VP2, VP3 (B1)</td><td>American Research Products</td><td>03-61058</td><td></td></tr><tr><td>Neuro2a</td><td>American Type Culture Collection</td><td>CCL-131</td><td></td></tr><tr><td>Normalna surowica kozia</td><td>Gibco</td><td>16210064</td><td></td></tr><tr><td>NucleoBond Xtra Maxi EF</td><td>Macherey-Nagel</td><td>12738422</td><td></td></tr><tr><td>NZYColour Protein Marker II</td><td>NZYtech</td><td>MB09002</td><td></td></tr><tr><td>pAAV-CMV-scGFP</td><td>Addgene</td><td>32396</td><td>Addgene plazmid # 32396; http://n2t.net/addgene:32396; RRID:Addgene_32396</td></tr><tr><td>pAAV-CMV-ssGFP</td><td>Addgene</td><td>105530</td><td>Plazmid Addgene # 105530; http://n2t.net/addgene:105530; RRID:Addgene_105530</td></tr><tr><td>pAAV2/9n</td><td>Addgene</td><td>112865</td><td>Addgene plazmid # 112865; http://n2t.net/addgene:112865; RRID:Addgene_112865</td></tr><tr><td>Paraformaldehyd</td><td>Acros Organics</td><td>10342243</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Fisher BioReagents</td><td>BP2438</td><td></td></tr><tr><td>Penicylina-streptomycyna</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Pluronic F-68 Niejonowy środek powierzchniowo czynny (100x)</td><td>Gibco</td><td>24040032</td><td></td></tr><tr><td>Polietylenimina MAX, MW 40 000</td><td>Polysciences Europe</td><td>24765</td><td></td></tr><tr><td>Kompaktowa maszyna do znieczulania małych zwierząt serii R500 - Isoflurane</td><td>RWD</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Zawór wlotowy próbki V9-IS</td><td>Cytiva</td><td>29027746</td><td></td></tr><tr><td>Pompa do próbek P9-S</td><td>Cytiva</td><td>29027745</td><td></td></tr><tr><td>Azydek sodu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S2002</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek sodu</td><td>Fisher Scientific</td><td>10428420</td><td></td></tr><tr><td>Deoksycholan sodu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D6750</td><td></td></tr><tr><td>Dodecylosiarczan sodu (SDS)</td><td>Fisher Bioreagents</td><td>BP166</td><td></td></tr><tr><td>Sterylny filtr strzykawkowy PVDF</td><td>Fisher Scientific</td><td>15191499</td><td></td></tr><tr><td>Stunner Platform</td><td>Unchained Labs</td><td>700-2002</td><td>Sprzęt do sekwencyjnej absorpcji światła ultrafioletowo-widzialnego, statycznego rozpraszania światła i dynamicznej analizy rozpraszania światła próbek rAAV</td></tr><tr><td>Superloop 150 ml</td><td>Cytiva</td><td>18-1023-85</td><td></td></tr><tr><td>Superloop 50 ml</td><td>Cytiva</td><td>18-1113-82</td><td></td></tr><tr><td>SURE 2 superkompetentne komórki</td><td>Stratagene, Agilent Technologies</td><td>HPA200152</td><td></td></tr><tr><td>Naczynia hodowlane poddane działaniu</td> środka <td>Corning</td><td>734-1711</td><td></td></tr><tr><td>Baza Tris</td><td>Fisher BioReagents</td><td>BP152</td><td></td></tr><tr><td>Chlorowodorek</td> <td>TrisFisher BioReagents</td><td>BP153</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8787</td><td></td></tr><tr><td>Trypsyna-EDTA</td><td>Gibco</td><td>25200-072</td><td></td></tr><tr><td>Agglutynina z kiełków pszenicy (WGA) sprzężona z Alexa Fluor 633</td><td>Invitrogen</td><td>W21404</td><td></td></tr><tr><td>Xylazine</td><td>Dechra Pharmaceuticals</td><td>N/A</td><td>Sedaxylan</td></tr><tr><td>Zeiss Axio Observer Z1</td><td>Carl Zeiss Mikroskopia GmbH</td><td>N/A</td><td>Odwrócony mikroskop fluorescencyjny wyposażony w obiektyw EC Plan-Neofluar 10x/0,30 oraz obiektyw Plan-Apochromat 40x/0,95</td></tr><tr><td>Zeiss Axio Scan.Z1</td><td>Carl Zeiss Microscopy GmbH</td><td>N/A</td><td>Skaner slajdów mikroskop fluorescencyjny wyposażony w obiektyw Plan-Apochromat 20x/0,8</td></tr><tr><td>Zeiss LSM 710</td><td>Carl Zeiss Microscopy GmbH</td><td>N/A</td><td>Odwrócony mikroskop konfokalny wyposażony w Plan-Apochromat 40x/1,4 Oil DIC obiektyw</td></tr> <tr><td>i mikro szkiełko 8-dołkowe Ibidi</td><td>Ibidi</td><td>80826</td><td>8-dołkowe szkiełko</td></tr></tbody></table>

