Izolacja i analiza składu monomerów lipidowych poliestrowych naskórków roślin

Rośliny naczyniowe polegają na warstwach zewnątrzkomórkowych, które pełnią funkcję wodoodpornych barier między tkankami roślinnymi a środowiskiem zewnętrznym. Te lipofilne struktury komórkowe i powiązane z nimi elementy ograniczają infekcje patogenne oraz regulują pasywny transport gazów, wody i substancji rozpuszczonych do tkanek roślinnych i z nich. Jedną z ważnych barier jest kutykula roślinna – złożona struktura charakterystyczna wyłącznie dla roślin.

Kutyna jest nierozpuszczalnym poliestrem lipidowym glicerolu, który stanowi macierz strukturalną kutykuli i jest związany z woskami ekstrahowalnymi rozpuszczalnikami. Przedstawiamy tutaj wiarygodną technikę analizy składu poliestrów lipidowych w tkankach roślinnych. W niniejszym protokole próbki całych tkanek są pobierane, homogenizowane i poddawane wyczerpującej depolimeryzacji poprzez serię ekstrakcji rozpuszczalnikami w celu usunięcia lipidów rozpuszczalnych, w tym wosków kutykularnych i epikutykularnych.

Triglicerydy w lipidach błonowych. Próbki są następnie depolimeryzowane do ich składowych monomerów lipidowych poprzez metylizę katalizowaną metanolanem sodu. Odczynniki do silylowania są dodawane w celu transmetylacji grup hydroksylowych do odpowiadających im pochodnych trimetylosililowych, odpowiednich do analizy chromatograficznej w fazie gazowej.

Pozostałości pochodnych są następnie przenoszone do fiolek do GC i wprowadzane do A-G-C-M-S w celu przeprowadzenia analizy, co pozwala na wygenerowanie chromatogramu charakteryzującego skład monomerowy biopoliestrów obecnych w ekstraktach z próbek. W tym etapie pobieramy próbki całych liści z roślin arabidopsis ANA typu dzikiego oraz dwóch mutantów w fazie dojrzałej.

W celu ekstrakcji i analizy należy dodać 0,5 g tkanki do czystych probówek szklanych, które zostały uprzednio wypłukane chloroformem. Do kolby należy wlać 100 ml izopropanolu i dodać butylowany hydroksytoluen do stężenia 0,01%. BHT jest przeciwutleniaczem dodawanym w celu ochrony wiązań podwójnych i kwasów tłuszczowych przed utlenianiem podczas ekstrakcji rozpuszczalnikiem. Rozpuszczalnik należy wstępnie podgrzać w kąpieli wodnej do temperatury około 85°C.

Należy dodać 25 mililitrów podgrzanego izopropanolu na gram tkanki roślinnej i inkubować próbki w bloku grzejnym w temperaturze 85 stopni przez 15 minut. Pozostawić probówki do ostygnięcia do temperatury pokojowej, stosując ochronę słuchu i wzroku. Na koniec próbki należy rozdrobnić za pomocą homogenizatora w celu uzyskania jednorodnej zawiesiny, zamknąć probówki zakrętkami z gwintem i mieszać przy 100 RPM przez jedną do dwóch minut, a następnie odwirować próbki przy 800 G przez 10 minut.

Aby oddzielić fazę organiczną od materiałów o większej gęstości zbitych w osad, należy usunąć i odrzucić nadsącz za pomocą pipety Pasteura lub propentu. Należy uważać, aby nie naruszyć osadu. Należy dodać taką samą objętość izopropanolu w temperaturze pokojowej i inkubować próbki z wytrząsaniem przez noc.

Wiruj próbki przy 100 RPM, a następnie odlej nadsącz. Dodaj 25 mililitrów roztworu chloroformu i metanolu w stosunku dwa do jednego na gram tkanki, wstrząsaj próbkami przez noc, wiruj i odlej fazę organiczną. Następnie powtórz ten proces, stosując roztwór chloroformu i metanolu w stosunku jeden do dwóch.

Osad suszyć przez noc, a następnie przenieść probówki z dygestorium do eksykatora próżniowego zawierającego bezwodny siarczan wapnia, aby odwadniać próbki przez okres co najmniej trzech dni lub do uzyskania stałej masy. Po całkowitym wysuszeniu próbki są gotowe do defatacji poprzez metalizę katalizowaną metoksydem sodu. Do probówek zawierających suche tkanki dodać za pomocą szklanej strzykawki dwa roztwory standardów wewnętrznych, zaczynając od 25 µL decanianu metylu oraz 25 µL laktonu omega-pentadekanolowego.

