Name: Toxoplasma gondii (Toxoplasma gondii) Tworzenie ścian torbieli w aktywowanych makrofagach pochodzących ze szpiku kostnego i warunkach bradyzoitu (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-08-12T17:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 56 s
Description: Poznaj metodę indukcji i wizualizacji tworzenia ścian torbieli Toxoplasma gondii in vitro przy użyciu makrofagów i fibroblastów. Technika ta umożliwia badanie odpowiedzi pasożyta na stres.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Praca ta była finansowana ze stypendium Herman I. Shapiro Distinguished Graduate Fellowship Uniwersytetu w Wisconsin-Madison (C.M.T.), grantu NIH nr AI072817 (A.M.P.) oraz grantu American Heart Association nr 0840059N (L.J.K).

1. Przygotowanie szkiełek podstawowych pokrytych fibroblastami z ludzkiego napletka (HFF)
<ol>
<li>	Umieść sterylną okrągłą szkiełkiem zakrywkowym na dnie dołków 24-dołkowej płytki do hodowli tkanek.</li>
<li>	Aby zebrać HFF z konfluentnej kolby o powierzchni 150 cm2, przepłucz kolbę dwukrotnie 1X PBS i dodaj 2,5 ml 0,025% trypsyny-EDTA. Inkubuj kolbę w temperaturze 37°C przez 5-10 minut.</li>
<li>	Opukiwanie boku kolby o wnętrze dłoni może ułatwić odklejenie komórek od ścianek kolby. Po uwolnieniu komórek dodaj 150 ml pożywki HFF (Dulbecco's Modified Eagle Medium [DMEM] z 10% FBS, 2 mM L-glutaminy oraz 1% penicyliny-streptomycyny) i wykorzystaj pożywkę do przepłukania kolby i zebrania komórek. </li>
<li>	Rozdystrybuj 1 ml zawiesiny komórek do każdego dołka ze szkiełkami zakrywkowymi. </li>
<li>	Pozostaw komórki do osiągnięcia konfluencji w temperaturze 37°C i 5% CO2.</li>
</ol>
2. Przygotowanie pożywki warunkowej (CM) z komórek L929 do rozwoju BMC
<ol>
<li>L929 to aneuploidal linia komórek włókniakomięsaka mysiego, która po długim okresie osiągnięcia konfluencji wydziela czynnik stymulujący kolonie makrofagów. Wydzielanie to sprawia, że CM z komórek L929 może być wykorzystywane do różnicowania komórek szpiku kostnego myszy w makrofagi w hodowli komórkowej1.</li>
<li>Po osiągnięciu konfluencji przez komórki L929, należy inkubować je przez dodatkowe 7-9 dni, aż staną się sferyczne i zaczną odrywać się od ścianek kolby. Należy zebrać nadsącz i odwirować oderwane komórki przy 425 x g przez 10 minut. Otrzymany nadsącz stanowi CM.</li>
<li>Jedna kolba o powierzchni 150 cm2 z komórkami L929 pozwala uzyskać 30 ml CM, co umożliwia przygotowanie 150 ml pożywki BMC. Pożywka BMC składa się z 10% FBS, 20% CM, 1% penicyliny-streptomycyny oraz 1% L-glutaminy w DMEM.</li>
</ol>
3. Izolacja szpiku kostnego i hodowla komórkowa BMC
<ol>
<li>Uśmierć jedną mysz C57BL/6 poprzez uduszenie CO2 i przeprowadź sterylizację powierzchniową 70% etanolem.</li>
<li>Odsłoń otrzewną, odsuwając skórę brzucha w okolicy nogi i rozcinając ją nożyczkami. Unikaj przebicia jamy otrzewnej. Rozetnij skórę w dół w kierunku nogi, aby odsłonić kość piszczelową i kość udową. Usuń tkankę mięśniową z kości kończyn za pomocą nożyczek.</li>
<li>Aby usunąć kość udową, wykonaj jedno cięcie poniżej kolana i jedno w okolicy biodra. Umieść kości w bakteriologicznej szalce Petri zawierającej zimny 1X PBS. Na tych etapach nie należy używać szalek Petri traktowanych do hodowli tkankowych, ponieważ BMC będą trwale przylegać do powierzchni. Za pomocą skalpela zeskrob nadmiar tkanki mięśniowej. Przetnij kość tuż powyżej kolana, aby odsłonić szpik.</li>
<li>Powtórz kroki (b) i (c), aby pobrać szpik kostny z drugiej kości udowej.</li>
<li>Użyj strzykawki 10 cc wypełnionej zimnym 1X PBS i igły 25 G, aby wypłukać szpik kostny do probówki stożkowej 50 ml. Po usunięciu szpiku kość powinna być czysto biała.</li>
<li>Przepuść mieszaninę PBS/szpik przez igłę 22 G, aby rozbić agregaty szpiku kostnego.</li>
<li>Wirowuj mieszaninę przy 425 x g przez 10 minut, a następnie usuń nadsącz.</li>
<li>Resuspenduj osad w 8 ml medium do BMC. Do 8 bakteriologicznych szalek Petri dodaj po 1 ml zawiesiny komórkowej i 9 ml medium do BMC.</li>
<li>Inkubuj w 37°C, 5% CO2.</li>
<li>W 5. dniu dodaj do każdej płytki 10 ml medium do BMC. Do 7. dnia komórki będą w pełni rozwinięte. BMC można pasażować przez 1-2 tygodnie po dojrzewaniu.</li>
<li>Aby rozdzielić BMC, usuń medium i dodaj 5 ml zimnego 1X PBS do każdej szalki Petri. Inkubuj w 4°C przez 30 minut, aż komórki zaczną odklejać się od powierzchni. Zmyj BMC z płytki za pomocą sterylnej pipety transferowej.</li>
