Name: Obrazowanie w czasie rzeczywistym dynamiki powierzchni komórek roślinnych za pomocą mikroskopii epifluorescencyjnej o zmiennym kącie (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-12-12T14:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 31 s
Description: Poznaj metodę obrazowania dynamiki białek na powierzchni komórek roślinnych za pomocą mikroskopii epifluorescencyjnej o zmiennym kącie w Arabidopsis thaliana. Technika ta umożliwia wizualizację białek GFP-PATROL1 w czasie rzeczywistym.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Jestem wdzięczny Dr. Masaru Fujimoto za jego techniczne sugestie dotyczące VAEM. Jestem również wdzięczny prof. Koh Iba i dr Mimi Hashimoto-Sugimoto za dostarczenie roślin transgenicznych z GFP-PATROL1 oraz dyskusje na temat PATROL1. Dziękuję prof. Seiichiro Hasezawie za nieustające wsparcie dla mojej pracy. Prace te były wspierane przez Japońskie Towarzystwo Promocji Nauki (JSPS) grant KAKENHI numer 25711017.

1. Przygotowanie sadzonek
<ol>
	<li>Wysterylizuj nasiona.
	<ol>
		<li>Przygotować roztwór sterylizacyjny, dodając 500 μl NaClO (dostępny chlor: 5,0%) i 1 μl 10% Triton X-100 do 500 μl sterylnej wody.</li>
		<li>Umieść ok. 10 transgenicznych nasion A. thaliana niosących GFP-PATROL18 w probówce o pojemności 1,5 ml.</li>
		<li>Dodać 1 ml 70% roztworu etanolu i dobrze wymieszać, odwracając pięć razy. Pozostaw na 1 min.</li>
		<li>Obserwuj, jak nasiona opadają na dno tuby. W czystej komorze z przepływem laminarnym delikatnie usuń 70% etanolu za pomocą mikropipety i dodaj 1 ml roztworu sterylizacyjnego. Dobrze wymieszaj, odwracając pięć razy i odstaw na 5 minut. </li>
		<li>Umyj nasiona. Pracując w warunkach aseptycznych, na czystej ławce, delikatnie usuń roztwór za pomocą mikropipety i dodaj 1 ml sterylnej wody. Powtórz to pięć razy. Wysterylizowane nasiona można przechowywać w sterylnej wodzie o temperaturze 4 °C przez 2 dni.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wysterylizowane nasiona wysiewać na 0,5% zestalonej gumie gellan 1/2 pożywki Murashige i Skoog (pH 5,8)9. Przyklej pokrywkę do płytki za pomocą dwóch warstw taśmy chirurgicznej.</li>
	<li>Inkubować płytkę w ciemności w temperaturze 4 °C w komorze chłodniczej O/N.</li>
	<li>Przenieść płytkę do komory wzrostowej ustawionej na temperaturę 23,5 °C z 12-godzinnym/12-godzinnym cyklem jasno-ciemnym przy użyciu 100 μmol m−2 sek−1 białych świateł i inkubować przez 7 dni. Następnie można zbierać sadzonki z liścieniami o długości około 1 mm.</li>
</ol>
2. Montaż kropli z nieba okazów liścienia
UWAGA: Ważnym czynnikiem w przygotowaniu próbki do obserwacji VAEM jest unikanie umieszczania pęcherzyków powietrza między próbką a szkłem nakrywkowym. Bąbelki znacznie obniżają jakość obrazu VAEM, powodując różnice we współczynniku załamania światła. Prosta metoda, którą nazwaliśmy montażem "kropli nieba", może być zastosowana w celu uniknięcia pęcherzyków między liścieniami A. thaliana a szkłem nakrywkowym. Należy to zrobić bezpośrednio przed obserwacją.
<ol>
	<li>Umieścić 30 μl buforu bazowego [5 mM kwasu 2-(N-morfolino)-etanosulfonowego-Tris (MES-Tris) o pH 6,5, 50 mM KCl, 100 μM CaCl2] na środku szkiełka podstawowego (rozmiar: 76×26 mm, grubość: 1,0–1,2 mm).</li>
	<li>Usuń liścienie z 7-dniowej sadzonki za pomocą nożyczek do preparowania. Unieś liścienie stroną obserwacyjną skierowaną do góry na podstawowym spadku buforowym (rysunek 1, krok 1).</li>
	<li>Umieść 30 μl buforu podstawowego na środku szkła nakrywkowego (rozmiar: 18×18 mm, grubość: 0,12–0,17 mm) (Rysunek 1, krok 2). Delikatnie odwróć szklankę nakrywkową do góry nogami. Napięcie powierzchniowe zapobiegnie spadkowi bufora. Przytrzymaj szklankę nakrywkową pęsetą na jednej krawędzi. Umieść przeciwną krawędź na szkiełku podstawowym tak, aby kropla buforu znajdowała się w przybliżeniu powyżej liścienia.</li>
	<li>Trzymając krawędź szkła nakrywkowego nadal na szkiełku podstawowym i nadal przytrzymując przeciwległą krawędź pęsetą, wyreguluj położenie kropli buforowej pod szkłem nakrywkowym tak, aby znajdowała się bezpośrednio nad próbką liścienia (Rysunek 1, krok 3). Puść szklaną pokrywę. Umieść kroplę na próbce, dając preparat bez pęcherzyków powietrza.</li>
	<li>Zetrzyj nadmiar buforu za pomocą niestrzępiących się chusteczek. Natychmiast obserwować przygotowanie (patrz krok 3). 
	UWAGA: Nie ma potrzeby uszczelniania próbek.</li>
</ol>
3. Obserwacja VAEM i akwizycja filmów