Aby rozpocząć głęboką polimeryzację, należy dodać do próbek 0.9 ml octanu metylu, a następnie 1.5 ml katalizatora w postaci metanolanu sodu oraz 3.6 ml metanolu. Próbki należy inkubować w temperaturze 60 °C przez dwie godziny, okresowo mieszając je w wirówce wewnątrz układu reakcyjnego; poliestry lipidowe reagują z nukleofilowymi anionami metoksydowymi, tworząc niestabilne produkty pośrednie o strukturze tetraedrycznej, które łatwo dysocjują do estrów metylowych kwasów tłuszczowych i anionów tlenkowych. Tlenki te są zasadami sprzężonymi i reagują z metanolem, regenerując aktywne katalitycznie aniony metoksydu, co umożliwia przebieg kolejnych reakcji głębokiej polimeryzacji.

Jeśli w układzie znajduje się woda, przereaguje ona z metoksydem sodu, tworząc wodorotlenek sodu. Jest to silna zasada, która nieodwracalnie przekształca poliestry w niepożądane wolne kwasy tłuszczowe. Aby zapobiec hydrolizie, w celu usunięcia wodorotlenku sodu z układu, dodaje się octan metylu.

Pozostawić probówki do ostygnięcia do temperatury pokojowej. Po inkubacji wyekstrahować monomery, dodając do każdej probówki 10 ml dichlorometanu. Następnie dodać 1,5 ml octowego kwasu lodowatego w celu zakwaszenia próbek.

Napełnić probówki 0,5 M roztworem chlorku sodu, dokładnie wymieszać w wstrząsarze vortex i wirować przez kilka minut. Pod wyciągiem. Ostrożnie przenieść dolną fazę organiczną za pomocą pipety do czystych, uprzednio wypłukanych probówek o średniej wielkości.

Ponownie przemyj próbki roztworem soli fizjologicznej, wymieszaj w wirówce typu vortex i wiruj przez 10 minut. Usuń górną fazę wodną, a następnie dodaj do próbek bezwodny siarczan sodu jako środek osuszający w celu usunięcia śladowych ilości wody pozostałych w roztworze; wymieszaj próbki w vortexie, odwiruj i przenieś rozpuszczalnik do czystych, uprzednio wypłukanych probówek o małej objętości. Umieść probówki w ewaporatorze azotowym, aby odparować rozpuszczalnik i uzyskać suche pozostałości monomerów. Za pomocą szklanej strzykawki dodaj 100 µL puryny i 100 µL B-S-T-F-A, aby przekształcić grupy hydroksylowe w lotne pochodne trimetylcellulozowe.

Inkubować próbki w temperaturze 100°C przez 10 minut. Pozostawić probówki do ostygnięcia i odparowania pod strumieniem azotu. Dodać 500 µL roztworu HEPTANE i toluenu w stosunku jeden do jednego, aby ponownie rozpuścić osady, a następnie krótko odwirować.

Przenieś próbki pochodnych do fiolek GC zawierających wkłady 400 µL. Zamknij fiolki i wprowadź próbki do chromatografu gazowego, który wstrzykuje je do kolumny kapilarnej w celu analizy; eluaty są następnie wykrywane przez kwadrupolowy spektrometr mas. Surowe dane uzyskane z analizy GCMS są przetwarzane i przedstawiane w formie chromatogramu dla każdej próbki.

Poszczególne monomery odpowiadające różnym pikiom chromatograficznym są identyfikowane na podstawie ich specyficznych widm masowych. W przypadku czasów retencji w GC, ilości poszczególnych monomerów są wyznaczane przy użyciu metody ilościowego oznaczenia ze standardem wewnętrznym, co umożliwia porównanie zawartości i składu monomerów pomiędzy próbkami. Przedstawiono tutaj nałożone na siebie chromatogramy z reprezentatywnych analiz monomerów uwolnionych z tkanki liścia ropnia królika odpowiadającej typowi dzikiemu oraz dwóm allelom mutantowym genu kodującego enzym P450 monooxygenaza, wykazujących odmienne profile monomerowe.

Nasze wyniki wykazują istotne różnice w zawartości trzech głównych monomerów kutyny w roślinach arabidopsis typu dzikiego oraz mutantach. Niniejszy protokół stanowi solidną metodę analizy składu poliestrów lipidowych roślin poprzez izolację, identyfikację i ilościowe oznaczenie ich monomerów składowych. Procedura ta jest skalowalna i może zostać łatwo dostosowana do przetwarzania dużych ilości różnych materiałów roślinnych, w tym korzeni, nasion, liści oraz innych tkanek w całości.

Technika ta znajduje zastosowanie w badaniach nad regulacją biosyntezy oraz dystrybucją kutyny i suberyny u roślin wyższych.