<li>Zbierz BMC do probówki stożkowej 50 ml i zcentryfuguj przy 425 x g przez 10 minut.</li>
<li>Resuspenduj osad w 10 ml medium do BMC i policz komórki za pomocą hemocytometru. Wysiej 2x105 BMC na studzienkę w płytce 24-dołkowej z okrągłymi szkiełkami nakrywkowymi na dnie. Pozostaw BMC do przytwierdzenia na noc przed zakażeniem T. gondii. Nadmiar BMC można ponownie wysiać na szalki Petri do późniejszego użycia.</li>
</ol>
4. Zakażanie komórek T. gondii
<ol>
<li>Zainfekuj konfluencją fibroblastów HFF w kolbie 25 cm2 za pomocą 2x106 T. gondii i hoduj do momentu rozpoczęcia lizy komórek (około 2-3 dni).</li>
<li>Użyj skrobaka do komórek, aby usunąć zainfekowaną monowarstwę komórek gospodarza z kolby do hodowli tkanek, a następnie uwolnij pasożyty z komórek gospodarza, przepuszczając oderwaną monowarstwę przez igłę o rozmiarze 27G.</li>
<li>Użyj hemocytometru, aby określić liczbę pasożytów w medium.</li>
<li>Zainfekuj monowarstwy HFF na szkiełkach nakrywkowych z Protokołu 1 lub komórki BMC z Protokołu 3, używając 105 pasożytów na dołek. Pozostaw pasożyty do inwazji na 3 godziny w temperaturze 37°C, przy 5% CO2.</li>
</ol>
5. Indukowanie rozwoju bradyzoitów T. gondii poprzez stresy środowiskowe
<ol>
<li>Rozwój bradyzoitów w komórkach HFF przy zwiększeniu pH medium i deficycie CO2
<ol class="lalpha">
<li>Przygotować medium do różnicowania. Medium do różnicowania zawiera RPMI 1640 bez wodorowęglanów, 1% FBS, 1% penicyliny-streptomycyny oraz 42 mM HEPES. Dostosować pH do 8,0 i wysterylizować za pomocą filtra.</li>
<li>Usunąć DMEM z zainfekowanych komórek HFF, wypłukać 1X PBS i dodać 1 ml medium do różnicowania.</li>
<li>Inkubować przez 3 dni w temperaturze 37°C w powietrzu otoczenia.</li>
</ol></li>
<li>Aktywacja komórek BMC
<ol class="lalpha">
<li>Przygotować medium do aktywacji komórek BMC. Medium do aktywacji to medium BMC uzupełnione o 100 U/ml IFN-γ oraz 100 ng/ml LPS. Przed użyciem poddać LPS sonikacji w kąpieli wodnej przez 2 minuty w celu rozbicia agregatów.</li>
<li>Usunąć medium BMC z dołków i zastąpić je 1 ml medium do aktywacji.</li>
<li>Inkubować w temperaturze 37°C, 5% CO2 przez 3 dni.</li></ol></li>
</ol>
6. Detekcja immunofluorescencyjna
<ol>
<li> Przepłucz zainfekowane studzienki trzykrotnie roztworem 1X PBS.</li>
<li> Utrwal monowarstwę, dodając 200ul 3% formaldehydu, i pozostaw na 20 minut. </li>
<li> Usuń utrwalacz i przepłucz studzienki roztworem 1X PBS.</li>
<li> Dodaj do studzienek 200μl 0,1 M glicyny i pozostaw na 5 minut.</li>
<li> Usuń glicynę i przepłucz studzienki roztworem 1X PBS.</li>
<li> Dodaj 250 μl 3% BSA/0,2% TritonX-100 w 1X PBS, aby przeprowadzić permeabilizację i blokowanie monowarstwy przez 30 minut.</li> 
<li> Usuń roztwór blokujący i przepłucz studzienki roztworem 1X PBS.</li>
<li> Dodaj 50 μl roztworu aglutyniny Dolichos biflorus znakowanej rodamyną w rozcieńczeniu 1:250 w 3% BSA/0,2% Triton X-100 w 1X PBS.</li>
<li> Przykryj płytkę i inkubuj na wytrząsarce platformowej w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę.</li>
<li> Przemyj szkiełka podstawowe 3 razy roztworem 0,2% Triton X-100 w 1X PBS przez 5 minut każde, używając wytrząsarki platformowej.</li> 
<li> Zamontuj szkiełka podstawowe, używając medium montażowego VectaShield zawierającego 4'6-diamidino-2-phenylindole (DAPI).</li>
<li> Zabarwione T. gondii można wizualizować za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego z filtrem odpowiednim dla rodamyny przy powiększeniu 100x. </li>
</ol>
7. Reprezentatywne wyniki
Rysunek 1 przedstawia reprezentatywne barwienie DBA T. gondii w aktywowanych BMM i HFF pod wpływem stresu pH. W obu przypadkach widoczne jest barwienie DBA wokół wakuol zawierających pasożyty, co wskazuje na obecność składników ściany cysty. Obraz aktywowanych BMM wykazuje barwienie DBA zgodne z powierzchnią wakuoli. Przekrój poprzeczny T. gondii w HFF poddanych stresowi pH ukazuje ścianę cysty bez zabarwienia struktur wewnętrznych.
<img src="/files/ftp_upload/2091/2091fig1.jpg" alt="Mikroskopia kontrastowa różnicowa i fluorescencyjna DBA porównująca HFF i BMM." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 1"> 
Rycina 1. Barwienie DBA zestresowanych T. gondii. Pasożyty wewnątrzkomórkowe w warunkach stresu, w aktywowanych BMM lub w HFF poddanych stresowi pH, zabarwiono DBA sprzężonym z rodamyną (czerwony). Kontrast różnicowy (DIC) pokazuje obrys cysty, a czarny pasek skali odpowiada 2 μM.

