Name: Protokoły analizy roli komórek Panetha w regeneracji jelita mysiego przy użyciu warunkowych modeli myszy Cre-lox (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-11-21T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 48 s
Description: Poznaj metodę izolacji jelita myszego do analizy komórek macierzystych nabłonka jelitowego i roli komórek Panetha w regeneracji. Technika umożliwia badanie repopulacji ISC po manipulacjach genetycznych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy chcieliby podziękować Markowi Bishopowi, Mathew Zverevowi, Victorii Marsh-Durban, Adamowi Blackwoodowi i Sylvie Robine. Praca ta została sfinansowana z grantu programowego Cancer Research UK.

<ol><li>Cheng, H., Origin Leblond, C. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((differentiation+and+renewal+of+the+four+main+epithelial+cell+types+in+the+mouse+small+intestine.+V.+Unitarian+Theory+of+the+origin+of+the+four+epithelial+cell+types%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Anat%22%5BJournal%5D)">differentiation and renewal of the four main epithelial cell types in the mouse small intestine. V. Unitarian Theory of the origin of the four epithelial cell types.</a> Am J Anat. 141 (4), 537-561 (1974).</li>
<li>Barker, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+stem+cells+in+small+intestine+and+colon+by+marker+gene+Lgr5%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Identification of stem cells in small intestine and colon by marker gene Lgr5.</a> Nature. 449 (7165), 1003-1007 (2007).</li>
<li>Clevers, H. The gut, a clonal conveyor belt. , Available from: 
 <a target="_blank" href="http://www.molecularmovies.com/movies/view/96">http://www.molecularmovies.com/movies/view/96</a> (2015).</li>
<li>Snippert, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intestinal+crypt+homeostasis+results+from+neutral+competition+between+symmetrically+dividing+Lgr5+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Intestinal crypt homeostasis results from neutral competition between symmetrically dividing Lgr5 stem cells.</a> Cell. 143 (1), 134-144 (2010).</li>
<li>Lopez-Garcia, C., Klein, A. M., Simons, B. D., Winton, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intestinal+stem+cell+replacement+follows+a+pattern+of+neutral+drift%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Intestinal stem cell replacement follows a pattern of neutral drift.</a> Science. 330 (6005), 822-825 (2010).</li>
<li>Buczacki, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intestinal+label-retaining+cells+are+secretory+precursors+expressing+Lgr5%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Intestinal label-retaining cells are secretory precursors expressing Lgr5.</a> Nature. 495 (7439), 65-69 (2013).</li>
<li>Basak, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mapping+early+fate+determination+in+Lgr5%2B+crypt+stem+cells+using+a+novel+Ki67-RFP+allele%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Mapping early fate determination in Lgr5+ crypt stem cells using a novel Ki67-RFP allele.</a> EMBO J. 33 (18), 2057-2068 (2014).</li>
<li>Sato, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Paneth+cells+constitute+the+niche+for+Lgr5+stem+cells+in+intestinal+crypts%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Paneth cells constitute the niche for Lgr5 stem cells in intestinal crypts.</a> Nature. 469 (7330), 415-418 (2011).</li>
<li>Young, M., Ordonez, L., Clarke, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((What+are+the+best+routes+to+effectively+model+human+colorectal+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+oncology%22%5BJournal%5D)">What are the best routes to effectively model human colorectal cancer.</a> Molecular oncology. 7 (2), 178-189 (2013).</li>
<li>Sauer, B., Henderson, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Site-specific+DNA+recombination+in+mammalian+cells+by+the+Cre+recombinase+of+bacteriophage+P1%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Site-specific DNA recombination in mammalian cells by the Cre recombinase of bacteriophage P1.</a> Proc Natl Acad Sci U.S.A. 85 (14), 5166-5170 (1988).</li>
<li>Brault, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inactivation+of+the+beta-catenin+gene+by+Wnt1-Cre-mediated+deletion+results+in+dramatic+brain+malformation+and+failure+of+craniofacial+development%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Inactivation of the beta-catenin gene by Wnt1-Cre-mediated deletion results in dramatic brain malformation and failure of craniofacial development.</a> Development. 128 (8), 1253-1264 (2001).</li>
<li>Fevr, T., Robine, S., Louvard, D., Huelsken, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wnt%2F%CE%B2-catenin+is+essential+for+intestinal+homeostasis+and+maintenance+of+intestinal+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cellular+Biology%22%5BJournal%5D)">Wnt/β-catenin is essential for intestinal homeostasis and maintenance of intestinal stem cells.</a> Molecular and Cellular Biology. 27 (21), 7551-7559 (2007).</li>
<li>Ireland, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inducible+Cre-mediated+control+of+gene+expression+in+the+murine+gastrointestinal+tract%3A+effect+of+loss+of+beta-catenin%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Inducible Cre-mediated control of gene expression in the murine gastrointestinal tract: effect of loss of beta-catenin.</a> Gastroenterology. 126 (5), 1236-1246 (2004).</li>
<li>Kemp, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Elimination+of+background+recombination%3A+somatic+induction+of+Cre+by+combined+transcriptional+regulation+and+hormone+binding+affinity%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Elimination of background recombination: somatic induction of Cre by combined transcriptional regulation and hormone binding affinity.</a> Nucleic Acids Res. 32 (11), e92(2004).</li>
<li>Madison, B. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cis+elements+of+the+villin+gene+control+expression+in+restricted+domains+of+the+vertical+%28crypt%29+and+horizontal+%28duodenum%2C+cecum%29+axes+of+the+intestine%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Cis elements of the villin gene control expression in restricted domains of the vertical (crypt) and horizontal (duodenum, cecum) axes of the intestine.</a> J Biol Chem. 277 (36), 33275-33283 (2002).</li>
