Name: Badanie proteolizy cykliny B na poziomie pojedynczej komórki w całych populacjach komórek (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-09-17T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 54 s
Description: Poznaj metodę monitorowania proteolizy cykliny B w żywych komórkach za pomocą fluorescencyjnego reportera SNAP i mikroskopii. Technika ta umożliwia badanie kinetyki degradacji cykliny B podczas mitozy na poziomie pojedynczej komórki.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Jesteśmy wdzięczni S. Taylor za udostępnienie plazmidu pLPCX-Histone H2-GFP. Dziękujemy R. Mertelsmann za nieustanne wsparcie. Praca ta była finansowana przez Deutsche Forschungsgemeinschaft.

1. Wysiewanie komórek reporterowych Cyclin B-SNAP opartych na linii U2OS (komórki klonu 11 6) na szkiełkach przedmiotowych z komorą do mikroskopu
<ol>
	<li>Poddać trypsynizacji subkonfluentne komórki reporterowe SNAP, którym pozwolono rosnąć asynchronicznie w fazie logarytmicznej przez co najmniej 48 hr.</li>
	<li>Pracować z komorami mikroskopowymi z 8 dołkami (zapewnia to stały rozkład komórek).</li>
</ol>
Aby wysiać komórki do 8-dołkowych komór mikroskopowych przy zachowaniu stałego rozkładu na całej powierzchni komory, odwiruj 10 000 komórek i resuspenduj je w 350 μl zwykłej pożywki wzrostowej bez czerwieni fenolowej (uzupełnionej o 10% płodowej surowicy bydlęcej, penicylinę/streptomycynę i pirogronian sodu). Przenieś zawiesinę komórkową do komory mikroskopowej (Rysunek 2).
Praca z komorami mikroskopowymi z 8 dołkami (maksymalna gęstość komórek w centrum).
Aby wysiać komórki z większą gęstością w centrum komory mikroskopowej, napełnić komorę 300 μl normalnego pożywki wzrostowej bez czerwieni fenolowej. Ostrożnie dodać 5 000 komórek do centrum komory mikroskopowej (Rysunek 2).
Praca z 96-dołkowymi płytkami do specjalnej optyki (stały rozkład komórek).
W celu wysiewania komórek na płytki 96-dołkowe z zapewnieniem stałego rozkładu na całej powierzchni dołka, odwiruj 5 000 komórek i resuspenderuj w 300 μl standardowej pożywki wzrostowej bez czerwieni fenolowej. Przenieś zawiesinę komórkową na płytkę 96-dołkową. W zależności od wymaganej całkowitej liczby dołków z komórkami, dostosuj liczbę komórek oraz całkowitą objętość pożywki do resuspensji (Rycina 2).
Praca z 96-dołkowymi płytkami do specjalnej optyki (maksymalna gęstość komórek w centrum).
W celu wysiania komórek na płytki 96-dołkowe, należy ostrożnie dodać 1 500 komórek w 15 μl normalnej pożywki wzrostowej bez czerwieni fenolowej w postaci małej kropli do środka każdego dołka, aby ograniczyć wzrost komórek do centrum dołka (Rycina 2).
<ol start="3">
	<li>Pozostawić zasiane komórki do wzrostu przez co najmniej 18 hr w standardowych warunkach hodowli komórkowej (37 °C, 100% wilgotności powietrza, 5% CO2).</li>
</ol>
2. Barwienie komórek reporterowych substratem SNAP
<ol>
	<li>Na 30 min przed rozpoczęciem procedury barwienia należy ogrzać alikwoty normalnej pożywki wzrostowej bez czerwieni fenolowej do 37 °C.</li>
	<li>W celu łatwiejszego dozowania substratu SNAP (w naszym przypadku TMR Star), należy rozpuścić TMR Star w DMSO do uzyskania stężenia w roztworze stokowym wynoszącego 400 μM; roztwór ten można przechowywać w temperaturze -20 °C.</li>
	<li>Przed barwieniem należy rozcieńczyć 0,5 μl roztworu stokowego TMR Star w 200 μl normalnej pożywki wzrostowej bez czerwieni fenolowej (37 °C), aby uzyskać końcowe stężenie znakowania wynoszące 1 μM.</li>
	<li>Z komórek rosnących asynchronicznie należy usunąć normalną pożywkę wzrostową i inkubować je w pożywce do znakowania przez 25 min w standardowych warunkach hodowli.</li>
	<li>Należy usunąć pożywkę do znakowania i przemyć komórki czterokrotnie normalną pożywką wzrostową bez czerwieni fenolowej (37 °C). Komórki należy inkubować w 300 μl normalnej pożywki wzrostowej bez czerwieni fenolowej (37 °C) przez 30 min. Przed przeniesieniem do mikroskopu należy wymienić pożywkę na świeżą normalną pożywkę wzrostową bez czerwieni fenolowej (37 °C), aby usunąć pozostałości niezwiązanego substratu SNAP.</li>
	<li>Komórki należy transportować do mikroskopu w pudełku styropianowym na wstępnie ogrzanym (37 °C) bloku grzejnym, aby zminimalizować wahania temperatury.</li>
</ol>
3. Pomiar intensywności fluorescencji
<ol>
	<li>Na dwie godziny przed analizą ustaw temperaturę powietrza w komorze klimatycznej na 37 °C w trybie suchego powietrza, aby doprowadzić cały mikroskop wraz ze wszystkimi jego komponentami do pożądanej temperatury. Wstępne podgrzanie przed ustawieniem wilgotności jest istotne, aby uniknąć kondensacji i w konsekwencji uszkodzenia mikroskopu.</li>
