Toxoplasma gondii (Toxoplasma gondii) Tworzenie ścian torbieli w aktywowanych makrofagach pochodzących ze szpiku kostnego i warunkach bradyzoitu

Ogólnym celem tej procedury jest wywołanie i uwidocznienie tworzenia się ściany torbieli u Toxoplasma Gandhi. In vitro. Osiąga się to poprzez pierwszą hodowlę makrofagów i fibroblastów.

A następnie, poprzez zakażenie tych komórek gospodarza pasożytem, reakcje stresowe mogą być wywołane w tym samym oku poprzez szokowanie fibroblastów pH lub aktywację makrofagów, co doprowadzi do powstania ściany torbieli. Na koniec do kultur dodaje się fluorescencyjną lektynę, która wiąże się ze ścianą torbieli, tak aby torbiel można było uwidocznić za pomocą mikroskopii immunofluorescencyjnej. Cześć, nazywam się Crystal Tobin i pracuję w laboratorium dr Laury Noel na Wydziale Mikrobiologii Medycznej i Immunologii Uniwersytetu Wisconsin w Madison.

Nazywam się Angela Pollard i również pracuję w No Lab. Dzisiaj pokażemy Ci procedurę tworzenia ściany torbieli Toxoplasma Gandhi in vitro. Stosujemy tę procedurę w naszym laboratorium do badania reakcji pasożytów na warunki stresowe.

Więc zacznijmy. Zacznij od umieszczenia sterylnej okrągłej szklanej pokrywy na dnie każdej studzienki 24-dołkowej płytki do hodowli tkankowej, aby wywołać konwersję Toxoplasma Gandhi do Brady Zoes w ludzkich czterech fibroblastach skóry w warunkach wysokiego pH i głodu dwutlenku węgla. Zacznij od zlewającej się kolby o powierzchni 150 centymetrów kwadratowych z ludzkimi fibroblastami napletka pod kapturem do hodowli tkankowej.

Przepłukać zlewającą się kolbę ludzkich fibroblastów napletka dwa razy jednym XPBS, a następnie dodać 2,5 mililitra 0,025% tripsin EDTA. Inkubować kolbę w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez pięć do 10 minut. Po 5 do 10 minutach inkubacji postukaj kilka razy w kolbę, aby uwolnić komórki z powierzchni plastiku.

Następnie dodaj 150 mililitrów pożywki HFF lub uzupełnionej pożywki delcos modified eagles. I użyj pożywki do przepłukania kolby i zebrania komórek. Dozuj jeden mililitr komórek do każdego dołka 24-dołkowej płytki z szkiełkami nakrywkowymi, aby komórki osiągnęły zbieżność w temperaturze 37 stopni Celsjusza w 5% dwutlenku węgla.

Komórki będą wtedy gotowe do zakażenia pasożytem Toxoplasma Gandhi. Pod kapturem do hodowli tkankowej zainfekuj kolbę o powierzchni 25 centymetrów kwadratowych z nakładającymi się ludzkimi czterema fibroblastami skóry dwa razy 10 do sześciu pasożytów i inkubuj w temperaturze 37 stopni Celsjusza, aż komórki zaczną się. Około dwóch do trzech dni używa skrobaka do komórek, aby usunąć zakażoną monowarstwę fibroblastów napletka z kolby do hodowli tkankowych.

Następnie uwolnij pasożyty z komórek gospodarza, przepuszczając usuniętą monowarstwę przez igłę o rozmiarze 27. Użyj cytometru hemologicznego, aby określić liczbę pasożytów w pożywce, a następnie zainfekuj od 10 do piątego pasożyta do każdej z 24 studzienek zbiegających się ludzkich fibroblastów napletka. Wcześniej przygotowane.

Inkubuj komórki przez trzy godziny w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla, aby pasożyty mogły zaatakować komórki gospodarza. Przystąp do indukowania przemiany pasożytów w stadium zeolitu Brady'ego. Usuń DMEM z zakażonych ludzkich fibroblastów napletka.

Opłucz je jednym XPBS, a następnie dodaj jeden mililitr pożywki rozwojowej. Pożywka na bazie RPMI bez wodorowęglanów dostosowana do pH ósmego. Inkubuj komórki przez trzy dni w temperaturze 37 stopni Celsjusza w otaczającym powietrzu.

Komórki są teraz gotowe do analizy pod kątem obecności Brady'ego zos. Obecność Brady ZOS określa się za pomocą znakowanych fluorescencyjnie lektyny docos za pomocą fluorescencyjnej gluteniny lub DBA, która wiąże się ze ścianą wspomagającą Toxoplasma Gandhi w celu przygotowania zakażonych komórek do obrazowania fluorescencyjnego. Przepłucz studzienki trzy razy za pomocą jednego XPBS.

Następnie utrwal monowarstwy komórek za pomocą 200 mikrolitrów 3% formaldehydu przez 20 minut. Usuń utrwalacz i przepłucz studzienki jednym XPBS. Dodaj 200 mikrolitrów 0,1 molowej glicyny do studzienek i pozostaw je na pięć minut.

Usuń glicynę i przepłucz studzienki jednym XPBS, aby zablokować i przepuszczalność komórek. Dodaj 250 mikrolitrów roztworu blokującego. Inkubuj komórki przez 30 minut.