<li>Parry, L., Young, M., El Marjou, F., Clarke, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evidence+for+a+crucial+role+of+paneth+cells+in+mediating+the+intestinal+response+to+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Evidence for a crucial role of paneth cells in mediating the intestinal response to injury.</a> Stem Cells. 31 (4), 776-785 (2013).</li>
<li>Soriano, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generalized+lacZ+expression+with+the+ROSA26+Cre+reporter+strain%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Genet%22%5BJournal%5D)">Generalized lacZ expression with the ROSA26 Cre reporter strain.</a> Nat Genet. 21 (1), 70-71 (1999).</li>
<li>el Marjou, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue-specific+and+inducible+Cre-mediated+recombination+in+the+gut+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22Genesis%22%5BJournal%5D)">Tissue-specific and inducible Cre-mediated recombination in the gut epithelium.</a> Genesis. 39 (3), 186-193 (2004).</li>
<li>Guillemot, F., Nagy, A., Auerbach, A., Rossant, J., Joyner, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Essential+role+of+Mash-2+in+extraembryonic+development%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Essential role of Mash-2 in extraembryonic development.</a> Nature. 371 (6495), 333-336 (1994).</li>
<li>Gregorieff, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+pattern+of+Wnt+signaling+components+in+the+adult+intestine%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Expression pattern of Wnt signaling components in the adult intestine.</a> Gastroenterology. 129 (2), 626-638 (2005).</li>
<li>van der Flier, L. G., Haegebarth, A., Stange, D. E., van de Wetering, M., Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((OLFM4+is+a+robust+marker+for+stem+cells+in+human+intestine+and+marks+a+subset+of+colorectal+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">OLFM4 is a robust marker for stem cells in human intestine and marks a subset of colorectal cancer cells.</a> Gastroenterology. 137 (1), 15-17 (2009).</li>
<li>Merritt, A., Allen, T., Potten, C., Hickman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Apoptosis+in+small+intestinal+epithelial+from+p53-null+mice%3A+evidence+for+a+delayed%2C+p53-independent+G2%2FM-associated+cell+death+after+gamma-irradiation%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">Apoptosis in small intestinal epithelial from p53-null mice: evidence for a delayed, p53-independent G2/M-associated cell death after gamma-irradiation.</a> Oncogene. 14 (23), 2759-2766 (1997).</li>
<li>Marshman, E., Ottewell, P., Potten, C., Watson, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Caspase+activation+during+spontaneous+and+radiation-induced+apoptosis+in+the+murine+intestine%5BTitle%5D)+AND+%22J+Pathol%22%5BJournal%5D)">Caspase activation during spontaneous and radiation-induced apoptosis in the murine intestine.</a> J Pathol. 195 (3), 285-292 (2001).</li>
<li>Fevr, T., Robine, S., Louvard, D., Huelsken, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wnt%2Fbeta-catenin+is+essential+for+intestinal+homeostasis+and+maintenance+of+intestinal+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Wnt/beta-catenin is essential for intestinal homeostasis and maintenance of intestinal stem cells.</a> Mol Cell Biol. 27 (21), 7551-7559 (2007).</li>
<li>Barker, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crypt+stem+cells+as+the+cells-of-origin+of+intestinal+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Crypt stem cells as the cells-of-origin of intestinal cancer.</a> Nature. 457 (7229), 608-611 (2009).</li>
<li>Tian, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+reserve+stem+cell+population+in+small+intestine+renders+Lgr5-positive+cells+dispensable%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A reserve stem cell population in small intestine renders Lgr5-positive cells dispensable.</a> Nature. 478 (7368), 255-259 (2011).</li>
<li>Yilmaz, O. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((mTORC1+in+the+Paneth+cell+niche+couples+intestinal+stem-cell+function+to+calorie+intake%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">mTORC1 in the Paneth cell niche couples intestinal stem-cell function to calorie intake.</a> Nature. 486 (7404), 490-495 (2012).</li>
<li>Adolph, T. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Paneth+cells+as+a+site+of+origin+for+intestinal+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Paneth cells as a site of origin for intestinal inflammation.</a> Nature. 503 (7475), 272-276 (2013).</li>
<li>Marsh, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epithelial+Pten+is+dispensable+for+intestinal+homeostasis+but+suppresses+adenoma+development+and+progression+after+Apc+mutation%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Genet%22%5BJournal%5D)">Epithelial Pten is dispensable for intestinal homeostasis but suppresses adenoma development and progression after Apc mutation.</a> Nat Genet. 40 (12), 1436-1444 (2008).</li>
<li>Jardé, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+and+in+vitro+models+for+the+therapeutic+targeting+of+Wnt+signaling+using+a+Tet-O%CE%94N89%CE%B2-catenin+system%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">In vivo and in vitro models for the therapeutic targeting of Wnt signaling using a Tet-OΔN89β-catenin system.</a> Oncogene. 32 (7), 883-893 (2013).</li>
<li>Hung, K. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+mouse+model+for+sporadic+and+metastatic+colon+tumors+and+its+use+in+assessing+drug+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Development of a mouse model for sporadic and metastatic colon tumors and its use in assessing drug treatment.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (4), 1565-1570 (2010).</li>
<li>Dacquin, R., Starbuck, M., Schinke, T., Karsenty, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+alpha1%28I%29-collagen+promoter+is+the+best+known+promoter+to+drive+efficient+Cre+recombinase+expression+in+osteoblast%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Dyn%22%5BJournal%5D)">Mouse alpha1(I)-collagen promoter is the best known promoter to drive efficient Cre recombinase expression in osteoblast.</a> Dev Dyn. 224 (2), 245-251 (2002).</li>
<li>Hinoi, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+model+of+colonic+adenoma-carcinoma+progression+based+on+somatic+Apc+inactivation%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Mouse model of colonic adenoma-carcinoma progression based on somatic Apc inactivation.</a> Cancer Res. 67 (20), 9721-9730 (2007).</li>