	<li>Przed rozpoczęciem analizy ustaw wilgotność powietrza na 60% oraz stężenie CO2 na 5%.</li>
	<li>Uruchom oprogramowanie Scan^R Acquisition i zdefiniuj standardowe ustawienia (patrz Tabela 1).</li>
	<li>Zdefiniuj pozycje studzienek przeznaczonych do analizy.</li>
	<li>Zdefiniuj Δt (czas cyklu akwizycji) oraz absolutną liczbę cykli akwizycji.</li>
	<li>Jeśli planowana jest analiza większej liczby studzienek, wybierz sprzętowy autofokus; w przeciwnym razie wystarczy zastosować sam autofokus programowy.</li>
	<li>Rozpocznij akwizycję i nadzoruj pierwsze dwa cykle. Mikroskop ustawi ostrość na sygnał histony H2-GFP, a następnie wykona pierwszy obraz w tym kanale przed zmianą filtra i zarejestrowaniem odpowiadającego mu obrazu TMR Star (Rycina 3). Procedura ta jest powtarzana dla wszystkich pozycji w obrębie studzienki oraz dla każdej z badanych studzienek, a następnie cały cykl zostaje powtórzony.</li>
</ol>
4. Analiza profili proteolitycznych przy użyciu Scan^R
<ol>
	<li>Uruchom oprogramowanie Scan^R Analysis i przeanalizuj obrazy, definiując jądra komórkowe widoczne dzięki histonie H2-GFP jako obiekty główne, stosując próg oparty na intensywności sygnału oraz algorytm watershed w celu oddzielenia sąsiadujących komórek. Do analizy TMRstar należy utworzyć subobiekt składający się z jądra wraz z cytoplazmą. (Kluczowymi właściwościami obiektu głównego są pozycje X i Y, czas oraz maksymalna i średnia intensywność GFP dla obiektu głównego, a także całkowita intensywność podzielona przez pole powierzchni dla subobiektu TMRstar). Ze względu na duże ilości danych proces analizy ten może potrwać kilka godzin.</li>
	<li>Przejdź do trybu śledzenia (trace mode), aby zwizualizować średnią intensywność fluorescencji TMR Star subobiektu w czasie (ślady komórkowe) przypisaną do analizowanych obiektów głównych (Rysunek 4). Liczbę badanych komórek można ograniczyć poprzez bramkowanie pomiarów trwających co najmniej 140 cykli i charakteryzujących się wysoką maksymalną intensywnością H2-GFP. Analiza większej liczby komórek pozwala na uzyskanie pierwszej reprezentatywnej i obiektywnej oceny (Rysunek 4).</li>
	<li>Wybierz interesujący ślad komórkowy, aby jednocześnie zwizualizować fluorescencję histony H2-GFP i TMR Star na poziomie pojedynczej komórki (Rysunek 5A).</li>
	<li>Kliknij prawym przyciskiem myszy na wybranej komórce i wygeneruj eksportowalną galerię obrazów ilustrujących histon H2-GFP oraz cyklinę B-SNAP TMR Star dla każdego punktu czasowego.</li>
	<li>Przełącz oprogramowanie Scan^R Analysis w tryb populacyjny i obramuj obszar (gate), w którym wybrana komórka jest reprezentowana na wykresie kropkowym X vs. Y (Rysunek 5B).</li>
	<li>Zastosuj nowe okno wykresu kropkowego do obramowanego obszaru i zwizualizuj średnią intensywność fluorescencji TMR Star w czasie (Rysunek 5C).</li>
	<li>Wyeksportuj dane (czas i intensywność fluorescencji) do programu Microsoft Excel w celu dalszych obliczeń.</li>
</ol>
5. Reprezentatywne wyniki
Rysunki 5D i 5E przedstawiają kinetykę cykliny B, reprezentowaną przez krzywą intensywności fluorescencji TMR Star, w komórce przechodzącej prawidłową mitozę bez oznak nieprawidłowego ustawienia chromosomów (Rysunek 5E). Po zagęszczeniu cytoplazmy następującym po rozpadzie otoczki jądrowej (NEBD, zaznaczonym czerwonym trójkątem), intensywność fluorescencji TMR Star wykazuje gwałtowny wzrost aż do osiągnięcia okna izomorficznego (jaśniejszy obszar na schemacie), gdy komórka wchodzi w prometafazę 6. Intensywność fluorescencji utrzymuje się na stabilnym poziomie tak długo, jak komórka przechodzi przez profazę i metafazę, a następnie zaczyna gwałtownie spadać, gdy wszystkie chromosomy utworzą stabilną płytkę metafazową (Rysunki 5D i 5E). Spadek ten poprzedza rozdzielenie chromosomów podczas anafazy (niebieska kropka na krzywej). W późnej fazie mitozy chromatyna zaczyna się rozpraszać (niebieskie paski), a komórka przyjmuje morfologię charakterystyczną dla interfazu, podczas gdy krzywa intensywności fluorescencji dąży do plateau, która jest niższa od plateau sprzed mitozy (Rysunki 5D i 5E).
<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Ustawienia autofokusu</td>
			<td>Histona H2-GFP (ustawienia akwizycji głównego obiektu)</td>
			<td>Cyklina B-SNAP znakowana TMR Star 
			(ustawienia akwizycji)</td>
			<td>Czas cyklu akwizycji Powtórzenia</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wstępne ustawianie ostrości +/-39 μm 24 warstwy 
			Precyzyjne ustawianie ostrości 
