Name: Charakterystyka metaboliczna spolaryzowanych makrofagów pochodzących ze szpiku kostnego M1 i M2 przy użyciu analizy strumienia zewnątrzkomórkowego w czasie rzeczywistym (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-11-28T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 45 s
Description: Poznaj analizę strumienia zewnątrzkomórkowego do badania metabolizmu makrofagów M1 i M2 pochodzących ze szpiku kostnego. Ta metoda umożliwia pomiar glikolizy i funkcji mitochondrialnych w czasie rzeczywistym.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Jan Van den Bossche otrzymał stypendium podoktorskie od Netherlands Heart Foundation (2013T003) oraz stypendium VENI od ZonMW (91615052). Menno de Winther jest uznanym badaczem w Netherlands Heart Foundation (2007T067), jest wspierany przez grant Netherlands Heart Foundation (2010B022) i posiada stypendium AMC. Dziękujemy również za wsparcie ze strony Holenderskiej Inicjatywy Badań nad Układem Sercowo-Naczyniowym, Holenderskiej Federacji Uniwersyteckich Centrów Medycznych, Holenderskiej Organizacji Badań i Rozwoju Zdrowia oraz Królewskiej Holenderskiej Akademii Nauk dla projektu GENIUS "Generowanie najlepszych opartych na dowodach celów farmaceutycznych dla miażdżycy" (CVON2011-19). Dziękujemy firmie Seahorse Bioscience za umożliwienie publikacji w otwartym dostępie. Autorzy dziękują Riekeltowi Houtkooperowi i Vincentowi de Boerowi (Laboratorium Genetycznych Chorób Metabolicznych, Akademickie Centrum Medyczne, Amsterdam, Holandia) za wszelką wcześniejszą pomoc przy analizatorze Seahorse.