<li>Sansom, O. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Loss+of+Apc+allows+phenotypic+manifestation+of+the+transforming+properties+of+an+endogenous+K-ras+oncogene+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Loss of Apc allows phenotypic manifestation of the transforming properties of an endogenous K-ras oncogene in vivo.</a> Proc Natl Acad Sci U.S.A. 103 (38), 14122-14127 (2006).</li>
<li>Wong, V. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lrig1+controls+intestinal+stem-cell+homeostasis+by+negative+regulation+of+ErbB+signalling%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Lrig1 controls intestinal stem-cell homeostasis by negative regulation of ErbB signalling.</a> Nat Cell Biol. 14 (4), 401-408 (2012).</li>
<li>Sato, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+Lgr5+stem+cells+build+crypt-villus+structures+in+vitro+without+a+mesenchymal+niche%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche.</a> Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).</li>
<li>van de Wetering, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prospective+Derivation+of+a+Living+Organoid+Biobank+of+Colorectal+Cancer+Patients%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Prospective Derivation of a Living Organoid Biobank of Colorectal Cancer Patients.</a> Cell. 161 (4), 933-945 (2015).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Wykorzystanie warunkowych myszy transgenicznych cre-lox do analizy funkcji genów i komórek jest powszechnie stosowanym podejściem. Modele te zostały wykorzystane z dużym powodzeniem w jelicie do identyfikacji i scharakteryzowania komórek macierzystych2,4-6 oraz zrozumienia ich roli w chorobie25. Pełne wykorzystanie tych modeli wymaga kompleksowej charakterystyki systemu, która umożliwi prawidłową interpretację danych. Pełne zrozumienie tych systemów jest trudne do osiągnięcia ze względu na to, że geny rzadko są specyficzne dla pojedynczego typu komórki lub lokalizacji, brak wiedzy biologicznej i nieskuteczność systemów wykorzystywanych do indukowania ekspresji Cre . Opisane tutaj metody pokazują, w jaki sposób przezwyciężamy te problemy poprzez projektowanie eksperymentalne i zastosowanie istniejącej wiedzy. Chociaż użyliśmy tych metod, aby odpowiedzieć na konkretne pytanie badawcze, przedstawione tutaj techniki są ogólne i mogą być wykorzystane w dowolnych badaniach dotyczących jelita mysiego.
Przygotowanie tkanki jelitowej
Kluczowym krokiem do zapewnienia solidnych wyników jest pobranie i przetworzenie tkanki, która musi być przetworzona w odpowiednim czasie i musi być ściśle przestrzegana zgodnie z protokołami utrwalania. Ponieważ prawie wszystkie istotne problemy można przypisać artefaktom związanym z wysychaniem tkanki i/lub niepełnym utrwaleniem. Czas ma kluczowe znaczenie dla zapobiegania degradacji architektury tkanek i/lub kwasów nukleinowych i białek. Niepełne lub nadgorliwe utrwalenie może spowodować utratę rozdzielczości histochemicznej. Niepełna fiksacja spowodowana niewystarczającą ilością czasu lub sekcjami zbyt grubymi, aby umożliwić penetrację utrwalacza, może spowodować utratę rozdzielczości w kryptach jelitowych, którą można zaobserwować jako "znak pływu" podczas analizy IHC. Ponadto ważne jest, aby utrwalanie nie trwało zbyt długo, ponieważ jądrowa β-katenina może dyfundować z jądra, chyba że zostanie natychmiast przetworzona i zatopiona w wosku po utrwaleniu formaliny.
Rola komórek Panetha w niszy ISC
Przedstawione dane skutecznie pokazują znaczenie komórek Panetha w regeneracji krypt w jelicie dorosłego osobnika po utracie ISC. Istniała jednak możliwość, że Ah-cre oszczędzi populację ISC, które vil-Cre-ERT2 jest celem ataku. Tian i wsp.26 elegancko wykazało, że Lgr5hi ISC są zastępowane przez populację Lgr5lo reserve ISC. Obecnie wydaje się prawdopodobne, że te ISC są oszczędzane w systemie Ah-cre ze względu na to, że populacja rezerwowa została zidentyfikowana jako prekursory komórek wydzielniczych6,7. Znaczenie dojrzałej komórki Panetha we wspieraniu tych prekursorów komórek wydzielniczych, gdy wymagane jest powrót do stanu ISC, pozostaje bez odpowiedzi. Ponieważ komórki Panetha stanowią niszę ISC8 i odgrywają rolę w regulacji odpowiedzi ISC na spożycie kalorii27 i stan zapalny28 , prawdopodobne jest, że ich funkcje pielęgniarskie rozszerzą się na ich własne prekursory.
Nowe podejścia i technologie do skutecznego modelowania ludzkiego raka jelita grubego
Odkrycie ISC doprowadziło do identyfikacji genów, które są obecnie wykorzystywane do generowania nowych modeli myszy do badania ról genów i komórek w biologii jelit i chorobach, dokonanych przez Clarke'a iwsp.9. Jedynym ograniczeniem tej techniki jest identyfikacja genów odpowiedzialnych za ekspresję białka Cre. Obecnie ISC są rutynowo badane przy użyciu warunkowo transgenicznych myszy w oparciu o wzorzec ekspresji genu Lgr5 . Myszy, które eksprymują Cre z promotora Lgr5 , zostały wykorzystane do usunięcia Apc, genu najczęściej zmutowanego w raku jelita grubego (CRC), wykazując ISC jako komórkę pochodzenia25. Selektywne usuwanie innych genów CRC w tych komórkach dostarcza informacji na temat progresji i rozprzestrzeniania się choroby, np. PTEN29. Dalsze informacje na temat funkcji ISC są uzyskiwane poprzez specyficzną ablację komórek wyrażających ekspresję Lgr5 u myszy przy użyciu genu ludzkiego receptora toksyny błoniczej (DTR) wbitego do locus Lgr5 26. Inne strategie wykorzystują system Tet-O, który umożliwia ciągłą odwracalną ekspresję zmutowanych białek30. Wykorzystanie tych narzędzi do modyfikacji genów w różnych komórkach31 i lokalizacjach32,33 służy do zrozumienia, w jaki sposób rak inicjuje, postępuje i daje przerzuty34. Alternatywnie, mutageneza z wykorzystaniem systemu transpozonów śpiącej królewny identyfikuje nowe czynniki powodujące CRC. Ciągły rozwój myszy, technik i strategii zmian genetycznych prowadzi do opracowania modeli bardziej odpowiednich dla pacjentów.
Opracowano nowe metody charakterystyki nabłonka jelitowego i ISC. Charakterystykę stosunku typów komórek nabłonkowych można uzyskać za pomocą cytometrii przepływowej opartej na zróżnicowanej ekspresji lektyny i CD2435. Potencjalnie największy postęp w zrozumieniu biologii ISC i jej roli w chorobach zostanie osiągnięty przy użyciu systemu hodowli organoidów ex vivo 36. System ten umożliwia hodowlę normalnych i złośliwych ISC w 3D, gdzie replikują się i różnicują w bardziej fizjologicznie istotny sposób. Oczekuje się, że umożliwią one bezpośrednie testowanie leków na próbkach pobranych od pacjentów in vitro, torując drogę dla medycyny spersonalizowanej37.