Eksperymenty na zwierzętach
Doświadczenia na zwierzętach zostały przeprowadzone zgodnie z wytycznymi i przepisami ustanowionymi przez Komitet ds. Opieki i Wykorzystania Zwierząt Uniwersytetu Wisconsin.

<ol><li>Tomida, M., Yamamoto-Yamaguchi, Y., Hozumi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+of+a+factor+inducing+differentiation+of+mouse+myeloid+leukemic+M1+cells+from+conditioned+medium+of+mouse+fibroblast+L929+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Purification of a factor inducing differentiation of mouse myeloid leukemic M1 cells from conditioned medium of mouse fibroblast L929 cells.</a> J Biol Chem. 259 (17), 10978-10980 (1984).</li>
<li>Matrajt, M., Donald, R. G., Singh, U., Roos, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+and+characterization+of+differentiation+mutants+in+the+protozoan+parasite+Toxoplasma+gondii%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Identification and characterization of differentiation mutants in the protozoan parasite Toxoplasma gondii.</a> Mol Microbiol. 44, 735-747 (2002).</li>
<li>Singh, U., Brewer, J. L., Boothroyd, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+analysis+of+tachyzoite+to+bradyzoite+differentiation+mutants+in+Toxoplasma+gondii+reveals+a+hierarchy+of+gene+induction%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Genetic analysis of tachyzoite to bradyzoite differentiation mutants in Toxoplasma gondii reveals a hierarchy of gene induction.</a> Mol Microbiol. 44, 721-733 (2002).</li>
<li>J, P., Knoll, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+Toxoplasma+gondii+development+mutants+identifies+a+potential+proteophosphogylcan+that+enhances+cyst+wall+formation.+Molecular+and+Biochemical+Parasitology%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Isolation of Toxoplasma gondii development mutants identifies a potential proteophosphogylcan that enhances cyst wall formation. Molecular and Biochemical Parasitology.</a> 169 (2), 120-123 (2010).</li>
<li>Bohne, W., Heesemann, J., Gross, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+Bradyzoite-Specific+Toxoplasma+gondii+Antigens+in+Gamma+Interferon-Treated+Mouse+Macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22Infection+and+Immunity%22%5BJournal%5D)">Induction of Bradyzoite-Specific Toxoplasma gondii Antigens in Gamma Interferon-Treated Mouse Macrophages.</a> Infection and Immunity. 61 (3), 1141-1145 (1993).</li>
<li>Ibrahim, H. M., Bannai, H., Xuan, X., Nishikawa, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toxoplasma+gondii+Cyclophilin+18-Mediated+Production+of+Nitric+Oxide+Induces+Bradyzoite+Conversion+in+a+CCR5-Dependent+Manner%5BTitle%5D)+AND+%22Infection+and+Immunity%22%5BJournal%5D)">Toxoplasma gondii Cyclophilin 18-Mediated Production of Nitric Oxide Induces Bradyzoite Conversion in a CCR5-Dependent Manner.</a> Infection and Immunity. 77 (9), 3686-3695 (2009).</li>
<li>Lyons, R. E., McLeod, R., Roberts, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toxoplasma+gondii+tachyzoite-bradyzoite+interconversion%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Parasitology%22%5BJournal%5D)">Toxoplasma gondii tachyzoite-bradyzoite interconversion.</a> Trends in Parasitology. 18 (5), 198-201 (2002).</li>
<li>Berghaus, L. J., Moore, J. N., Hurley, D. J., Vandenplas, M. L., Fortes, B. P., Wolfert, M. A., Boons, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Innate+immune+responses+of+primary+murine+macrophage-lineage+cells+and+RAW+264.7+cells+to+ligands+of+Toll-like+receptors+2%2C+3%2C+and+4%5BTitle%5D)+AND+%22Comp+Immunol+Microbiol+Infect+Dis%22%5BJournal%5D)">Innate immune responses of primary murine macrophage-lineage cells and RAW 264.7 cells to ligands of Toll-like receptors 2, 3, and 4.</a> Comp Immunol Microbiol Infect Dis. , (2009).</li>
<li>Mordue, D. G., Scott-Weathers, C. F., Tobin, C. M., Knoll, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+patatin-like+protein+protects+Toxoplasma+gondii+from+degradation+in+activated+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Microbiol%22%5BJournal%5D)">A patatin-like protein protects Toxoplasma gondii from degradation in activated macrophages.</a> Mol Microbiol. 63 (2), 482-496 (2007).</li>
<li>Bohne, W., Heesemann, J., Gross, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reduced+replication+of+Toxoplasma+gondii+is+necessary+for+induction+of+bradyzoite-specific+antigens%3A+a+possible+role+for+nitric+oxide+in+triggering+stage+conversion%5BTitle%5D)+AND+%22Infection+and+Immunity%22%5BJournal%5D)">Reduced replication of Toxoplasma gondii is necessary for induction of bradyzoite-specific antigens: a possible role for nitric oxide in triggering stage conversion.</a> Infection and Immunity. 62 (5), 1761-1777 (1994).</li>
</ol>

