Protokoły analizy roli komórek Panetha w regeneracji jelita mysiego przy użyciu warunkowych modeli myszy Cre-lox

Ogólnym celem tej procedury preparacji jest pokazanie, w jaki sposób wyizolować i przygotować jelito myszy do kolejnych technik charakteryzacji. Metoda ta może być wykorzystana do zbadania zdolności jelitowych komórek macierzystych do ponownego zasiedlenia jelita po procedurze eksperymentalnej. Główną zaletą tej techniki jest to, że można ją stosować zgodnie z dowolną techniką lub procedurą lub po manipulacji genami Korzystanie z technologii zamków rakowych Zacznij od umieszczenia uśpionej dorosłej myszy w pozycji leżącej na plecach i zwilżenia futra 70% etanolem.

Następnie za pomocą nożyczek otwórz jamę śródotrzewnową wzdłużnie wzdłuż linii środkowej i zabezpiecz żołądek kleszczami. Następnie odetnij połączenie z przełykiem i delikatnie pociągnij za żołądek, aby usunąć jelito cienkie aż do wyrostka robaczkowego. Następnie delikatnie pociągnij za wyrostek robaczkowy, aby usunąć jelito grube aż do odbytu.

Po wyizolowaniu jelit usuń żołądek w wyrostku robaczkowym i użyj strzykawki wyposażonej w tępo zakończoną końcówkę pipety, aby przepłukać jelita PBS natychmiast po przepłukaniu, przeciąć jelito na trzy równej wielkości: proksymalny, środkowy i dystalny odcinek. Następnie pokrój każdą sekcję na jednocentymetrowe kawałki i umieść od trzech do pięciu fragmentów tkanki na środku kawałka taśmy chirurgicznej o wymiarach dwa na dwa centymetry. W formacji piramidy, gdy wszystkie tkanki zostaną połączone, uszczelnij taśmę wokół kawałków wzdłużnie, tworząc stos kłód.

Następnie umieść taśmę w płaskim dnie pojemniku zawierającym co najmniej 10-krotność objętości neutralnej, buforowanej, formalnej i utrwalającej w stosunku do objętości tkanki i przechowuj próbki w temperaturze czterech stopni Celsjusza przed zatopieniem i podziałem. Po utrwaleniu należy przenieść tkankę do pojemnika o płaskim dnie, zawierającego co najmniej 10-krotność objętości 70% etanolu jako objętość tkanki w celu utrwalenia tkanki w Metcon natychmiast po spłukaniu. Pokrój jelito na trzy równej wielkości części, jak pokazano.

Następnie umieść każdą sekcję obok siebie na kawałku bibuły filtracyjnej o wymiarach 15 na 15 centymetrów i użyj nożyczek sprężynowych, aby otworzyć sekcje na FOSS, gdy wszystkie sekcje zostaną podzielone. Przenieś bibułę filtracyjną do szklanego naczynia zawierającego świeżo przygotowany Metcon na trzy do 24 godzin w temperaturze pokojowej pod koniec utrwalenia, użyj kleszczy, aby podnieść koniec każdego z kawałków jelita pojedynczo i owiń tkanki wokół kleszczy, aby utworzyć pojedyncze szwajcarskie bułki. Zabezpiecz każdą rolkę, lekko otwierając kleszcze i wkładając igłę o rozmiarze 25 przez tkankę.

Następnie umieść zwinięte tkanki w płaskim dnie zawierającym co najmniej 10-krotność objętości neutralnej buforowanej formuły i utrwalacza jako tkanki na co najmniej godzinę przed przetworzeniem w celu pełnej wizualizacji pęknięcia tkanki przez cały wierzchowiec. Wlej stopiony surowy wosk zmieszany z olejem mineralnym do 15-centymetrowych szalek Petriego. Następnie natychmiast po przepłukaniu jelit lodowatym PBS przepłucz tkanki 25 mililitrami lodowatego utrwalacza ex cal

Po utrwaleniu pokrój jelita na trzy do pięciu równych części i umieść każdą sekcję na jednej ze schłodzonych płytek woskowych. Przypnij każdy koniec tak, aby sekcje były lekko rozciągnięte z liniami krezkowymi na górze płytek. Przytnij nadmiar krezki.

Następnie użyj sprężynowych nożyczek z łukami, aby przeciąć wnętrzności wzdłużnie, przypinając je tak, jak są otwierane, gdy wszystkie sekcje zostały przypięte. Zalej płytki wystarczającą ilością utrwalacza xal, aby pokryć wszystkie tkanki po co najmniej godzinie w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Użyj pipety lub strzykawki o pojemności 25 mililitrów, aby usunąć utrwalacz i umyj chusteczki raz 30 mililitrami PBS.

Następnie przykryj sekcje 30 mililitrami roztworu ujednolicającego DTTD na 30 do 60 minut inkubacji w temperaturze pokojowej z kołysaniem. Pod koniec inkubacji usuń deifikujący roztwór za pomocą 25-mililitrowej pipety lub strzykawki i zalej tkanki kolejnymi 30 mililitrami PBS. Następnie użyj tylnej pipety, aby usunąć śluz za pomocą PBS po umyciu.

Zastąp PBS 30 mililitrami xal, aby uzyskać nocną plamę w temperaturze pokojowej w ciemności z delikatnym mieszaniem na kołyszącej się platformie następnego ranka. Jeśli na skrawkach pojawiła się niebiesko-zielona plama, zastąp xal 30 mililitrami PBS. Po trzech minutach delikatnego mieszania przygotuj szwajcarskie bułki, jak właśnie pokazano, i umieść tkanki w pojemniku z płaskim dnem o szerokich otworach, zawierającym co najmniej 10 razy większą objętość odpowiedniego utrwalacza niż objętość tkanki w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez co najmniej 24 godziny przed osadzeniem i pocięciem.

Korzystając z warunkowego reportera ROSA 26 R Laxy, 100% rekombinację można zaobserwować trzy dni po indukcji w jelicie cienkim przy użyciu DNA wyekstrahowanego z repołączonych łóżeczek. QPCR dla rekombinowanych alleli wykazał nieistotny wzrost rekombinacji w obrębie układu fałdowania VI, potencjalnie z powodu niezaobserwowanej rekombinacji w komórkach peth. Korzystając z systemu fałdowania AH z wykorzystaniem luźnego reportera, oba systemy wykazały również całkowitą utratę zrekombinowanych komórek po trzech dniach od indukcji.

Dane dotyczące mitozy i wysokości komórek K crypt wskazują, że system ah H Cree może się odbudować prawdopodobnie z powodu ponownego zasiedlenia przez niepołączone jelitowe komórki macierzyste. W przeciwieństwie do tego, złoczyńca Cree nie zdołał wyzdrowieć, mimo że zachował nabłonkowe komórki krypty. Co więcej, komórki kryptywne u myszy z grupy Vi Cree Cantin B nie były proliferacyjne i brakowało im ekspresji markera jelitowych komórek macierzystych.

EM cztery. W przeciwieństwie do krypt u myszy ah cre, komórki PTH uległy apoptozie po delecji Caden b tylko w systemie VI Cree. Po opanowaniu tej techniki można ją wykonać w około 10 minut.

Ważne jest, aby zminimalizować opóźnienia, aby zapobiec degradacji tkanek. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak usunąć jelito z myszy w celu dalszej analizy.