Na powierzchni świetlnej jelita ssaków znajdują się powtarzające się jednostki krypt i wypustek przypominających palce, zwanych kosmkami, które wystają w światło. Powierzchnia ta jest ciągłym arkuszem nabłonka, który ulega całkowitej samoodnowie mniej więcej co 3 - 4 dni1. Ta dynamiczna tkanka jest wspierana przez populację szybko zmieniających się komórek macierzystych (ISC; znanych również jako komórki kolumnowe o podstawie krypty), które początkowo zidentyfikowano na podstawie ekspresji genu Lgr5 2,3. Komórki te znajdują się w wyspecjalizowanej niszy na dnie krypt Lieberkuhna. Początkowo odkrycie, że ISC szybko zmieniają się cyklicznie, było niezgodne z dominującą ideą, że komórka macierzysta ma charakter spoczynkowy. Przed identyfikacją ISC Lgr5+ postulowano, że populacja komórek zatrzymujących spoczynek etykiety w pozycji +4, w stosunku do podstawy krypty, to ISC1. Ostatnie badania pogodziły te obserwacje, wykazując, że przede wszystkim w każdej krypcie znajduje się pula równosilnych cyklicznych ISC, których los jest regulowany przez sąsiadów4,5. W przypadku ich utraty mogą one zostać zastąpione komórkami w stanie spoczynku, które zwykle są zaangażowane w linię wydzielniczą, ale mogą powrócić do ISC, jeśli populacja ISC zostanie uszkodzona6.
Sąsiedzi ISC mogą być zarówno ISC, jak i ich komórkami potomnymi. ISC wytwarzają naiwne komórki potomne, które namnażają się i różnicują w wyspecjalizowane typy komórek, które składają się na arkusz nabłonka wyściełający światło jelita1. Komórki kielichowe, enteroendokrynne, enterocyty, kępki i komórki M migrują w górę do powierzchni światła, gdzie pełnią różne funkcje absorpcyjne i regulacyjne, jednak komórki Panetha pozostają na dnie krypty, gdzie występują zmieszane z ISC. W ostatnich latach wykazano, że część naiwnych komórek potomnych przeznaczonych do linii wydzielniczej to komórki spoczynkowe zachowujące Lgr5lo zdolne do powrotu do ISC po urazie6,7.
Ze względu na jego znaczenie w regeneracji krypt, priorytetem było zrozumienie interakcji między ISC a jego sąsiadami, szczególnie komórkami Panetha. Komórki Paneth odgrywają kluczową rolę w niszy, która wspiera ISC8. Oprócz produktów bakteriobójczych komórki Panetha wytwarzają cząsteczki sygnałowe, które aktywują szlaki rządzące odnową lub różnicowaniem ISC. Wcześniejsze badania wykazały, że ISC Lgr5+ mogą istnieć tylko wtedy, gdy mogą konkurować o niezbędne sygnały niszowe dostarczane przez ich córki komórkiPanath 8. W badaniach tych oceniano rolę komórek Panetha w prawidłowych ISC Lgr5+, a nie w sytuacji, gdy są one uszkodzone i wymagają uzupełnienia z populacji Lgr5lo.
Aby zrozumieć biologię jelit i modelową chorobę, badamy funkcjonalną rolę komórek i/lub genów za pomocą transgenicznych modeli myszy9,10. Często modele te wykorzystują technologię cre-lox do warunkowej modyfikacji genu (genów)9,10. Rekombinaza Cre (powoduje rekombinację) jest specyficzną dla miejsca rekombinazą z rodziny integraz, wyizolowaną z bakteriofaga P1. Cre katalizuje specyficzną dla miejsca rekombinację między zdefiniowanymi miejscami "Lox P" o długości 34 pz (locus χ skrzyżowania P1). Myszy są genetycznie modyfikowane tak, aby zawierały miejsca LoxP, które otaczają obszary zainteresowania, które po ekspresji rekombinazy Cre są wycinane. Powiązanie ekspresji genu Cre z komórką lub specyficznym dla rozwoju promotorem pozwala na dokonywanie zmian w sposób przestrzenny9,10, co jest szczególnie przydatne w przezwyciężaniu embrionalnych mutacji letalnych. Dalsze powiązanie ekspresji Cre ze szlakiem receptorowym, który może być sztucznie aktywowany, pozwala na zmiany czasowe.
Korzystając z tej technologii, inaktywowaliśmy gen CatnB 11 w nabłonku jelitowym. β-katenina, produkt genu CatnB, jest kluczowym regulatorem kanonicznego szlaku sygnałowego Wnt, który zarządza homeostazą ISC. Dwa wcześniejsze badania wykorzystujące tę strategię przyniosły sprzeczne wyniki12,13. Badanie przeprowadzone przez Fevr i wsp.12, wykazały utratę komórek macierzystych i homeostazę jelit. Mając na uwadze, że Irlandia i wsp.W 14badaniu stwierdzono, że po zmniejszeniu żywotności komórek oś krypta-kosmek została ponownie zasiedlona z komórek typu dzikiego wykazujących ekspresję CatnB. Główną różnicą w tych badaniach był promotor używany do ekspresji Cre w nabłonku jelitowym. W badaniu Fevr i wsp. wykorzystano promotor genu villin związany z receptorem estrogenowym, który może być aktywowany przez podanie tamoksyfenu (vil-Cre-ERT2)15,16. Z kolei Ireland i wsp. wykorzystali element promotorowy genu cytochromu P450A1 szczura (CYP1A1) do stymulowania ekspresji Cre w odpowiedzi na ksenobiotyk β-naftoflawon (Ah-cre). Charakterystyka tych różnych systemów wygenerowała dwie hipotezy wyjaśniające te różne obserwacje. Po pierwsze, CatnB jest skuteczniej usuwany w ISC przy użyciu systemu vil-Cre-ERT2 w porównaniu z Ah-cre, zmniejszając w ten sposób liczbę ISC do poziomów subpopulacji. Alternatywnie było to spowodowane różnicową delecją CatnB w zróżnicowanej populacji komórek. System vil-Cre-ERT2 celuje we wszystkie komórki nabłonkowe krypty i kosmków, podczas gdy system Ah-cre celuje tylko w komórki nie-Paneth niszy i krypty ISC. Systemy te dostarczyły idealnych narzędzi do badania zachowania ISC i ich interakcji z komórkami Panetha. Tutaj przedstawiamy kilka szczegółowych protokołów opartych na tym, jak wykorzystaliśmy te systemy, aby ustalić, że komórki Panetha odgrywają kluczową rolę w pośredniczeniu w odpowiedzi jelitowej na uraz17.