Usuń roztwór blokujący i przepłucz studzienki jednym XPBS. Dodać 50 mikrolitrów rozcieńczenia jeden do 250 DBA, który został sprzężony ze żwaczem do studzienek. Przykryj talerz i potrząsaj w temperaturze pokojowej przez godzinę na wytrząsarce platformowej.

Po inkubacji usuń fluorescencyjnie oznakowany DBA, myjąc szkiełka nakrywkowe trzykrotnie 0,2% Triton X 100 w jednym XPBS przez pięć minut każdy na wytrząsarce platformowej, a na koniec zamontuj szkiełka nakrywkowe za pomocą podłoża montażowego beta shield zawierającego dpi. Plamę T Gandhi można uwidocznić za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego z filtrem odpowiednim dla zgnilizny przy 100-krotnym powiększeniu. Jako alternatywną metodę indukowania tworzenia Brady ZO można aktywować zakażone makrofagi pochodzące ze szpiku kostnego za pomocą interferonu, gamma i lipopolisacharydu lub LPS Aby rozpocząć, najpierw przygotuj pożywkę kondycjonowaną L 9 29 do tego procesu.

L 9 29 to lustrzana, stosowana linia komórkowa mięsaka włóknistego, która wydziela czynnik stymulujący tworzenie kolonii makrofagów po długich okresach współpłynności. To kondycjonowane podłoże można wykorzystać do rozwoju komórek szpiku kostnego myszy w makrofagi w hodowli komórkowej w celu przygotowania kondycjonowanego podłoża do wyhodowania 1 150 centymetrów kwadratowych kolby z komórkami L 9 2 9 do współpłynności w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Następnie inkubuj je przez dodatkowe siedem do dziewięciu dni, aż staną się kuliste i zaczną odrywać się od powierzchni kolby.

Zbierz podłoże i wszelkie odłączone komórki w 50-mililitrowej tubie i wiruj w temperaturze 420 5G przez 10 minut. Otrzymany stan jest pożywką kondycyjną 1 150 centymetrów kwadratowych kolby L 9 29 komórek da 30 mililitrów kondycjonowanej pożywki, co jest objętością wymaganą do przygotowania 150 mililitrów pożywki BMC. Pamiętaj, aby przygotować DMEM dla BMC z L 9 29 cm, który będzie używany do rozwoju BMC.

Do obejrzenia szczegółowych protokołów wideo ilustrujących metodę izolowania komórek szpiku kostnego. W przypadku kości udowej myszy zapoznaj się z poniższymi protokołami wideo po inkubacji zebranych BMC przez pięć dni. Na bakteriologicznych szalkach Petriego dodaj 10 mililitrów pożywki BMC, która będzie zawierać kondycjonowaną pożywkę z komórek L 9 2 9 i inkubuj przez dodatkowe dwa dni, po czym komórki będą w pełni rozwinięte.

Dojrzałe makrofagi pochodzące ze szpiku kostnego lub BMS mogą być pasażowane przez jeden do dwóch tygodni po osiągnięciu dojrzałości, aby rozdzielić bms, usunąć pożywkę i dodać pięć mililitrów zimnego jednego XPBS inkubowanego w czterech stopniach Celsjusza przez 30 minut, aż komórki zaczną się podnosić. Wypłukać komórki z płytki sterylną pipetą do przenoszenia. Wyciągnij BMS w stożkowej rurce o pojemności 50 mililitrów i granuluj ogniwa w temperaturze 420 5G przez 10 minut.

Ponownie zawiesić osad w 10 mililitrach pożywki BMC, a następnie użyć cytometru hemologicznego, aby określić zalążek gęstości komórek. Dwa razy 10 do piątego BMS na studnię. W 24-dołkowej płytce zawierającej okrągłe szkiełka osłonowe na dnie, pozwól komórkom przylegać przez noc przed zakażeniem T. Gandhim.

Nadmiar komórek można cofnąć na szalkach Petriego do późniejszego wykorzystania. Aby aktywować BMS, przygotuj pożywkę aktywacyjną, poddaj LPS sonikacji w łaźni wodnej przez dwie minuty, aby rozbić wszelkie agregaty. Następnie do pożywki BMC dodaj 100 nanogramów na mililitr LPS i 100 jednostek na mililitr IFN gamma.

Na koniec wyjmij pożywkę BMC ze studzienek i zastąp ją jedną z pożywek aktywacyjnych. Inkubować w temperaturze 37 stopni Celsjusza, 5% dwutlenku węgla przez trzy dni. BMC mogą być barwione, jak wykazano wcześniej, za pomocą fibroblastów napletka.

W tych przykładach toksoplazma Gandhi I Bradys jest znakowana fluorescencyjnym DBA w ludzkich fibroblastach napletka. W stresie pH. Ściana torbieli jest znakowana fluorescencyjnie, jak pokazano w tym przekroju torbieli in vitro w dms, które zostały aktywowane za pomocą IFN Gamma i L-P-S-D-V-A.

Barwienie jest również obecne, jak pokazano tutaj na powierzchni wakuoli. Właśnie pokazaliśmy Ci, jak barwieć in vitro Toxoplasma Gandhi, torbiel w fibroblastach i aktywowanych makrofagach. Wykonując tę procedurę, należy pamiętać o zaplanowaniu, aby pasożyty i komórki gospodarza były gotowe tego samego dnia.

Więc to wszystko. Dziękujemy za oglądanie i życzymy powodzenia w eksperymentach.