			+/-5.4 μm 14 warstw</td>
			<td>zestaw filtrów GFP: 
			Czas ekspozycji: 100 msec 
			Natężenie światła: 25%</td>
			<td>zestaw filtrów TRITC: 
			Czas naświetlania: 150 ms 
			Intensywność światła: 33,3%</td>
			<td>od 2 do 5 min.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>zestaw filtrów GFP: 
			Czas naświetlania: 12 ms 
			Intensywność światła: 12,5%</td>
			<td> </td>
			<td> </td>
			<td>Do 48 h ciągłej analizy (ograniczonej przez obniżoną wilgotność powietrza wynoszącą 60%)</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 1. Standardowe ustawienia stosowane do analizy proteolizy cykliny B. Histona H2-GFP została wykorzystana jako struktura referencyjna do zdefiniowania płaszczyzny ogniskowania dla pomiaru intensywności fluorescencji cykliny B-SNAP. Intensywność światła podczas procedury ogniskowania jest niższa w porównaniu do ustawień akwizycji obrazu, aby uniknąć kumulatywnej fototoksyczności.
<img alt="Schemat procesu proteolizy cykliny B-SNAP przedstawiający szlak APC/C, znakowanie TMR Star, fluorescencję." src="/files/ftp_upload/4239/4239fig1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 1"> 
 Rysunek 1. Schemat pomiaru proteolizy cykliny B poprzez ekspresję chimerycznej pochodnej cykliny B o charakterystyce degradacji zbliżonej do białka endogennego. Spadek intensywności fluorescencji po znakowaniu metodą pulse-chase jest miarą aktywności APC/C.
<img alt="Schemat technik wysiewania komórek; przygotowanie zawiesiny komórkowej, przygotowanie pożywki, proces pipetowania." src="/files/ftp_upload/4239/4239fig2.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 2"> 
 Rysunek 2. Analiza komórek na szkiełkach z 8 dołkami lub płytkach 96-dołkowych. Równomierny rozkład komórek na powierzchni dołka uzyskuje się poprzez resuspensję w końcowej objętości 300 μl; jest to zalecane w przypadku, gdy do analizy definiuje się ręcznie tylko jedną lub kilka pozycji. Zagęszczenie komórek w regionie centralnym uzyskuje się poprzez dodanie komórek do centrum wypełnionych lub pustych dołków. Technika ta jest zalecana w przypadku zautomatyzowanego pozyskiwania obrazów z różnych dołków.
<img alt="Schemat mikroskopii fluorescencyjnej: filtry GFP, TRITC; intensywność Histone H2-GFP, Cyclin B-SNAP/TMR Star." src="/files/ftp_upload/4239/4239fig3.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 3"> 
 Rycina 3. Sekwencja akwizycji danych. A) Detekcja histone H2-GFP służy do zdefiniowania płaszczyzny ogniskowania oraz monitorowania ustawienia chromosomów podczas mitozy. B) Intensywność fluorescencji TMR Star jest miarą bezwzględnej ilości cyclin B-SNAP znakowanej metodą pulse-chase.
<img alt="Wykres intensywności fluorescencji i mikroskopia dla analizy wyrównania chromosomów i fluorescencji." src="/files/ftp_upload/4239/4239fig4.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 4"> 
 Rycina 4. Reprezentacyjny obraz średnich intensywności fluorescencji TMR Star (całkowita intensywność TMRstar podzielona przez pole powierzchni) w czasie, wygenerowany przez oprogramowanie Scan^R Analysis. Wybór reprezentatywnego śladu komórki (kolor niebieski). Odpowiadające mu obrazy (po prawej) umożliwiają jednoczesną wizualizację histonu H2-GFP (kolor zielony) i cykliny B-SNAP (kolor czerwony). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/4239/4239fig4large.jpg" target="_blank"> Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną rycinę</a>.
<img alt="Analiza intensywności fluorescencji z bramkowaniem, wykresem szeregów czasowych i obrazami z mikroskopii do eksportu danych." src="/files/ftp_upload/4239/4239fig5.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 5"> 
 Rysunek 5. A+B) Przykład bramkowania punktów reprezentujących analizowaną komórkę na wykresie kropkowym XY. C) Wizualizacja średniej intensywności fluorescencji TMRstar (całkowita intensywność TMRstar podzielona przez pole powierzchni) w czasie z wykorzystaniem wykresu kropkowego. D+E) Reprezentatywna krzywa intensywności fluorescencji cykliny B-SNAP z izomorficznym oknem (jaśniejszy obszar na diagramie) pomiędzy NEBD (rozpadem otoczki jądrowej) a dekondensacją chromatyny (niebieski pasek), wygenerowana w programie Microsoft Excel. Anafaza jest zaznaczona niebieskim punktem na krzywej. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/4239/4239fig5large.jpg" target="_blank"> Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększony rysunek</a>.
Film 1. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/4239/4239movie1.avi" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić dodatkowy film</a>.