<table><tbody><tr><td>Bufor octanowy</td><td>*</td><td>*</td><td>Aby przygotować 100 ml: 4,8 ml 0,2 M kwasu octowego, 45,2 ml 0,2 M octanu sodu i 50 ml wody destylowanej</td></tr><tr><td>Kwas octowy</td><td>Fisher Scientific</td><td>C/0400/PB17</td><td></td></tr><tr><td>Bezwodnik octowy</td><td>Sigma</td><td>A6404</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór bezwodnika octowego</td><td>*</td><td>*</td><td>2 M Bezwodnik octowy w 0,1 M chlorowodorku trietanoloaminy</td></tr><tr><td>Błękit alciański</td><td>Sigma</td><td>A5268</td><td></td></tr><tr><td>Alcian Blue pH 2,5</td><td>*</td><td>*</td><td>Aby przygotować 500 ml: 15 ml kwasu octowego, 5 g Alcian Blue i 485 ml wody destylowanej</td></tr> przeciwciało <tr><td>sprzężone z fosfatazą alkaliczną antydigoksygeniny</td><td>Abcam</td><td>ab119345</td><td></td></tr><tr><td>B(beta)-naftoflawon</td><td>Sigma</td><td>N3633</td><td>BNF, wstrzykiwać, nie dopuszczając do zbytniego ostygnięcia roztworu, ponieważ związek wypadnie z roztworu. Roztwór może być ponownie użyty &ndash; Przechowywać w temperaturze -20 & C między użyciami nie podgrzewaj więcej niż dwa razy.</td></tr><tr><td>Bloxall</td><td>Vector Labs</td><td>SP-6000</td><td></td></tr><tr><td>BM fioletowy</td><td>Roche</td><td>11442074001</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma</td><td>A4503</td><td>Albumina surowicy bydlęcej</td></tr><tr><td>Chloroform Fisher</td><td>Scientific</td><td>C/4920/17</td><td></td></tr><tr><td>Bufor cytrynianowy/roztwór demaskujący antygen</td><td>Vector Labs</td><td>H-3300</td><td></td></tr><tr><td>Olej kukurydziany</td><td>Sigma</td><td>C8627</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór demucyfizujący</td><td>*</td><td>*</td><td>Dla 500 ml: 50 ml glicerolu, 50 ml Tris 0,1M pH8,8, 100 ml EtOH, 300 ml soli fizjologicznej (0,9% NaCl w wodzie), DTT 1,7 g. Roztwór odmukowiający można przygotować z wyprzedzeniem i przechowywać, ale DTT należy dodać tuż przed inkubacją (340 mg/100 ml).</td></tr><tr><td>Woda uzdatniona DEPC</td><td>Life Technologies</td><td>750023</td><td></td></tr><tr><td>DTT</td><td>Sigma 101509944</td><td></td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma</td><td>O3690</td><td>0,5 M</td></tr><tr><td>Etanol</td><td>Fisher Scientific</td><td>E/0650DF/17</td><td></td></tr><tr><td>Bibuła filtracyjna</td><td>Whatman</td><td>3000917</td><td></td></tr><tr><td>Formaldehyd</td><td>Sigma</td><td>F8775</td><td></td></tr><tr><td>Formalina&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>SLBL11382V</td><td>Neutralna buforowana formalina</td></tr><tr><td>Formamid</td><td>Sigma</td><td>F5786</td><td></td></tr><tr><td>Aldehye glutaraldehye</td><td>Sigma</td><td>G6257</td><td></td></tr><tr><td>H2O2</td><td>Sigma</td><td>216763</td><td></td></tr><tr><td>Hematoksylina</td><td>Raymond A Jagnięcina</td><td>12698616</td><td></td></tr><tr><td>HBSS</td><td>Gibco</td><td>14175-053</td><td>HBSS (-MgCl2+; -CaCl2)</td></tr><tr><td>Bufor hybrydyzacyjny</td><td>*</td><td>*</td><td>&nbsp; 5 i razy; SSC, 50% formamidu, 5% SDS, 1 mg/ml heparyny, 1 mg/ml tRNA wątroby cielęcej</td></tr><tr><td>Hydrochinon</td><td>Sigma</td><td>H9003</td><td></td></tr><tr><td>ImmPACT DAB Peroksydaza</td><td>Vector Labs</td><td>SK-4105</td><td></td></tr><tr><td>Immpress HRP Anti-Mouse IgG</td><td>Kit Vector Labs</td><td>MP-7402</td><td></td></tr><tr><td>Immpress HRP Anti-Rabbit IgG</td><td>Kit Vector Labs</td><td>MP-7401</td><td></td></tr><tr><td>Proszek do tkanki jelitowej</td><td>*</td><td>*</td><td>Jelito cienkie 5 dorosłych myszy połączono i zhomogenizowano w minimalnej objętości lodowatego PBS. Do homogenizowanego jelita dodano 4 objętości lodowatego acetonu, który dokładnie wymieszano i inkubowano na lodzie przez 30 minut. Zostało to odwirowane, a granulat przemyto lodowatym acetonem. Poddano je dalszemu odwirowaniu, a powstały granulat rozprowadzono na bibule filtracyjnej i pozostawiono do wyschnięcia. Po dokładnym wyschnięciu materiał został zmielony na drobny proszek za pomocą tłuczka i moździerza.</td></tr><tr><td>K-żelazocyjanek</td><td>Sigma</td><td>P-3667</td><td></td></tr><tr><td>K-żelazocyjanek</td><td>Sigma</td><td>P3289</td><td></td></tr><tr><td>Lewamizol</td><td>Sigma</td><td>L0380000</td><td></td></tr><tr><td>Methacarn</td><td>*</td><td>*</td><td>60% Metanol:30% Chloroform:10% Kwas octowy</td></tr><tr><td>Metanol</td><td>Fisher Scientific</td><td>M/4000/17</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Sigma</td><td>M8266</td><td></td></tr><tr><td>Normalna surowica kozia</td><td>Vector Labs</td><td>S-1012</td><td>NGS</td></tr><tr><td>Normalna surowica królicza</td><td>Dako</td><td>X0902</td><td>NRS</td></tr><tr><td>NTMT</td><td>*</td><td>*</td><td>100 mM NaCl, 100 mM Tris HCl, 50 mM MgCl2, 0,1% Tween20, 2 mM Lewamizol</td></tr><tr><td>PAP długopis</td><td>Vector</td><td>H-400</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyd</td><td>Sigma</td><td>P6148</td><td></td></tr><tr><td>PBT</td><td>*</td><td>*</td><td>0,5 M NaCl, 10 mM TrisHCL pH 7,5, 0,1% Tween 20</td></tr><tr><td>Penicylina / Streptomycyna</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td>100x roztwor</td></tr>.<tr><td>Sól fizjologiczna buforowana fosforanami (10x)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP3994</td><td>Rozcieńczony 1:10 wodą destylowaną do wykonania 1x</td></tr><tr><td>szkiełka PLL</td><td>Sigma</td><td>P0425-72EA</td><td>Szkiełka mikroskopowe z poli-L-lizyną</td></tr><tr><td>Proteinaza K</td><td>Sigma</td><td>P2308</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór proteinazy k</td><td>*</td><td>*</td><td>Rozcieńczyć proteinazę K w 200 &mikro; g/ml w 50 mM Tris, 5 mM EDTA.</td></tr><tr><td>Ralwax</td><td>BDH</td><td>36154 Roztwór</td> reduktora 7N<td></td></tr><tr><td></td><td>*</td><td>*</td><td>Aby przygotować 100 ml: 1 g hydrochinonu, 5 g siarczynu sodu i 100 ml wody destylowanej</td></tr><tr><td>RnaseA</td><td>Sigma</td><td>R6148</td><td></td></tr><tr><td>Sól fizjologiczna</td><td>*</td><td>*</td><td>0,9% NaCl w wodzie destylowanej</td></tr><tr><td>SDS</td><td>Sigma</td><td>I3771</td><td></td></tr><tr><td>Surowica owcza</td><td>Sigma</td><td>S3772</td><td></td></tr><tr><td>Azotan srebra</td><td>Sigma</td><td>S/1240/46</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór srebra</td><td>*</td><td>*</td><td>Aby przygotować 100 ml: 10 ml buforu octanowego, 87 ml wody destylowanej, 3 ml 1% azotanu</td></tr><tr><td>srebra Octan sodu</td><td>Fisher Scientific</td><td>S/2120/53</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek sodu</td><td>Sigma</td><td>S6753</td><td>NaCl</td></tr><tr><td>Siarczyn sodu</td><td>Sigma</td><td>239321</td><td></td></tr><tr><td>SSC</td><td>Sigma</td><td>93017</td><td>20x sól fizjologiczna cytrynian sodu</td></tr><tr><td>Taśma chirurgiczna</td><td>Fisher Scientific</td><td>12960495</td><td></td></tr><tr><td>Tamoxifen</td><td>Sigma</td><td>T5648</td><td>TAM, wstrzyknąć, nie dopuszczając do zbytniego ostygnięcia roztworu, ponieważ związek wypadnie z roztworu. Roztwór może być ponownie użyty &ndash; Przechowywać w temperaturze -20 & C między użyciami nie podgrzewaj więcej niż dwa razy.</td></tr><tr><td>Sygnalizacja komórkowa</td> <td>TBS/T</td><td>#9997</td><td></td></tr><tr><td>Chlorowodorek trietanoloaminy</td><td>Sigma</td><td>T1502</td><td></td></tr><tr><td>Tris-HCL</td><td>Invitrogen</td><td>15567-027</td><td></td></tr><tr><td>Tween20</td><td>Sigma</td><td>TP9416</td><td></td></tr><tr><td>VectaMount</td><td>Vector Labs</td><td>H-5000</td><td></td></tr><tr><td>VectaShield Hardset Medium montażowe z DAPI</td><td>Vector Labs</td><td>H-1500</td><td></td></tr><tr><td>Vectastain ABC Kit</td><td>Vector Labs</td><td>PK-4001</td><td></td></tr><tr><td>X-gal</td><td>Promega</td><td>V3941</td><td></td></tr><tr><td>Utrwalacz X-gal</td><td></td>*<td>*</td><td>2% formaldehydu, 0,1% aldehydu glutarowego w 1x</td></tr><tr><td>barwie PBS X-gal</td><td>*</td><td>*</td><td>Barwienie X-gal; 200 &#956; l X-gal (A) w 50 ml roztworu B (0,214 g MgCl2, 0,48 g K-żelazocyjanku, 0,734 g K-żelazocyjanku w 500 ml PBS).&nbsp; Roztwór B można przygotować wcześniej i przechowywać w temperaturze 4 & stopni; C</td></tr><tr><td>Ksylen</td><td>Fisher Scientific</td><td>X/0200/21</td><td></td></tr></tbody></table>

