Badanie proteolizy cykliny B na poziomie pojedynczej komórki w populacjach całych komórek

Celem niniejszej procedury jest monitorowanie, w jaki sposób proteoliza cykliny B reguluje początek anafazy oraz wyjście z mitozy. W pierwszej kolejności komórki z reporterem snap cykliny B są wysiewane na szkiełka mikroskopowe. W drugim kroku chimeryczna cząsteczka reportera snap cykliny B jest znakowana fluorescencyjnym substratem TMR star.

Następnie, na stanowisku mikroskopowym, przeprowadza się akwizycję serii obrazów. Ostatnim krokiem jest analiza komórek i obliczenie intensywności fluorescencji TMR star w czasie, co odzwierciedla proteolizę cykliny B. Ostatecznie mikroskopia immunofluorescencyjna żywych komórek reporterowych pozwala ujawnić kinetykę proteolizy cykliny B zachodzącą podczas mitozy.

Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak monitorowanie cyclone BGFP, jest to, że cyclone B SNAP umożliwia monitorowanie degradacji cyclone B, a nie ekspresji całego białka. Komórki reporterowe snap do tego eksperymentu są początkowo hodowane asynchronicznie w fazie logarytmicznej przez co najmniej 48 godzin. W celu rozpoczęcia, procedura z użyciem trypsyny polega na przygotowaniu podkonfluencyjnych komórek reporterowych snap do wysiania na ośmiodołowe komory mikroskopowe, zapewniając stały rozkład komórek na całej powierzchni komory wirowarki.

10 000 komórek i resuspensję w 350 µL normalnej pożywki wzrostowej bez czerwieni fenolowej. Przenieś zawiesinę komórkową do komory mikroskopowej w celu wysiania komórek do ośmiogrotowych komór mikroskopowych, zapewniając maksymalną gęstość komórek w centrum komory. Najpierw napełnij komorę 300 µL normalnej pożywki wzrostowej bez czerwieni fenolowej.

Następnie, w celu wysiania komórek na specjalne płytki optyczne 96-dołkowe, ostrożnie dodaj 5 000 komórek do centrum komory mikroskopowej, zapewniając stały rozkład na całej powierzchni dołka. Odwirowuj 5 000 komórek i resuspenduj w 300 µL normalnej pożywki wzrostowej bez czerwieni fenolowej, w zależności od całkowitej liczby wymaganych dołków zawierających komórki. Dostosuj liczbę komórek oraz całkowitą objętość medium zawiesiny.

Następnie przenieś zawiesinę komórek na płytkę 96-dołkową w celu wysiania komórek na specjalne płytki optyczne 96-dołkowe z maksymalną gęstością komórek w centrum dołka. Ostrożnie nanieś 1 500 komórek w 15 µL normalnej pożywki wzrostowej bez czerwieni fenolowej w postaci małej kropli do centrum każdego dołka.

Ograniczy to wzrost komórek do centrum dołka. Przed rozpoczęciem procedury barwienia należy pozwolić wszystkim wysianym komórkom na wzrost przez co najmniej 18 godzin w standardowych warunkach hodowli komórkowej. Podgrzać alikwoty normalnej pożywki wzrostowej bez czerwieni fenolowej do 37 stopni Celsjusza.

Podłożem snap w niniejszej demonstracji jest TMR star; dla ułatwienia obsługi rozpuszczono TMR star w DMSO, aby uzyskać roztwór zapasu o stężeniu 400 µM. Następnie 0,5 µL roztworu zapasu TMR star rozcieńczono w 200 µL podgrzanego, normalnego podłoża wzrostowego bez czerwieni fenolowej, aby uzyskać końcowe stężenie znakowania wynoszące 1 µM. Następnie usunięto normalne podłoże wzrostowe z komórek rosnących asynchronicznie i zastąpiono je podłożem do znakowania. Komórki inkubowano w podłożu do znakowania przez 25 minut w standardowych warunkach hodowli.

Po 25 minutach usunąć medium do znakowania i przemyć komórki czterokrotnie ciepłym standardowym medium wzrostowym bez czerwieni fenolowej. Po ostatnim przemyciu inkubować komórki w 300 µL ciepłego standardowego medium wzrostowego bez czerwieni fenolowej przez 30 minut przed przeniesieniem pod mikroskop. Wymienić medium na świeże, ciepłe standardowe medium wzrostowe bez czerwieni fenolowej, aby usunąć pozostałości niezwiązanego substratu snaps; transportować komórki pod mikroskop w styropianowym pudełku na wstępnie podgrzanym bloku grzewczym o temperaturze 37 °C.

Aby zminimalizować wahania temperatury, na dwie godziny przed pomiarem intensywności fluorescencji należy ustawić temperaturę powietrza w komorze klimatycznej na 37 °C w trybie suchego powietrza, aby doprowadzić mikroskop i wszystkie jego komponenty do pożądanej temperatury. W celu uniknięcia kondensacji i późniejszego uszkodzenia mikroskopu ważne jest przeprowadzenie wstępnego podgrzania przed ustawieniem wilgotności.