izolacja wektorów wirusowych związanych z adenowirusem za pomocą jednoetapowego i częściowo zautomatyzowanego protokołu chromatografii powinowactwa do heparyny

Isolation of Adeno-Associated Viral Vectors Through a Single-Step and Semi-Automated Heparin Affinity Chromatography Protocol

Wirus związany z adenowirusem (AAV) stał się coraz cenniejszym wektorem do dostarczania genów in vivo i obecnie przechodzi badania kliniczne na ludziach. Jednak powszechnie stosowane metody oczyszczania AAV wykorzystują ultrawirowanie w gradiacji gęstości chlorku cezu lub jodiksanolu. Pomimo swoich zalet, metody te są czasochłonne, mają ograniczoną skalowalność i często skutkują wektorami o niskiej czystości. Aby przezwyciężyć te ograniczenia, naukowcy zwracają uwagę na techniki chromatograficzne. W tym miejscu przedstawiamy zoptymalizowany protokół chromatografii powinowactwa oparty na heparynie, który służy jako uniwersalny etap wychwytywania do oczyszczania AAV.
Ta metoda opiera się na wewnętrznym powinowactwie serotypu 2 AAV (AAV2) do proteoglikanów siarczanu heparanu. W szczególności protokół pociąga za sobą kotransfekcję plazmidów kodujących pożądane białka kapsydu AAV z białkami AAV2, dając mozaikowe wektory AAV, które łączą właściwości obu rodzicielskich serotypów. Krótko mówiąc, po lizie komórek produkcyjnych, mieszanina zawierająca cząstki AAV jest bezpośrednio oczyszczana zgodnie ze zoptymalizowanym jednoetapowym protokołem chromatografii powinowactwa heparyny przy użyciu standardowego systemu szybkiej chromatografii cieczowej białek (FPLC). Oczyszczone cząsteczki AAV są następnie zagęszczane i poddawane kompleksowej charakterystyce pod względem czystości i aktywności biologicznej. Protokół ten oferuje uproszczone i skalowalne podejście, które można wykonać bez konieczności ultrawirowania i gradientów, uzyskując czyste i wysokie miano wirusa.

Ten manuskrypt opisuje szczegółowy protokół generowania i oczyszczania wektorów wirusowych związanych z adenowirusem przy użyciu zoptymalizowanej metody chromatografii powinowactwa opartej na heparynie. Przedstawia proste, skalowalne i ekonomiczne podejście, eliminując potrzebę ultrawirowania. Otrzymane wektory wykazują wysoką czystość i aktywność biologiczną, co dowodzi ich wartości w badaniach przedklinicznych.