protokoły analizy roli komórek panetha w regeneracji jelita mysiego przy użyciu warunkowych modeli myszy cre-lox

Protocols for Analyzing the Role of Paneth Cells in Regenerating the Murine Intestine using Conditional Cre-lox Mouse Models

Powierzchnia nabłonka jelita ssaków to dynamiczna tkanka, która odnawia się co 3 - 7 dni. Zrozumienie tego procesu odnowy pozwoliło zidentyfikować populację szybko cyklicznych jelitowych komórek macierzystych (ISC) charakteryzujących się ekspresją genu Lgr5. Są one wspierane przez spokojną populację komórek macierzystych, charakteryzującą się ekspresją Bmi-1, zdolną do zastąpienia ich w przypadku urazu. Badanie interakcji między tymi populacjami ma kluczowe znaczenie dla zrozumienia ich roli w chorobach i nowotworach. ISC istnieją w kryptach na powierzchni jelita, nisze te wspierają ISC w uzupełnianiu nabłonka. Interakcja między aktywnymi i spokojnymi ISC prawdopodobnie obejmuje inne zróżnicowane komórki w niszy, ponieważ wcześniej wykazano, że "macierzystość" ISC Lgr5 jest ściśle związana z obecnością sąsiednich komórek Panetha. Korzystając z warunkowych modeli myszy cre-lox, przetestowaliśmy efekt usunięcia większości aktywnych komórek ISC w obecności lub braku komórek Panetha. Tutaj opisujemy techniki i analizy podjęte w celu scharakteryzowania jelita i wykazania, że komórki Panetha odgrywają kluczową rolę w niszy ISC we wspomaganiu powrotu do zdrowia po znacznym zniekształceniu.

Komórki macierzyste nabłonka jelitowego (ISC) są zmieszane z komórkami Panetha. Komórki te są zróżnicowanym potomstwem ISC, które wspiera ISC i zapewnia ochronę przeciwbakteryjną. Tutaj pokazujemy, w jaki sposób wykorzystaliśmy transgeniczne warunkowe modele myszy, aby ustalić, że komórki Panetha odgrywają kluczową rolę w utrzymaniu nabłonka jelitowego.

Protokoły analizy roli komórek Panetha w regeneracji jelita mysiego przy użyciu warunkowych modeli myszy Cre-lox

The epithelial surface of the mammalian intestine is a dynamic tissue that renews every 3 - 7 days. Understanding this renewal process identified a ...

