Obrazowanie w czasie rzeczywistym dynamiki powierzchni komórek roślinnych za pomocą mikroskopii epifluorescencyjnej o zmiennym kącie

Ogólnym celem tej procedury jest obserwacja ruchu fluorescencyjnie znakowanych białek na powierzchni komórek roślinnych za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej epi o zmiennym kącie. To naczynie może pomóc nam w postępie w dziedzinie biologii komórek roślin, na przykład w jaki sposób białka działają na powierzchni komórek płytki. Główną zaletą tej techniki jest to, że pozwala nam ona na wizualizację dynamiki białek ataku fluorescencyjnego w czasie rzeczywistym przed rozpoczęciem zabiegu.

Skalibruj laserowe centrowanie i ogniskowanie mikroskopu zgodnie z instrukcjami producenta. Następnie użyj ścieżki światła wolnej od soczewki obiektywu, aby zlokalizować środek sufitu w pomieszczeniu mikroskopowym i oznaczyć pozycję kolorową uszczelką. Następnie oświetl sufit soczewką obiektywu i przesuń oświetlany obszar do pozycji środkowej.

Następnie ustaw ostrość laser i dostosuj położenie lasera do środka sufitu. Centrowanie i ogniskowanie lasera jest bardzo ważne dla udanej obserwacji mikroskopu epi scent o zmiennym kącie lub VAEM. Użytkownicy powinni zostać przeszkoleni przez profesjonalną osobę z firmy produkującej mikroskopy przed rozpoczęciem eksperymentu.

Gdy mikroskop będzie gotowy, nałóż 30 mikrolitrów buforu podstawowego na środek szkiełka podstawowego o wymiarach 76 na 26 milimetrów. Następnie użyj nożyczek preparacyjnych, aby usunąć koleadynę z siedmiodniowej sadzonki i spławić koleadynę stroną obserwacyjną do góry na podstawowej kropli buforowej. Następnie dodaj 30 mikrolitrów buforu podstawowego na środek o wymiarach 18 na 18 milimetrów.

Nakryj szklaną i odwróć szklaną pokrywę do góry nogami. Delikatne napięcie powierzchniowe zapobiegnie upadkowi kropli, przytrzymując szklankę nakrywkową pęsetą na jednej krawędzi. Umieść przeciwległą krawędź na szkiełku tak, aby bufor znajdował się nad wprowadzeniem współ.

Następnie przytrzymując krawędź szkła nakrywkowego na szkiełku. Dostosuj położenie kropli tak, aby znajdowała się bezpośrednio nad próbką oleiny i upuść szkło nakrywkowe. Jeśli nie ma pęcherzyków powietrza, należy użyć niestrzępiących się chusteczek do wytarcia nadmiaru buforu i natychmiast przenieść preparat do mikroskopu.

Korzystając z oświetlenia w jasnym polu, wybierz komórki do obserwacji. Następnie potwierdź, że można zaobserwować białko fluorescencyjne i użyj oświetlenia fluorescencyjnego epi, aby ustawić pozycję osi Z na powierzchni komórki. Aby wykonać VAEM, użyj skrzynki sterownika, aby nachylić kąt wejścia wiązki laserowej.

Stopniowo, uważnie monitorując obraz na żywo. Początkowo obraz będzie wyglądał na rozmyty. Wraz ze wzrostem kąta lasera obraz VAEM stanie się mniej rozmyty, co ostatecznie zapewni wyraźny obraz.

W tym momencie przestań zwiększać kąt lasera. Teraz w porządku. Dostosuj kąt wejścia lasera, aby uzyskać lepszy obraz, dostosowując parametry czujnika optycznego i obrazu w razie potrzeby.

Następnie, korzystając z komercyjnego oprogramowania mikroskopowego, uzyskaj film jako wielostronicowy plik obrazu TIFF. Tutaj film pokazuje kropki oznaczone GFP na powierzchni komórek modelu STA. Aby określić ilościowo czas przebywania DOT oznaczony przez GFP przy użyciu Fidżi, przejdź do menu otwierania pliku i otwórz uzyskany wielostronicowy plik porady.

Użyj narzędzia do zaznaczania linii prostej, aby umieścić linię po interesującej Cię stronie. Następnie użyj wtyczki dynamic res slice do stosów obrazów, aby wygenerować obraz wykresu. Wraz ze zmianą linii obraz wykresu będzie się zmieniał dynamicznie.

Zapisz obraz jako plik TIFF w pliku, zapisz jako menu tiff. Następnie, aby wykonać redukcję szumów, przejdź do menu rozmycia gaussowskiego filtrów procesowych i zastosuj filtr gaussowski do obrazów chronografu. Parametr promienia sigma powinien być dostrojony w razie potrzeby.

Korzystając z narzędzia do regulacji progu obrazu, podziel obszary sygnału na segmenty według progowania i otwórz menu analizy zestawu pomiarów. Następnie sprawdź prostokąt ograniczający w oknie ustawionych pomiarów, wybierając minimalną możliwą liczbę pikseli. Następnie w menu analizuj, analizuj cząstki.

Zmierz czas interesującej Cię kropki względem osi Y i sprawdź wyświetlane wyniki oraz dodaj do pól menedżera, aby wyświetlić wartości danych. Na koniec w menu tabeli wyników wybierz plik, zapisz jako i przetwórz zestaw danych czasu trwania obrazu punktowego za pomocą odpowiedniego oprogramowania do analizy. Tutaj pokazano czasy przebywania 185 patroli GFP z jednej kropki z 12 niezależnych komórek pomocniczych w ósmym edin, mierzone za pomocą analizy wykresu chm, jak pokazano na wykresie.

Dopasowana funkcja gęstości ujawniła, że większość jednopunktowych patroli GFP przebywała w komórce pomocniczej przez okres od dwóch do 10 sekund, ze szczytem wynoszącym około 3,5 sekundy. Sugeruje to szybką endocytozę egzocytozy pomp protonowych na powierzchni komórki pomocniczej. Po pracy nad tym filmem powinieneś dobrze zrozumieć, jak wizualizować i określać ilościowo dynamikę białek typu arycznego na powierzchni komórek roślinnych za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej epi o zmiennym kącie.