Charakterystyka metaboliczna spolaryzowanych makrofagów pochodzących ze szpiku kostnego M1 i M2 przy użyciu analizy strumienia zewnątrzkomórkowego w czasie rzeczywistym

Ogólnym celem tej analizy strumienia zewnątrzkomórkowego jest ocena charakterystyki metabolicznej naiwnych makrofagów M1 i M dwóch spolaryzowanych makrofagów pochodzących ze szpiku kostnego. Metoda ta może służyć jako ramy do badania, w jaki sposób poszczególne cytokiny, związki lub kody genowe wpływają na fenotyp metaboliczny makrofagów. Główną zaletą tej techniki jest to, że wymaga tylko niewielkiej ilości makrofagów.

Co więcej, mierzy wszystkie istotne parametry glikolizy i mitochondriów w jednym teście. Chociaż metoda ta zapewnia wgląd w fenotyp metaboliczny makrofagów pochodzących ze szpiku kostnego, można ją również zastosować do wszystkich typów makrofagów lub komórek odpornościowych. Wpadliśmy na pomysł, aby opublikować tę metodę w J, ponieważ często otrzymujemy prośby od innych naukowców o pomoc w testach przepływu komórkowego dostępu metabolicznego W ósmym dniu hodowli sprawdź obecność dojrzałych makrofagów przez oględziny i inkubuj dojrzałe makrofagi pochodzące ze szpiku kostnego w 10 mililitrach soli fizjologicznej cytrynianu przez pięć minut.

37 stopni Celsjusza, gdy komórki się odłączą. Umyj kulturę 10 mililitrami PBS i policz liczbę żywotnych komórek. Następnie wysiewaj pięć razy po 10 do czwartej komórki na studzienkę.

W hodowli komórkowej XFE 96 należy umieścić mikropłytkę w 100 mikrolitrach pożywki hodowlanej na studzienkę, trzymając pipetę pod kątem mniej więcej w połowie boku każdej studzienki. Aby dozować komórki, dodaj samo podłoże do studzienek korekcyjnych tła A, A 12, H jeden i H 12. Następnie pozwól komórkom osiąść w temperaturze pokojowej w kapturze do hodowli komórkowych przez godzinę.

Po potwierdzeniu hodowli adhezyjnej komórki w inkubatorze z 5% dwutlenkiem węgla o temperaturze 37 stopni Celsjusza. Trzy godziny po posiewie stymulować od czterech do sześciu dołków komórek na stan, w zależności od potrzeb, przez 24 godziny. Aby spolaryzować makrofagi pochodzące ze szpiku kostnego w dniu poprzedzającym test strumienia zewnątrzkomórkowego, umieść wkład czujnika do góry nogami obok płytki użytkowej i dobrze napełnij każdą płytkę 200 mikrolitrami roztworu crin.

Następnie opuść wkład czujnika na płytkę narzędziową, aby zanurzyć czujniki w roztworze Cain i sprawdź, czy poziom roztworu Cain jest wystarczająco wysoki, aby czujnik był zanurzony. Następnie umieść wkład na noc w inkubatorze bez dwutlenku węgla o temperaturze 37 stopni Celsjusza. Następnego dnia delikatnie usuń supernatant ze spolaryzowanych makrofagów i umyj komórki 100 mikrolitrami świeżo przygotowanego testu.

Medium na studzienkę. Dodaj 180 mikrolitrów pożywki testowej do każdej studzienki i użyj mikroskopu, aby sprawdzić, czy komórki nie zostały zmyte. Jeśli komórki są nadal połączone, umieść płytkę w inkubatorze bez dwutlenku węgla o temperaturze 37 stopni Celsjusza na godzinę przed testem, podczas gdy komórki są w inkubacji.