Ogólnym celem tej procedury sekcji jest zademonstrowanie sposobu izolacji i przygotowania jelita myszy do późniejszych technik charakterystyki. Metoda ta może zostać wykorzystana do zbadania zdolności komórek macierzystych jelit do ponownej populacji jelita po przeprowadzeniu procedury eksperymentalnej. Główną zaletą tej techniki jest możliwość jej zastosowania po dowolnej technice, procedurze lub manipulacji genetycznej z użyciem technologii CRISPR/Cas9. Należy rozpocząć od ułożenia uśpionej dorosłej myszy w pozycji grzbietnej i zwilżenia futra 70% etanolem.Następnie za pomocą nożyczek należy otworzyć jamę otrzewnową wzdłuż linii środkowej i zabezpieczyć żołądek pęsetą. Kolejnym krokiem jest przecięcie połączenia z przełykiem i delikatne pociągnięcie żołądka w celu usunięcia jelita cienkiego aż do wyrostka robaczkowego. Następnie należy delikatnie pociągnąć wyrostek robaczkowy, aby usunąć jelito grube aż do odbytu.Po wyizolowaniu jelit usuń żołądek w wyrostku i za pomocą strzykawki z zaokrągloną końcówką pipety przepłucz jelita roztworem PBS. Natychmiast po przepłukaniu przetnij jelito na trzy równe odcinki: proksymalny, środkowy i dystalny. Następnie podziel każdy odcinek na fragmenty o długości jednego centymetra i umieść od trzech do pięciu fragmentów tkanki na środku kawałka taśmy chirurgicznej o wymiarach dwa na dwa centymetry. Po przytwierdzeniu wszystkich tkanek w formacji piramidy, zaklej taśmę wzdłuż fragmentów, tworząc strukturę przypominającą stos polan.Następnie umieść taśmę w naczyniu o płaskim dnie zawierającym co najmniej 10-krotną objętości tkanki neutralny, buforowany utrwalacz formalowy i przechowuj próbki w temperaturze 4 °C przed zatopieniem i krojeniem. Po utrwaleniu przenieś tkankę do naczynia o płaskim dnie zawierającego co najmniej 10-krotną objętość 70% etanolu w stosunku do objętości tkanki, aby utrwalić tkankę w Metconie bezpośrednio po przepłukaniu. Potnij jelito na trzy sekcje o jednakowej wielkości, tak jak właśnie zaprezentowano.Następnie ułóż każdy fragment obok siebie na kawałku papieru filtracyjnego o wymiarach 15 na 15 centymetrów i użyj nożyczek sprężynowych, aby rozciąć fragmenty na FOSS, gdy wszystkie sekcje zostaną rozdzielone. Przenieś papier filtracyjny do szklanego naczynia zawierającego świeżo przygotowany Metcon na okres od 3 do 24 godzin w temperaturze pokojowej. Po zakończeniu utrwalania, użyj pincety, aby pojedynczo chwytać końce każdego z fragmentów jelita i nawijaj tkanki na pincetę, tworząc pojedyncze rolki typu Swiss roll. Zabezpiecz każdą rolkę, lekko rozwierając pincetę i wbijając igłę 25 gauge przez tkankę.Następnie zwinięte tkanki umieść w naczyniu o płaskim dnie zawierającym co najmniej 10-krotną w stosunku do objętości tkanek ilość neutralnego buforu i utrwalacza na co najmniej jedną godzinę przed rozpoczęciem procesu wizualizacji całego preparatu (whole mount) pęknięcia tkanki. Wlej stopiony surowy wosk zmieszany z olejem mineralnym do szalek Petriego o średnicy 15 cm. Następnie, bezpośrednio po przepłukaniu jelit lodowatym PBS, przepłucz tkanki 25 ml lodowatego utrwalacza ex cal.Po utrwaleniu podziel jelita na od trzech do pięciu równych fragmentów i umieść każdy z nich na jednej z schłodzonych płytek woskowych. Przypnij oba końce tak, aby fragmenty były lekko naciągnięte, a linie krezkowe znajdowały się u góry płytek. Odetnij nadmiar krezki.Następnie za pomocą nożyczek sprężynowych przeciąć jelita wzdłuż, przypinając je w miarę otwierania, aż wszystkie sekcje zostaną przypięte. Po upływie co najmniej jednej godziny w temperaturze 4 °C zalać płytki wystarczającą ilością fiksatywy xal, aby przykryć wszystkie tkanki. Za pomocą pipety o pojemności 25 ml lub strzykawki usunąć fiksatywę i jednokrotnie przemyć tkanki 30 ml PBS.Następnie przykryć przekroje 30 mililitrami roztworu ujednolicającego DTTD i inkubować przez 30 do 60 minut w temperaturze pokojowej przy ciągłym kołysaniu. Po zakończeniu inkubacji usunąć roztwór odtłuszczający za pomocą pipety 25 mililitrów lub strzykawki, a następnie zalać tkanki kolejnymi 30 mililitrami PBS. Po przemyciu użyć pipety Pasteura, aby usunąć śluz wraz z PBS.Zastąp PBS 30 mililitrami xal w celu przeprowadzenia barwienia przez noc w temperaturze pokojowej, w ciemności, przy łagodnym mieszaniu na platformie kołyszącej. Następnego ranka, jeśli przekroje nabiorą niebiesko-zielonego zabarwienia, zastąp xal 30 mililitrami PBS. Po trzech minutach łagodnego mieszania przygotuj tzw. swiss rolls, zgodnie z wcześniejszą demonstracją, a następnie umieść tkanki w szerokoustnym naczyniu o płaskim dnie zawierającym odpowiedni utrwalacz w objętości co najmniej 10-krotnie większej niż objętość tkanki, w temperaturze czterech stopni Celsjusza, na co najmniej 24 godziny przed zatopieniem i skrawaniem.Przy użyciu warunkowego reportera ROSA 26 R Laxy można zaobserwować 100% rekombinacji trzy dni po indukcji w jelicie cienkim, wykorzystując DNA wyekstrahowane z rekombinowanych tkanek. qPCR dla rekombinowanych alleli wykazał nieistotny statystycznie wzrost rekombinacji w systemie VI crease, co potencjalnie wynika z braku obserwacji rekombinacji w komórkach Panetha. W przypadku zastosowania systemu ah crease z reporterem laxy, oba systemy wykazały również całkowitą utratę rekombinowanych komórek trzy dni po indukcji.Dane dotyczące mitozy oraz wysokości komórkowej krypt K wskazały, że system ah H Cree mógł ulec regeneracji, prawdopodobnie dzięki repopulacji przez niepołączone komórki macierzyste jelit. W przeciwieństwie do tego, system villain Cree nie odzyskał sprawności, mimo zachowania komórek krypt nabłonkowych. Co więcej, komórki krypt u myszy vi Cree Cantin B nie wykazywały proliferacji i nie posiadały ekspresji markera komórek macierzystych jelit.EM cztery. Podobnie jak w przypadku krypt u myszy ah cre, komórki PTH uległy apoptozie po delecji Caden b wyłącznie w obrębie systemu VI Cree. Po opanowaniu techniki czas jej wykonania wynosi około 10 minut.Ważne jest zminimalizowanie opóźnień, aby zapobiec degradacji tkanek. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś mieć dobrą wiedzę na temat tego, jak usunąć jelito myszy w celu przeprowadzenia dalszych analiz.

protocols-for-analyzing-role-paneth-cells-regenerating-murine

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia rozwojowa

W tym filmie opisujemy procedurę chirurgiczną polegającą na generowaniu pętli proksymalnej okrężnicy myszy lub segmentu pcLoop, po której następuje doświetlna iniekcja markerów fluorescencyjnych do segmentu w celu zbadania przepuszczalności nabłonka jelitowego.