Nie zadeklarowano żadnych konfliktów interesów.

Choć mechanizm rozwoju bradyzoitów nie jest w pełni poznany, analizy genetyki molekularnej konwersji stadiów T. gondii w hodowlach tkankowych doprowadziły do odkrycia genów zaangażowanych w tworzenie cyst bradyzoitowych2,3,4. Analizy te pozwoliły również zauważyć, że niektóre markery bradyzoitów ulegają ekspresji w innych warunkach przedłużonego stresu, w tym podczas wzrostu w aktywowanych makrofagach5,6. Powyższe metody opisują sposób hodowli T. gondii oraz indukowania rozwoju str...

<table><tbody><tr><td>Serykowa albumina bydlęca</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A7906</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco&amp;rsquo;pożywka DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium)</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>11960-051</td><td></td></tr><tr><td>Płastry płodowa cielęca (FBS)</td><td>Atlanta Biologicals</td><td>S11150</td><td>inaktywować termicznie </td></tr><tr><td>Rodamina &lt;em&gt;Dolichos biflorus&lt;/em&gt; aglutynina</td><td>Vector Laboratories</td><td>RL-1032</td><td></td></tr><tr><td>Formaldehyd (16%)</td><td>Polysciences, Inc.</td><td>18814</td><td></td></tr><tr><td>Glicyna</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP381-5</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP310-1</td><td></td></tr><tr><td>IFN&amp;#947;</td><td>PeproTech Inc</td><td>315-05</td><td>Przechowywać w alikwotach do jednorazowego użycia</td></tr><tr><td>L-glutamina (200 mM)</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>25030</td><td></td></tr><tr><td>Lipopolisacharyd (LPS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L4391-1MG</td><td>Przechowywać w alikwotach do jednorazowego użycia</td></tr><tr><td>Szkiełko nakrywowe do mikroskopu</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-545-80 12CIR-1</td><td></td></tr><tr><td>Penicylina-streptomycyna</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>15140</td><td></td></tr><tr><td>pożywka RPMI 1640 w proszku (z L-glutaminą, bez wodorowęglanu)</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>31800-022</td><td></td></tr><tr><td>Triton-X-100</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP151-500</td><td></td></tr><tr><td>Trypsyna-EDTA (0,25%)</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>25200</td><td></td></tr><tr><td>medium montażowe VectaShield z DAPI</td><td>Vector Laboratories</td><td>H-1200</td><td></td></tr></tbody></table>

toxoplasma gondii formowanie ściany cysty w aktywowanych makrofagach pochodzących z szpiku kostnego oraz w warunkach sprzyjających bradyzoitom