Przygotować 10 x mieszaniny mieszanek iniekcyjnych zgodnie z opisem w tabeli i ogrzać mieszaniny do 37 stopni Celsjusza. Następnie załaduj wkład czujnika odpowiednimi objętościami związku i portami A, B, C i D, korzystając z dostarczonych prowadnic ładowania, aby scharakteryzować bioenergię spolaryzowanych makrofagów za pomocą testu strumienia zewnątrzkomórkowego. Użyj kreatora testu, aby utworzyć matrycę testu z dwuminutowym czasem mieszania i trzyminutowym czasem pomiaru oraz co najmniej trzema pętlami pomiaru mieszania i szybkości przed każdym z czterech wstrzyknięć i po ostatnim wstrzyknięciu.

Następnie rozpocznij test i postępuj zgodnie z instrukcjami wskazanymi przez aparaturę. Ładowanie płytki wkładu uwodnionymi sondami, aby umożliwić kalibrację przez aparat i płytkę ogniwa. Po otrzymaniu instrukcji, pod koniec testu, ostrożnie wyrzuć całą pożywkę testową i przechowuj analizowaną mikropłytkę do hodowli komórkowej w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza do normalizacji.

Aby znormalizować komórki za pomocą zestawu do oznaczania proliferacji komórek, rozmrozić płytkę i inkubować komórki w 200 mikrolitrach świeżo przygotowanego buforu do lizy komórek na dołek przez pięć minut w temperaturze pokojowej. Na koniec zmierz fluorescencję z około 480 nanometrowym wzbudzeniem i około 520 nanometrowymi maksimami emisji. Wykorzystując uzyskane pomiary fluorescencji do obliczenia stosunku, w którym średnia liczba komórek we wszystkich naiwnych studniach makrofagowych jest ustawiona na jeden, a następnie wyeksportuj te proporcje do oprogramowania do analizy fal konika morskiego.

Aby znormalizować dane, test strumienia zewnątrzkomórkowego zazwyczaj daje wskaźnik zakwaszenia zewnątrzkomórkowego lub wskaźnik ECAR i wskaźnik zużycia tlenu lub wykresy OCR, jak pokazano na tym reprezentatywnym rysunku po wstrzyknięciu glukozy, obserwowany wzrost ECAR reprezentuje szybkość glikolizy. Dodatkowy wzrost obserwowany w ECAR po zahamowaniu syntazy TP przez całą liga mycynę dostarcza dalszych informacji na temat rezerwy glikolitycznej i pojemności. Podczas analizy wartości OCR, wstrzyknięcie CIN ułatwia obliczenie zużycia tlenu wykorzystywanego do syntezy mitochondriów A TP, FCCP rozprzęga oddychanie mitochondrialne.

Odpowiednie pomiary OCR dostarczają danych o maksymalnej i wolnej pojemności oddechowej znanej zgnilizny i wstrzyknięciu antymycyny, jednak blokują kompleksy mitochondrialne jeden i trzy z resztkowym OCR reprezentującym niemitochondrialne zużycie tlenu. Aktywacja makrofagów za pomocą LPS indukuje zwiększony metabolizm glikolitonów. Różnice między LPS i IL w czterech traktowanych makrofagach stają się jeszcze bardziej widoczne, gdy obserwuje się wskaźniki zużycia tlenu.

Rzeczywiście, podczas gdy maksymalny metabolizm oksydacyjny jest silnie stłumiony w makrofagach traktowanych LPS, IL four indukuje silne oddychanie w makrofagach M dwóch. Po opanowaniu, test grypy zewnątrzkomórkowej można wykonać w ciągu dwóch godzin, jeśli zostanie wykonany prawidłowo. Próbując wykonać tę procedurę, należy pamiętać o wstrzyknięciu weterynarza razem z FCCP, aby zapewnić maksymalne oddychanie po rozłączeniu.

Po tej technice można wykonać dodatkowe testy, takie jak Eliza, w celu oceny efektywnej polaryzacji makrofagów. Technika ta utorowała drogę naukowcom z dziedziny immunologii do zbadania charakterystyki metabolicznej szerokiej gamy komórek odpornościowych. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak przeprowadzić analizę strumienia zewnątrzkomórkowego w celu oceny fenotypu metabolicznego makrofagów.