Ablacja laserowa i mikroskopia przyżyteczna w celu zbadania przebudowy jelit

Modele urazów są niezbędne do badania regeneracji in vivo, jednak badanie regeneracji w jelicie okazało się wyzwaniem technicznym. Brak protokołów obrazowania podłużnego uniemożliwił głębszy wgląd w dynamikę skali komórek i tkanek, które koordynują regenerację jelit. W tym protokole opisujemy metodę mikroskopii przyżyciowej, która lokalnie indukuje uszkodzenie tkanki w pojedynczej skali krypty i śledzi regeneracyjną odpowiedź nabłonka jelitowego u żywej myszy na uszkodzenia ablacji laserowej oparte na fotonach pojedynczych krypt lub większych pól jelitowych w sposób kontrolowany w czasie i przestrzeni.

Kolejne, długotrwałe, powtarzalne obrazowanie przyżyciowe umożliwia śledzenie uszkodzonego obszaru w czasie i pozwala na monitorowanie dynamiki krypty podczas rekonwalescencji tkanek przez okres wielu tygodni. Indukuj myszy, wstrzykując tamoksyfen rozpuszczony w oleju słonecznikowym na cztery do sześciu tygodni przed zabiegiem. Zastosuj środek przeciwbólowy, wstrzyknij podskórnie 200 mikrolitrów buprenorfiny na 30 minut przed zabiegiem.

Karprofen należy podawać w wodzie pitnej na 24 godziny przed zabiegiem. Wprowadź autoklawowane sterylne narzędzia chirurgiczne do szafki na zagrożenia biologiczne. Włącz poduszkę grzewczą i ustaw temperaturę na 37 stopni Celsjusza.

Włącz komorę kontrolną temperatury mikroskopu co najmniej cztery godziny przed obrazowaniem. Utrzymuj stabilną temperaturę wewnątrz komory klimatycznej na poziomie 37 stopni Celsjusza. Włącz mikroskop dwufotonowy, skaner i laser.

Uruchom oprogramowanie do obrazowania. Dostosuj długość fali lasera do 960 nanometrów i otwórz migawkę. Znieczul mysz za pomocą dwóch do 3% izofluranu i umieść ją na poduszce grzewczej pokrytej sterylną szmatką.

Sprawdź głębokość znieczulenia, oceniając częstotliwość i jakość oddychania jednym oddechem na sekundę oraz sprawdzając odruch myszy. Przykryj oczy myszy maścią do oczu. Wstrzyknąć podskórnie 200 mikrolitrów wstępnie podgrzanej sterylnej soli fizjologicznej.

Ogol brzuch i usuń włosy. Zmień sterylną szmatkę w polu operacyjnym. Włóż sondę doodbytniczą, aby monitorować temperaturę myszy.

Temperatura powinna wynosić około 37 stopni Celsjusza. Załóż nową parę sterylnych rękawiczek. Oczyść obszar operacyjny okrężną ręką naprzemiennie szorując roztworem antyseptycznym, a następnie trzykrotnie 80% etanolem.

Przykryj mysz sterylną obłożeniem chirurgicznym. Sprawdź refleks myszy. Wykonaj 10-milimetrowe pionowe nacięcie linii środkowej przez skórę za pomocą sterylnego skalpela.

Naciąć linea alba za pomocą nożyczek, aby oddzielić mięśnie proste brzucha i otworzyć brzuch. Znajdź jelito ślepe myszy za pomocą sterylnego bawełnianego wacika nasączonego podgrzaną solą fizjologiczną, aby użyć go jako punktu odniesienia. Zrób małe nacięcie na kawałku gazy, zwilż go w podgrzanym sterylnym roztworze soli fizjologicznej i umieść nad nacięciem.

Wyjmij jelito sterylnymi wacikami nasączonymi podgrzanym sterylnym roztworem soli fizjologicznej. Utrzymuj nawodnienie jelita, dodając wysterylizowaną, wstępnie podgrzaną sól fizjologiczną. Przenieś mysz do podgrzanego sterylnego pudełka do obrazowania.

Umieść jelito na sterylnym szkle. Umieść głowę myszy w rurce inhalacyjnej zestawu do obrazowania. W razie potrzeby zabezpiecz mysz sterylną elastyczną folią i taśmą.

Umieść pudełko do obrazowania zawierające mysz w komorze mikroskopu. Monitoruj mysz podczas obrazowania, sprawdzając częstotliwość i głębokość oddechu oraz temperaturę za pomocą sondy doodbytniczej co 15 minut. Izofluran powinien być utrzymywany w zakresie od jednego do 2%Znajdź obszar w jelicie za pomocą adresów IP mikroskopu.

Uzyskaj szeroki widok pola zainteresowania obszaru zainteresowania za pomocą wewnętrznej kamery mikroskopu. Zobrazuj obszar zainteresowania za pomocą lasera 960 nm mikroskopu wielofotonowego. Dostosuj moc lasera i długość fali zgodnie z fluoroformami użytymi w eksperymencie.