1. Hodowla i polaryzacja makrofagów pochodzących ze szpiku kostnego
<ol>
	<li>Dzień 0: Wyizoluj kości udowe i piszczelowe od 6-10 tygodniowych myszy będących przedmiotem zainteresowania (C57Bl / 6 w tym teście).</li>
	<li>Usuń tkankę mięśniową z kości i umieść kości w 9-centymetrowej szalce Petriego wypełnionej lodowatym PBS.</li>
	<li>Przenieś kości na 9-centymetrową szalkę Petriego wypełnioną 70% etanolem i delikatnie potrząsaj płytką przez 30 sekund.</li>
	<li>Przenieś kości na świeżą 9 cm szalkę Petriego wypełnioną lodowato zimnym sterylnym PBS.</li>
	<li>Przetnij kość udową i piszczelową na obu końcach sterylnymi nożyczkami.</li>
	<li>Przepłukać kości 10 ml lodowatego sterylnego PBS za pomocą strzykawki o pojemności 10 ml i igły 25 G. Zebrać szpik kostny do probówki o pojemności 50 ml.</li>
	<li>Przenieść komórki szpiku kostnego do nowej probówki o pojemności 50 ml za pomocą igły 23 G.</li>
	<li>Powtórz ten krok z igłą 25 G. Uwaga: Te kroki są potrzebne do usunięcia grudek komórek i resztek kostnych.</li>
	<li>Wirować przy 300 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić komórki w 40 ml pożywki kondycjonowanej komórkami (RPMI-1640 plus 2 mM L-glutamina, 10% FCS, penicylina (100 U/ml), streptomycyna (100 μg/ml) i 15% przefiltrowana pożywka kondycjonowana komórkami L-929 (ATCC, CCL-1) zawierająca M-CSF (lub alternatywnie 10 ng/ml rekombinowanego M-CSF zamiast pożywki kondycjonowanej komórkowo L-929). 
	Uwaga: Generacja pożywki kondycjonowanej komórkami L-929 została szczegółowo opisana wcześniej w tym czasopiśmie w 2013 roku. 11</li>
	<li>Wyhodować komórki jednej myszy na dwóch 15-centymetrowych szalkach Petriego (nie używać płytek poddanych działaniu hodowli komórkowych, ponieważ makrofagi nie oderwą się od tego tworzywa sztucznego) w 20 ml pożywki hodowlanej na płytkę w inkubatorze o temperaturze 37 °C, 5% CO2 .</li>
	<li>Dodać 10 ml świeżej pożywki do hodowli komórkowych w dniu 3, nie usuwając 20 ml starszej pożywki do hodowli komórkowych.</li>
	<li>Zastąp starą pożywkę z każdej płytki 20 ml świeżej pożywki hodowlanej w dniu 6. W ten sposób zostaną również usunięte nieprzylegające komórki.</li>
	<li>Dzień 8:
	<ol>
		<li>Oderwać komórki, inkubując je przez 5 minut w temperaturze 37 °C w 10 ml soli fizjologicznej z cytrynianu (135 mM chlorku potasu plus 15 mM cytrynianu sodu wH2O, autoklawizowany) i przemyć 10 ml PBS. Policz dojrzałe makrofagi pochodzące ze szpiku kostnego (BMDM) w dniu 8 za pomocą licznika komórek.</li>
		<li>Sprawdzić tworzenie się dojrzałego (CD11b+ F4/80+) BMDM za pomocą oględzin lub cytometrii przepływowej. Zablokuj 105 komórek z 1/100 anty-CD16/CD32 w PBS przez 20 minut w 100 μl PBS, inkubuj z 1/200 anty-CD11b-FITC plus 1/200 anty-F4/80-APC-Cy7 w temperaturze RT, przemyj i przeanalizuj za pomocą cytometrii przepływowej. 
		Uwaga: Hodowla makrofagów pochodzących ze szpiku kostnego myszy została szczegółowo opublikowana wcześniej w tym czasopiśmie przez Ying i wsp.Rozdział 11.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Zasiej 50 000 komórek (optymalna liczba komórek musi być zoptymalizowana) na basenie w mikropłytce do hodowli komórkowej w 100 μl pożywki hodowlanej. Nie należy umieszczać komórek w dołkach korekcyjnych w tle (A1, A12, H1, H12) i umieszczać w nich tylko pożywkę (bez komórek). Wskazówka: Trzymaj pipetę pod kątem mniej więcej do połowy boku studzienek, aby uzyskać najbardziej jednorodną warstwę komórek.</li>
	<li>Pozwól komórkom osiąść w temperaturze pokojowej w kapturze do hodowli komórkowych przez 1 godzinę. Zapewni to równomierne rozmieszczenie komórek i zmniejszy efekty krawędziowe. Monitorować przestrzeganie zaleceń za pomocą mikroskopu i hodowli w inkubatorze o temperaturze 37 °C, 5% CO2 .</li>
	<li>Trzy godziny po posianiu stymuluj komórki przez 24 godziny za pomocą 10 ng / ml LPS lub 20 ng / ml rekombinowanej myszy IL-4 w celu wytworzenia odpowiednio makrofagów M1 lub M2. Uwzględnij nieleczone wcześniej (M0) makrofagi jako kontrolę. Oceń prawidłową polaryzację makrofagów M1 i M2, mierząc indukowane przez LPS wydzielanie IL-6, IL-12, TNF (ELISA) i indukowanej przez IL-4 aktywności arginazy-1 i/lub ekspresji powierzchniowej MMR (CD206) i MGL (CD301) (cytometria przepływowa), jak opisano wcześniej3,11. 
	Uwaga: W tym momencie komórki mogą być (wstępnie) traktowane interesującymi związkami farmakologicznymi lub makrofagi mogą być stymulowane innymi czynnikami. Ponieważ różnice między oddzielnymi studzienkami mogą być znaczne, zaleca się stosowanie co najmniej 4, a najlepiej 6 studzienek na warunek.</li>
</ol>
2. Przygotowanie testu strumienia zewnątrzkomórkowego
<ol>
	<li>Uwodnij wkład czujnika na dzień przed uruchomieniem testu:
	<ol>
		<li>Umieść wkład czujnika do góry nogami obok tabliczki użytkowej.</li>
		<li>Napełnij każdą studzienkę płytki użytkowej roztworem kalibru 200 μl i opuść wkład czujnika na płytkę użytkową, zanurzając czujniki w roztworze kalibru.</li>
		<li>Sprawdź, czy poziom roztworu kalibru jest wystarczająco wysoki, aby czujniki były zanurzone i umieść w inkubatorze O/N o temperaturze 37 °C bez emisjiCO2.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotować pożywkę do oznaczania w dniu oznaczania w następujący sposób:
	<ol>
		<li>Podgrzej 50 ml pożywki bazowej XF do temperatury 37 °C.</li>
		<li>Dodaj 500 μl 200 mM L-glutaminy, aby uzyskać końcowe stężenie 2 mM.</li>
		<li>Doprowadzić pH do 7,4 za pomocą 1 N NaOH i wysterylizować filtrem 0,2 μM i utrzymać pożywkę testową w temperaturze 37 °C.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Delikatnie usunąć pożywkę do hodowli komórkowych ze spolaryzowanych makrofagów i przechowywać ją w temperaturze -20 °C do wykorzystania w przyszłości (np. test ELISA w celu zbadania prawidłowej polaryzacji makrofagów). Przemyć komórki 100 μl pożywki do oznaczania, dodać 180 μl pożywki do oznaczania do studzienki i sprawdzić pod mikroskopem, czy komórki nie zostały wypłukane. Umieścić płytkę do hodowli komórkowej w inkubatorze o temperaturze 37 °C bez CO2 na 1 godzinę przed testem.</li>
	<li>Przygotować 10 x mieszaniny związków do wstrzykiwań od A do D, jak opisano w tabeli 1, ogrzać do temperatury 37 °C, dostosować pH do 7,4 i wysterylizować filtr.
	<ol>
		<li>Przygotuj wszystkie związki w tych mieszaninach przy 10-krotnym stężeniu końcowym w studzienkach hodowli komórkowej i zoptymalizuj te stężenia dla każdego typu komórek.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Załaduj wkład czujnika, korzystając z dostarczonych prowadnic ładowania ze wskazanymi objętościami (Tabela 1) przygotowanych 10 mieszanin związków iniekcyjnych odpowiednio w portach A, B, C i D.</li>
</ol>
<obramowanie tabeli="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Mieszanina/Iniekcja</td>
			<td>Związki </td>
			<td>Objętość dodana w celu uzyskania 10x mieszaniny (μl)</td>
			<td>Pożywka do oznaczania objętościowego (ml)</td>
			<td>Objętość wstrzykiwana podczas pracy (μl)</td>
			<td>Stężenie końcowe w teście</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ZA</td>
			<td> 2,5 mln (45%) glukozy </td>
			<td>300</td> szt.
			<td>2.7</td>
			<td>20</td>
			<td>25 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>W</td>
			<td>5 mM oligomycyna A (OM) </td>
			<td>9</td>
			<td>Wersja 3.0</td>
			<td>22 Rozdział 22</td>
			<td>1,5 μM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Z</td>
			<td>5 mM FCCP </td>
			<td>9</td>
			<td>2.7</td>
			<td>25</td>
			<td>1,5 μM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>100 mM roztwór pirogronianu sodu </td>
			<td>300</td> szt.
			<td></td>
			<td></td>
			<td>1 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D</td>
			<td>5 mM antymycyny A (AA)</td>
			<td>15</td>
			<td>Wersja 3.0</td>
			<td>28</td>
			<td>2,5 μM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>5 mM rotenon (Rot) </td>
			<td>7,5</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>1,25 μM</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 1. Mieszaniny iniekcyjne.
3. Charakterystyka bioenergetyczna spolaryzowanych M1 i M2 BMDM za pomocą analizatora strumienia zewnątrzkomórkowego
<ol>
	<li>Utwórz szablon testu za pomocą kreatora testu z 2-minutowymi czasami MIX i 3-minutowymi czasami pomiaru oraz (co najmniej) 3 pętlami pomiarów mieszania i szybkości przed każdym z 4 wstrzyknięć (Tabela 1) i po ostatnim wstrzyknięciu. 
	Uwaga: Stężenia te są ważne dla makrofagów pochodzących ze szpiku kostnego i linii komórkowych makrofagów Raw264.7, ale powinny być zoptymalizowane dla każdego typu komórek. Dodanie pirogronianu do mieszaniny FCCP jest potrzebne do zapewnienia maksymalnego oddychania.</li>
	<li>Rozpocznij bieg, naciskając dolny start i postępuj zgodnie z instrukcjami urządzenia. Najpierw załaduj płytkę wkładu uwodnionymi sondami, aby umożliwić kalibrację za pomocą aparatury, a następnie załaduj płytkę ogniwa.</li>
	<li>Po wykonaniu testu należy ostrożnie wyrzucić całą pożywkę testową i przechowywać analizowaną mikropłytkę do hodowli komórkowej w temperaturze -20 °C w celu przyszłej normalizacji komórek przy użyciu zestawu do oznaczania proliferacji komórek, zgodnie ze szczegółowym opisem dostawcy.
	<ol>
		<li>Krótko mówiąc, przygotuj 1x bufor do lizy komórek, rozcieńczając składnik B 20-krotnie w wodzie destylowanej i rozcieńczając związek A 400-krotnie w 1x buforze do lizy komórek. Dodać 200 μl na studzienkę, inkubować 5 minut w temperaturze RT i zmierzyć fluorescencję z ~180 nm wzbudzeniem i ~520 nm maksimum emisji. 
		Uwaga: Podczas pracy z komórkami, które nie przylegają do zaleceń lekarskich lub jeśli problemem jest słabe przyleganie, zestaw do bezpośredniej proliferacji komórek może być używany jako alternatywa, ponieważ protokół ten nie wymaga odrzucenia całej pożywki testowej. Jednak ten bezpośredni protokół jest nieco mniej czuły w porównaniu z protokołem używanym w tym laboratorium.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Po pomiarze fluorescencji znormalizuj liczbę komórek w każdym studzience w stosunku, w którym średnia liczba komórek we wszystkich naiwnych studzienkach makrofagów jest ustalona na 1, 
	Uwaga: Kwantyfikacja białek (np. przy użyciu testu BCA) może być stosowana jako alternatywny sposób normalizacji liczby komórek. Jednak w naszych rękach ten test był mniej czuły w porównaniu z zestawem do testowania proliferacji komórek.</li>
</ol>