UWAGA : System mikroskopowy TIRF9 używany w niniejszym badaniu jest opisany w następujący sposób: Mikroskop odwrócony jest wyposażony w jednostkę TIRF i soczewkę obiektywową TIRF o aperturze numerycznej 1,49. Do komputerowej kontroli kąta wejścia lasera używana jest skrzynka sterownicza. Zielone białko fluorescencyjne (GFP) jest wzbudzane za pomocą optycznie pompowanego lasera półprzewodnikowego o długości fali 488 nm, a fluorescencja jest wykrywana przez filtr pasmowo-przepustowy o długości fali 510–550 nm, aby zapobiec autofluorescencji chloroplastów. Zmierzona maksymalna wartość mocy wyjściowej światłowodu wynosi 13,0–13,5 mW. Do detekcji stosuje się system głowicy kamery EM-CCD (Electron Multipling Charge-Coupled Device) oraz jednostkę zmiany powiększenia kamery z mocowaniem C.
<ol>
	<li>Skalibruj centrowanie i ogniskowanie lasera zgodnie z instrukcjami producenta. 
	UWAGA: Ten krok ma kluczowe znaczenie dla precyzyjnych obserwacji VAEM. Zdecydowanie zaleca się przeprowadzanie okresowych kontroli procedur regulacji ścieżki lasera, odpowiednich dla posiadanego mikroskopu.
	<ol>
		<li>Określ centralną pozycję oświetloną ścieżką światła bez soczewek obiektywu na suficie sali mikroskopowej. Aby zaznaczyć środkową pozycję, umieść kolorową okrągłą uszczelkę na suficie (Rysunek 2, krok 1, 2).</li>
		<li>Oświetl sufit za pomocą soczewki obiektywu (Rysunek 2, krok 3, 4). Przesuń oświetlony obszar do pozycji środkowej (Rysunek 2, krok 5). Ustaw ostrość lasera (Rysunek 2, krok 6). Dostosuj położenie zogniskowanego lasera do środka (Rysunek 2, krok 7).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Ustaw próbkę na stoliku mikroskopu i wybierz komórki do obserwacji za pomocą oświetlenia jasnego pola.</li>
	<li>Sprawdź, czy białko fluorescencyjne można zaobserwować w komórkach i ustaw pozycję osi Z na powierzchni komórki za pomocą oświetlenia epifluorescencyjnego (ryc. 3A).</li>
	<li>Wykonaj obserwacje VAEM.
	<ol>
		<li>Stopniowo zwiększaj kąt wejścia wiązki laserowej za pomocą skrzynki sterownika. Jednocześnie uważnie monitoruj obraz na żywo. Początkowo obraz będzie rozmazany (rysunek 3B).</li>
		<li>Wraz ze wzrostem kąta lasera obraz VAEM stanie się mniej rozmyty, co ostatecznie zapewni wyraźny obraz (ryc. 3C i D). W tym momencie przestań zwiększać kąt lasera. Jeśli sygnał fluorescencji zostanie utracony, zmniejsz go do płytszego kąta.</li>
		<li>Dostosuj kąt wejścia lasera, aby uzyskać lepszy obraz. Dostrojenie położenia osi z może również poprawić jakość obrazu. W razie potrzeby dostosuj parametry optyczne (moc lasera, długość fali i zestaw filtrów) oraz parametry przetwornika obrazu [rozmiar obrazu, czas ekspozycji, wzmocnienie, digitizer i wzmocnienie zwielokrotniające elektrony (EM)]. 
		UWAGA: W przypadku opisanego powyżej sprzętu mikroskopowego TIRF reprezentatywne parametry są następujące. Powiększenie obiektywu tuż przed aparatem: 2X; Moc lasera: 1,0 mW; Rozmiar obrazu: 512 × 512 pikseli; Czas naświetlania: 100 ms; Zysk: 5×; Digitizer: 11 MHz; i wzmocnienie EM: 100.</li>
	</ol>
	</li>
	<li> Pobieranie filmu w postaci wielostronicowego pliku obrazu TIFF za pomocą komercyjnego oprogramowania mikroskopowego. Na zdjęciu film przedstawia kropki oznaczone GFP na powierzchni komórek szparkowych. 
	UWAGA: Warunki pozyskiwania reprezentatywnych obrazów są następujące. Tryb akwizycji: Przesyłanie strumieniowe do pamięci RAM; Liczba ramek: 600; i rozmiar wielostronicowego pliku TIFF: ~302 MB.</li>
</ol>
4. Analiza kymograficzna do ilościowego oznaczania czasu przebywania kropki znakowanej GFP przy użyciu oprogramowania Fidżi
<ol>
	<li>Zainstaluj oprogramowanie Fiji ("Fiji is Just ImageJ")10, korzystając z instrukcji autorów (http://fiji.sc/Fiji).</li>
	<li>Uruchom Fiji i otwórz uzyskany wielostronicowy plik TIFF za pomocą menu Fiji "File-Open".</li>
	<li>Umieść linię w interesującym Cię miejscu, korzystając z menu paska narzędzi Fidżi "Narzędzie do zaznaczania linii prostej". Opcjonalnie użyj narzędzia "Narzędzie do zaznaczania linii segmentowanych" lub "Narzędzie do zaznaczania linii odręcznie". W przedstawionych tutaj wynikach linia prosta o długości 100 pikseli (odpowiadająca 8,0 μm) została umieszczona na komórce pomocniczej (rysunek 4A).</li>