Izolacja wektorów wirusowych związanych z adenowirusem za pomocą jednoetapowego i częściowo zautomatyzowanego protokołu chromatografii powinowactwa do heparyny

Adeno-associated virus (AAV) has become an increasingly valuable vector for in vivo gene delivery and is currently undergoing human clinical trials. ...

W tej pracy zamierzamy opracować ulepszony protokół produkcji, oczyszczania i charakterystyki mozaikowych wektorów wirusowych związanych z adenowirusem, które mogłyby udowodnić swoją wartość w badaniach przedklinicznych. Pomimo wysiłków zmierzających do ustanowienia stabilnych linii komórkowych producentów, transfekcja przejściowa w komórkach ssaków jest nadal dominującym przepływem pracy w produkcji AV. Następnie AV są oczyszczane przez ultraszybkie wirowanie gradientowe o dużej gęstości lub za pomocą technik chromatograficznych, które opierają się na właściwościach biochemicznych cząstek wirusa.Powszechnie stosowane metody oczyszczania AV wykorzystują ultrawirowanie w gradicycie gęstości chlorku cezu lub jodiksanolu. Pomimo swoich zalet mają pewne ograniczenia. Są czasochłonne, mają ograniczoną skalowalność i często dają wyniki niektórym wektorom o niskiej czystości.Teraz, aby przezwyciężyć te ograniczenia, kilku badaczy zwróciło uwagę na techniki chromatograficzne. Opisujemy krok po kroku protokół generowania mozaikowych rAAV w oparciu o zdolność wiązania heparyny przez AAV2. Metoda ta sprawia, że rAAV są wysoce czyste i biologicznie aktywne, gotowe do użycia w ciągu sześciu dni, prezentując się jako półautomatyczna, skalowalna i opłacalna strategia generowania rAAV do badań przedklinicznych.Po wykazaniu możliwości zastosowania tej metody do generowania mozaikowych rAAV, system produkcyjny może być teraz precyzyjnie dostrojony w celu osiągnięcia lepszej skalowalności i efektywności kosztowej poprzez ustanowienie produkcyjnej linii komórkowej. Dodatkowo naszym celem jest usunięcie pustych cząstek poprzez włączenie drugiego etapu oczyszczania polerowania. Na początek płytka z komórkami HEK 293T, dodając 22 mililitry uzupełnionej pożywki hodowlanej w 10 poddanych działaniu pożywki hodowlanej o średnicy 15 centymetrów.Inkubuj płytki przez 24 godziny, aby osiągnąć zbieżność od 70% do 80%. Do transfekcji komórek należy przygotować mieszaninę, łącząc odczynniki w probówce do mikrowirówek i wymieszać, stukając. Dodaj mieszaninę transfekcji do 4,56 mililitra nieuzupełnionego DMEM w 50-mililitrowej probówce wirówkowej i wymieszaj, stukając.Następnie dodaj 1,37 mililitra sterylnego roztworu aminy polietylenowej, kropla po kropli. Mieszać przez stukanie i inkubować w temperaturze pokojowej przez 10 minut, aby utworzyć kompleksy DNA-polietylenoaminy. Dodaj tę mieszaninę do 231 mililitrów wstępnie podgrzanego, uzupełnionego DMEM.Zastąp pożywkę hodowlaną w każdym naczyniu hodowlanym 22 mililitrami tej mieszaniny transfekcyjnej i inkubuj komórki przez 48 godzin. Jeśli PITR koduje reporter fluorescencyjny, należy obserwować transfekowane komórki pod mikroskopem fluorescencyjnym. Następnie zebrać pożywkę z każdej szalki, odwirować przy 800 G przez 10 minut i usunąć supernatant.Następnie dodaj 10 mililitrów wstępnie podgrzanego PBS do płytki i użyj skrobaka do komórek, aby usunąć komórki. Zebrać zawiesinę komórkową do probówek wirówkowych zawierających osad komórkowy. Upewnij się, że wszystkie komórki zostały zebrane, myjąc pięć naczyń na raz 10 mililitrami PBS.Ponownie odwirować, aby osadzać komórki. W przypadku ekstrakcji rAAV rozmrozić transfekowane granulki komórek i ponownie zawiesić w 100 mililitrach sterylnego buforu i pipety, aby zapewnić jednorodną zawiesinę. Następnie dodaj 12,5 mililitra świeżo przygotowanego, sterylnego 10% roztworu deoksycholanu sodu, aby wywołać lizę komórek i wymieszaj przez pipetowanie.Dodaj 27 mikrolitrów nukleazy benzonazy i dokładnie wymieszaj, aż mieszanina przestanie być lepka. Inkubować w temperaturze 37 stopni Celsjusza, wirując co 10 minut przez godzinę. Wirować przy 3000 G przez 60 minut w temperaturze 25 stopni Celsjusza.Przefiltrować supernatant