<ol><li>Murray, P. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macrophage+activation+and+polarization%3A+nomenclature+and+experimental+guidelines%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Macrophage activation and polarization: nomenclature and experimental guidelines.</a> Immunity. 41, 14-20 (2014).</li>
<li>Hoeksema, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IFN+gamma+Priming+of+Macrophages+Represses+a+Part+of+the+Inflammatory+Program+and+Attenuates+Neutrophil+Recruitment%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">IFN gamma Priming of Macrophages Represses a Part of the Inflammatory Program and Attenuates Neutrophil Recruitment.</a> J Immunol. , (2015).</li>
<li>Vanden Bossche, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pivotal+Advance+Arginase+1+independent+polyamine+production+stimulates+the+expression+of+IL+4+induced+alternatively+activated+macrophage+markers+while+inhibiting+LPS-induced+expression+of+inflammatory+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+leukocyte+biology%22%5BJournal%5D)">Pivotal Advance Arginase 1 independent polyamine production stimulates the expression of IL 4 induced alternatively activated macrophage markers while inhibiting LPS-induced expression of inflammatory genes.</a> Journal of leukocyte biology. 91, 685-699 (2012).</li>
<li>Pearce, E. L., Pearce, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolic+pathways+in+immune+cell+activation+and+quiescence%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Metabolic pathways in immune cell activation and quiescence.</a> Immunity. 38, 633-643 (2013).</li>
<li>Yang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PKM2+regulates+the+Warburg+effect+and+promotes+HMGB1+release+in+sepsis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+communications%22%5BJournal%5D)">PKM2 regulates the Warburg effect and promotes HMGB1 release in sepsis.</a> Nature communications. 5, 4436(2014).</li>
<li>Freemerman, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolic+reprogramming+of+macrophages+glucose+transporter+1+%28GLUT1%29+mediated+glucose+metabolism+drives+a+proinflammatory+phenotype%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+biological+chemistry%22%5BJournal%5D)">Metabolic reprogramming of macrophages glucose transporter 1 (GLUT1) mediated glucose metabolism drives a proinflammatory phenotype.</a> The Journal of biological chemistry. 289, 7884-7896 (2014).</li>
<li>Tavakoli, S., Zamora, D., Ullevig, S., Asmis, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bioenergetic+profiles+diverge+during+macrophage+polarization+implications+for+the+interpretation+of+18F+FDG+PET+imaging+of+atherosclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Nucl+Med%22%5BJournal%5D)">Bioenergetic profiles diverge during macrophage polarization implications for the interpretation of 18F FDG PET imaging of atherosclerosis.</a> J Nucl Med. 54, 1661-1667 (2013).</li>
<li>Vats, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oxidative+metabolism+and+PGC+1beta+attenuate+macrophage+mediated+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+metabolism%22%5BJournal%5D)">Oxidative metabolism and PGC 1beta attenuate macrophage mediated inflammation.</a> Cell metabolism. 4, 13-24 (2006).</li>
<li>Huang, S. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+intrinsic+lysosomal+lipolysis+is+essential+for+alternative+activation+of+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+immunology%22%5BJournal%5D)">Cell intrinsic lysosomal lipolysis is essential for alternative activation of macrophages.</a> Nature immunology. 15, 846-855 (2014).</li>
<li>Tannahill, G. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Succinate+is+an+inflammatory+signal+that+induces+IL+1beta+through+HIF+1alpha%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Succinate is an inflammatory signal that induces IL 1beta through HIF 1alpha.</a> Nature. 496, 238-242 (2013).</li>
<li>Ying, W., Cheruku, P. S., Bazer, F. W., Safe, S. H., Zhou, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Investigation+of+macrophage+polarization+using+bone+marrow+derived+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Investigation of macrophage polarization using bone marrow derived macrophages.</a> J Vis Exp. (76), (2013).</li>
<li>Hoeksema, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+macrophage+Histone+deacetylase+3+stabilizes+atherosclerotic+lesions%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Mol+Med%22%5BJournal%5D)">Targeting macrophage Histone deacetylase 3 stabilizes atherosclerotic lesions.</a> EMBO Mol Med. 6, 1124-1132 (2014).</li>
<li>Vanden Bossche, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alternatively+activated+macrophages+engage+in+homotypic+and+heterotypic+interactions+through+IL+4+and+polyamine+induced+E+cadherin+catenin+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Alternatively activated macrophages engage in homotypic and heterotypic interactions through IL 4 and polyamine induced E cadherin catenin complexes.</a> Blood. 114, 4664-4674 (2009).</li>
<li>Van den Bossche, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibiting+epigenetic+enzymes+to+improve+atherogenic+macrophage+functions%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Biophys+Res+Commun%22%5BJournal%5D)">Inhibiting epigenetic enzymes to improve atherogenic macrophage functions.</a> Biochem Biophys Res Commun. 455, 396-402 (2014).</li>
<li>Galvan Pena, S., O Neill, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolic+reprograming+in+macrophage+polarization%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+immunology%22%5BJournal%5D)">Metabolic reprograming in macrophage polarization.</a> Frontiers in immunology. 5, 420(2014).</li>
<li>Zhu, L., Zhao, Q., Yang, T., Ding, W., Zhao, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+metabolism+and+macrophage+functional+polarization%5BTitle%5D)+AND+%22International+reviews+of+immunology%22%5BJournal%5D)">Cellular metabolism and macrophage functional polarization.</a> International reviews of immunology. 34, 82-100 (2015).</li>
</ol>

Bezpłatny dostęp do tego artykułu jest sponsorowany przez Seahorse Bioscience.