	<li>Utwórz obraz kimograficzny za pomocą menu Fidżi "Image-Stacks-Dynamic Reslice" (http://fiji.sc/Dynamic_Reslice) (Rysunek 4B). Opcjonalnie dostępne są również opcje "Odwróć w pionie" i "Obróć o 90 stopni" w oknie pola wyboru (nieużywane w prezentowanych tutaj wynikach). Osie x i y na obrazie kimografu wskazują odpowiednio położenie linii (100 pikseli odpowiada 8,0 μm) i czas obserwacji (600 pikseli odpowiada 60 sekundom). Jeśli obraz kimografu nie jest zadowalający, położenie i rodzaj (prosty, segmentowy i odręczny) linii na obrazie wielostronicowym może ulec zmianie. Wraz ze zmianą linii obraz kimografu zmienia się dynamicznie. Zapisz obraz kimograficzny jako plik TIFF za pomocą menu Fidżi "File-Save As-Tiff".</li>
	<li>Zmierz długość plamy w orientacji osi czasu.
	<ol>
		<li>Aby wykonać redukcję szumów, zastosuj filtr Gaussa do obrazów kimograficznych za pomocą menu Fidżi "Proces-Filtry-Rozmycie gaussowskie". Parametr "Sigma (Promień)" jest przestrajany (do prezentowanych wyników używany jest promień 1 piksela).</li>
		<li>Segmentuj obszary sygnału według progowania, korzystając z menu Fidżi "Image-Adjust-Threshold". 
		UWAGA: Do wyboru jest kilka algorytmów progowania. W prezentowanych wynikach wybrano algorytm "Yen" (Rysunek 4C).</li>
		<li>Przygotuj się do zmierzenia długości osi czasu (y) plamy za pomocą menu "Analyze-Set Measurements". Sprawdź "Prostokąt ograniczający" w oknie "Ustaw pomiary". Idealnie byłoby, gdyby ustawiony obszar był jak najmniejszy, aby wykluczyć hałas. W tym przypadku minimalny obszar został ustawiony na 50 pikseli. Zmierz długość osi czasu (y) plamy za pomocą menu "Analizuj-Analizuj cząstki". Aby uzyskać wartości wyników i udowodnić wiarygodność obszarów pomiaru, zaznacz pola "Wyświetl wyniki" i "Dodaj do menedżera".</li>
		<li>Wartości w kolumnie "Wysokość" to długości osi czasu (y) dla mierzonej plamy (Rysunek 4D). Zapisz wartości za pomocą menu tabeli wyników "Zapisz plik jako" oraz oblicz i przetwórz zestaw danych czasu trwania obrazu obiektu blob za pomocą pakietu statystycznego i/lub oprogramowania do arkusza kalkulacyjnego (Rysunek 4E).</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Konopka, C. A., Bednarek, S. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+the+dynamics+and+functional+redundancy+of+the+Arabidopsis+dynamin-related+isoforms+DRP1A+and+DRP1C+during+plant+development%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiol%22%5BJournal%5D)">Comparison of the dynamics and functional redundancy of the Arabidopsis dynamin-related isoforms DRP1A and DRP1C during plant development.</a> Plant Physiol. 147 (4), 1590-1602 (2008).</li>
<li>Fujimoto, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Arabidopsis+dynamin-related+proteins+DRP2B+and+DRP1A+participate+together+in+clathrin-coated+vesicle+formation+during+endocytosis%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+USA%22%5BJournal%5D)">Arabidopsis dynamin-related proteins DRP2B and DRP1A participate together in clathrin-coated vesicle formation during endocytosis.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 107 (13), 6094-6099 (2010).</li>
<li>Higaki, T., Sano, T., Hasezawa, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Actin+microfilament+dynamics+and+actin+side-binding+proteins+in+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Plant+Biol%22%5BJournal%5D)">Actin microfilament dynamics and actin side-binding proteins in plants.</a> Curr. Opin. Plant Biol. 10 (6), 549-556 (2007).</li>
<li>Rosero, A., Žársky, V., Cvrčková, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((AtFH1+formin+mutation+affects+actin+filament+and+microtubule+dynamics+in+Arabidopsis+thaliana%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Bot%22%5BJournal%5D)">AtFH1 formin mutation affects actin filament and microtubule dynamics in Arabidopsis thaliana.</a> J. Exp. Bot. 64 (2), 585-597 (2013).</li>
<li>Axelrod, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Total+internal+reflection+fluorescence+microscopy+in+cell+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Traffic%22%5BJournal%5D)">Total internal reflection fluorescence microscopy in cell biology.</a> Traffic. 2 (11), 764-774 (2001).</li>
<li>Konopka, C. A., Bednarek, S. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Variable-angle+epifluorescence+microscopy%3A+a+new+way+to+look+at+protein+dynamics+in+the+plant+cell+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+J%22%5BJournal%5D)">Variable-angle epifluorescence microscopy: a new way to look at protein dynamics in the plant cell cortex.</a> Plant J. 53 (1), 186-196 (2008).</li>