Generowanie mysiego modelu pętli proksymalnej jelita grubego: procedura chirurgiczna mająca na celu wygenerowanie pętli proksymalnej jelita grubego i pomiar przepuszczalności jelit poprzez wykrycie markerów fluorescencyjnych w surowicy po wstrzyknięciu doświetlnym

Dokładna identyfikacja i lokalizacja komórek nabłonkowych wzdłuż błony śluzowej jelit są niezbędne do zdefiniowania różnych linii komórkowych. Prawidłowe obrazowanie tkanek jelitowych ma kluczowe znaczenie dla identyfikacji wzorców ekspresji białek z maksymalną rozdzielczością. Badanie to ma na celu nakreślenie optymalnych metod i warunków przetwarzania tkanek jelitowych myszy.

Ulepszona technika walcowania szwajcarskiego do przygotowania tkanki jelitowej do analiz immunohistochemicznych i immunofluorescencyjnych

Przezroczyste jelito C. elegans może służyć jako "komora tkankowa in vivo" do badania biogenezy błony wierzchołkowej i światła na poziomie pojedynczej komórki i subkomórkowej podczas tubulingenezy wielokomórkowej. Protokół ten opisuje, w jaki sposób połączyć standardowe znakowanie, genetykę utraty funkcji/RNAi i podejścia mikroskopowe w celu przeanalizowania tych procesów na poziomie molekularnym.

Jelito C. elegans jako model morfogenezy światła międzykomórkowego i biogenezy błony spolaryzowanej in vivo na poziomie pojedynczej komórki: znakowanie przez barwienie przeciwciałami, analiza utraty funkcji RNAi i obrazowanie

Hodowle organoidów jelitowych są tworzone z całych krypt i nie pozwalają na analizę samoodnowy i różnicowania w sposób specyficzny dla komórki. Protokół ten opisuje rekonstrukcję posortowanych komórek macierzystych (Lgr5+) i niszowych (Paneth), które dają początek organoidom, umożliwiając jednocześnie ich wcześniejszą modyfikację biochemiczną i genetyczną oraz analizę funkcjonalną.

Test rekonstytucji organoidów (ORA) do analizy funkcjonalnej jelitowych komórek macierzystych i niszowych

Korzystając z mikroskopii przyżyciowej, przedstawiona tutaj metoda umożliwia wizualizację w czasie rzeczywistym wydalania komórek nabłonka jelitowego u żywych zwierząt. W związku z tym miejscowo wybarwiona błona śluzowa jelit (akryflawina i rodamina B-dekstran) znieczulonych myszy jest obrazowana do rozdzielczości pojedynczej komórki za pomocą mikroskopii konfokalnej.

Podejście oparte na mikroskopii przyżyciowej do oceny przepuszczalności jelit i wydajności wydalania komórek nabłonkowych

Rozregulowana funkcja bariery nabłonkowej jelit i reakcje immunologiczne są cechami charakterystycznymi nieswoistego zapalenia jelit, które pozostają słabo zbadane z powodu braku modeli fizjologicznych. W tym miejscu opisujemy model pętli jelitowej myszy, który wykorzystuje dobrze unaczyniony i zewnętrzny odcinek jelita do badania przepuszczalności błony śluzowej i rekrutacji leukocytów in vivo.

Funkcjonalna ocena przepuszczalności jelit i migracji przeznabłonkowej neutrofili u myszy przy użyciu standaryzowanego modelu pętli jelitowej

W tym protokole opisujemy, jak generować monowarstwy mysiego pierwotnego nabłonka jelita grubego bezpośrednio z krypt jelitowych. Zapewniamy eksperymentalne podejścia do generowania zlewających się monowarstw na filtrach przepuszczalnych, monowarstw konfluentnych do gojenia ran drapanych i badań biochemicznych oraz rzadkich i zlewających się monowarstw do analizy immunofluorescencyjnej.

Generowanie monowarstw nabłonka pierwotnego jelita grubego myszy z krypt jelitowych

Ten protokół oferuje szczegółowe instrukcje dotyczące tworzenia mysich organoidów jelita cienkiego, izolowania wrodzonych komórek limfoidalnych typu 1 od mysiej blaszki jelita cienkiego oraz ustanawiania trójwymiarowych (3D) kokultur między oboma typami komórek w celu zbadania dwukierunkowych interakcji między komórkami nabłonka jelitowego a wrodzonymi komórkami limfoidalnymi typu 1.

Współhodowla organoidów nabłonkowych mysiego jelita cienkiego z wrodzonymi komórkami limfoidalnymi

Przewód pokarmowy jest jednym z najbardziej wrażliwych organów na uszkodzenia podczas radioterapeutycznego leczenia raka. Jest to jednocześnie układ narządów o jednej z najwyższych zdolności regeneracyjnych po takich zniewagach. Przedstawiony protokół opisuje skuteczną metodę badania zdolności regeneracyjnych nabłonka jelitowego.

Regeneracja nabłonka jelit w odpowiedzi na promieniowanie jonizujące

Tutaj prezentujemy metodę uzyskiwania obrazów jelita po zranieniu wywołanym laserem. Poprzez wystawienie jelita myszy na działanie lasera wielofotonowego, utrata jednej lub wielu krypt jest indukowana lokalnie. Poprzez wielokrotne obrazowanie uszkodzonego obszaru przez miesiące, uchwycona jest dynamika regeneracji jelit w czasie rzeczywistym.

Ablacja laserowa i mikroskopia przyżyteczna w celu zbadania przebudowy jelit

Opisujemy protokół szczegółowo opisujący izolację mysich krypt okrężnicy w celu opracowania 3-wymiarowych kolonoidów. Ustalone okokrody mogą być następnie ostatecznie różnicowane, aby odzwierciedlić skład komórkowy nabłonka gospodarza przed otrzymaniem prowokacji zapalnej lub skierowaniem do utworzenia monowarstwy nabłonka.

Badanie nabłonkowego wpływu zapalenia jelit in vitro na ustalone mysie kolonoidy

Poznaj metodę izolacji jelita myszego do analizy komórek macierzystych nabłonka jelitowego i roli komórek Panetha w regeneracji. Technika umożliwia badanie repopulacji ISC po manipulacjach genetycznych.

Protokoły analizy roli komórek Panetha w regeneracji jelita mysiego przy użyciu warunkowych modeli myszy Cre-lox

Przeglądaj więcej filmów