Celem naszego laboratorium jest zrozumienie, w jaki sposób można wpływać na polaryzację i funkcję makrofagów, a ostatecznym celem jest poprawa wyników miażdżycy i innych stanów zapalnych12. Aby ocenić polaryzację makrofagów, zazwyczaj mierzy się indukowaną przez LPS (+ IFNγ) i indukowaną IL-4 ekspresję genów markerów M1 i M2 (qPCR), określa wydzielanie IL-6, IL-12, TNF i NO (za pomocą reakcji ELISA i Griessa) oraz bada indukowaną przez IL-4 ekspresję powierzchniową CD71, CD206, CD273 i CD301 (za pomocą cytometrii przepływowej) oraz aktywność arginazy3,13. Dodatkowo można przeprowadzić testy apoptozy (przez barwienie Aneksyną-V / PI), testy fagocytozy (z fluorescencyjnymi kulkami lateksowymi i / lub pHrodo E. coli) i testy tworzenia komórek piankowatych (przez wychwyt DiI-oxLDL, barwienie neutralnymi lipidami LipidTOX) w celu oceny funkcjonalności makrofagów14. Dodatkowo, analiza strumienia zewnątrzkomórkowego może być przeprowadzona w celu zmierzenia profili bioenergetycznych spolaryzowanych makrofagów jako nowy i alternatywny odczyt funkcjonalny.
Ten manuskrypt pokazuje, że polaryzacja makrofagów indukuje przeprogramowanie metaboliczne, a makrofagi indukowane przez LPS przełączają się na zwiększoną glikolizę jako źródło energii. I odwrotnie, makrofagi M2 indukowane przez IL-4 wykorzystują mitochondrialną fosforylację oksydacyjną jako główne źródło ATP. Co ważne, przeprogramowanie metaboliczne nie tylko dostarcza energii na szczególne wymagania makrofagów spolaryzowanych M1 i M2. Rzeczywiście, zmiany metaboliczne wpływają na stężenia metabolitów, które są bezpośrednimi regulatorami fenotypu makrofagów 10,15,16. W związku z tym metabolizm makrofagów jest nie tylko cechą charakterystyczną (jak pokazano na rysunku 2), ale także czynnikiem napędzającym różne stany polaryzacji makrofagów, a ta nowa wiedza wspierała szybki rozwój obszaru badań nad immunometabolizmem w ciągu ostatnich kilku lat.
Jednak dokładne pomiary profili metabolicznych makrofagów pozostały trudne i miały swoje ograniczenia. W tym badaniu analizator strumienia zewnątrzkomórkowego jest stosowany do solidnego pomiaru glikolizy, rezerwy glikolitycznej, maksymalnej pojemności glikolitycznej, zakwaszenia nieglikolitycznego, oddychania podstawowego i maksymalnego, produkcji ATP, wolnej pojemności oddechowej, wycieku protonów i oddychania niemitochondrialnego w czasie rzeczywistym przy minimalnej ilości makrofagów.
Dlatego zmodyfikowaliśmy i ulepszyliśmy protokoły producenta w następujący sposób. Standardowy test wysiłkowy Mito (# 103015-100) sugeruje użycie pożywki z glukozą i pirogronianem oraz protokołu z 3 wstrzyknięciami (OM, FCCP, AA/Rot). Decydujemy się rozpocząć test od podłoża wolnego od glukozy/pirogronianu, dodać glukozę jako pierwsze wstrzyknięcie do portu A (jak w teście stresu glikolizy # 103020-100) i dodać pirogronian razem z rozłącznikiem FCCP w porcie C. W ten sposób wszystkie istotne parametry glikolizy pochodzą z pomiarów ECAR 1-9, a wszystkie istotne informacje o funkcji mitochondriów z pomiarów OCR 4-15.
Należy pamiętać, że bardzo ważne jest wstrzykiwanie pirogronianu razem z FCCP, aby zapewnić maksymalne oddychanie po rozłączeniu. Przed zastosowaniem tego połączonego protokołu należy również sprawdzić, czy 2-Deoksy-D-Glucose (2-DG) obniża poziomy ECAR po teście do wartości podstawowych (1-3) i czy zarejestrowane wskaźniki ECAR 4-6 są rzeczywiście spowodowane glikolizą. Ponadto należy zrozumieć, że stężenia związków i liczby komórek użyte w tym manuskrypcie są ważne dla makrofagów pochodzących ze szpiku kostnego i linii komórkowych makrofagów Raw264.7 i powinny być zoptymalizowane dla innych typów komórek. Ponadto należy zauważyć, że M-CSF, który jest używany do generowania makrofagów pochodzących ze szpiku kostnego, promuje fenotyp przeciwzapalny podobny do M2. Przedstawione wyniki dotyczące makrofagów pochodzących ze szpiku kostnego mogą zatem nie być w pełni porównywalne z pomiarami z pierwotnymi makrofagami rezydującymi w tkankach lub liniami komórkowymi makrofagów, które nie wymagają M-CSF podczas hodowli komórek.
W porównaniu z istniejącymi metodami, protokół ten wymaga minimalnych ilości makrofagów i szybko zapewnia praktycznie wszystkie podstawowe cechy metaboliczne komórek. Powoduje to wystarczającą nadwyżkę komórek do przeprowadzenia innych testów immunologicznych, a nawet komórki użyte do profilowania bioenergetycznego mogą być nadal wykorzystywane do innych celów po teście. Co więcej, specjalny format płytki 96-dołkowej pozwala na ocenę wielu warunków w czasie rzeczywistym w tym samym czasie. Jednak różnice między poszczególnymi studniami mogą być znaczne, dlatego często pożądane jest użycie co najmniej 4 studni na warunek. Biorąc pod uwagę to ograniczenie, opisana analiza strumienia zewnątrzkomórkowego nadal pozwala na przeprowadzenie jednocześnie więcej niż 10 warunków eksperymentalnych (n = 6), czyli znacznie więcej niż w przypadku tradycyjnych technik.
Ogólnie rzecz biorąc, ten artykuł zawiera łatwy i powtarzalny test funkcjonalny, który umożliwia pomiar wszystkich istotnych parametrów glikolizy i mitochondriów w spolaryzowanych podzbiorach makrofagów. Technika ta może służyć jako przyszłe zastosowanie do oceny funkcji makrofagów i oceny wpływu różnych manipulacji (np. knock down, nowych leków itp.) na fenotyp (metaboliczny) makrofagów. W związku z tym dane dotyczące strumienia zewnątrzkomórkowego mogą być wykorzystywane w połączeniu z innymi testami, aby umożliwić dogłębną charakterystykę stanu aktywacji makrofagów.

Chociaż makrofagi odgrywają kluczową rolę w praktycznie wszystkich chorobach, mechanizmy molekularne regulujące ich fenotyp wciąż nie są w pełni odkryte. Makrofagi wykazują wysoką heterogeniczność i w odpowiedzi na mikrośrodowisko przyjmują różnefenotypy1. Klasycznie aktywowane makrofagi M1 lub M(LPS) indukowane LPS (+ IFNγ) sprzyjają stanowi zapalnemu i chronią gospodarza przed różnymi rodzajami zagrożeń mikrobiologicznych2. Inni używają IFNγ samodzielnie lub w połączeniu z TNF jako bodźców do wywołania polaryzacji M1. IL-4 i/lub IL-13 indukuje alternatywną aktywację makrofagów, a te komórki M2 lub M (IL-4) są silnymi supresorami i kontrolerami trwających odpowiedzi immunologicznych3. Spolaryzowane makrofagi wykazują wyraźną regulację metabolizmu komórkowego, a makrofagi M1 aktywowane przez LPS przechodzą przemianę metaboliczną na zwiększoną glikolizę4-6. I odwrotnie, zwiększone utlenianie kwasów tłuszczowych (FAO) i mitochondrialna fosforylacja oksydacyjna (OXPHOS) zapewniają trwałą energię w makrofagach M2 indukowanych przez IL-47-9. Tak więc zmieniony metabolizm jest nie tylko cechą spolaryzowanych podzbiorów makrofagów, ale jest również warunkiem wstępnym prawidłowej polaryzacji i regulacji stanu zapalnego. Co ważne, wykazano, że hamowanie glikolizy lub OXPHOS/FAO upośledza aktywację M1 lub M2, odpowiednio8,10. W związku z tym identyfikacja zmian metabolicznych w makrofagach może być stosowana jako narzędzie do oceny ich stanu polaryzacji i potencjału zapalnego.
Spójny test, który mierzy metabolizm makrofagów, mógłby być zatem wykorzystany do przewidywania, czy lek, powalenie genu lub inne leczenie wpływa na polaryzację i funkcję makrofagów. W tym filmie analizator strumienia zewnątrzkomórkowego jest używany do scharakteryzowania profili bioenergetycznych naiwnych makrofagów M1 i M2.
Ten manuskrypt szczegółowo opisuje zoptymalizowany protokół, który pozwala na pomiar wszystkich istotnych parametrów glikolizy (glikoliza, maksymalna glikoliza i rezerwa glikolityczna) oraz charakterystyki funkcji mitochondriów (oddychanie całkowite, podstawowe oddychanie mitochondrialne, produkcja ATP, wyciek protonów, maksymalne oddychanie i zapasowa pojemność oddechowa) w jednym teście. Korzystając z tego zestawu doświadczalnego, bioenergetyka może być porównana między komórkami kontrolnymi i "zmienionymi" (np. knock down, nadekspresja transgeniczna lub leczenie farmakologiczne).

