Obrazowanie w czasie rzeczywistym dynamiki powierzchni komórek roślinnych za pomocą mikroskopii epifluorescencyjnej o zmiennym kącie

Ogólnym celem niniejszej procedury jest obserwacja ruchu białek znakowanych fluorescencyjnie na powierzchniach komórek roślinnych przy użyciu epi-mikroskopii fluorescencyjnej pod zmiennym kątem. Metoda ta może przyczynić się do postępów w dziedzinie biologii komórki roślinnej, na przykład w badaniach nad sposobem funkcjonowania białek na powierzchniach komórek roślinnych. Główną zaletą tej techniki jest możliwość wizualizacji dynamiki białek znakowanych fluorescencyjnie w czasie rzeczywistym przed rozpoczęciem procedury.

Przeprowadź kalibrację centrowania i ogniskowania lasera mikroskopu zgodnie z instrukcjami producenta. Następnie, wykorzystując wolną ścieżkę optyczną obiektywu, zlokalizuj środek sufitu w pomieszczeniu mikroskopowym i zaznacz to miejsce kolorową plombą. W kolejnym kroku oświetl sufit za pomocą obiektywu i przesuń oświetlony obszar do pozycji centralnej.

Następnie należy ustawić ostrość lasera i precyzyjnie dostroić jego położenie względem centrum sufitu. Centrowanie i ogniskowanie lasera są kluczowe dla pomyślnej obserwacji z wykorzystaniem epifluorescencyjnego mikroskopu o zmiennym kącie (VAEM). Przed rozpoczęciem eksperymentu użytkownicy powinni przejść szkolenie przeprowadzone przez wykwalifikowanego pracownika firmy produkującej mikroskop.

Po przygotowaniu mikroskopu nanieś 30 µl buforu podstawowego na środek szkiełka przedmiotowego o wymiarach 76 x 26 mm. Następnie za pomocą nożyczek sekcyjnych odetnij koleinkę z siedmiodniowego siewki i ułóż ją stroną obserwacyjną do góry na kropli buforu podstawowego. Następnie dodaj 30 µl buforu podstawowego na środek pola o wymiarach 18 x 18 mm.

Przykryj próbkę szkiełkiem podstawowym, a następnie odwróć je do góry dnem. Delikatnie przytrzymaj krawędź szkiełka pęsetą; napięcie powierzchniowe zapobiegnie spłynięciu kropli. Połóż przeciwległą krawędź na szkiełku przedmiotowym w taki sposób, aby bufor znajdował się nad wprowadzeniem co.

Następnie, trzymając krawędź szkiełka nakrywnego na preparacie, należy dostosować położenie kropli tak, aby znajdowała się ona bezpośrednio nad próbką oleiny, a następnie opuścić szkiełko nakrywne. Jeśli nie powstały pęcherzyki powietrza, należy za pomocą chusteczek beztkaninowych zebrać nadmiar buforu i niezwłocznie przenieść preparat pod mikroskop.

Przy użyciu oświetlenia w polu jasnym należy wybrać komórki do obserwacji. Następnie należy potwierdzić obecność białka fluorescencyjnego i użyć oświetlenia epi-fluorescencyjnego, aby ustawić pozycję osi Z na powierzchni komórki. Aby przeprowadzić VAEM, należy użyć sterownika do zmiany kąta wpadania wiązki lasera.

Stopniowo, uważnie monitorując obraz na żywo. Początkowo obraz będzie wydawał się rozmyty. Wraz ze zwiększaniem kąta lasera obraz VAEM stanie się mniej rozmyty, aż w końcu powstanie wyraźny obraz.

W tym momencie należy zaprzestać zwiększania kąta lasera. Teraz należy precyzyjnie dostroić kąt wpadania wiązki lasera, aby uzyskać lepszy obraz, dostosowując w razie potrzeby parametry optyczne oraz parametry czujnika obrazu.

Następnie, korzystając z komercyjnego oprogramowania do mikroskopu, zarejestruj film w postaci wielostronicowego pliku obrazu TIFF. Przedstawiony tutaj film ukazuje migotanie kropek znakowanych GFP na powierzchni komórek modelu STA. Aby określić czas rezydencji kropek DOT znakowanych GFP za pomocą programu Fiji, przejdź do menu otwierania plików i otwórz zarejestrowany wielostronicowy plik TIFF.

Użyj narzędzia wyboru linii prostej, aby wyznaczyć linię na interesującym obszarze. Następnie użyj wtyczki dynamic res slice dla stosów obrazów, aby wygenerować obraz wykresu. Wraz ze zmianą położenia linii, obraz wykresu będzie zmieniać się dynamicznie.

Zapisz obraz jako plik TIFF, korzystając z menu zapisu plików w formacie TIFF. Następnie, aby przeprowadzić redukcję szumów, przejdź do menu filtrów procesowych do rozmycia Gaussa i zastosuj filtr Gaussa do obrazów z chronografu. Parametr promienia sigma należy dostosować w zależności od potrzeb.

Używając narzędzia do dopasowania progu obrazu, wyodrębnij obszary sygnału poprzez progowanie, a następnie otwórz menu ustawień pomiarów. Następnie zaznacz prostokąt ograniczający w oknie ustawień pomiarów, wybierając minimalną możliwą liczbę pikseli. Następnie przejdź do menu analiza, analizuj cząsteczki.

Zmierz czas trwania interesującego punktu względem osi Y, sprawdź wyniki na wyświetlaczu i dodaj je do okien menedżera, aby przejrzeć wartości danych. Na koniec w menu tabeli wyników wybierz plik, zapisz jako i przetwórz zestaw danych czasów trwania obrazów punktów przy użyciu odpowiedniego oprogramowania analitycznego. Tutaj przedstawiono czasy przebywania 185 punktów GFP patrol one z 12 niezależnych komórek pomocniczych w ósmym edinie, zmierzone za pomocą analizy wykresu chm, zgodnie z ilustracją na wykresie.

Dopasowana funkcja gęstości wykazała, że większość kropek patrol one GFP przebywała w komórce pomocniczej od 2 do 10 sekund, z pikiem wynoszącym około 3,5 sekundy. Sugeruje to szybką egzocytozę i endocytozę pomp protonowych na powierzchni komórki pomocniczej. Po zapoznaniu się z tym materiałem wideo powinni Państwo posiadać dobrą wiedzę na temat tego, jak wizualizować i kwantyfikować dynamikę białek typu ary na powierzchni komórek roślinnych przy użyciu zmiennokątnej mikroskopii epifluorescencyjnej.