<li>Wan, Y., Ash, W. M., Fan, L., Hao, H., Kim, M. K., Lin, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Variable-angle+total+internal+reflection+fluorescence+microscopy+of+intact+cells+of+Arabidopsis+thaliana%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Methods%22%5BJournal%5D)">Variable-angle total internal reflection fluorescence microscopy of intact cells of Arabidopsis thaliana.</a> Plant Methods. 7 (27), (2011).</li>
<li>Hashimoto-Sugimoto, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Munc13-like+protein+in+Arabidopsis+mediates+H%2B-ATPase+translocation+that+is+essential+for+stomatal+responses%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Commun%22%5BJournal%5D)">A Munc13-like protein in Arabidopsis mediates H+-ATPase translocation that is essential for stomatal responses.</a> Nat. Commun. 4, 2215(2013).</li>
<li>Higaki, T., Hashimoto-Sugimoto, M., Akita, K., Iba, K., Hasezawa, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamics+and+environmental+responses+of+PATROL1+in+Arabidopsis+subsidiary+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell+Physiol%22%5BJournal%5D)">Dynamics and environmental responses of PATROL1 in Arabidopsis subsidiary cells.</a> Plant Cell Physiol. 55 (4), (2014).</li>
<li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fiji%3A+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nat. Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li>
<li>Chebli, Y., Kaneda, M., Zerzour, R., Geitmann, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+cell+wall+of+the+Arabidopsis+pollen+tube-spatial+distribution%2C+recycling%2C+and+network+formation+of+polysaccharides%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiol%22%5BJournal%5D)">The cell wall of the Arabidopsis pollen tube-spatial distribution, recycling, and network formation of polysaccharides.</a> Plant Physiol. 160 (4), 1940-1955 (2012).</li>
<li>Fujimoto, M., Suda, Y., Vernhettes, S., Nakano, A., Ueda, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phosphatidylinositol+3-kinase+and+4-kinase+have+distinct+roles+in+intracellular+trafficking+of+cellulose+synthase+complexes+in+Arabidopsis+thaliana%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell+Physiol%22%5BJournal%5D)">Phosphatidylinositol 3-kinase and 4-kinase have distinct roles in intracellular trafficking of cellulose synthase complexes in Arabidopsis thaliana.</a> Plant Cell Physiol. 56 (2), 287-298 (2015).</li>
<li>Li, X., Wang, X., Yang, Y., Li, R., He, Q., Fang, X., Luu, D. T., Maurel, C., Lin, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-molecule+analysis+of+PIP2%3B+1+dynamics+and+partitioning+reveals+multiple+modes+of+Arabidopsis+plasma+membrane+aquaporin+regulation%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">Single-molecule analysis of PIP2; 1 dynamics and partitioning reveals multiple modes of Arabidopsis plasma membrane aquaporin regulation.</a> Plant Cell. 23 (10), 3780-3797 (2011).</li>
<li>Li, R., Liu, P., Wan, Y., Chen, T., Wang, Q., Mettbach, U., Baluska, F., Samaj, J., Fang, X., Lucas, W. J., Lin, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+membrane+microdomain-associated+protein%2C+Arabidopsis+Flot1%2C+is+involved+in+a+clathrin-independent+endocytic+pathway+and+is+required+for+seedling+development%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">A membrane microdomain-associated protein, Arabidopsis Flot1, is involved in a clathrin-independent endocytic pathway and is required for seedling development.</a> Plant Cell. 24 (5), 2105-2122 (2012).</li>
<li>Staiger, C. J., Sheahan, M. B., Khurana, P., Wang, X., McCurdy, D. W., Blanchoin, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Actin+filament+dynamics+are+dominated+by+rapid+growth+and+severing+activity+in+the+Arabidopsis+cortical+array%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Actin filament dynamics are dominated by rapid growth and severing activity in the Arabidopsis cortical array.</a> J. Cell Biol. 184 (2), 269-280 (2009).</li>
<li>Ueda, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myosin-dependent+endoplasmic+reticulum+motility+and+F-actin+organization+in+plant+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+USA%22%5BJournal%5D)">Myosin-dependent endoplasmic reticulum motility and F-actin organization in plant cells.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 107 (15), 6894-6899 (2010).</li>
</ol>