za pomocą 0,45-mikronowego filtra strzykawkowego PVDF do nowego sterylnego pojemnika. Aby rozpocząć, przygotuj system FPLC do oczyszczania. Dokładnie przepłucz ścieżkę przepływu cieczy sterylną, ultra czystą wodą, korzystając z instrukcji ręcznych lub niestandardowej metody.Podłącz jednomililitrową, wstępnie zapakowaną kolumnę heparyny. Dostosuj alarm ciśnienia. I umyć pięcioma objętościami kolumny ultraczystej wody o natężeniu przepływu jednego mililitra na minutę.Następnie zamień roztwory pomp systemowych, aby przygotować się do aplikacji próbki. Umyć pompę systemową B buforem B i napełnić pozostałą część ścieżki przepływu cieczy buforem A. Włożyć rurkę do próbki pompy do próbki do preparatu wirusowego. Alternatywnie użyj super pętli dla próbki.Włóż rurkę wylotową do nowego pojemnika. Wykonując oczyszczanie po raz pierwszy, zdefiniuj niestandardową metodę automatycznego oczyszczania. Po włączeniu ogólnych ustawień oczyszczania, metoda zaleczy ścieżkę przepływu od wlotu próbki S1 do zaworu iniekcyjnego roztworem próbki.Następnie zrównoważyć kolumnę z łącznie pięcioma objętościami kolumny, używając 12,5% buforu B w tempie jednego mililitra na minutę. Nanieść próbkę na kolumnę z prędkością 0,5 mililitra na minutę i zebrać przepływ przez otwór wylotowy. Przemyć kolumnę 20 objętościami buforu A w ilości jednego mililitra na minutę.Następnie eluuj próbkę z prędkością jednego mililitra na minutę za pomocą tego schematu. Wybrać, aby zebrać eluowaną próbkę we frakcjach jednomililitrowych za pomocą kolektora frakcji. Następnie ponownie wyrównaj kolumnę z prędkością jednego mililitra na minutę z 12,5% buforu B dla pięciu objętości kolumny.Otwórz utworzoną metodę i poczekaj na etap elucji. Zbierz ułamki za pomocą kolektora ułamków. Zbierz również porcję przepływu i przechowuj frakcje w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza.Ocenić automatycznie zapisany chromatogram wszystkich etapów oczyszczania, w tym profilu elucji. Po zakończeniu przełączyć wloty z roztworów buforowych na wodę ultraczystą i umyć kolumnę z prędkością jednego mililitra na minutę dla pięciu objętości kolumny. Przywracając kolumnę, przełącz wloty z wody ultraczystej na 20% etanol i umyj kolumnę przez pięć objętości kolumny.Aby skoncentrować rAAV, załaduj pożądane frakcje FPLC do 15-mililitrowej odśrodkowej jednostki filtrującej z odcięciem masy cząsteczkowej 100 kilodaltonów. Wirować przy 2000 G przez dwie minuty w temperaturze pokojowej, aby osiągnąć skoncentrowaną objętość około 500 mikrolitrów. Kontynuuj wymianę buforu, dodając jeden mililitr sterylnego PBS do filtra odśrodkowego.Umyć filtr przez pipetowanie i odwirowywać w jednominutowych odstępach, aż do osiągnięcia objętości 500 mikrolitrów. Dalsze zagęszczanie rAAV poprzez przeniesienie tej próbki o pojemności 500 mikrolitrów do 0,5-mililitrowej jednostki filtra odśrodkowego z odcięciem 100 kilodaltonów i odwirowywanie przy 6000 G w odstępach jednominutowych, aż objętość spadnie poniżej 100 mikrolitrów. Odzyskaj skoncentrowany rAAV poprzez odwrócenie urządzenia filtrującego do nowej probówki mikrowirówki i odwirowanie w celu przeniesienia rAAV do probówki.Porcjować rAAV do probówek mikrowirówek o niskiej retencji i przechowywać w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza. Czystość preparatów rAAV analizowano za pomocą SDS-PAGE, ujawniając wyraźne prążki białkowe kapsydu. Wizualizacja cząstek wirusa za pomocą TEM pokazała puste cząstki z centrum o dużej gęstości elektronów i pełnymi cząstkami.Ocena właściwości zanieczyszczeń fizycznych rAAV przy użyciu platformy Stunner ujawniła nienaruszone cząstki kapsydu o wielkości około 30 nanometrów, całkowite miano kapsydu, wolne i zagregowane białko oraz jednoniciowe DNA. Testy zakaźności w komórkach neuro 2A wykazały wysoki poziom zakaźności. Pierwotne hodowle neuronów zakażone preparatami wirusowymi wykazały zachowane właściwości transferu genów.Transdukcja in vivo móżdżku myszy wektorami rAAV spowodowała przedłużoną ekspresję GFP, co wskazuje na udaną ekspresję transgenu w mózgu ssaków.