Toxoplasma gondii Cyst Wall Formation in Activated Bone Marrow-derived Macrophages and Bradyzoite Conditions

Toxoplasma gondii to obligatoryczny pasożyt wewnątrzkomórkowy, który może infekować każdą komórkę z jądrem zwierząt ciepłokrwistych. Podczas infekcji T. gondii rozprzestrzenia się w formie szybko replikującej, zwanej tachyzoitem. Tachyzoity przekształcają się w wolno rosnącą formę otoczkowaną, zwaną bradyzoitem, w wyniku procesu sygnalizacyjnego, który nie jest jeszcze dobrze opisany. W organizmach zwierząt cysty bradyzoitów znajdują się w ośrodkowym układzie nerwowym oraz w tkance mięśniowej i reprezentują chroniczne stadium infekcji. Przekształcenie w bradyzoity można symulować w hodwli tkankowej poprzez deprywację CO2, stosowanie pożywek o wysokim pH lub dodanie interferonu gamma (IFNγ). Bradyzoity charakteryzują się obecnością ściany cysty, do której wiąże się lektyna – aglutynina Dolichos biflorus (DBA). Fluorescencyjnie znakowana DBA jest wykorzystywana do wizualizacji ściany cysty u pasożytów hodowanych w fibroblastach napletka ludzkiego (HFFs), które poddano działaniu niskiego stężenia CO2 oraz pożywki o wysokim pH. Podobnie pasożyty bytujące w makrofagach szpiku kostnego myszy (BMMs) wykazują obecność ściany cysty wykrywalnej za pomocą DBA po aktywacji BMMs za pomocą IFNγ i lipopolisacharydu (LPS). Niniejszy protokół zaprezentuje sposób indukcji przekształcenia T. gondii w bradyzoity z wykorzystaniem pożywki wzrostowej o wysokim pH i niskim poziomie CO2 oraz aktywacji BMMs. Komórki gospodarza będą hodowane na szkiełkach podstawowych, zainfekowane tachyzoitami, a następnie poddane aktywacji poprzez dodanie IFNγ i LPS (BMMs) lub wystawione na działanie pożywki wzrostowej o wysokim pH (HFFs) przez trzy dni. Po zakończeniu infekcji komórki gospodarza zostaną utrwalone, permeabilizowane i poddane blokowaniu. Ściany cyst zostaną zwizualizowane przy użyciu rhodaminy DBA za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej.

Toxoplasma gondii przekształca się w formę cysty w odpowiedzi na stres środowiskowy, co można odtworzyć w modelach kultur tkankowych. W niniejszym materiale wideo zaprezentowano techniki badania tworzenia się ściany cysty poprzez aktywację makrofagów pochodzących z szpiku kostnego lub zmianę pH pożywki wzrostowej w komórkach fibroblastów.

Toxoplasma gondii Formowanie ściany cysty w aktywowanych makrofagach pochodzących z szpiku kostnego oraz w warunkach sprzyjających bradyzoitom

