Badanie proteolizy cykliny B na poziomie pojedynczej komórki w całych populacjach komórek

Przejście metafazy do anafazy jest wywoływane przez zależną od ubikwitynacji (APC/C) i późniejsze zniszczenie cykliny B. W tym przypadku stworzyliśmy system, który po znakowaniu impulsowym umożliwia monitorowanie proteolizy cykliny B w całych populacjach komórek i ułatwia wykrywanie zakłóceń przez mitotyczny punkt kontrolny.

Celem tej procedury jest monitorowanie, w jaki sposób proteoliza cyklu B rządzi początkiem anafazy i wyjściem mitotycznym. Osiąga się to poprzez pierwsze wysiewanie cyklicznych komórek reporterowych B snap na szkiełkach mikroskopowych. Drugim krokiem jest oznaczenie chimerycznej cząsteczki reporterowej cykliny B za pomocą fluorescencyjnego podłoża TMR star.

Następnie serie obrazów są rejestrowane w stacji mikroskopowej. Ostatnim krokiem jest analiza komórek i obliczenie intensywności fluorescencji gwiazdy TMR w czasie, która odzwierciedla cykliczną proteolizę B. Ostatecznie mikroskopia immunofluorescencyjna żywych komórek reporterowych ujawnia kinetykę cyklicznej proteolizy B zachodzącej podczas mitozy.

Główną przewagą tej techniki nad istniejącymi metodami, takimi jak monitorowanie cyklonu BGFP, jest to, że cyklon B SNAP umożliwia monitorowanie degradacji cyklonu B, a nie ekspresji całego białka. Komórki reporterowe snap w tym eksperymencie mogą początkowo rosnąć asynchronicznie w fazie logarytmicznej przez co najmniej 48 godzin. Na początek procedura wysiewu trypsyny polega na wysiewaniu komórek reporterowych do wysiewu komórek do ośmiu studzienek mikroskopowych przy stałym rozkładzie na całej powierzchni wirówki komorowej.

10 000 komórek i Resus wydają się na 350 mikrolitrów, normalną pożywkę wzrostową wolną od czerwieni fenolowej. Przenieś zawiesinę komórek do komory mikroskopu w celu wysiewu komórek do ośmiu studzienek mikroskopowych o maksymalnej gęstości komórek w środku komory. Najpierw załaduj komorę 300 mikrolitrami normalnego podłoża wolnego od czerwieni fenocznej.

Następnie ostrożnie dodaj 5 000 komórek do środka komory mikroskopu w celu wysiewu komórek na 96. Studnia specjalna optyka płytkuje w stałym rozkładzie na całej powierzchni wirówki studziennej, 5 000 komórek i ponownie zawiesić w 300 mikrolitrach czerwonej fenoli wolnej normalnej pożywki wzrostowej w zależności od całkowitej liczby wymaganych komórek zawierających studzienki. Dostosuj liczbę komórek i całkowitą objętość zawiesiny.

Następnie przenieś zawiesinę komórek na 96-dołkową płytkę w celu wysiewu komórek na 96. Cóż, specjalne płytki optyczne o maksymalnej gęstości komórek w środku studni. Ostrożnie dodaj 1,500 komórek w 15 mikrolitrach normalnej pożywki o wolnym od czerwieni fenolowej w małej kropli do środka każdej studzienki.

Ograniczy to wzrost komórek do środka studni. Pozwól wszystkim wysianym komórkom rosnąć przez co najmniej 18 godzin w standardowych warunkach hodowli komórkowej 30 minut przed rozpoczęciem procedury barwienia. Kwaty rozgrzewkowe z czerwonej fenolu wolnej od normalnego podłoża do 37 stopni Celsjusza.

Substratem zatrzaskowym w tej demonstracji jest gwiazda TMR do łatwej obsługi rozpuszczonej w gwieździe TMR gwiazdy w DMSO w celu uzyskania roztworu podstawowego o stężeniu 400 mikromolowym, rozcieńczonego 0,5 mikrolitra roztworu podstawowego gwiazdy TMR. W 200 mikrolitrach ciepłej czerwieni fenolowej wolnej normalnej pożywki wzrostowej w celu uzyskania końcowego stężenia znakowania jednego mikromola. Następnie usuń normalną pożywkę wzrostową z asynchronicznie rosnących komórek i zastąp ją pożywką znakującą, inkubuj komórki w pożywce znakującej przez 25 minut w standardowych warunkach hodowli.

Po 25 minutach usuń pożywkę do etykietowania i umyj komórki czterokrotnie ciepłym normalnym podłożem wolnym od czerwieni fenolowej. Po ostatnim płukaniu inkubować komórki w 300 mikrolitrach ciepłej, wolnej od czerwieni fenolowej normalnej pożywki wzrostowej przez 30 minut przed transportem do mikroskopu. Zastąp pożywkę świeżą, ciepłą, wolną od czerwieni fenolowej, normalną pożywką, aby usunąć resztki niezwiązanych zatrzasków transportujących podłoże do mikroskopu w styropianowym pudełku na podgrzewanym bloku grzewczym o temperaturze 37 stopni Celsjusza.