isolation-adeno-associated-viral-vectors-through-single-step-semi

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioinżynieria

Wektory rekombinowanego wirusa towarzyszącego adenowirusom (rAAVs) stają się coraz bardziej cenne w badaniach in vivo na zwierzętach. Opisujemy, w jaki sposób rAAVs mogą być produkowane w laboratorium oraz jak można oznaczać miano tych wektorów, aby uzyskać dokładny odczyt liczby wyprodukowanych cząstek zakaźnych.

Produkcja i miareczkowanie rekombinowanych wektorów wirusowych opartych na wirusie towarzyszącym adenowirusom (AAV)

Tutaj opisujemy efektywną i powtarzalną strategię produkcji, mianowania i kontroli jakości partii wektorów wirusowych związanych z adeno. Pozwala na uzyskanie preparatu wektorowego o wysokim mianie (≥1 x10 13 genomów wektorowych/ml) i wysokiej czystości, gotowego do użycia in vitro lub in vivo.

Produkcja, oczyszczanie i kontrola jakości wektorów wirusowych związanych z adenowirusem

Tutaj przedstawiamy szczegółową procedurę produkcji na dużą skalę wektorów AAV klasy badawczej przy użyciu przylegających komórek HEK 293 hodowanych w stosach komórkowych i oczyszczania metodą chromatografii powinowactwa. Protokół ten konsekwentnie daje &gt;1 x 1013 genomów wektorowych/ml, zapewniając ilości wektorów odpowiednie dla badań na dużych zwierzętach.

Produkcja wektorów wirusowych związanych z adenowirusem w stosach komórkowych do badań przedklinicznych na dużych modelach zwierzęcych

Wirus związany z adenowirusem jest wytwarzany w hodowli komórek zawiesinowych i oczyszczany przez wirowanie w gradiacji gęstości podwójnego jodixanolu. Uwzględniono kroki mające na celu zwiększenie całkowitej wydajności wirusa, zmniejszenie ryzyka wytrącania się wirusa i dalszą koncentrację końcowego produktu wirusowego. Oczekiwane końcowe miana osiągają10-12 cząstek wirusa/ml i nadają się do przedklinicznego stosowania in vivo.

