Toxoplasma gondii Formowanie ściany cysty w aktywowanych makrofagach pochodzących z szpiku kostnego oraz w warunkach sprzyjających bradyzoitom

Ogólnym celem niniejszej procedury jest indukowanie i wizualizacja tworzenia się ściany cysty u Toxoplasma gondii in vitro. Jest to osiągane poprzez uprzednie hodowlę makrofagów i fibroblastów.

Następnie, poprzez zainfekowanie tych komórek gospodarza pasożytem, w modelu oka można wywołać reakcje stresowe poprzez poddanie fibroblastów szokowi pH lub aktywację makrofagów, co w obu przypadkach doprowadzi do powstania ściany cysty. Na koniec do kultur dodaje się fluorescencyjną lektynę, która wiąże się ze ścianą cysty, umożliwiając wizualizację cysty za pomocą mikroskopii immunofluorescencyjnej. Witam, nazywam się Crystal Tobin i reprezentuję laboratorium dr Laury Noel z Katedry Mikrobiologii Medycznej i Immunologii na Uniwersytecie Wisconsin w Madison.

Jestem Angela Pollard, również z No Lab. Dzisiaj zaprezentujemy procedurę indukcji tworzenia ścian cyst *Toxoplasma gondii* in vitro. Stosujemy tę procedurę w naszym laboratorium, aby badać reakcje pasożyta na warunki stresowe.

Zacznijmy zatem. W pierwszej kolejności umieść sterylną, okrągłą szkiełko nakrywkowe na dnie każdej studni 24-dołkowej płytki hodowlanej, aby indukować konwersję Toxoplasma gondii do formy bradyzoitów w ludzkich fibroblastach skóry prącia w warunkach wysokiego pH i deficytu dwutlenku węgla. Rozpocznij pracę z konfluencyjnym flakonem o powierzchni 150 cm² zawierającym ludzkie fibroblasty skóry prącia, korzystając z dygestorium do hodowli tkankowych.

Opłucz konfluencyczną kolbę z fibroblastami z ludzkiego napletka dwukrotnie za pomocą XPBS, a następnie dodaj 2,5 ml 0,025% trypsyny EDTA. Inkubuj kolbę w temperaturze 37 °C przez 5 do 10 minut. Po zakończeniu inkubacji ostukaj kolbę kilka razy, aby odłączyć komórki od powierzchni tworzywa.

Następnie należy dodać 150 milliliters pożywki HFF lub suplementowanej zmodyfikowanej pożywki Eagle'a (DMEM). Pożywkę należy wykorzystać do wypłukania kolby i zebrania komórek. Do każdego dołka płytki 24-dołkowej z szkiełkami podstawowymi należy nanieść one milliliter zawiesiny komórkowej i inkubować komórki do osiągnięcia pełnej konfluencji w temperaturze 37 degrees Celsius w atmosferze 5%carbon dioxide.

Komórki będą następnie gotowe do zakażenia pasożytem Toxoplasma Gandhi. W komorze z laminarnym przepływem powietrza zakaź dwietimes 10 to the six pasożytami konfluentną hodowlę ludzkich fibroblastów skóry prącia w kolbie o powierzchni 25 square centimeter i inkubuj w temperaturze 37 degrees Celsius do momentu, gdy komórki zaczną ulegać lizie. Po około dwóch do trzech dniach użyj skrobaka do komórek, aby usunąć zakażoną monowarstwę fibroblastów skóry prącia z kolby do hodowli tkankowej.

Następnie uwolnij pasożyty z komórek gospodarza, przepuszczając oderwaną monowarstwę przez igłę o rozmiarze 27 G. Użyj cytomierza treści krwi, aby określić liczbę pasożytów w medium, a następnie zakaź 10⁵ pasożyty do każdej z 24 studni z uprzednio przygotowanymi, konfluentnymi fibroblastami z ludzkiego napletka.

Inkubować komórki przez trzy godziny w temperaturze 37°C i 5% CO2, aby umożliwić pasożytom zainfekowanie komórek gospodarza. Następnie indukowanie konwersji pasożytów do stadium bradyzoity. Usunąć DMEM z zainfekowanych fibroblastów ludzkiej skórki prącia.

Przepłucz je raz roztworem XPBS, a następnie dodaj jeden mililitr medium do wywoływania. Jest to medium na bazie RPMI bez wodorowęglanów, o pH dostosowanym do wartości 8. Inkubuj komórki przez trzy dni w temperaturze 37 °C w powietrzu otoczenia.

Komórki są teraz gotowe do analizy pod kątem obecności bradyzoitów. Obecność bradyzoitów określa się przy użyciu znakowanej fluorescencyjnie lektyny docos przez fluorescencyjną gluteninę lub DBA, która wiąże się ze ścianą cysty Toxoplasma gondii, aby przygotować zainfekowane komórki do obrazowania fluorescencyjnego. Przepłucz dołki trzy razy roztworem 1x PBS.

Następnie utrwal monowarstwy komórek, dodając 200 µL 3% formaldehydu na 20 minut. Usuń utrwalacz i przepłucz dołki przy użyciu XPBS. Dodaj do dołków 200 µL 0,1 M glicyny i pozostaw na pięć minut.

Usunąć glicynę i wypłukać studzienki za pomocą jednej porcji XPBS, aby zablokować i permeabilizować komórki. Dodać 250 µl roztworu blokującego. Inkubować komórki przez 30 minut.