Autor nie ma nic do zdradzienia.

W tym artykule wideo podano protokoły monitorowania i pomiaru dynamicznego zachowania kropek GFP-PATROL1 na kompleksie szparkowym Arabidopsis thaliana. Jak pokazano tutaj, obserwacja VAEM jest potężnym narzędziem do obrazowania na żywo powierzchni komórek roślinnych. W warunkach eksperymentalnych zastosowanych tutaj do monitorowania GFP-PATROL1, fotowybielanie fluorescencyjne było bardzo małe w próbce użytej do 1 minuty przechwytywania wideo, ponieważ bardzo czuły EM-CCD pozwala na użycie stosunkowo słabego lase...

Powierzchnia komórki roślinnej, w tym błona plazmatyczna i bezpośrednio przylegająca do niej cytoplazma, jest głównym regionem percepcji komórki roślinnej i integracji sygnałów biotycznych i abiotycznych ze środowiska zewnątrzkomórkowego. W odpowiedzi na te sygnały składniki powierzchni komórki, w tym białka błony plazmatycznej i cytoszkielet korowy, ulegają dynamicznym zmianom w skali czasu od sekund do minut1-4. W ten sposób obrazowanie białek fluorescencyjnych na powierzchni komórki w czasie rzeczywistym i w wysokiej rozdzielczości może rzucić światło na reakcje rośliny na sygnały środowiskowe na poziomie molekularnym.
Konfokalna laserowa mikroskopia skaningowa jest potężnym narzędziem do określania lokalizacji białek znakowanych fluorescencyjnie3, jednak często trudno jest monitorować dynamikę białek w czasie rzeczywistym ze względu na stosunkowo długi czas ich przechwytywania. Nową techniką monitorowania białek w komórce roślinnej w czasie rzeczywistym jest mikroskopia epifluorescencyjna o zmiennym kącie nachylenia (VAEM), która jest adaptacją sprzętu zwykle używanego do mikroskopii fluorescencji całkowitego wewnętrznego odbicia (TIRF). W mikroskopii TIRF fluorescencyjno-wzbudziające źródło światła jest ulotnym polem świetlnym, które jest generowane, gdy kąt wejścia lasera jest wystarczająco płytki, aby całkowicie wewnętrznie odbijać światło na granicy szkła i wody. Głębokość penetracji ulotnego pola świetlnego wynosi około 100 nm. Mikroskopia TIRF jest znakomitym narzędziem do obrazowania pojedynczych cząsteczek, takich jak wykrywanie egzocytozy w komórkach zwierzęcych5. Jednak ulotne światło nie może dotrzeć do błon plazmatycznych ani cytoplazmy korowej w komórkach roślinnych, ponieważ mają one grube ściany komórkowe. Ostatnio sprzęt do mikroskopii TIRF został zaadaptowany przez biologów komórek roślinnych, obserwując, że laser, jeśli jest ustawiony pod nieco większym kątem niż wtedy, gdy jest używany do wywoływania zjawisk całkowitego wewnętrznego odbicia, może wzbudzić powierzchnię próbek komórek roślinnych, co skutkuje wysokiej jakości obrazowaniem komórek roślinnych6,7. Głębokość oświetlenia wzbudzenia zmienia się poprzez regulację kąta wejścia lasera; dlatego ta technika jest opisana jako VAEM. Ten układ optyczny jest również nazywany mikroskopią TIRF o zmiennym kącie (VA-TIRFM), ponieważ istnieje możliwość, że całkowite odbicie może mieć miejsce na granicy ściana komórkowa-peryplazma7, jednak termin VAEM jest używany w tym artykule, zgodnie z pierwszym raportem w roślinach6.
Celem tego protokołu jest zademonstrowanie praktycznych procedur użycia VAEM do wizualizacji fluorescencyjnie znakowanej dynamiki białek na powierzchni komórek roślinnych. Dodatkowo opisano protokół analizy obrazu w celu ilościowego określenia czasu przebywania (czasu obecności) cząsteczek do analizy filmu VAEM. Jako przykład posłużono się kropką GFP-PATROL1 na komórkach kompleksu szparkowego u liścieni Arabidopsis thaliana. PATROL1 został zidentyfikowany za pomocą zaawansowanych metod genetycznych jako gen przyczynowy mutanta defektu odpowiedzi szparkowej u A. thaliana8. PATROL1 jest roślinnym homologiem MUNC-13, który jest czynnikiem primingowym w egzocytozie pęcherzyków synapsowych8. W odpowiedzi na sygnały środowiskowe, takie jak światło lub wilgotność, uważa się, że PATROL1 odwracalnie reguluje dostarczanie pompy protonowej do błon plazmatycznych w kompleksie szparkowym. Każdy kompleks szparkowy składa się z pary komórek ochronnych8 i komórek pomocniczych9 i wymaga pompy protonowej do ruchu aparatów szparkowych. W tych komórkach PATROL1 znakowane GFP lokalizuje się w kropkowatych strukturach, które pozostają na błonie plazmatycznej przez mniej niż 1 minutę9.

<table><tbody><tr><td>Mikroskop odwrócony</td><td>Olympus</td><td>IX-73</td><td></td></tr><tr><td>Jednostka TIRF</td><td>Soczewka obiektywowa Olympus</td><td>IX3-RFAEVAW</td><td></td></tr><tr><td>TIRF&nbsp;</td><td>Olympus</td><td>UAPON 100 i razy; OTIRF&nbsp;</td><td>NA = 1,49</td></tr><tr><td>Skrzynka kontroli kąta lasera</td><td>Chuo Seiki</td><td>QT-AK</td><td></td></tr><tr><td>Optycznie pompowany laser półprzewodnikowy</td><td>Coherent</td><td>SapphireTM LP USB 488-20 CDRH Laser</td><td></td></tr><tr><td>510&ndash; Filtr pasmowo-przepustowy 550 nm</td><td>Aparat Olympus</td><td>U-FBNA</td><td></td></tr><tr><td>EM CCD</td><td>Hamamatsu Photonics</td><td>ImagEM C9100-13</td><td></td></tr><tr><td>Jednostka zmiany powiększenia kamery z mocowaniem C&nbsp;</td><td>Oprogramowanie Olympus</td><td>U-TVCAC</td><td></td></tr><tr><td>MetaMorph</td><td>Urządzenia molekularne</td><td>MetaMorph wersja 7.7.11.0</td><td></td></tr><tr><td>Instrukcja mikroskopii TIRF</td><td>Olympus</td><td>AX7385</td><td>Instrukcje: System oświetlenia całkowitego wewnętrznego odbicia (wydrukowano w Japonii 24 sierpnia 2012 r.)</td></tr><tr><td>Olejek immersyjny</td><td>Olympus</td><td>Immersion Oil Typr-F</td><td>ne = 1,518 (23 stopnie)</td></tr></tbody></table>

obrazowanie w czasie rzeczywistym dynamiki powierzchni komórek roślinnych za pomocą mikroskopii epifluorescencyjnej o zmiennym kącie

