Izolacja i analiza składu monomerów lipidowych poliestrowych naskórków roślin

Rośliny naczyniowe opierają się na warstwach zewnątrzkomórkowych, które działają jako wodoodporne bariery między tkankami roślinnymi a środowiskiem zewnętrznym. Te lipofilowe komórki, podczas gdy związane z nimi struktury, ograniczają infekcje chorobotwórcze i regulują bierny transport gazów, wody i rozpuszczonych substancji do i z tkanek roślinnych. Jedną z ważnych barier jest kutykula roślinna, złożona struktura unikalna dla roślin.

Kutyna jest nierozpuszczalnym poliestrem lipidowym glicerolu, który stanowi matrycę strukturalną naskórka i jest związany z woskami ekstrahowanymi rozpuszczalnikiem. Tutaj przedstawiamy wiarygodną technikę oznaczania składu lipidowych poliestrów i utrzymywania de lipidowych tkanek roślinnych. W tym protokole całe próbki tkanek są pobierane, homogenizowane i wyczerpująco niszczone przez serię ekstrakcji rozpuszczalnikiem w celu usunięcia rozpuszczalnych w rozpuszczalnikach lipidów, w tym wosków kutykularnych i epi.

Trójglicerol w lipidach błonowych. Próbki są następnie depolimeryzowane na ich składowe monomery lipidowe przez lizę metylową katalizowaną tlenkiem metamfetaminy. Odczynniki symulacyjne dodaje się do grup hydroksylowych trans metylanu do odpowiadających im pochodnych komórek trimetylowych nadających się do analizy metodą chromatografii gazowej.

Pozostałości pochodne są następnie przenoszone do fiolek GC i ładowane do A-G-C-M-S w celu analizy, generując chromatogram, charakteryzujący monomeryczny skład biopoliestrów. Obecny w wyekstrahowanych próbkach. Tutaj zbieramy próbki całych liści z dzikiego typu i dwóch mutantów dojrzałych roślin Arabidopsis ANA.

W celu ekstrakcji i analizy dodaj 0,5 grama tkanki do czystych szklanych probówek, które zostały wstępnie przepłukane chloroformem. Umieść 100 mililitrów izopropanolu w kolbie i dodaj butylowany hydroksytoluen do stężenia 0,01% BHT jest przeciwutleniaczem dodawanym w celu ochrony podwójnych wiązań i kwasów tłuszczowych przed utlenianiem podczas ekstrakcji rozpuszczalnikiem. Podgrzej rozpuszczalnik w łaźni wodnej do około 85 stopni.

Dodać 25 mililitrów podgrzanego izopropanolu na gram tkanki roślinnej i inkubować próbki w cieple LOC w temperaturze 85 stopni przez 15 minut. Pozwól rurkom ostygnąć do temperatury pokojowej i z ochroną słuchu i oczu. Na koniec zmielić próbki homogenizatorem w celu uzyskania jednorodnej dyspersji, probówki uszczelniające z nakrętkami i wstrząsnąć z prędkością 100 obr./min dla jednej lub dwóch próbek wirówek o sile 800 G przez 10 minut.

Aby oddzielić fazę organiczną od materiałów o większej gęstości zagęszczonych w osadzie, należy usunąć i wyrzucić supernatant za pomocą Pasteura lub propent. Uważaj, aby nie naruszyć pelletu. Dodać równą objętość izopropanolu w temperaturze pokojowej i wstrząsnąć próbkami przez noc.

Przy prędkości 100 obr./min odwirować próbki i odrzucić supernatant. Dodaję 25 mililitrów roztworu chloroformu, metanolu dwa do jednego, pergram tkanki i wstrząsam próbkami przez noc, odwirowuję i odrzucam fazę organiczną. Następnie powtórz ten proces, używając jednego do dwóch roztworów chloroformu metanolu.

Wysuszyć osad przez noc i przenieść rurki z dygestorium do osuszacza próżniowego zawierającego bezwodny siarczan wapnia w celu odwodnienia próbek przez okres co najmniej trzech dni lub do momentu osiągnięcia stałej masy. Po dokładnym wysuszeniu próbki są gotowe do defloracji przez metalizę katalizowaną tlenkiem sodu. Dodać dwa roztwory wzorców wewnętrznych do probówek zawierających suche tkanki za pomocą szklanej strzykawki, zaczynając od 25 mikrolitrów dekanianu metylu HETO i 25 mikrolitrów omega pentec i laktonu.