Usunąć roztwór blokujący i przepłukać dołki raz roztworem XPBS. Do dołków dodać 50 µL DBA w rozcieńczeniu 1:250, sprzężonego z ruminą. Przykryć płytkę i inkubować w temperaturze pokojowej przez jedną godzinę na wytrząsarce platformowej.

Po inkubacji usuń fluorescencyjnie znakowany DBA, płukząc szkiełka podstawowe trzykrotnie w 0,2% Triton X 100 w 1x PBS przez pięć minut każde na potrząsaczu platformowym, a następnie zamocuj szkiełka podstawowe, używając medium montażowego beta shield zawierającego dpi. Barwienie można wizualizować za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego z filtrem odpowiednim dla rodaminy przy powiększeniu 100x. Jako alternatywną metodę indukowania formowania się bradyzoitów można aktywować zainfekowane makrofagi pochodzące z szpiku kostnego za pomocą interferonu gamma i lipopolisacharydu (LPS). Aby rozpocząć, przygotuj najpierw medium warunkowane L 9 29 do tego procesu.

L 9 29 to linia komórek włókniakomięsaka, która po długim okresie konfluencji wydziela czynnik stymulujący wzrost kolonii makrofagów. To medium warunkujące może być wykorzystywane do różnicowania komórek szpiku kostnego myszy w makrofagi w hodowli komórkowej. Aby przygotować medium warunkujące, należy wyhodować komórki L 9 2 9 w kolbie o powierzchni 150 cm² do pełnej konfluencji w temperaturze 37 °C. Następnie należy inkubować je przez kolejne siedem do dziewięciu dni, aż komórki przybiorą kształt sferyczny i zaczną odrywać się od powierzchni kolby.

Zebrać pożywkę oraz wszelkie oddzielone komórki do probówki o pojemności 50 ml i wirować przy 420 5G przez 10 minut. Otrzymany nadsącz jest pożywką warunkującą. Jedna kolba o powierzchni 150 cm² z komórkami L 9 29 dostarczy 30 ml pożywki warunkującej, co jest objętością wymaganą do przygotowania 150 ml pożywki BMC. Należy pamiętać o przygotowaniu DMEM dla BMC z użyciem L 9 29 do rozwoju BMC.

Aby zapoznać się ze szczegółowymi protokołami wideo ilustrującymi metodę izolacji komórek szpiku kostnego, w przypadku kości udowej myszy prosimy o obejrzenie następujących protokołów wideo po pięciodniowej inkubacji zebranych komórek BMC. Do szalek Petriego dodaje się 10 ml pożywki dla komórek BMC, zawierającej pożywkę warunkowaną z komórek L 9 2 9, a następnie inkubuje przez kolejne dwa dni, po których komórki będą w pełni rozwinięte.

Dojrzałe makrofagi pochodzące z szpiku kostnego (BMS) można pasażować przez jeden do dwóch tygodni po ich dojrzewaniu w celu ich rozdzielenia; należy usunąć medium i dodać 5 mL zimnego 1x PBS inkubowanego w temperaturze 4 °C przez 30 minut, aż komórki zaczną odrywać się od podłoża. Komórki należy spłukać z płytki za pomocą sterylnej pipety transferowej. Przenieść BMS do stożkowej probówki o pojemności 50 mL i zcentryfugować komórki przy 420 ×g przez 10 minut.

Resuspenduj osad w 10 ml medium BMC, a następnie za pomocą hemocytometru określ gęstość komórek. Wysiej 2 × 10⁵ komórek BMS na dołek. W płytce 24-dołkowej z okrągłymi szkiełkami nakrywkowymi na dnie pozostaw komórki do przytwierdzenia na noc przed zakażeniem T. gondii.

Nadmiar komórek można przenieść na szalki Petriego do późniejszego wykorzystania. Aby aktywować BMS, należy przygotować medium aktywacyjne: poddać LPS sonikacji w łaźni wodnej przez dwie minuty w celu rozbicia agregatów. Następnie do medium BMC dodać 100 ng/mL LPS oraz 100 U/mL IFN gamma.

Na koniec usuń pożywkę BMC z dołków i zastąp ją pożywką aktywującą. Inkubuj w temperaturze 37 °C w atmosferze 5% CO2 przez trzy dni. Komórki BMC można barwić w sposób opisany wcześniej dla fibroblastów napletka.

W poniższych przykładach toksoplazma Gandhi I Bradys są znakowane fluorescencyjnym DBA w ludzkich fibroblastach przesิวki. W warunkach stresu pH. Ściana cysty jest znakowana fluorescencyjnie, co pokazano na tym przekroju poprzecznym cysty in vitro w dms, które zostały aktywowane za pomocą IFN Gamma i L-P-S-D-V-A.

Barwienie jest również widoczne tutaj na powierzchni wakuoli. Właśnie zaprezentowaliśmy sposób barwienia in vitro cyst Toxoplasma gondii w fibroblastach i aktywowanych makrofagach. Podczas wykonywania tej procedury ważne jest, aby zaplanować przygotowanie pasożytów i komórek gospodarza na ten sam dzień.

To wszystko. Dziękujemy za oglądanie i życzymy powodzenia w przeprowadzaniu eksperymentów.