Name: Ekspresja i oczyszczanie ludzkiego wrażliwego na lipidy kanału kationowego TRPC3 do oznaczania strukturalnego za pomocą mikroskopii krioelektronowej pojedynczych cząstek (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-01-07T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 27 s
Description: Poznaj metodę ekspresji i oczyszczania ludzkiego kanału TRPC3 w komórkach HEK293 przy użyciu systemu bakulowirusowego. Technika ta umożliwia oznaczanie strukturalne krio-EM białek błonowych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy G. Zhao i X. Meng za wsparcie w zbieraniu danych w zestawie zaawansowanej mikroskopii krioelektronowej Davida Van Andela. Jesteśmy wdzięczni zespołowi VARI High-Performance Computing za wsparcie obliczeniowe. Wyrażamy naszą wdzięczność N. Clemente, D. Duesowi, J. Floramo, Y. Huangowi, Y. Kimowi, C. Muellerowi, B. Rothowi i Z. Ruanowi za komentarze, które znacznie ulepszyły ten manuskrypt. Dziękujemy D. Nadziejce za wsparcie redakcyjne dla tego manuskryptu. Prace te były wspierane przez wewnętrzne fundusze VARI.

<ol><li>Berridge, M. J., Bootman, M. D., Roderick, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+signalling%3A+dynamics%2C+homeostasis+and+remodelling%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Calcium signalling: dynamics, homeostasis and remodelling.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 4 (7), 517-529 (2003).</li>
<li>Kumar, R., Thompson, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+regulation+of+parathyroid+hormone+secretion+and+synthesis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Society+of+Nephrology%22%5BJournal%5D)">The regulation of parathyroid hormone secretion and synthesis.</a> Journal of the American Society of Nephrology. 22 (2), 216-224 (2011).</li>
<li>Sudhof, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+control+of+neurotransmitter+release%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Perspectives+in+Biology%22%5BJournal%5D)">Calcium control of neurotransmitter release.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 4 (1), a011353(2012).</li>
<li>Ong, H. L., de Souza, L. B., Ambudkar, I. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+TRPC+Channels+in+Store-Operated+Calcium+Entry%5BTitle%5D)+AND+%22Advances+in+Experimental+Medicine+and+Biology%22%5BJournal%5D)">Role of TRPC Channels in Store-Operated Calcium Entry.</a> Advances in Experimental Medicine and Biology. 898, 87-109 (2016).</li>
<li>Smyth, J. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+and+regulation+of+store-operated+calcium+entry%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cellular+and+Molecular+Medicine%22%5BJournal%5D)">Activation and regulation of store-operated calcium entry.</a> Journal of Cellular and Molecular Medicine. 14 (10), 2337-2349 (2010).</li>
<li>Prakriya, M., Lewis, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Store-Operated+Calcium+Channels%5BTitle%5D)+AND+%22Physiological+Reviews%22%5BJournal%5D)">Store-Operated Calcium Channels.</a> Physiological Reviews. 95 (4), 1383-1436 (2015).</li>
<li>Liu, X., Singh, B. B., Ambudkar, I. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TRPC1+is+required+for+functional+store-operated+Ca2%2B+channels.+Role+of+acidic+amino+acid+residues+in+the+S5-S6+region%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">TRPC1 is required for functional store-operated Ca2+ channels. Role of acidic amino acid residues in the S5-S6 region.</a> Journal of Biological Chemistry. 278 (13), 11337-11343 (2003).</li>
<li>Zhu, X., Jiang, M., Birnbaumer, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Receptor-activated+Ca2%2B+influx+via+human+Trp3+stably+expressed+in+human+embryonic+kidney+%28HEK%29293+cells.+Evidence+for+a+non-capacitative+Ca2%2B+entry%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Receptor-activated Ca2+ influx via human Trp3 stably expressed in human embryonic kidney (HEK)293 cells. Evidence for a non-capacitative Ca2+ entry.</a> Journal of Biological Chemistry. 273 (1), 133-142 (1998).</li>
<li>Zhu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((trp%2C+a+novel+mammalian+gene+family+essential+for+agonist-activated+capacitative+Ca2%2B+entry%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">trp, a novel mammalian gene family essential for agonist-activated capacitative Ca2+ entry.</a> Cell. 85 (5), 661-671 (1996).</li>
<li>Itsuki, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Voltage-sensing+phosphatase+reveals+temporal+regulation+of+TRPC3%2FC6%2FC7+channels+by+membrane+phosphoinositides%5BTitle%5D)+AND+%22Channels+%28Austin%29%22%5BJournal%5D)">Voltage-sensing phosphatase reveals temporal regulation of TRPC3/C6/C7 channels by membrane phosphoinositides.</a> Channels (Austin). 6 (3), 206-209 (2012).</li>
<li>Tang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+common+binding+sites+for+calmodulin+and+inositol+1%2C4%2C5-trisphosphate+receptors+on+the+carboxyl+termini+of+trp+channels%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Identification of common binding sites for calmodulin and inositol 1,4,5-trisphosphate receptors on the carboxyl termini of trp channels.</a> Journal of Biological Chemistry. 276 (24), 21303-21310 (2001).</li>