Real-time Imaging of Plant Cell Surface Dynamics with Variable-angle Epifluorescence Microscopy

Powierzchnia komórki rośliny jest jej interfejsem do odbierania sygnałów środowiskowych; reaguje zmianami biologicznymi komórki, takimi jak transport błonowy i przegrupowanie cytoszkieletu. Analiza obrazu w czasie rzeczywistym i wysokiej rozdzielczości takich zdarzeń wewnątrzkomórkowych zwiększy zrozumienie biologii komórek roślinnych na poziomie molekularnym. Mikroskopia epifluorescencyjna o zmiennym kącie nachylenia (VAEM) to nowa technika, która zapewnia wysokiej jakości obrazy poklatkowe białek znakowanych fluorescencyjnie na powierzchni komórek roślinnych. W tym artykule opisano praktyczne procedury przygotowania próbek VAEM, regulacji układu optycznego VAEM, przechwytywania filmów i analizy obrazu. Jako przykład obserwacji VAEM przedstawiono reprezentatywne wyniki dotyczące dynamiki PATROL1. Jest to białko niezbędne do ruchu aparatów szparkowych, uważa się, że bierze udział w dostarczaniu pompy protonowej do błon plazmatycznych w kompleksie szparkowym Arabidopsis thaliana. Obserwacja w czasie rzeczywistym komórek ochronnych i komórek pomocniczych w liścieniach A. thaliana wykazała, że znakowane fluorescencyjnie PATROL1 pojawiały się jako kropkowate struktury na błonach plazmatycznych przez kilka sekund, a następnie znikały. Analiza kymograficzna danych filmowych VAEM pozwoliła określić rozkład czasowy obecności (określany jako "czas przebywania") struktur przypominających kropki. Zastosowanie VAEM zostało omówione w kontekście tego przykładu.

W niniejszym artykule wideo przedstawiono protokoły obserwacji GFP-PATROL1 w komórkach kompleksu szparkowego liści zakotwiczeniowych A. thaliana przy użyciu VAEM. Montaż metodą kropli (sky drop mounting) jest prostą metodą przygotowania, która może pomóc w ograniczeniu powstawania pęcherzyków powietrza w preparatach VAEM liści zakotwiczeniowych A. thaliana (Rycina 1). Zbyt duże nachylenie lasera wejściowego i/lub niewłaściwe pozycjonowanie preparatów w osi z dla VAEM spowoduje uzyskanie...

Celem tego protokołu jest pokazanie, jak monitorować dynamikę białek znakowanych fluorescencyjnie na powierzchni komórek roślinnych za pomocą mikroskopii epifluorescencyjnej o zmiennym kącie, pokazując kropki PATROL1 oznaczonej GFP, białka transportującego błonę, w korze komórkowej kompleksu szparkowego u Arabidopsis thaliana.

Obrazowanie w czasie rzeczywistym dynamiki powierzchni komórek roślinnych za pomocą mikroskopii epifluorescencyjnej o zmiennym kącie