Toxoplasma gondii to obligatoryjny pasożyt wewnątrzkomórkowy, który potrafi zainfekować każdą komórkę z jądrem zwierząt ciepłokrwistych. Podczas infekcji T. gondii ...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest indukowanie i wizualizacja tworzenia się ściany cysty u Toxoplasma gondii in vitro. Jest to osiągane poprzez uprzednie hodowlę makrofagów i fibroblastów.Następnie, poprzez zainfekowanie tych komórek gospodarza pasożytem, w modelu oka można wywołać reakcje stresowe poprzez poddanie fibroblastów szokowi pH lub aktywację makrofagów, co w obu przypadkach doprowadzi do powstania ściany cysty. Na koniec do kultur dodaje się fluorescencyjną lektynę, która wiąże się ze ścianą cysty, umożliwiając wizualizację cysty za pomocą mikroskopii immunofluorescencyjnej. Witam, nazywam się Crystal Tobin i reprezentuję laboratorium dr Laury Noel z Katedry Mikrobiologii Medycznej i Immunologii na Uniwersytecie Wisconsin w Madison.Jestem Angela Pollard, również z No Lab. Dzisiaj zaprezentujemy procedurę indukcji tworzenia ścian cyst *Toxoplasma gondii* in vitro. Stosujemy tę procedurę w naszym laboratorium, aby badać reakcje pasożyta na warunki stresowe.Zacznijmy zatem. W pierwszej kolejności umieść sterylną, okrągłą szkiełko nakrywkowe na dnie każdej studni 24-dołkowej płytki hodowlanej, aby indukować konwersję Toxoplasma gondii do formy bradyzoitów w ludzkich fibroblastach skóry prącia w warunkach wysokiego pH i deficytu dwutlenku węgla. Rozpocznij pracę z konfluencyjnym flakonem o powierzchni 150 cm² zawierającym ludzkie fibroblasty skóry prącia, korzystając z dygestorium do hodowli tkankowych.Opłucz konfluencyczną kolbę z fibroblastami z ludzkiego napletka dwukrotnie za pomocą XPBS, a następnie dodaj 2,5 ml 0,025% trypsyny EDTA. Inkubuj kolbę w temperaturze 37 °C przez 5 do 10 minut. Po zakończeniu inkubacji ostukaj kolbę kilka razy, aby odłączyć komórki od powierzchni tworzywa.Następnie należy dodać 150 milliliters pożywki HFF lub suplementowanej zmodyfikowanej pożywki Eagle'a (DMEM). Pożywkę należy wykorzystać do wypłukania kolby i zebrania komórek. Do każdego dołka płytki 24-dołkowej z szkiełkami podstawowymi należy nanieść one milliliter zawiesiny komórkowej i inkubować komórki do osiągnięcia pełnej konfluencji w temperaturze 37 degrees Celsius w atmosferze 5%carbon dioxide.Komórki będą następnie gotowe do zakażenia pasożytem Toxoplasma Gandhi. W komorze z laminarnym przepływem powietrza zakaź dwietimes 10 to the six pasożytami konfluentną hodowlę ludzkich fibroblastów skóry prącia w kolbie o powierzchni 25 square centimeter i inkubuj w temperaturze 37 degrees Celsius do momentu, gdy komórki zaczną ulegać lizie. Po około dwóch do trzech dniach użyj skrobaka do komórek, aby usunąć zakażoną monowarstwę fibroblastów skóry prącia z kolby do hodowli tkankowej.Następnie uwolnij pasożyty z komórek gospodarza, przepuszczając oderwaną monowarstwę przez igłę o rozmiarze 27 G. Użyj cytomierza treści krwi, aby określić liczbę pasożytów w medium, a następnie zakaź 10⁵ pasożyty do każdej z 24 studni z uprzednio przygotowanymi, konfluentnymi fibroblastami z ludzkiego napletka.Inkubować komórki przez trzy godziny w temperaturze 37°C i 5% CO2, aby umożliwić pasożytom zainfekowanie komórek gospodarza. Następnie indukowanie konwersji pasożytów do stadium bradyzoity. Usunąć DMEM z zainfekowanych fibroblastów ludzkiej skórki prącia.Przepłucz je raz roztworem XPBS, a następnie dodaj jeden mililitr medium do wywoływania. Jest to medium na bazie RPMI bez wodorowęglanów, o pH dostosowanym do wartości 8. Inkubuj komórki przez trzy dni w temperaturze 37 °C w powietrzu otoczenia.Komórki są teraz gotowe do analizy pod kątem obecności bradyzoitów. Obecność bradyzoitów określa się przy użyciu znakowanej fluorescencyjnie lektyny docos przez fluorescencyjną gluteninę lub DBA, która wiąże się ze ścianą cysty Toxoplasma gondii, aby przygotować zainfekowane komórki do obrazowania fluorescencyjnego. Przepłucz dołki trzy razy roztworem 1x PBS.Następnie utrwal monowarstwy komórek, dodając 200 µL 3% formaldehydu na 20 minut. Usuń utrwalacz i przepłucz dołki przy użyciu XPBS. Dodaj do dołków 200 µL 0,1 M glicyny i pozostaw na pięć minut.Usunąć glicynę i wypłukać studzienki za pomocą jednej porcji XPBS, aby zablokować i permeabilizować komórki. Dodać 250 µl