<ol><li>Musacchio, A., Salmon, E. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+spindle-assembly+checkpoint+in+space+and+time%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Mol.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">The spindle-assembly checkpoint in space and time.</a> Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 8, 379-393 (2007).</li>
<li>Nasmyth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Segregating+sister+genomes%3A+the+molecular+biology+of+chromosome+separation%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Segregating sister genomes: the molecular biology of chromosome separation.</a> Science. 297, 559-565 (2002).</li>
<li>Cahill, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mutations+of+mitotic+checkpoint+genes+in+human+cancers%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Mutations of mitotic checkpoint genes in human cancers.</a> Nature. 392, 300-303 (1998).</li>
<li>Lengauer, C., Kinzler, K. W., Vogelstein, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+instabilities+in+human+cancers%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Genetic instabilities in human cancers.</a> Nature. 396, 643-649 (1998).</li>
<li>Fletcher, D. A., Mullins, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+mechanics+and+the+cytoskeleton%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Cell mechanics and the cytoskeleton.</a> Nature. 463, 485-4892 (2010).</li>
<li>Schnerch, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monitoring+APC%2FC+activity+in+the+presence+of+chromosomal+misalignment+in+unperturbed+cell+populations%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Cycle%22%5BJournal%5D)">Monitoring APC/C activity in the presence of chromosomal misalignment in unperturbed cell populations.</a> Cell Cycle. 11, (2012).</li>
<li>Keppler, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+general+method+for+the+covalent+labeling+of+fusion+proteins+with+small+molecules+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">A general method for the covalent labeling of fusion proteins with small molecules in vivo.</a> Nat. Biotechnol. 21, 86-869 (2003).</li>
<li>Jansen, L. E., Black, B. E., Foltz, D. R., Cleveland, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Propagation+of+centromeric+chromatin+requires+exit+from+mitosis%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell.+Biol%22%5BJournal%5D)">Propagation of centromeric chromatin requires exit from mitosis.</a> J. Cell. Biol. 176, 795-805 (2007).</li>
<li>Malureanu, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cdc20+hypomorphic+mice+fail+to+counteract+de+novo+synthesis+of+cyclin+B1+in+mitosis%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Cdc20 hypomorphic mice fail to counteract de novo synthesis of cyclin B1 in mitosis.</a> J. Cell Biol. 191, 313-329 (2010).</li>
<li>Mena, A. L., Lam, E. W., Chatterjee, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sustained+spindle-assembly+checkpoint+response+requires+de+novo+transcription+and+translation+of+cyclin+B1%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Sustained spindle-assembly checkpoint response requires de novo transcription and translation of cyclin B1.</a> PLoS One. 5, (2010).</li>
<li>Wolthuis, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cdc20+and+Cks+direct+the+spindle+checkpoint-independent+destruction+of+cyclin%5BTitle%5D)+AND+%22A.+Mol.+Cell%22%5BJournal%5D)">Cdc20 and Cks direct the spindle checkpoint-independent destruction of cyclin.</a> A. Mol. Cell. 30, 290-302 (2008).</li>
</ol>