A plant&#8217;s cell surface is its interface for perceiving environmental cues; it responds with cell biological changes such as membrane trafficking and ...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest obserwacja ruchu białek znakowanych fluorescencyjnie na powierzchniach komórek roślinnych przy użyciu epi-mikroskopii fluorescencyjnej pod zmiennym kątem. Metoda ta może przyczynić się do postępów w dziedzinie biologii komórki roślinnej, na przykład w badaniach nad sposobem funkcjonowania białek na powierzchniach komórek roślinnych. Główną zaletą tej techniki jest możliwość wizualizacji dynamiki białek znakowanych fluorescencyjnie w czasie rzeczywistym przed rozpoczęciem procedury.Przeprowadź kalibrację centrowania i ogniskowania lasera mikroskopu zgodnie z instrukcjami producenta. Następnie, wykorzystując wolną ścieżkę optyczną obiektywu, zlokalizuj środek sufitu w pomieszczeniu mikroskopowym i zaznacz to miejsce kolorową plombą. W kolejnym kroku oświetl sufit za pomocą obiektywu i przesuń oświetlony obszar do pozycji centralnej.Następnie należy ustawić ostrość lasera i precyzyjnie dostroić jego położenie względem centrum sufitu. Centrowanie i ogniskowanie lasera są kluczowe dla pomyślnej obserwacji z wykorzystaniem epifluorescencyjnego mikroskopu o zmiennym kącie (VAEM). Przed rozpoczęciem eksperymentu użytkownicy powinni przejść szkolenie przeprowadzone przez wykwalifikowanego pracownika firmy produkującej mikroskop.Po przygotowaniu mikroskopu nanieś 30 µl buforu podstawowego na środek szkiełka przedmiotowego o wymiarach 76 x 26 mm. Następnie za pomocą nożyczek sekcyjnych odetnij koleinkę z siedmiodniowego siewki i ułóż ją stroną obserwacyjną do góry na kropli buforu podstawowego. Następnie dodaj 30 µl buforu podstawowego na środek pola o wymiarach 18 x 18 mm.Przykryj próbkę szkiełkiem podstawowym, a następnie odwróć je do góry dnem. Delikatnie przytrzymaj krawędź szkiełka pęsetą; napięcie powierzchniowe zapobiegnie spłynięciu kropli. Połóż przeciwległą krawędź na szkiełku przedmiotowym w taki sposób, aby bufor znajdował się nad wprowadzeniem co.Następnie, trzymając krawędź szkiełka nakrywnego na preparacie, należy dostosować położenie kropli tak, aby znajdowała się ona bezpośrednio nad próbką oleiny, a następnie opuścić szkiełko nakrywne. Jeśli nie powstały pęcherzyki powietrza, należy za pomocą chusteczek beztkaninowych zebrać nadmiar buforu i niezwłocznie przenieść preparat pod mikroskop.Przy użyciu oświetlenia w polu jasnym należy wybrać komórki do obserwacji. Następnie należy potwierdzić obecność białka fluorescencyjnego i użyć oświetlenia epi-fluorescencyjnego, aby ustawić pozycję osi Z na powierzchni komórki. Aby przeprowadzić VAEM, należy użyć sterownika do zmiany kąta wpadania wiązki lasera.Stopniowo, uważnie monitorując obraz na żywo. Początkowo obraz będzie wydawał się rozmyty. Wraz ze zwiększaniem kąta lasera obraz VAEM stanie się mniej rozmyty, aż w końcu powstanie wyraźny obraz.W tym momencie należy zaprzestać zwiększania kąta lasera. Teraz należy precyzyjnie dostroić kąt wpadania wiązki lasera, aby uzyskać lepszy obraz, dostosowując w razie potrzeby parametry optyczne oraz parametry czujnika obrazu.Następnie, korzystając z komercyjnego oprogramowania do mikroskopu, zarejestruj film w postaci wielostronicowego pliku obrazu TIFF. Przedstawiony tutaj film ukazuje migotanie kropek znakowanych GFP na powierzchni komórek modelu STA. Aby określić czas rezydencji kropek DOT znakowanych GFP za pomocą programu Fiji, przejdź do menu otwierania plików i otwórz zarejestrowany wielostronicowy plik TIFF.Użyj narzędzia wyboru linii prostej, aby wyznaczyć linię na interesującym obszarze. Następnie użyj wtyczki dynamic res slice dla stosów obrazów, aby wygenerować obraz wykresu. Wraz ze zmianą położenia linii, obraz wykresu będzie zmieniać się dynamicznie.Zapisz obraz jako plik TIFF, korzystając z menu zapisu plików w formacie TIFF. Następnie, aby przeprowadzić redukcję szumów, przejdź do menu filtrów procesowych do rozmycia Gaussa i zastosuj filtr Gaussa do obrazów z chronografu. Parametr promienia sigma należy dostosować w zależności od potrzeb.Używając narzędzia do dopasowania progu obrazu, wyodrębnij obszary sygnału poprzez progowanie, a następnie otwórz menu ustawień pomiarów. Następnie zaznacz prostokąt ograniczający w oknie ustawień pomiarów, wybierając minimalną możliwą liczbę pikseli. Następnie przejdź do menu analiza, analizuj cząsteczki.Zmierz czas trwania interesującego punktu względem osi Y, sprawdź wyniki na wyświetlaczu i dodaj je do okien menedżera, aby przejrzeć wartości danych. Na koniec w menu tabeli wyników wybierz plik, zapisz jako i przetwórz zestaw danych czasów trwania obrazów punktów przy użyciu odpowiedniego oprogramowania analitycznego. Tutaj przedstawiono czasy przebywania 185 punktów GFP patrol one z 12 niezależnych komórek pomocniczych w ósmym edinie, zmierzone za pomocą analizy wykresu chm, zgodnie z ilustracją na wykresie.Dopasowana funkcja gęstości wykazała, że większość kropek patrol one GFP przebywała w komórce pomocniczej od 2 do 10 sekund, z pikiem wynoszącym około 3,5 sekundy. Sugeruje to szybką egzocytozę i endocytozę pomp protonowych na powierzchni komórki pomocniczej. Po zapoznaniu się z tym materiałem wideo powinni Państwo posiadać dobrą wiedzę na temat tego, jak wizualizować i kwantyfikować dynamikę białek typu ary na powierzchni komórek roślinnych przy użyciu zmiennokątnej mikroskopii epifluorescencyjnej.

real-time-imaging-plant-cell-surface-dynamics-with-variable-angle

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Opisujemy metodę wprowadzania, śledzenia i ilościowej analizy ekspresji GFP w komórkach roślinnych. Metoda ta wykorzystuje specjalnie zaprojektowany system robotyczny do półciągłego zbierania obrazów z dużej liczby próbek w czasie. Demonstrujemy również zastosowanie programów ImageJ i ImageReady do analizy serii obrazów.

Robotyka i dynamiczna analiza obrazu w badaniach ekspresji genów w tkankach roślinnych

Opisujemy zastosowanie perfluorodekaliny jako infiltracyjnego medium montażowego. Jest to prosta metoda poprawiająca głębokość obrazowania w tkance liścia Arabidopsis thaliana przy minimalnym wpływie fizjologicznym.