<table><tbody><tr><td>Igły 23G i 25G</td><td>Becton Dickinson</td><td>#300800 i #300600</td><td>Do zaczerwienionego szpiku kostnego</td></tr><tr><td>Strzykawki 10 ml</td><td>Becton Dickinson</td><td>#307736</td><td>Do zaczerwienionego szpiku kostnego</td></tr><tr><td>szalki Petriego</td><td>Greiner</td><td>#639161</td><td>Do hodowli komórek szpiku kostnego</td></tr><tr><td>Zestaw do oznaczania proliferacji komórek CyQUANT&nbsp;</td><td>Sondy molekularne</td><td>#C7026</td><td>Do kwantyfikacji komórek w późniejszym czasie (działa tylko w przypadku komórek przylegających)</td></tr><tr><td>Zestaw do bezpośredniego testu proliferacji komórek CyQUANT&nbsp;</td><td>Sondy molekularne</td><td>#35011</td><td>Do oznaczania ilościowego komórek bezpośrednio po teście (komórki nieprzylegające)</td></tr><tr><td>XFe96 mikropłytka do hodowli komórkowej</td><td>Seahorse Bioscience</td><td>#101085-004</td><td>96-dołkowa płytka, w której hoduje się komórki i w której przeprowadza się</td></tr><tr><td>test rekombinowana mysia interleukina-4 (IL-4)</td><td>Peprotech</td><td>#214-14-B</td><td>Służy do indukowania alternatywnej aktywacji</td></tr> <tr><td>makrofagówlipopolisacharyd (LPS)</td><td>Sigma</td><td>#L2637</td><td>Prozapalny bodziec</td></tr><tr><td>Wkład czujnika konika morskiego&nbsp;</td><td>Seahorse Bioscience</td><td>#102416-100</td><td>Zawiera sondy do pomiaru pH i O2</td></tr><tr><td>Seahorse XF Calibrant&nbsp;</td><td>Seahorse Bioscience</td><td>#100840-000</td><td>Potrzebne do nawodnienia sond przez noc&nbsp;</td></tr><tr><td>Podstawa XF średnia&nbsp;</td><td>Seahorse Bioscience</td><td>#102353-100</td><td>Pożywka bez buforu, która umożliwia skuteczny pomiar zmian pH</td></tr><tr><td>L-glutamina</td><td>Life Technologies</td><td>#25030-081</td><td></td></tr><tr><td>D-(+)-glukoza</td><td>Sigma</td><td>#G8769</td><td>Napędza glikolizę po dodaniu do komórek</td></tr><tr><td>oligomycyna A</td><td>Sigma</td><td>#75351</td><td>Hamuje mitochondrialną syntazę ATP</td></tr><tr><td>FCCP ( 4-(trifluorometoksy cyjanku karbonylu)fenylohydrazon)</td><td>Sigma</td><td>#C2920</td><td>Rozprzęga oddychanie mitochondrialne</td></tr><tr><td>100 mM roztwór pirogronianu sodu</td><td>Lonza</td><td>#BE13-115E</td><td>Umożliwia maksymalne oddychanie mitochondrialne bez konieczności glikolizy</td></tr><tr><td>Antymycyna A</td><td>Sigma</td><td>#BE13-115EA8674</td><td>Hamuje kompleks III mitochondriów</td></tr><tr><td>Rotenon</td><td>Sigma</td><td>#BE13-115EA8674R8875</td><td>Hamuje kompleks I mitochondria</td></tr><tr><td>Casy Cell Counter Roche</td><td>Diagnostics</td><td>#05 651 697 001</td><td>Przyrząd do liczenia komórek</td></tr><tr><td>anty-CD16/CD32</td><td>eBioscience</td><td>#14-0161</td><td>Cytometria przepływowa blokowa receptora Fc</td></tr><tr><td>anty-F4/80-APC-eFluor780</td><td>eBioscience</td><td>#47-4801</td><td>Przeciwciało do barwienia makrofagów</td></tr><tr><td>anty-CD11b-FITC</td><td>eBioscience</td><td>#11-0112</td><td>Przeciwciało przeciwko makrofagom barwiącym</td></tr></tbody></table>

charakterystyka metaboliczna spolaryzowanych makrofagów pochodzących ze szpiku kostnego m1 i m2 przy użyciu analizy strumienia zewnątrzkomórkowego w czasie rzeczywistym

Metabolic Characterization of Polarized M1 and M2 Bone Marrow-derived Macrophages Using Real-time Extracellular Flux Analysis

Specyficzne szlaki metaboliczne są coraz częściej uznawane za kluczowe cechy charakterystyczne podzbiorów makrofagów. Podczas gdy indukowane klasycznie aktywowane makrofagi M1 lub M (LPS) indukowane przez LPS są prozapalne, IL-4 indukuje alternatywną aktywację makrofagów, a te tak zwane M2 lub M (IL-4) wspomagają rozwiązywanie stanów zapalnych i gojenie się ran. Najnowsze dowody wskazują na kluczową rolę przeprogramowania metabolicznego w regulacji polaryzacji makrofagów M1 i M2. 
W tym manuskrypcie analizator strumienia zewnątrzkomórkowego jest stosowany do oceny cech metabolicznych naiwnych, spolaryzowanych M1 i M2 makrofagów pochodzących ze szpiku kostnego myszy. Ten instrument wykorzystuje czujniki pH i tlenu do pomiaru wskaźnika zakwaszenia zewnątrzkomórkowego (ECAR) i wskaźnika zużycia tlenu (OCR), które mogą być związane z glikolitycznym i mitochondrialnym metabolizmem oksydacyjnym. W związku z tym zarówno glikoliza, jak i mitochondrialny metabolizm oksydacyjny mogą być mierzone w czasie rzeczywistym w jednym teście.
Korzystając z tej techniki, pokazujemy tutaj, że zapalne makrofagi M1 wykazują zwiększony metabolizm glikolityczny i zmniejszoną aktywność mitochondriów. I odwrotnie, przeciwzapalne makrofagi M2 wykazują wysoką mitochondrialną fosforylację oksydacyjną (OXPHOS) i charakteryzują się zwiększoną wolną pojemnością oddechową (SRC). 
Prezentowany test funkcjonalny służy jako ramy do zbadania, jak poszczególne cytokiny, związki farmakologiczne, nokautacje genów lub inne interwencje wpływają na fenotyp metaboliczny makrofagów i stan zapalny.