Nie zadeklarowano żadnych konfliktów interesów.

Przedstawiamy tutaj podejście oparte na obrazowaniu żywych komórek, które umożliwia jednoczesne monitorowanie proteolizy cykliny B oraz ustawienia chromosomów. Metoda ta pozwala na badanie kontroli mitozy w niezakłóconych populacjach komórek na poziomie pojedynczej komórki. Krzywe degradacji cykliny B umożliwiają bezpośredni wgląd w aktywność APC/C, a tym samym pośrednio odzwierciedlają stan SAC 6.
To podejście, mimo że opracowane w oparciu o oprogramowanie Scan^R, można łatwo odtw...

<table><tbody><tr><td>Linia komórek reporterowych</td><td>stworzona wewnętrznie zgodnie z opisem &lt;sup&gt;6&lt;/sup&gt;</td><td>komórki reporterowe klonu 11&lt;br/&gt; (komórki oparte na linii U2Os ekspresujące cyclin B-SNAP)</td><td></td></tr><tr><td>Retrowirusowy wektor ekspresyjny cyclin B-SNAP</td><td>stworzony wewnętrznie zgodnie z opisem &lt;sup&gt;6&lt;/sup&gt;</td><td>pLNCX2-cyclin B mut5-SNAP</td><td></td></tr><tr><td>DMEM bez czerwieni fenolowej</td><td>Gibco</td><td>21063-029</td><td>Wymagana suplementacja FCS, pirogronianem sodu oraz penicyliną/streptomycyną</td></tr><tr><td>SNAP-Cell TMR-Star</td><td>New England Biolabs</td><td>S9105S</td><td>Roztwór zapasowy 400 &amp;mu;M w DMSO</td></tr><tr><td>Specjalna płytka Opstics, 96 dołków</td><td>Costar</td><td>3720</td><td></td></tr><tr><td>&amp;mu;-Slide 8 dołków, ibiTreat</td><td>Ibidi</td><td>80826</td><td></td></tr><tr><td>Urządzenie mikroskopowe</td><td>Olympus</td><td>mikroskop odwrócony IX-81 z komorą klimatyczną</td><td></td></tr><tr><td>Obiektyw</td><td>Olympus</td><td>obiektyw UPLSAPO 20x (N.A. 0,75)</td><td></td></tr><tr><td>Oprogramowanie do akwizycji</td><td>Olympus</td><td>oprogramowanie do akwizycji Scan^R (v.2.2.09)</td><td></td></tr><tr><td>Oprogramowanie do analizy</td><td>Olympus</td><td>oprogramowanie do analizy Scan^R (v.1.2.0.6)</td><td></td></tr></tbody></table>