Aby zainicjować głęboką polimeryzację, dodaj 0,9 mililitra octanu metylu do próbek, a następnie 1,5 mililitra katalizatora tlenku mety sodu i 3,6 mililitra metanolu. Inkubuj próbki w temperaturze 60 stopni przez dwie godziny z okresowym wirowaniem w układzie reakcyjnym, poliestry lipidowe reagują z nukleofilowymi anionami tlenku metamfetaminy, tworząc niestabilne półprodukty czworościenne, które łatwo dysocjują na kwasy tłuszczowe, estry metylowe i aniony tlenkowe. Te tlenki a są sprzężonymi zasadami i reagują z metanolem, regenerując katalitycznie aktywne aniony IDE metamfetaminy, podtrzymując w ten sposób dodatkowe głębokie reakcje polimeryzacji.

Jeśli w systemie obecna jest woda, będzie reagować z metatlenkiem sodu, tworząc wodorotlenek sodu. Mocna baza, która nieodwracalnie przekształca poliestry w niepożądane wolne kwasy tłuszczowe. Zamiast fas, aby zapobiec hydrolizie, dodaje się octan metylu w celu usunięcia wodorotlenku sodu w układzie.

Pozwól rurkom ostygnąć do temperatury pokojowej. Po inkubacji wyekstrahować monomery, dodając 10 mililitrów dichlorku metylenu do każdej probówki. Następnie dodaj 1,5 mililitra lodowatego kwasu kwaśnego, aby zakwasić próbki.

Napełnij probówki 0,5 molowym roztworem chlorku sodu, dokładnie zwiruj i odwiruj przez kilka minut. Pod wyciągiem. Ostrożnie przenieść dolną fazę organiczną za pomocą pipety do czystych, wstępnie wypłukanych, średniej wielkości probówek.

Ponownie przemyć próbki roztworem soli fizjologicznej, wirować i wirować przez 10 minut. Usunąć górną fazę wodną, a następnie dodać bezwodny siarczan sodu do próbek jako środek osuszający w celu usunięcia śladowych ilości wody pozostałej w wirówce próbek wirowych roztworu i przenieść rozpuszczalnik do czystych, wstępnie wypłukanych probówek o małych rozmiarach, załadować probówki do parownika azotu w celu odparowania rozpuszczalnika i uzyskania suchych pozostałości monomerów. Za pomocą szklanej strzykawki dodaj 100 mikrolitrów puryny i 100 mikrolitrów B-S-T-F-A, aby przekształcić grupy hydroksylowe w lotne pochodne komórek trimetylu.

Próbki inkubować w temperaturze 100 stopni przez 10 minut. Poczekaj, aż probówki ostygną i odparują pod wpływem azotu. Dodać 500 mikrolitrów roztworu toluenu HEPTANE jeden do jednego do jednego do czerwonych rozpuszczonych pozostałości, które następnie krótko odwirowuje.

Przenieść próbki pochodne do fiolek GC zawierających 400 mikrolitrów. Zamknąć fiolki, załadować próbki do chromatografu gazowego, który wstrzykuje je do kolumny kapilarnej w celu analizy, eluat jest następnie wykrywany za pomocą poczwórnego spektrometru mas. Surowe dane uzyskane w wyniku analizy GCMS są przetwarzane i prezentowane jako chromatogram dla każdej próbki.

Poszczególne monomery odpowiadające różnym pikom chromatograficznym są identyfikowane za pomocą ich specyficznych widm masowych. W czasach retencji GC ilości poszczególnych monomerów określa się przy użyciu metody oznaczania ilościowego wzorca wewnętrznego, co umożliwia porównanie obfitości i składu monomerów między próbkami. Pokazano tutaj chromatogramy nakładkowe z reprezentatywnych analiz monomerów uwolnionych z tkanki liścia ropnia królika odpowiadającej typowi dzikiemu i dwóm zmutowanym allelom genu kodującego enzym monooksygenazy P 450 wykazujący odrębne profile monomeryczne.

Nasze wyniki wskazują na znaczące różnice, obfitość trzech głównych kutyn, monomerów oraz dzikich i zmutowanych roślin rzodkiewnika. Protokół ten jest solidną metodą oznaczania składu poliestrów lipidowych roślin poprzez izolację, identyfikację i kwantyfikację ich monomerów składowych. Procedura jest skalowalna i może być łatwo dostosowana do przetwarzania dużych ilości różnych materiałów roślinnych, w tym korzeni, nasion, liści i innych całych tkanek.

Technika ta ma zastosowanie w badaniach nad biosyntezą, regulacją i dystrybucją kutyny i suberyny w roślinach wyższych.