Po zakończeniu pomiaru strumienia zewnątrzkomórkowego i kwantyfikacji komórek, dane można znormalizować względem liczby komórek i poddać analizie. Zazwyczaj pozwoli to na uzyskanie wykresów ECAR i OCR, takich jak przedstawiono na Ryc. 1A i Ryc. 1B.
Po wstrzyknięciu glukozy (A) wzrost ECAR reprezentuje tempo glikolizy. Dodatkowy wzrost ECAR po zahamowaniu syntazy ATP oligomycyną (B) dostarcza informacji o rezerwie i wydolności glikolitycznej (Rycina 1A). Podczas analizy wartości OCR wstrzyknięcie oligomycyny (B) umożliwia obliczenie zużycia tlenu wykorzystywanego do mitochondrialnej syntezy ATP. FCCP (C) rozsprzęga oddychanie mitochondrialne, a odpowiadające mu pomiary OCR dostarczają danych o maksymalnej i zapasowej wydolności oddechowej. Na koniec wstrzyknięcie rotenonu (Rot) i antymycyny A (AA) blokuje kompleksy I i III mitochondriów, a pozostałe OCR reprezentuje pozamitochondrialne zużycie tlenu (Rycina 1B).
<img alt="Analiza wydolności glikolitycznej i oddychania, wykres ECAR, OCR, strumień metaboliczny, wyniki eksperymentalne." src="/files/ftp_upload/53424/53424fig1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 1"> 
Rycina 1: Parametry metaboliczne uzyskane z testu XF Extracellular flux. (A) Następujące parametry glikolizy komórkowej są obliczane z wartości ECAR (w mpH/min): glikoliza, maksymalna wydolność glikolityczna i rezerwa glikolityczna. (B) Pomiary OCR (w pMoles/min) są wykorzystywane do obliczenia kolejnych podstawowych parametrów funkcji mitochondrialnej: oddychanie podstawowe, produkcja ATP, wyciek protonów, oddychanie maksymalne i rezerwowa wydolność oddechowa. Gluc = glukoza; OM = oligomycyna A; FCCP = cyjanian karbonylu 4-(trifluorometoksy)fenylohydrazonu; AA = antymycyna A; Rot = rotenon <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53424/53424fig1large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
Po zakończeniu pomiaru wartości ECAR i OCR od 1 do 15 dla każdej studzienki można wyeksportować do programu Excel, a następnie na podstawie pomiarów ECAR obliczyć następujące parametry glikolityczne w poniższy sposób:
Zakwaszenie nieglikolityczne = średnie ECAR(1,2,3)
Glikoliza = średni ECAR(4,5,6) – średni ECAR(1,2,3)
Maksymalna zdolność glikolityczna = średnia ECAR(7,8,9)– średnia ECAR(1,2,3)
Rezerwa glikolityczna = średni ECAR(7,8,9) - średni ECAR(4,5,6)
Na podstawie wskaźników OCR można określić następujące cechy metaboliczne:
Oddychanie pozimitochondrialne = średnie OCR(13,14,15)
Oddychanie podstawowe = średnia OCR(4,5,6) - średnia OCR(13,14,15)
Produkcja ATP = średni OCR(4,5,6) - średni OCR(7,8,9)
Przeciek protonowy = średnia OCR(7,8,9) - średnia OCR(13,14,15)
Maksymalna respiracja = średni OCR(10,11,12) - średni OCR(13,14,15)
Rezerwowa wydolność oddechowa (SRC) = średnia OCR(10,11,12) - średnia OCR(4,5,6)
<img alt="Wykres analizy strumienia metabolicznego pokazujący ECAR i OCR w obecności glukozy, oligomycyny, FCCP oraz Rot/AA." src="/files/ftp_upload/53424/53424fig2.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 2"> 
Rycina 2: Charakterystyka metaboliczna makrofagów naiwnych (M0) oraz spolaryzowanych LPS (M1) i IL-4 (M2). Dla każdego pomiaru przedstawiono średnią oraz błąd standardowy średniej (SEM) z 8 pojedynczych studzienek. (A) Zmierzono wskaźniki zakwaszenia zewnątrzkomórkowego (ECAR, w mpH/min) oraz (B) wskaźniki zużycia tlenu (OCR, w pMoles/min) dla makrofagów różnie spolaryzowanych (M1 i M2) oraz naiwnych (M0). Wszystkie pomiary znormalizowano do liczby komórek (mierzonej za pomocą CyQUANT), przyjmując średnią liczbę komórek makrofagów naiwnych jako 1. Iniekcja A = glukoza; B = oligomycyna; C = FCCP; D= antymycyna A + rotenon. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53424/53424fig2large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
Jak pokazano na Rysunku 2A, aktywacja makrofagów za pomocą LPS indukuje zwiększony metabolizm glikolityczny. Różnice między makrofagami traktowanymi LPS a tymi traktowanymi IL-4 są jeszcze bardziej widoczne przy analizie tempa zużycia tlenu (OCR) na Rysunku 2B. Rzeczywiście, podczas gdy maksymalny metabolizm oksydacyjny jest silnie stłumiony w M(LPS), IL-4 indukuje respirację bazalną, a zwłaszcza maksymalną w makrofagach M2. Należy zauważyć, że zwiększona glikoliza jest raczej charakterystyczna dla makrofagów M(LPS) i niekoniecznie jest cechą makrofagów M1, ponieważ makrofagi M(IFNγ) nie wykazują nasilonej glikolizy.
Ogólnie rzecz biorąc, ta analiza strumienia zewnątrzkomórkowego wykazuje, że makrofagi M2 indukowane IL-4 charakteryzują się zwiększonym metabolizmem oksydacyjnym i zwłaszcza wysoką rezerwową wydolnością oddechową (SRC), podczas gdy makrofagi aktywowane LPS wykazują zwiększony metabolizm glikolityczny i nie posiadają żadnej rezerwowej wydolności oddechowej.

Przeprogramowanie metaboliczne jest cechą charakterystyczną i warunkiem wstępnym polaryzacji makrofagów M1 i M2. Niniejszy manuskrypt opisuje test do pomiaru podstawowych parametrów glikolizy i funkcji mitochondriów w makrofagach pochodzących ze szpiku kostnego myszy. Narzędzie to można zastosować do zbadania, w jaki sposób poszczególne czynniki wpływają na metabolizm i fenotyp makrofagów.