roztworu blokującego. Inkubować komórki przez 30 minut.Usunąć roztwór blokujący i przepłukać dołki raz roztworem XPBS. Do dołków dodać 50 µL DBA w rozcieńczeniu 1:250, sprzężonego z ruminą. Przykryć płytkę i inkubować w temperaturze pokojowej przez jedną godzinę na wytrząsarce platformowej.Po inkubacji usuń fluorescencyjnie znakowany DBA, płukząc szkiełka podstawowe trzykrotnie w 0,2% Triton X 100 w 1x PBS przez pięć minut każde na potrząsaczu platformowym, a następnie zamocuj szkiełka podstawowe, używając medium montażowego beta shield zawierającego dpi. Barwienie można wizualizować za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego z filtrem odpowiednim dla rodaminy przy powiększeniu 100x. Jako alternatywną metodę indukowania formowania się bradyzoitów można aktywować zainfekowane makrofagi pochodzące z szpiku kostnego za pomocą interferonu gamma i lipopolisacharydu (LPS). Aby rozpocząć, przygotuj najpierw medium warunkowane L 9 29 do tego procesu.L 9 29 to linia komórek włókniakomięsaka, która po długim okresie konfluencji wydziela czynnik stymulujący wzrost kolonii makrofagów. To medium warunkujące może być wykorzystywane do różnicowania komórek szpiku kostnego myszy w makrofagi w hodowli komórkowej. Aby przygotować medium warunkujące, należy wyhodować komórki L 9 2 9 w kolbie o powierzchni 150 cm² do pełnej konfluencji w temperaturze 37 °C. Następnie należy inkubować je przez kolejne siedem do dziewięciu dni, aż komórki przybiorą kształt sferyczny i zaczną odrywać się od powierzchni kolby.Zebrać pożywkę oraz wszelkie oddzielone komórki do probówki o pojemności 50 ml i wirować przy 420 5G przez 10 minut. Otrzymany nadsącz jest pożywką warunkującą. Jedna kolba o powierzchni 150 cm² z komórkami L 9 29 dostarczy 30 ml pożywki warunkującej, co jest objętością wymaganą do przygotowania 150 ml pożywki BMC. Należy pamiętać o przygotowaniu DMEM dla BMC z użyciem L 9 29 do rozwoju BMC.Aby zapoznać się ze szczegółowymi protokołami wideo ilustrującymi metodę izolacji komórek szpiku kostnego, w przypadku kości udowej myszy prosimy o obejrzenie następujących protokołów wideo po pięciodniowej inkubacji zebranych komórek BMC. Do szalek Petriego dodaje się 10 ml pożywki dla komórek BMC, zawierającej pożywkę warunkowaną z komórek L 9 2 9, a następnie inkubuje przez kolejne dwa dni, po których komórki będą w pełni rozwinięte.Dojrzałe makrofagi pochodzące z szpiku kostnego (BMS) można pasażować przez jeden do dwóch tygodni po ich dojrzewaniu w celu ich rozdzielenia; należy usunąć medium i dodać 5 mL zimnego 1x PBS inkubowanego w temperaturze 4 °C przez 30 minut, aż komórki zaczną odrywać się od podłoża. Komórki należy spłukać z płytki za pomocą sterylnej pipety transferowej. Przenieść BMS do stożkowej probówki o pojemności 50 mL i zcentryfugować komórki przy 420 ×g przez 10 minut.Resuspenduj osad w 10 ml medium BMC, a następnie za pomocą hemocytometru określ gęstość komórek. Wysiej 2 × 10⁵ komórek BMS na dołek. W płytce 24-dołkowej z okrągłymi szkiełkami nakrywkowymi na dnie pozostaw komórki do przytwierdzenia na noc przed zakażeniem T. gondii.Nadmiar komórek można przenieść na szalki Petriego do późniejszego wykorzystania. Aby aktywować BMS, należy przygotować medium aktywacyjne: poddać LPS sonikacji w łaźni wodnej przez dwie minuty w celu rozbicia agregatów. Następnie do medium BMC dodać 100 ng/mL LPS oraz 100 U/mL IFN gamma.Na koniec usuń pożywkę BMC z dołków i zastąp ją pożywką aktywującą. Inkubuj w temperaturze 37 °C w atmosferze 5% CO2 przez trzy dni. Komórki BMC można barwić w sposób opisany wcześniej dla fibroblastów napletka.W poniższych przykładach toksoplazma Gandhi I Bradys są znakowane fluorescencyjnym DBA w ludzkich fibroblastach przesิวki. W warunkach stresu pH. Ściana cysty jest znakowana fluorescencyjnie, co pokazano na tym przekroju poprzecznym cysty in vitro w dms, które zostały aktywowane za pomocą IFN Gamma i L-P-S-D-V-A.Barwienie jest również widoczne tutaj na powierzchni wakuoli. Właśnie zaprezentowaliśmy sposób barwienia in vitro cyst Toxoplasma gondii w fibroblastach i aktywowanych makrofagach. Podczas wykonywania tej procedury ważne jest, aby zaplanować przygotowanie pasożytów i komórek gospodarza na ten sam dzień.To wszystko. Dziękujemy za oglądanie i życzymy powodzenia w przeprowadzaniu eksperymentów.