Prosta metoda obrazowania liści Arabidopsis z wykorzystaniem perfluorodekaliny jako infiltrującego medium obrazującego

Mikroskopia fluorescencyjna z całkowitym wewnętrznym odbiciem (TIRF) to potężna metoda obserwacji struktur znajdujących się blisko powierzchni komórki przy wysokim kontraście i rozdzielczości czasowej. Demonstrujemy, w jaki sposób TIRF może być wykorzystany do badania dynamiki białek w korze bakterii i grzybów otoczonych ścianą komórkową.

Wizualizacja organizacji i dynamiki kory mikroorganizmów z wykorzystaniem mikroskopii fluorescencyjnej z całkowitym wewnętrznym odbiciem

Niniejszy artykuł przedstawia protokół hodowli siewek Arabidopsis w RootChip, mikrofluidycznej platformie obrazowania, która łączy zautomatyzowaną kontrolę warunków wzrostu z mikroskopijnym monitorowaniem korzeni oraz pomiarem wewnątrzkomórkowych poziomów metabolitów w oparciu o technikę FRET.

Obrazowanie fluorescencyjne w czasie rzeczywistym wzrostu korzeni Arabidopsis z szybką manipulacją środowiskiem korzenia przy użyciu urządzenia RootChip

Opisujemy protokół z wykorzystaniem szkiełek z komorami oraz pośrodków do unieruchamiania liści zasadniczych roślin w celu obrazowania konfokalnego epidermy przez kilka dni rozwoju, co pozwala na dokumentowanie różnicowania szparek. Białka znakowane fluoroforami mogą być śledzone dynamicznie poprzez analizę ich ekspresji i lokalizacji subkomórkowej, co zwiększa zrozumienie ich potencjalnych ról podczas podziału komórek i różnicowania typów komórek.

Długoterminowe obrazowanie poklatkowe wysokiej rozdzielczości konfokalne epidermy zawilżnych liści przeciwstawnych Arabidopsis podczas kiełkowania

Ten protokół pokazuje metodę przygotowania próbek roślinnych do mikroskopii świetlnej. Konfiguracja charakteryzuje się zamontowaniem rośliny pionowo na powierzchni żelu i pozwoleniem jej rosnąć w kontrolowanych jasnych warunkach. Pozwala to na długotrwałą obserwację rozwoju organów roślinnych w znormalizowanych warunkach.

Mikroskopia fluorescencyjna arkusza świetlnego korzeni roślin rosnących na powierzchni żelu

Defensyny roślinne odgrywają ważną rolę w obronie roślin przed patogenami. Aby skutecznie wykorzystać te peptydy przeciwgrzybicze jako środki przeciwgrzybicze, zrozumienie ich sposobów działania (MOA) ma kluczowe znaczenie. W tym miejscu opisano metodę obrazowania żywych komórek w celu zbadania krytycznych aspektów MOA tych peptydów.

Obrazowanie żywych komórek grzybów w celu zbadania sposobów wnikania i lokalizacji subkomórkowej przeciwgrzybiczych defensyn roślinnych

Przedstawiamy prostą i wszechstronną metodę wykonywania fluorescencyjnego obrazowania na żywo liści Arabidopsis thaliana przez dłuższy okres czasu. Używamy transgenicznej rośliny Arabidopsis wykazującej ekspresję fluorescencyjnego genu reporterowego pod kontrolą promotora związanego z odpornością jako przykładu uzyskania czasoprzestrzennego zrozumienia odpowiedzi immunologicznych roślin.

Uniwersalna metoda montażu liści Arabidopsis do przyżyciowego obrazowania poklatkowego

Tutaj opisujemy protokół obrazowania żywych komórek cytoszkieletu mikrotubul korowych na merystemie wierzchołkowym pędu i monitorowania jego reakcji na zmiany sił fizycznych.

Obrazowanie żywych komórek cytoszkieletu mikrotubul i manipulacja mikromechaniczna merystemu wierzchołkowego rzodkiewnika

Ten manuskrypt przedstawia szczegółowy protokół obrazowania dynamiki 3-wymiarowej ściany komórkowej żywej tkanki mchu, umożliwiając wizualizację odrywania się ścian komórkowych u mutantów ggb i zagęszczania wzorów ścian komórkowych u typu dzikiego podczas rozwoju przez długi okres.

Obrazowanie poklatkowe 3D dynamiki ściany komórkowej przy użyciu kalkofluoru w physcomitrium patens mchu

Kilka powszechnie stosowanych metod jest tutaj wprowadzanych do badania zdarzeń transportu błonowego kinazy receptora błony komórkowej. Manuskrypt ten opisuje szczegółowe protokoły, w tym przygotowanie materiału roślinnego, leczenie farmakologiczne i konfokalną.

Oparte na obrazie metody badania zdarzeń transportu błonowego w komórkach linii szparkowej

Poznaj metodę obrazowania dynamiki białek na powierzchni komórek roślinnych za pomocą mikroskopii epifluorescencyjnej o zmiennym kącie w Arabidopsis thaliana. Technika ta umożliwia wizualizację białek GFP-PATROL1 w czasie rzeczywistym.

Obrazowanie w czasie rzeczywistym dynamiki powierzchni komórek roślinnych za pomocą mikroskopii epifluorescencyjnej o zmiennym kącie (Wideo) | JoVE Journal

Obrazowanie w czasie rzeczywistym dynamiki powierzchni komórek roślinnych za pomocą mikroskopii epifluorescencyjnej o zmiennym kącie

Przeglądaj więcej filmów