Gdy cały system mikroskopowy osiągnie temperaturę 37°C, należy dostosować wilgotność powietrza do 60% oraz stężenie dwutlenku węgla do 5%. Uruchom oprogramowanie do skanowania lub akwizycji i zdefiniuj standardowe ustawienia. Określ położenie studzienek przeznaczonych do analizy. Zdefiniuj wartość delta T lub czas cyklu akwizycji oraz całkowitą liczbę cykli akwizycji.

W tej demonstracji dla analizy większej liczby studzienek wybrano wstępnie sprzętowy autofokus. Uruchom akwizycję i nadzoruj pierwsze dwa cykle akwizycyjne.

Mikroskop zostanie ustawiony na sygnał GFP histony H2, a następnie zostanie wykonane pierwsze zdjęcie w tym kanale, przed zmianą filtra i wykonaniem odpowiadającego mu zdjęcia w kanale TMR star. Procedura ta zostanie powtórzona dla wszystkich pozycji w obrębie jednej studzienki oraz dla każdej z badanych studzienek przed rozpoczęciem kolejnego cyklu. W celu analizy profili proteolitycznych należy uruchomić oprogramowanie analityczne scan R.

Przeanalizuj obrazy z jądrami komórkowymi wizualizowanymi za pomocą histony H2 GFP, definiując je jako obiekt główny przy użyciu progu opartego na intensywności sygnału oraz algorytmu watershed w celu wspomagania separacji sąsiadujących komórek. Do analizy TMR* należy utworzyć subobiekt składający się z jądra wraz z cytoplazmą. Ważnymi właściwościami obiektu głównego są pozycje X i Y, czas oraz maksymalna i średnia intensywność GFP dla obiektu głównego, a także całkowita intensywność podzielona przez powierzchnię.

W przypadku subobiektu TMR star, przełącz na tryb śledzenia (trace mode), aby zwizualizować średnią intensywność fluorescencji TMR star subobiektu w czasie lub ślady komórkowe przypisane do analizowanych obiektów głównych. Analiza większej liczby komórek pozwala na uzyskanie pierwszej reprezentatywnej i obiektywnej oceny, jednak liczbę badanych komórek można ograniczyć poprzez bramkowanie (gating) pomiarów trwających co najmniej 140 cykli i charakteryzujących się wysoką maksymalną intensywnością histony H2 GFP. Wybierz interesujący ślad komórkowy, aby jednocześnie zwizualizować fluorescencję histony H2 GFP oraz TMR star na poziomie pojedynczej komórki.

Kliknij prawym przyciskiem myszy na wybraną komórkę i wygeneruj obraz do eksportu. Galeria ilustrująca histone H2 GFP oraz cycling B snap TMR star dla każdego pojedynczego punktu czasowego. Przełącz oprogramowanie do analizy skanera w tryb populacyjny i wyznacz bramkę dla obszaru, w którym wybrana komórka jest reprezentowana na wykresie punktowym (dot blot).

Zastosuj nowe okno wykresu kropkowego (dot plot) do bramkowanego obszaru i zwizualizuj średnią intensywność fluorescencji TMR star w czasie. Eksportuj dane do programu Microsoft Excel w celu przeprowadzenia dalszych obliczeń. Przedstawione tutaj ryciny obrazują kinetykę cykliny B, reprezentowaną przez krzywą intensywności fluorescencji TMR star komórki przechodzącej regularną mitozę bez oznak błędnego ustawienia chromosomów podczas kondensacji cytoplazmy po rozpadzie otoczki jądrowej (NEBD), co zaznaczono czerwonym trójkątem; intensywność fluorescencji TMR staph wykazuje gwałtowny wzrost aż do osiągnięcia okna izomorficznego.

Gdy komórka wchodzi w prometafazę, intensywność fluorescencji utrzymuje się na stabilnym poziomie, dopóki komórka przechodzi przez profazę i metafazę, a następnie zaczyna gwałtownie spadać. Gdy wszystkie chromosomy utworzą stabilną płytkę metafazową, spadek ten poprzedza rozdzielenie chromosomów. Podczas anafazy, oznaczonej niebieską kropką na krzywej w późnej mitozie, chromatyna zaczyna się dekondensować, a komórka przyjmuje morfologię charakterystyczną dla tej fazy.

Podczas gdy krzywa intensywności fluorescencji zbliża się do plateau, które jest niższe niż plateau przed mitozą po jego rozwinięciu. Technika ta utorowała drogę badaczom zajmującym się mitozą do zgłębienia ścisłej równowagi między cyklami, degradacją i syntezą, która reguluje przebieg mitozy.