badanie proteolizy cykliny b na poziomie pojedynczej komórki w populacjach całych komórek

Studying Proteolysis of Cyclin B at the Single Cell Level in Whole Cell Populations

Równomierny rozdział chromosomów między dwie komórki potomne podczas podziału komórkowego jest warunkiem koniecznym dla zapewnienia stabilności genetycznej 1. Błędy podczas segregacji chromosomów są cechą charakterystyczną dla procesów nowotworowych i wiążą się z progresją choroby 2-4. Punkt kontrolny zgrupowania wrzeciona (SAC) jest mitotycznym mechanizmem nadzorczym, który wstrzymuje komórki w metafazie do momentu, aż każdy pojedynczy chromosom ustanowi stabilne dwubiegunowe połączenie z wrzecionem podziałowym1. SAC pełni swoją funkcję poprzez interferencję z aktywującą podjednostką APC/C Cdc20, co blokuje proteolizę sekuryny i cykliny B, a tym samym uniemożliwia separację chromosomów i wyjście z mitozy. Nieprawidłowe przytwierdzenie chromosomów zapobiega wyciszeniu sygnalizacji SAC i powoduje ciągłe hamowanie APC/CCdc20 , aż do rozwiązania problemu, aby uniknąć błędnej segregacji chromosomów, aneuploidii i rozrostów nowotworowych1.
Większość badań dotyczących wpływu nieprawidłowego przyczepienia chromosomów na proteolizę zależną od APC/C wykorzystywała zaburzenia wrzeciona za pomocą leków depolimeryzujących lub stabilizujących mikrotubule, aby zakłócić przyczepienie chromosomów do mikrotubul. Ponieważ ingerencja w kinetykę mikrotubul może wpływać na transport i lokalizację kluczowych regulatorów, procedury te niosą ryzyko wywołania efektów sztucznych 5.
Aby zbadać, w jaki sposób SAC zakłóca zależną od APC/C proteolizę cykliny B podczas mitozy w niezakłóconych populacjach komórek, opracowaliśmy system oparty na histonie H2-GFP, który umożliwił jednoczesne monitorowanie ustawienia chromosomów mitotycznych w metafazie oraz proteolizy cykliny B 6.
Aby zobrazować profile proteolityczne, stworzyliśmy chimeryczną cząsteczkę reporterową cykliny B z domeną SNAP na C-końcu 6 (Rysunek 1). W reakcji samoznakowania domena SNAP jest w stanie tworzyć wiązania kowalencyjne z nośnikami alkilguaniny (substratem SNAP) 7,8 (Rysunek 1). Cząsteczki substratu SNAP są łatwo dostępne i niosą szerokie spektrum różnych fluorochromów. Chimeryczne cząsteczki cykliny B-SNAP zostają znakowane po dodaniu do medium wzrostowego przenikającego przez błony substratu SNAP 7 (Rysunek 1). Po reakcji znakowania intensywność fluorescencji cykliny B-SNAP spada w sposób przypominający reakcję typu pulse-chase, a intensywność fluorescencji odzwierciedla poziom degradacji cykliny B 6 (Rysunek 1). Nasz system ułatwia monitorowanie mitotycznej proteolizy zależnej od APC/C w dużej liczbie komórek (lub w kilku populacjach komórek) równolegle. W związku z tym system ten może być cennym narzędziem do identyfikacji czynników/małych cząsteczek zdolnych do zakłócania aktywności proteolitycznej podczas przejścia z metafazy do anafazy. Ponadto, ponieważ niedawno zasugerowano, że synteza cykliny B podczas mitozy jest istotnym mechanizmem sprzyjającym blokadzie mitotycznej u myszy i ludzi poprzez utrzymywanie stabilnych poziomów ekspresji cykliny B 9,10, system ten umożliwił nam analizę proteolizy cykliny B jako jednego z elementów zrównoważonej równowagi 6.

Przejście z metafazy do anafazy jest inicjowane poprzez zależną od kompleksu anafazy-promującego (APC/C) ubikwitynację i następującą po niej degradację cykliny B. W niniejszej pracy opracowaliśmy system, który po zastosowaniu znakowania metodą pulse-chase umożliwia monitorowanie proteolizy cykliny B w całych populacjach komórek oraz ułatwia wykrywanie interferencji wywołanej przez punkt kontrolny mitozy.

Badanie proteolizy cykliny B na poziomie pojedynczej komórki w populacjach całych komórek

Równomierny rozkład chromosomów między dwiema komórkami potomnymi podczas podziału komórki jest warunkiem koniecznym do zapewnienia stabilności genetycznej 1. Błędy...