Charakterystyka metaboliczna spolaryzowanych makrofagów pochodzących ze szpiku kostnego M1 i M2 przy użyciu analizy strumienia zewnątrzkomórkowego w czasie rzeczywistym

Specific metabolic pathways are increasingly being recognized as critical hallmarks of macrophage subsets. While LPS-induced classically activated M1 or ...

Ogólnym celem tej analizy strumieni zewnątrzkomórkowych jest ocena charakterystyki metabolicznej naiwnych oraz spolaryzowanych w kierunku M1 i M2 makrofagów pochodzących z szpiku kostnego. Metoda ta może służyć jako podstawa do badania wpływu konkretnych cytokin, związków lub kodów genetycznych na fenotyp metaboliczny makrofagów. Główną zaletą tej techniki jest fakt, że wymaga ona jedynie niewielkiej liczby makrofagów.Ponadto metoda ta pozwala na pomiar wszystkich istotnych parametrów glikolizy i funkcji mitochondriów w ramach jednego badania. Choć metoda ta dostarcza informacji o fenotypie metabolicznym makrofagów pochodzących z szpiku kostnego, może być ona zastosowana do wszystkich typów makrofagów lub komórek odpornościowych. Zdecydowaliśmy się opublikować tę metodę w J, ponieważ często otrzymujemy prośby od innych naukowców o pomoc w przeprowadzaniu komórkowych analiz przepływu metabolicznego. Ósmego dnia hodowli należy zweryfikować obecność dojrzałych makrofagów poprzez inspekcję wizualną, a następnie inkubować dojrzałe makrofagi pochodzące z szpiku kostnego w 10 mililitrach soli cytrychanowej przez pięć minut.Inkubować w temperaturze 37 °C do momentu odklejenia się komórek. Przemyć hodowlę 10 mL PBS i policzyć liczbę żywych komórek. Następnie wysiać 5 × 10⁴ komórek na studzienkę.W mikroplatecie XFE 96 do hodowli komórkowej, w 100 µL medium hodowlanego na dołek, trzymając pipetę pod kątem mniej więcej w połowie wysokości ścianki każdego dołka. Aby rozdać komórki, do dołków korekcji tła A1, A12, H1 i H12 należy dodać samo medium. Następnie należy pozostawić komórki do osadzenia w temperaturze pokojowej w dygestorze przez jedną godzinę.Po potwierdzeniu przyczepności hodowli, komórki umieszczono w inkubatorze w temperaturze 37 °C i przy 5% CO2. Trzy godziny po wysianiu, w zależności od potrzeb, stymulowano od czterech do sześciu studni z komórkami na każdą próbę przez 24 godziny. Aby spolaryzować makrofagi pochodzące z szpiku kostnego w dniu poprzedzającym analizę strumienia zewnątrzkomórkowego, należy umieścić kartridż czujnika do góry nogami obok płytki pomocniczej i napełnić każdą studni płytki 200 µL roztworu crin.Następnie opuść wkład z czujnikami na płytkę roboczą, aby zanurzyć czujniki w roztworze Caina i upewnij się, że poziom roztworu Caina jest wystarczająco wysoki, aby utrzymać czujniki w zanurzeniu. Następnie umieść wkład w inkubatorze w temperaturze 37 °C, bez dwutlenku węgla, na noc. Następnego dnia ostrożnie usuń supernatant z polaryzowanych makrofagów i przemyj komórki 100 µl świeżo przygotowanego odczynnika do analizy.Pożywka na dołek. Do każdego dołka należy dodać 180 µL pożywki do analizy, a następnie pod mikroskopem sprawdzić, czy komórki nie zostały wypłukane. Jeśli komórki nadal przylegają, płytkę należy umieścić w inkubatorze bez CO2 w temperaturze 37 °C na jedną godzinę przed wykonaniem analizy, aby zapewnić inkubację komórek.Przygotować 10 mieszanin związków do iniekcji zgodnie z oznaczeniami w tabeli i ogrzać je do 37 °C. Następnie, korzystając z dołączonych prowadnic do ładowania, napełnić wkład sensora odpowiednimi objętościami związków w portach A, B, C i D, aby scharakteryzować bioenergetykę spolaryzowanych makrofagów za pomocą analizy przepływu zewnątrzkomórkowego. Użyć kreatora analizy w celu utworzenia szablonu badania z dwuminutowym czasem mieszania i trzyminutowym czasem pomiaru, z co najmniej trzema pętlami mieszania i pomiaru szybkości przed każdą z czterech iniekcji oraz po ostatniej iniekcji.Następnie należy uruchomić analizę i postępować zgodnie z instrukcjami wyświetlanymi przez urządzenie. Załaduj płytkę kartridżową z nawodnionymi sondami, aby umożliwić kalibrację urządzenia oraz płytki z komórkami. Po otrzymaniu odpowiedniego polecenia, pod koniec analizy, ostrożnie wylej całe medium analityczne i przechowuj analizowaną mikropłytkę z hodowlą komórkową w temperaturze -20 °C do czasu normalizacji.Aby znormalizować komórki przy użyciu zestawu do analizy proliferacji komórek, rozmroź płytkę i inkubuj komórki w 200 µL świeżo przygotowanego buforu do lizy komórek na studzienkę przez pięć minut w temperaturze pokojowej. Na koniec zmierz fluorescencję przy maksimach wzbudzenia około 480 nm i emisji około 520 nm. Wykorzystaj uzyskane pomiary fluorescencji do obliczenia stosunku, w którym średnia liczba komórek we wszystkich studzienkach z naiwnymi makrofagami zostanie przyjęta jako jeden, a następnie wyeksportuj te stosunki do oprogramowania seahorse wave analysis.Aby znormalizować dane, w teście przepływu zewnątrzkomórkowego zazwyczaj uzyskuje się wykresy tempa zakwaszania zewnątrzkomórkowego (ECAR) oraz tempa zużycia tlenu (OCR); jak pokazano na tej reprezentatywnej figurze, obserwowany po wstrzyknięciu glukozy wzrost ECAR reprezentuje tempo glikolizy. Dodatkowy wzrost ECAR zaobserwowany po zahamowaniu syntezy ATP przez oligomycynę dostarcza dalszych informacji o rezerwie i wydajności glikolitycznej. Podczas analizy wartości OCR, wstrzyknięcie CIN ułatwia obliczenie zużycia tlenu wykorzystywanego do mitochondrialnej syntezy ATP, natomiast FCCP rozprzęga oddychanie mitochondrialne.Odpowiadające im pomiary OCR dostarczają danych na temat maksymalnej i zapasowej wydolności oddechowej; wstrzyknięcie rot논ononu i antymycyny A blokuje jednak mitochondrialne kompleksy I i III, a pozostały OCR reprezentuje pozamitochondrialny pobór tlenu. Aktywacja makrofagów za pomocą LPS indukuje zwiększony metabolizm glikolityczny. Różnice między makrofagami traktowanymi LPS a tymi traktowanymi IL-4 stają się jeszcze bardziej wyraźne podczas obserwacji szybkości poboru tlenu.W rzeczywistości, podczas gdy maksymalny metabolizm oksydacyjny jest silnie zahamowany w makrofagach traktowanych LPS, IL-4 indukuje intensywną respirację w makrofagach M2. Po opanowaniu techniki, analiza przepływu tlenu pozakomórkowego może zostać ukończona w ciągu dwóch godzin, jeśli jest przeprowadzana prawidłowo. Podczas wykonywania tej procedury należy pamiętać o wstrzykiwaniu VET wraz z FCCP, aby zasilić maksymalną respirację po rozprzęganiu.Po zastosowaniu tej techniki można przeprowadzić dodatkowe analizy, takie jak test ELISA, aby ocenić skuteczność polaryzacji makrofagów. Technika ta utorowała drogę badaczom z dziedziny immunologii do zgłębiania charakterystyki metabolicznej szerokiej gamy komórek odpornościowych. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś posiadaćH dobrą wiedzę na temat tego, jak przeprowadzić analizę przepływu zewnątrzkomórkowego w celu oceny fenotypu metabolicznego makrofagów.