toxoplasma-gondii-cyst-wall-formation-activated-bone-marrow-derived

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Toxoplasma gondii Formacja ściany cysty w makrofagach pochodzących z aktywowanego szpiku kostnego i warunki bradyzoitu

Niniejsze badanie opisuje opracowanie zmodyfikowanej metody z użyciem CsCl, która umożliwia łatwe oczyszczanie oocyst T. gondii z kału zarażonych kotów, tak aby nadawały się one do manipulacji w ramach biologii molekularnej i hodowli...

Uzyskiwanie wysoko oczyszczonych oocyst Toxoplasma gondii za pomocą nieciągłego gradientu chlorku cezu

Genetyka forward jest potężną metodą pozwalającą na odkrycie mechanizmów molekularnych, za pomocą których Toxoplasma opuszcza komórkę gospodarza. Przedstawione protokoły obejmują chemiczną mutagenizację pasożytów, wzbogacanie populacji mutantów z defektami indukowanego opuszczania komórki oraz walidację fenotypu sklonowanych mutantów.

Przesiew genetyczny w celu wyizolowania mutantów Toxoplasma gondii zaburzających wyjście z komórki gospodarza

Ten film demonstruje test do ilościowego określenia wewnątrzkomórkowego wzrostu pasożytów w makrofagach pochodzących ze szpiku kostnego (BMM). Komórki makrofagów są zakażone ruchliwymi i nieruchliwymi stadiami inwazyjnymi Leishmania, odpowiednio promastigotykami metacyklicznymi i amastigotami. Pasożyty atakują makrofagi, uwewnętrzniając się w parazytoforycznej wakuoli i namnażając się w środku. Wewnątrzkomórkowy wzrost pasożyta określa się ilościowo za pomocą mikroskopu po fluorescencyjnym...

Test in vitro w celu ilościowego określenia wewnątrzkomórkowego wzrostu pasożyta w makrofagach

Tutaj przedstawiamy metodę wykorzystania szczepów Δku80 typu I i II Toxoplasma gondii do efektywnego generowania docelowych delecji genów i zamienników genów do funkcjonalnej analizy genomowej.

Manipulacja genetyczna w szczepach Δku80 do funkcjonalnej analizy genomowej Toxoplasma gondii

Makrofagi od dawna są uznawane za kluczowy składnik wrodzonej i adaptacyjnej odpowiedzi immunologicznej. Niedawna eksplozja wiedzy dotyczącej ewolucyjnych, genetycznych i biochemicznych aspektów interakcji między makrofagami a mikroorganizmami ponownie zwróciła uwagę naukowców na makrofagi. W artykule opisano metodę różnicowania makrofagów od szpiku kostnego myszy.

Produkcja makrofagów pochodzących ze szpiku kostnego

Korzystając z tego protokołu, byliśmy w stanie zobrazować odcinki mózgu myszy zainfekowane pasożytem Toxoplasma gondii o grubości 160 μm, co umożliwia wizualizację i analizę przestrzennego związku między pasożytem otorbiającym a zainfekowanym neuronem.

Obrazowanie 3D i analiza neuronów zakażonych in vivo Toxoplasma gondii

Genetyka do przodu to potężne podejście do identyfikacji genów w patogenach wewnątrzkomórkowych, ważnych dla odporności na autonomiczną odporność komórki. Obecne podejście wykorzystuje wrodzone komórki odpornościowe, w szczególności makrofagi, do identyfikacji nowych genów Toxoplasma gondii ważnych dla unikania odporności.

Zaawansowane badania genetyczne wykorzystujące makrofagi do identyfikacji genów Toxoplasma gondii ważnych dla odporności na niezależną od IFN-γ odporności komórek

Ogólnym celem tego protokołu jest instrukcja, jak wydobywać, utrzymywać i oddzielać mysie komórki astrocytów i mikrogleju od ośrodkowego układu nerwowego, a następnie infekować pasożytami pierwotniaków.

Jednoczesna izolacja pierwotnych astrocytów i mikrogleju w celu zakażenia pasożytami pierwotniaków

To badanie pokazuje szczegółowy protokół do przeprowadzenia mikroskopii ekspansji ultrastruktury w trzech etapach cyklu życia in vitro Trypanosoma cruzi, patogenu odpowiedzialnego za chorobę Chagasa. Uwzględniamy zoptymalizowaną technikę białek cytoszkieletu i znakowania pan-proteomu.

Mikroskopia ekspansji ultrastrukturalnej w trzech etapach cyklu życia Trypanosoma cruzi in vitro

Wykazujemy tutaj, że przeprogramowanie epigenetyczne za pomocą transferu jąder komórek somatycznych (SCNT) może być wykorzystane jako narzędzie do tworzenia modeli mysich o zdefiniowanych specyficznościach receptorów limfocytów T (TCR). Myszy transjądrowe te wykazują ekspresję odpowiadającego TCR z ich locus endogennego pod kontrolą promotora endogennego.

Myszy transnuklearne o zdefiniowanej specyficzności receptorów limfocytów T przeciwko Toxoplasma gondii uzyskane poprzez SCNT

Poznaj metodę indukcji i wizualizacji tworzenia ścian torbieli Toxoplasma gondii in vitro przy użyciu makrofagów i fibroblastów. Technika ta umożliwia badanie odpowiedzi pasożyta na stres.

Toxoplasma gondii (Toxoplasma gondii) Tworzenie ścian torbieli w aktywowanych makrofagach pochodzących ze szpiku kostnego i warunkach bradyzoitu (Wideo) | JoVE Journal

Toxoplasma gondii Formowanie ściany cysty w aktywowanych makrofagach pochodzących z szpiku kostnego oraz w warunkach sprzyjających bradyzoitom

Przeglądaj więcej filmów