Celem niniejszej procedury jest monitorowanie wpływu proteolizy cykliny B na rozpoczęcie anafazy i wyjście z mitozy. Jest to realizowane poprzez najpierw wysianie komórek z reporterem snap cykliny B na szkiełkach mikroskopowych. W drugim kroku chimeryczna cząsteczka reportera snap cykliny B jest znakowana fluorescencyjnym substratem TMR star.Następnie, w stacji mikroskopowej, przeprowadza się akwizycję serii obrazów. Końcowym krokiem jest analiza komórek i obliczenie natężenia fluorescencji TMR star w czasie, co odzwierciedla proteolizę cykliny B. W rezultacie mikroskopia immunofluorescencyjna żywych komórek raportujących pozwala ujawnić kinetykę proteolizy cykliny B zachodzącą podczas mitozy.Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak monitorowanie cyclone BGFP, jest to, że cyclone B SNAP umożliwia monitorowanie degradacji cyclone B, a nie ekspresji całego białka. Komórki reporterowe snap do tego eksperymentu są początkowo hodowane asynchronicznie w fazie logarytmicznej przez co najmniej 48 godzin. Na początek, w celu wysiania komórek, stosuje się procedurę z użyciem trypsyny dla subkonfluencyjnych komórek reporterowych snap, aby wysiać je do ośmiogniazdkowych komór mikroskopowych, zapewniając stały rozkład na całej powierzchni komory wirówki.10 000 komórek i resuspends w 350 µL normalnego medium wzrostowego bez czerwieni fenolowej. Przenieś zawiesinę komórkową do komory mikroskopowej w celu wysiania komórek do ośmiogniazdkowych komór mikroskopowych, zapewniając maksymalną gęstość komórek w centrum komory. W pierwszej kolejności napełnij komorę 300 µL normalnego medium wzrostowego bez czerwieni fenolowej.Następnie, w celu wysiania komórek na specjalne optyczne płytki 96-dołkowe, ostrożnie dodaj 5 000 komórek do centrum komory mikroskopowej, zapewniając stałą dystrybucję na całej powierzchni dołka. Odwiruj 5 000 komórek i resuspenduj w 300 µL normalnej pożywki wzrostowej bez czerwieni fenolowej, zależnie od całkowitej liczby wymaganych dołków zawierających komórki. Dostosuj liczbę komórek oraz całkowitą objętość medium zawiesiny.Następnie przenieś zawiesinę komórek do płytki 96-dołkowej w celu wysiania komórek na specjalne płytki optyczne 96-dołkowe, tak aby uzyskać maksymalną gęstość komórek w centrum dołka. Ostrożnie nanieś 1 500 komórek w 15 µL normalnej pożywki wzrostowej bez czerwieni fenolowej w postaci małej kropli do centrum każdego dołka.Dzięki temu wzrost komórek zostanie ograniczony do centrum studzienki. Przed rozpoczęciem procedury barwienia pozwolić wszystkim wysianym komórkom na wzrost przez co najmniej 18 godzin w standardowych warunkach hodowli komórkowej. Podgrzać aliquoty standardowej pożywki wzrostowej bez czerwieni fenolowej do 37°C.Substrat snap zastosowany w tej demonstracji to TMR star. W celu łatwiejszej obsługi rozpuszczono TMR star w DMSO, aby uzyskać roztwór zapasowy o stężeniu 400 µM. Następnie 0,5 µl roztworu zapasowego TMR star rozcieńczono w 200 µl podgrzanej, normalnej pożywki wzrostowej wolnej od czerwieni fenolowej, aby uzyskać końcowe stężenie znakowania wynoszące 1 µM. Następnie usunięto normalną pożywkę wzrostową z asynchronicznie rosnących komórek i zastąpiono ją pożywką znakującą. Komórki inkubowano w pożywce znakującej przez 25 minut w standardowych warunkach hodowli.Po 25 minutach usunąć medium do znakowania i przemyć komórki czterokrotnie ciepłym, normalnym medium wzrostowym bez czerwieni fenolowej. Po ostatnim przemyciu inkubować komórki w 300 microliters ciepłego, normalnego medium wzrostowego bez czerwieni fenolowej przez 30 minut przed transportem do mikroskopu. Wymienić medium na świeże, ciepłe, normalne medium wzrostowe bez czerwieni fenolowej, aby usunąć pozostałości niezwiązanego substratu snaps; transportować komórki do mikroskopu w pudełku styropianowym na wstępnie podgrzanym bloku grzejnym o temperaturze 37 degree Celsius.Aby zminimalizować wahania temperatury, na dwie godziny przed pomiarem intensywności fluorescencji należy ustawić temperaturę powietrza w komorze klimatycznej na 37 °C w trybie osuszania, aby doprowadzić mikroskop i wszystkie jego komponenty do pożądanej temperatury. W celu uniknięcia kondensacji i wynikającego z niej uszkodzenia mikroskopu, ważne jest przeprowadzenie wstępnego podgrzewania przed ustawieniem wilgotności.Gdy cały system mikroskopowy osiągnie temperaturę 37 °C, należy ustawić wilgotność powietrza na 60% oraz stężenie dwutlenku węgla na 5%. Uruchom oprogramowanie do skanowania lub akwizycji i zdefiniuj standardowe ustawienia. Określ pozycje studni przeznaczonych do analizy. Zdefiniuj wartość delta T lub czas cyklu akwizycji oraz całkowitą liczbę cykli akwizycji.W tej demonstracji automatyczny autofocus sprzętowy został wybrany w celu analizy większej liczby studzienek. Rozpocznij akwizycję i nadzoruj pierwsze dwa cykle pozyskiwania danych.Mikroskop zostanie ustawiony na sygnał GFP histony H2, a następnie zostanie wykonane pierwsze zdjęcie w tym kanale, przed zmianą filtra i wykonaniem odpowiadającego mu zdjęcia TMR star. Procedura ta jest powtarzana dla wszystkich pozycji w obrębie jednej studzienki oraz dla każdej z badanych studzienek przed rozpoczęciem kolejnego cyklu. W celu analizy profili proteolitycznych należy uruchomić oprogramowanie analityczne scan R.Przeanalizuj obrazy z jądrami komórkowymi uwidocznionymi za pomocą histony H2 GFP, definiując je jako główne obiekty przy użyciu progu opartego na intensywności sygnału oraz algorytmu watershed, aby wspomóc separację sąsiadujących komórek. Do analizy TMR* należy utworzyć subobiekt składający się z jądra wraz z cytoplazmą. Istotnymi właściwościami głównego obiektu są pozycje X i Y, czas oraz maksymalna i średnia intensywność GFP dla głównego obiektu, a także całkowita intensywność podzielona przez powierzchnię.W przypadku podobiektu TMR star przełącz na tryb śledzenia (trace mode), aby zwizualizować średnią intensywność fluorescencji TMR star podobiektu w czasie lub ślady komórek przypisane do analizowanych obiektów głównych. Analiza większej liczby komórek pozwala na uzyskanie pierwszej reprezentatywnej i obiektywnej oceny, jednak liczbę badanych komórek można ograniczyć, stosując bramkowanie (gating) dla pomiarów trwających co najmniej 140 cykli i charakteryzujących się wysoką maksymalną intensywnością histone H two GFP. Wybierz interesujący ślad komórkowy, aby jednocześnie zwizualizować fluorescencję histone H two GFP oraz TMR star na poziomie pojedynczej komórki.Używając prawego przycisku myszy, kliknij wybraną komórkę i wygeneruj obraz do eksportu. Galeria ilustrująca histone H2 GFP oraz cycling B snap TMR star dla każdego punktu czasowego. Przełącz oprogramowanie analityczne skanera w tryb populacyjny i zaznacz obszar na wykresie kropkowym (dot blot), w którym znajduje się wybrana komórka.Zastosuj nowe okno wykresu kropkowego (dot plot) do bramowanego obszaru i zwizualizuj średnią intensywność fluorescencji TMR star w czasie. Eksportuj dane do programu Microsoft Excel w celu przeprowadzenia dalszych obliczeń. Przedstawione tutaj ryciny obrazują kinetykę cykliny B, reprezentowaną przez krzywą intensywności fluorescencji TMR star komórki przechodzącej przez prawidłową mitozę, bez oznak nieprawidłowego ułożenia chromosomów podczas kondensacji cytoplazmy po rozpadzie otoczki jądrowej (NEBD), co zaznaczono czerwonym trójkątem; intensywność fluorescencji TMR staph wykazuje gwałtowny wzrost aż do momentu osiągnięcia okna izomorficznego.Gdy komórka wchodzi w prometafazę, intensywność fluorescencji utrzymuje się na stabilnym poziomie, dopóki komórka przechodzi przez profazę i metafazę, a następnie zaczyna gwałtownie spadać. Gdy wszystkie chromosomy utworzą stabilną płytkę metafazową, spadek ten poprzedza separację chromosomów. Podczas anafazy, zaznaczonej niebieską kropką na krzywej w późnej mitozie, chromatyna zaczyna się dekondensować, a komórka przyjmuje morfologię charakterystyczną dla tej fazy.Podczas gdy krzywa intensywności fluorescencji zbliża się do plateau, które jest niższe od plateau przed mitozą po jej rozpoczęciu. Technika ta utorowała drogę badaczom zajmującym się mitozą do zgłębienia ścisłej równowagi między cyklem, degradacją a syntezą, która reguluje przebieg mitozy.