Produkcja kultur zawiesinowych i oczyszczanie wirusa związanego z adenowirusem za pomocą wirowania w gradicynacji gradientu gęstości jodiksanolu do zastosowań in vivo

Tutaj prezentowany jest protokół produkcji zawiesiny HEK293 oparty na komórkach AAV, co skutkuje zmniejszeniem czasu i pracy potrzebnej do produkcji wektorów przy użyciu komponentów, które są dostępne do celów badawczych od komercyjnych dostawców.

Produkcja wysokowydajnych partii wektorów związanych z adeno przy użyciu komórek zawiesinowych HEK293

Wraz z rozwojem terapii genowej, rośnie zapotrzebowanie na innowacyjne metody, które mogą sprostać tym wyzwaniom. Zaprezentowano tu unikalną metodę, która usprawnia proces generowania wysokowydajnych i czystych wektorów AAV z wykorzystaniem platformy fabryki komórek, spełniającej standardy jakości dla badań in vivo.

Uproszczona i ustandaryzowana procedura generowania wysokiej jakości wektorów wirusowych związanych z adenowirusem o wysokim mianie z wykorzystaniem platformy Cell Factory

Ten protokół pokaże ekstrakcję i analizę wolnych i estryfikowanych bioaktywnych kwasów tłuszczowych z komórek. Kwasy tłuszczowe są dokładnie oznaczane ilościowo za pomocą rozcieńczania stabilnych izotopów, chiralnej chromatografii cieczowej, wychwytywania elektronów, atmosferycznej jonizacji chemicznej, wielokrotnego monitorowania spektrometrii mas (SID-LC-ECAPCI-MRM/MS).

Ekstrakcja lipidów komórkowych do ukierunkowanego rozcieńczania stabilnych izotopów Chromatografia cieczowa - analiza spektrometrii mas

Opracowaliśmy cytometr przepływowy wykorzystujący ultradźwięki indukowane laserem do wykrywania krążących komórek czerniaka jako wczesnego wskaźnika choroby przerzutowej.

Detekcja i izolacja krążących komórek czerniaka z wykorzystaniem fotoakustycznej cytometrii przepływowej

Nanocząstki wirusowe pochodzenia roślinnego (VNPs) stanowią obiecujące platformy do zastosowań w biomedycynie. W niniejszym materiale opisujemy procedury propagacji, oczyszczania, charakteryzacji oraz biokoniugacji roślinnych VNP. Na koniec przedstawiamy zastosowanie VNP w celowanym dostarczaniu do guzów oraz obrazowaniu z wykorzystaniem modelu ksenoprzeszczepu u myszy i obrazowania fluorescencyjnego.

Nanocząsteczki wirusowe do obrazowania guzów in vivo

Rozwój biotynylowalnych białek fuzyjnych ma wiele potencjalnych zastosowań w różnych dziedzinach badań. Inżynieria białek rekombinowanych to prosta procedura, która jest opłacalna, zapewniając wysoką wydajność niestandardowych białek.

Ekspresja, izolacja i oczyszczanie rozpuszczalnych i nierozpuszczalnych białek biotynylowanych do regeneracji tkanki nerwowej

Naucz się izolować wektory adeno-związane z wirusami za pomocą chromatografii powinowactwa do heparyny. Ta metoda zapewnia wysoką czystość i aktywność biologiczną wektorów w zaledwie sześć dni.

Izolacja wektorów wirusowych związanych z adenowirusem za pomocą jednoetapowego i częściowo zautomatyzowanego protokołu chromatografii powinowactwa do heparyny (Wideo) | JoVE Journal

Izolacja wektorów wirusowych związanych z adenowirusem za pomocą jednoetapowego i częściowo zautomatyzowanego protokołu chromatografii powinowactwa do heparyny

Przeglądaj więcej filmów