W tym przykładzie błona krypt wyrażona jest białkiem czerwonej fluorescencji i jest znakowana stochastycznie zielonym białkiem fluorescencyjnym po indukcji niską dawką tamoksyfenu. Uzyskaj stos Z o krokach od 10 do 20 mikronów w obszarze zainteresowania. Wybierz pojedynczą pozycję lub wiele pozycji z obrazu kafelka.

Użyj funkcji kalibracji punktu naruszenia w oprogramowaniu do obrazowania przy rozdzielczości 32 i 124 na 124 piksele z prędkością skanowania 400 Hz, korzystając z właściwości skanowania dwukierunkowego przez trzy do 10 sekund, w zależności od wielkości zamierzonego uszkodzenia. Inicjację uszkodzenia w obszarze krypty można rozpoznać po wzroście autofluorescencji zarówno w kanale zielonym, jak i czerwonym. Po ablacji zdobądź stosy Z uszkodzonych obszarów, aby potwierdzić lokalizację i zakres obrażeń.

Powtórz poprzednie dwa kroki dla wielu regionów w tej samej myszy. Umieść mysz jeszcze pod narkozą na sterylnym obszarze do szycia i przykryj sterylną serwetą. Włóż odsłonięte jelito z powrotem do jamy brzusznej za pomocą sterylnych wacików nasączonych podgrzaną sterylną solą fizjologiczną.

Zszyj linię białą, wykonując prosty szew ciągły za pomocą szwu wchłanialnego. Zamknij końce szwu węzłami chirurgicznymi. Powtórz ten sam krok z warstwą skóry.

Wyłączyć stację izofranu, oczyścić i wysterylizować komorę obrazowania oraz wkładkę. Pozwól myszy dojść do siebie po operacji, podczas gdy klatka jest umieszczona na poduszce grzewczej na godzinę. Wstrzyknąć podskórnie 200 mikrolitrów buprenorfiny sześć do 12 godzin po operacji.

Karprofen należy podawać w wodzie pitnej przez 72 godziny po zabiegu. Zważ mysz i monitoruj dobrostan codziennie przez tydzień po operacji. W drugim punkcie czasowym co najmniej tydzień po pierwszej sesji obrazowania powtórz operację i obrazowanie przyżyciowe.

Użyj wzoru naczyń krwionośnych, aby znaleźć ten sam obraz obszarów zainteresowania w pierwszym punkcie czasowym. Jeśli mysz nie ma być obrazowana w innym punkcie czasowym, poświęć mysz, wykonując zwichnięcie szyjki macicy w znieczuleniu. W przeciwnym razie kontynuuj zamknięcie pola operacyjnego i opiekę pooperacyjną.

Myszom K19-Cre ERT mTmG wstrzyknięto tamoksyfen w celu wywołania stochastycznego znakowania komórek GFP na cztery do sześciu tygodni przed operacją i pierwszą sesją obrazowania. Po chirurgicznym naświetleniu jelita myszy i uzyskaniu obrazów kamerowych i fluorescencyjnych obszaru zainteresowania, ustawienia punktu naruszenia lasera wielofotonowego są wykorzystywane do ablacji krypt. Inicjację uszkodzenia można rozpoznać po wzroście autofluorescencji zarówno w kanale zielonym, jak i czerwonym.

Ta sama procedura jest powtarzana miesiąc później, a układ naczyniowy jest używany jako punkt orientacyjny, aby znaleźć ten sam region. Korzystając z modelu konfetti Lgr5-eGFP, krypty oznaczone różnymi kolorami mogą być śledzone w czasie, aby odwzorować dynamikę odzyskiwania. W tym przykładzie krypty w kolorze zielonym wyrażają Lgr5 Cre, a krypta w kolorze magenta jest oznaczona kolorem konfetti.

Dwa tygodnie po ablacji laserowej obserwuje się różne tryby regeneracji. Niektóre regiony pozostają niezmienione, podczas gdy inne wykazują przemodelowanie w postaci rozszczepienia krypty, a więc podziału jednej krypty na dwie lub fuzji, połączenia dwóch krypt w jedną, lub zniknięcia krypty. Ablacja laserowa w połączeniu z metodą mikroskopii przyżyciowej ogranicza uszkodzenia do określonego obszaru zainteresowania.

Dzięki temu możemy kontrolować lokalizację uszkodzeń, a także ich rozmiar. Nasilenie uszkodzeń można modulować w celu ablacji krypt lub całych pól jelitowych, aby poinformować nas o reakcji regeneracyjnej w skali krypty. Oprócz kontroli przestrzennej, ablacja laserowa pozwala również na precyzyjne określenie czasu wystąpienia uszkodzenia, a także na obrazowanie tego samego narządu zarówno w warunkach homeostatycznych, jak i regeneracyjnych u tej samej myszy, przewyższając w ten sposób precyzję poprzednich modeli urazów.

Zastosowanie ablacji laserowej i powtarzalnego obrazowania przyżyciowego może być wykorzystane jako platforma dla wielu pytań badawczych i różnych obszarów naukowych, które obejmują regenerację, immunologię i badania nad rakiem.