studying-proteolysis-cyclin-b-at-single-cell-level-whole-cell

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Badanie proteolizy Cykliny B na poziomie pojedynczej komórki w całej populacji komórek

Reportery oparte na FRET są coraz częściej wykorzystywane do monitorowania aktywności kinaz i fosfataz w żywych komórkach. W niniejszej pracy opisujemy metodę wykorzystania reporterów opartych na FRET do oceny zmian w fosforylacji celu zależnych od cyklu komórkowego.

Monitorowanie aktywności kinaz i fosfataz w cyklu komórkowym za pomocą ratiometrycznego FRET

Wyznaczanie pozycji w cyklu komórkowym populacji komórek lub zrozumienie wpływu sygnałów na proliferację można łatwo zmierzyć za pomocą cytometrii przepływowej, stosując niniejszy protokół. Przedstawiamy proste podejście eksperymentalne do barwienia komórek i ilościowego określania ich pozycji w cyklu komórkowym.

Analiza pozycji cyklu komórkowego w komórkach ssaków

Aby zbadać związek między homeostazą białek, stresem i starzeniem się, monitorowaliśmy zmiany w fałdowaniu białek, śledząc dysfunkcję białek, lokalizację białek w komórce i stabilność białek na poziomie organizmu, komórkowym i białkowym, używając genetycznie wykonalnego metazoanu Caenorhabditis elegans jako systemu modelowego.

Wykorzystanie Caenorhabditis elegans jako systemu modelowego do badania homeostazy białek w organizmie wielokomórkowym

Zgłaszamy urządzenie i nową metodę badania komórek i embrionów. Pojedyncze komórki są precyzyjnie uporządkowane w układach mikrownękowych. Ich uwięzienie w 3D jest krokiem w kierunku środowisk 3D spotykanych w warunkach fizjologicznych i umożliwia orientację organelli. Kontrolując kształt komórki, ta konfiguracja minimalizuje zmienność zgłaszaną w standardowych testach.

Porządkowanie pojedynczych komórek i pojedynczych zarodków w zamknięciu 3D: nowe urządzenie do badań przesiewowych o wysokiej zawartości

Tutaj opisujemy, jak badać mitochondrialną lokalizację kinazy (cyklu komórkowego) i jak określić jej submitochondrialne położenie, a także potencjalne substraty/cele mitochondrialne. Wymuszona ekspresja białek w mitochondriach stanowi użyteczne narzędzie do badania funkcjonalnych konsekwencji mitochondrialnej lokalizacji białka będącego przedmiotem zainteresowania.

Eksperymentalne podejścia do badania lokalizacji mitochondrialnej i funkcji kinazy jądrowego cyklu komórkowego, Cdk1

Obfitość białek odzwierciedla tempo zarówno syntezy białek, jak i ich degradacji. W artykule opisano zastosowanie cykloheksymidu, po którym następuje western blot, do analizy degradacji białek w modelowym jednokomórkowym eukarioncie, Saccharomyces cerevisiae (drożdże pączkujące).

Analiza Cycloheximide Chase degradacji białek u Saccharomyces cerevisiae

Zgłaszamy dwa protokoły synchronizacji komórek, które dostarczają kontekstu do badania zdarzeń związanych z określonymi fazami cyklu komórkowego. Pokazujemy, że to podejście jest przydatne do analizy regulacji określonych genów w niezakłóconym cyklu komórkowym lub po ekspozycji na czynniki wpływające na cykl komórkowy.

Badanie ekspresji genów regulowanej cyklem komórkowym za pomocą dwóch uzupełniających się protokołów synchronizacji komórek

Przedstawiamy protokół podwójnej synchronizacji komórek HeLa z tymidyną, a następnie analizę za pomocą mikroskopii konfokalnej o wysokiej rozdzielczości. Metoda ta jest kluczem do uzyskania dużej liczby komórek, które przechodzą synchronicznie z fazy S do mitozy, umożliwiając badania nad mitotycznymi rolami wielofunkcyjnych białek, które również pełnią funkcje interfazowe.

Połączenie mitotycznej synchronizacji komórek i mikroskopii konfokalnej o wysokiej rozdzielczości w celu zbadania roli wielofunkcyjnych białek cyklu komórkowego podczas mitozy

Kinaza zależna od cykliny 1 (Cdk1) jest aktywowana w fazie G2 cyklu komórkowego i reguluje wiele szlaków komórkowych. W tym miejscu przedstawiamy protokół testu kinazy in vitro z Cdk1, który umożliwia identyfikację miejsc fosforylacji specyficznych dla Cdk1 w celu ustalenia celów komórkowych tej ważnej kinazy.

Identyfikacja miejsc fosforylacji specyficznych dla kinazy 1 zależnej od cykliny za pomocą testu kinazy in vitro

Poniżej opisano dwa podejścia do charakteryzacji zdarzeń polaryzacji komórkowej w limfocytach B podczas formowania IS. Pierwsze obejmuje ilościową analizę rekrutacji organelli i reorganizacji cytoszkieletu w błonie synaptycznej. Drugie to podejście biochemiczne, którego celem jest charakterystyka zmian w składzie centrosomy, która ulega polaryzacji w synapsie immunologicznej.

Badanie dynamiki organelli w komórkach B podczas formowania się synapsy immunologicznej

Protokół ten opisuje dwie metody zatrzymania cyklu komórkowego drożdży oraz opcjonalnego uwalniania oraz rozwija zastosowanie mikroskopii fluorescencyjnej do badania procesów zależnych od cyklu komórkowego u S. cerevisiae.

Manipulacja i analiza procesów zależnych od cyklu komórkowego u drożdży pączkujących

Poznaj metodę monitorowania proteolizy cykliny B w żywych komórkach za pomocą fluorescencyjnego reportera SNAP i mikroskopii. Technika ta umożliwia badanie kinetyki degradacji cykliny B podczas mitozy na poziomie pojedynczej komórki.

Badanie proteolizy cykliny B na poziomie pojedynczej komórki w populacjach całych komórek

Przeglądaj więcej filmów