metabolic-characterization-polarized-m1-m2-bone-marrow-derived

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Artykuł opisuje łatwy w użyciu adaptacyjny model in vitro do badania polaryzacji makrofagów. W obecności GM-CSF/M-CSF krwiotwórcze komórki macierzyste/progenitorowe ze szpiku kostnego są kierowane do różnicowania monocytowego, a następnie stymulacji M1 lub M2. Stan aktywacji można śledzić za pomocą zmian w antygenach powierzchniowych komórki, ekspresji genów i szlakach sygnalizacji komórkowej.

Badanie polaryzacji makrofagów przy użyciu makrofagów pochodzących ze szpiku kostnego

Przedstawiamy protokół uzyskiwania sygnatur proteomicznych ludzkich makrofagów i stosowania go do określania wpływu środowiska o niskiej zawartości tlenu na polaryzację makrofagów.

Analiza proteomiczna polaryzacji ludzkich makrofagów w środowisku o niskiej zawartości tlenu

Ten protokół dostarcza metodę badania zakażenia Mycobacterium tuberculosis w ludzkich makrofagach spolaryzowanych M1 lub M2 w oparciu o różnicowanie monocytów krwi obwodowej do komórek podobnych do makrofagów, które są zakażone znakowanym przez GFP wirulentnym szczepem H37Rv, i analizowane za pomocą cytometrii przepływowej przy użyciu 10-kolorowego panelu, w tym ekspresji wybranych markerów M1/M2.

Polaryzacja ludzkich komórek pochodzących z monocytów M1 i M2 oraz analiza za pomocą cytometrii przepływowej po zakażeniu Mycobacterium tuberculosis

Test przepływu metabolicznego komórek w czasie rzeczywistym mierzy zużycie tlenu i stopień zakwaszenia zewnątrzkomórkowego, co odpowiada produkcji mitochondrialnego i glikolitycznego trifosforanu adenozyny, przy użyciu czujników pH i tlenu. W manuskrypcie wyjaśniono metodę pozwalającą zrozumieć stan energetyczny osteoblastów oraz charakterystykę i interpretację statusu bioenergetycznego komórek.

Wykorzystanie analizatora strumienia metabolicznego komórek w czasie rzeczywistym do monitorowania bioenergetyki osteoblastów

Opisujemy stopniowe protokoły mierzące oddychanie mitochondrialne mysich i ludzkich neutrofili oraz komórek HL60 za pomocą analizatora metabolicznego przepływu zewnątrzkomórkowego.

Pomiar w czasie rzeczywistym mitochondrialnego profilu bioenergetycznego neutrofili

Tutaj prezentujemy szczegółowy protokół oceny potencjału immunomodulacyjnego powierzchni implantów in vitro, mający na celu poprawę wiarygodności i odtwarzalności obecnych protokołów oraz promowanie dalszych badań. Profile cytokin wydzielniczych, ekspresję mRNA i markery powierzchni komórek monitorowano za pomocą makrofagów pochodzących z monocytów krwi w celu zbadania polaryzacji makrofagów hodowanych na tytanie.

Polaryzacja i charakterystyka ludzkich makrofagów pochodzących z monocytów typu M1 i M2 na powierzchniach implantów

Tutaj szczegółowo opisujemy metody ekstrakcji makrofagów ze szpiku kostnego, śledziony i serca po zawale serca, a następnie oceny przepływu metabolicznego w żywych komórkach.

Analiza przepływu metabolicznego ex vivo w makrofagach śledziony i serca oraz monocytach szpiku kostnego

Za pomocą modelu eksplantacji ex vivo, małe fragmenty części rostralnej tkanki tłuszczowej białej trzewnej od szczupłych myszy są hodowane przez 7–10 dni, co umożliwia indukcję i badanie zapalenia tkanki tłuszczowej, jak to ma miejsce podczas karmienia dietą wysokotłuszczową.

Ex vivo model myszy na zapaleniu tkanki tłuszczowej podobnym do diety wysoko tłuszczowej

Toxoplasma gondii przekształca się w formę cysty w odpowiedzi na stres środowiskowy, co można odtworzyć w modelach kultur tkankowych. W niniejszym materiale wideo zaprezentowano techniki badania tworzenia się ściany cysty poprzez aktywację makrofagów pochodzących z szpiku kostnego lub zmianę pH pożywki wzrostowej w komórkach fibroblastów.

Toxoplasma gondii Formowanie ściany cysty w aktywowanych makrofagach pochodzących z szpiku kostnego oraz w warunkach sprzyjających bradyzoitom

Makrofagi od dawna są uznawane za kluczowy składnik wrodzonej i adaptacyjnej odpowiedzi immunologicznej. Niedawna eksplozja wiedzy dotyczącej ewolucyjnych, genetycznych i biochemicznych aspektów interakcji między makrofagami a mikroorganizmami ponownie zwróciła uwagę naukowców na makrofagi. W artykule opisano metodę różnicowania makrofagów od szpiku kostnego myszy.

Produkcja makrofagów pochodzących ze szpiku kostnego

Poznaj analizę strumienia zewnątrzkomórkowego do badania metabolizmu makrofagów M1 i M2 pochodzących ze szpiku kostnego. Ta metoda umożliwia pomiar glikolizy i funkcji mitochondrialnych w czasie rzeczywistym.

Charakterystyka metaboliczna spolaryzowanych makrofagów pochodzących ze szpiku kostnego M1 i M2 przy użyciu analizy strumienia zewnątrzkomórkowego w czasie rzeczywistym (Wideo) | JoVE Journal

Charakterystyka metaboliczna spolaryzowanych makrofagów pochodzących ze szpiku kostnego M1 i M2 przy użyciu analizy strumienia zewnątrzkomórkowego w czasie rzeczywistym

Przeglądaj więcej filmów