Aby zminimalizować zmiany temperatury na dwie godziny przed pomiarem intensywności fluorescencji. Ustawić temperaturę powietrza w komorze klimatycznej na 37 stopni Celsjusza w trybie suchym, aby doprowadzić mikroskop i wszystkie jego elementy do żądanej temperatury. Aby uniknąć kondensacji i późniejszego uszkodzenia mikroskopu, ważne jest, aby podgrzać go przed ustawieniem wilgotności.

Gdy cały system mikroskopu osiągnie 37 stopni Celsjusza, dostosuj wilgotność powietrza do 60% i dwutlenek węgla do 5%Uruchom oprogramowanie do skanowania lub akwizycji i zdefiniuj standardowe ustawienia. Określ pozycje odwiertów, które mają być analizowane. Zdefiniuj różnicę T lub czas cyklu akwizycji oraz bezwzględną liczbę cykli akwizycji.

W tej demonstracji. Autofokus sprzętowy jest wstępnie wybrany do analizy większej liczby dołków. Rozpocznij akwizycję i nadzoruj pierwsze dwa cykle przejęcia.

Mikroskop skupi się na sygnale histonu H dwa GFP, a następnie uzyska pierwszy obraz w tym kanale, zanim filtr zostanie zmieniony i uzyskany zostanie odpowiedni obraz gwiazdy TMR. Jest to powtarzanie ich dla wszystkich pozycji w studni i dla każdej z studni, które mają być zbadane przed powtórzeniem następnego cyklu. Znów. Aby przeanalizować profile proteolityczne, uruchom oprogramowanie do analizy skanowania R.

Przeanalizuj obrazy z jądrami komórkowymi wizualizowanymi przez histon H dwa GFP, zdefiniowany jako główny obiekt przy użyciu progu opartego na intensywności sygnału i algorytmu zlewni, aby pomóc w oddzieleniu sąsiednich komórek. Do analizy gwiazd TMR powinien zostać stworzony podobiekt składający się z jądra z cytoplazmą. Ważnymi właściwościami obiektu głównego są pozycje X i Y, czas i maksimum oraz średnie intensywności GFP dla głównego obiektu i całkowita intensywność podzielona przez powierzchnię.

W przypadku obiektu podrzędnego gwiazdy TMR przejdź do trybu śledzenia, aby zobrazować średnią intensywność fluorescencji gwiazdy TMR w czasie lub ślady komórek przypisane do analizowanych obiektów głównych. Przyjrzenie się większej liczbie komórek pozwala na pierwszy reprezentatywny i obiektywny widok, ale liczbę komórek do zbadania można zawęzić, bramkując na tych pomiarach, które trwają co najmniej 140 cykli i zawierają dużą maksymalną intensywność histonu H dwa GFP. Wybierz interesujący Cię ślad komórkowy, aby uwidocznić histon H, dwie fluorescencyjne gwiazdy GFP i TMR jednocześnie na poziomie pojedynczej komórki.

Za pomocą prawego przycisku myszy kliknij interesującą Cię komórkę i wygeneruj obraz, który można wyeksportować. Galeria ilustrująca histon H, dwa GFP i kolarstwo B snap TMR star za każdym razem. Zmień tryb populacji w oprogramowaniu do analizy skanera i bramkuje obszar, w którym komórka zainteresowania jest reprezentowana na plamie kropkowej.

Zastosuj nowe okno wykresu punktowego do obszaru bramkowanego i zwizualizuj średnią intensywność fluorescencji gwiazdy TMR w czasie. Eksport danych do programu Microsoft Excel w celu dalszych obliczeń. Rysunki tutaj przedstawiają kinetykę cykliny B reprezentowaną przez krzywą intensywności fluorescencji gwiazdy TMR komórki, która przechodzi przez regularną mitozę bez oznak niewspółosiowości chromosomów po zagęszczeniu cytoplazmy po rozpadzie otoczki jądrowej lub NEBD, jak wskazano czerwonym trójkątem, intensywność fluorescencji gronkowca TMR wykazuje nagły wzrost, aż do osiągnięcia okna izomorficznego.

Kiedy komórka wchodzi w prometafazę, intensywność fluorescencji pozostaje na stabilnym poziomie tak długo, jak długo komórka przechodzi przez profazę i metafazę, a następnie zaczyna gwałtownie spadać. Gdy wszystkie chromosomy utworzą stabilną płytkę metafazową, krople te poprzedzają separację chromosomów. Podczas anafazy wskazanej niebieską kropką na krzywej w późnej mitozie, chromatyna zaczyna się dekondensować, a komórka przyjmuje morfologię fazową.

Podczas gdy krzywa intensywności fluorescencji zbliża się do plateau, który jest niższy niż plateau przed mitozą Po jego rozwoju. Technika ta utorowała drogę naukowcom zajmującym się mitozą do zbadania ścisłej równowagi między cyklem, degradacją i syntezą, która reguluje progresję mitotyczną.