<li>Gonzalez-Cobos, J. C., Trebak, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TRPC+channels+in+smooth+muscle+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Bioscience+%28Landmark+Edition%29%22%5BJournal%5D)">TRPC channels in smooth muscle cells.</a> Frontiers in Bioscience (Landmark Edition). 15, 1023-1039 (2010).</li>
<li>Li, H. S., Xu, X. Z., Montell, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+of+a+TRPC3-dependent+cation+current+through+the+neurotrophin+BDNF%29%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Activation of a TRPC3-dependent cation current through the neurotrophin BDNF).</a> Neuron. 24 (1), 261-273 (1999).</li>
<li>Becker, E. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Candidate+screening+of+the+TRPC3+gene+in+cerebellar+ataxia%5BTitle%5D)+AND+%22Cerebellum%22%5BJournal%5D)">Candidate screening of the TRPC3 gene in cerebellar ataxia.</a> Cerebellum. 10 (2), 296-299 (2011).</li>
<li>Kitajima, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TRPC3+positively+regulates+reactive+oxygen+species+driving+maladaptive+cardiac+remodeling%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">TRPC3 positively regulates reactive oxygen species driving maladaptive cardiac remodeling.</a> Scientific Reports. 6, 37001(2016).</li>
<li>Yang, S. L., Cao, Q., Zhou, K. C., Feng, Y. J., Wang, Y. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transient+receptor+potential+channel+C3+contributes+to+the+progression+of+human+ovarian+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">Transient receptor potential channel C3 contributes to the progression of human ovarian cancer.</a> Oncogene. 28 (10), 1320-1328 (2009).</li>
<li>Oda, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transient+receptor+potential+cation+3+channel+regulates+melanoma+proliferation+and+migration%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Physiological+Sciences%22%5BJournal%5D)">Transient receptor potential cation 3 channel regulates melanoma proliferation and migration.</a> Journal of Physiological Sciences. 67 (4), 497-505 (2017).</li>
<li>Xia, M., Liu, D., Yao, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TRPC3%3A+A+New+Target+for+Therapeutic+Strategies+in+Chronic+Pain-DAG-mediated+Activation+of+Non-selective+Cation+Currents+and+Chronic+Pain+%28Mol+Pain+2014%3B10%3A43%29%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurogastroenterology+and+Motility%22%5BJournal%5D)">TRPC3: A New Target for Therapeutic Strategies in Chronic Pain-DAG-mediated Activation of Non-selective Cation Currents and Chronic Pain (Mol Pain 2014;10:43).</a> Journal of Neurogastroenterology and Motility. 21 (3), 445-447 (2015).</li>
<li>Fan, C., Choi, W., Sun, W., Du, J., Lu, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+of+the+human+lipid-gated+cation+channel+TRPC3%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">Structure of the human lipid-gated cation channel TRPC3.</a> Elife. 7, e36852(2018).</li>
<li>Goehring, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Screening+and+large-scale+expression+of+membrane+proteins+in+mammalian+cells+for+structural+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Screening and large-scale expression of membrane proteins in mammalian cells for structural studies.</a> Nature Protocols. 9 (11), 2574-2585 (2014).</li>
<li>Hattori, M., Hibbs, R. E., Gouaux, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+fluorescence-detection+size-exclusion+chromatography-based+thermostability+assay+to+identify+membrane+protein+expression+and+crystallization+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22Structure+%28London%2C+England%3A+1993%29%22%5BJournal%5D)">A fluorescence-detection size-exclusion chromatography-based thermostability assay to identify membrane protein expression and crystallization conditions.</a> Structure (London, England: 1993). 20 (8), 1293-1299 (2012).</li>
<li>Zheng, S. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MotionCor2%3A+anisotropic+correction+of+beam-induced+motion+for+improved+cryo-electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">MotionCor2: anisotropic correction of beam-induced motion for improved cryo-electron microscopy.</a> Nature Methods. 14 (4), 331-332 (2017).</li>
<li>Zhang, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gctf%3A+Real-time+CTF+determination+and+correction%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">Gctf: Real-time CTF determination and correction.</a> Journal of Structural Biology. 193 (1), 1-12 (2016).</li>
<li>Scheres, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RELION%3A+implementation+of+a+Bayesian+approach+to+cryo-EM+structure+determination%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">RELION: implementation of a Bayesian approach to cryo-EM structure determination.</a> Journal of Structural Biology. 180 (3), 519-530 (2012).</li>
<li>Punjani, A., Rubinstein, J. L., Fleet, D. J., Brubaker, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((cryoSPARC%3A+algorithms+for+rapid+unsupervised+cryo-EM+structure+determination%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">cryoSPARC: algorithms for rapid unsupervised cryo-EM structure determination.</a> Nature Methods. 14 (3), 290-296 (2017).</li>
<li>Grigorieff, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Frealign%3A+An+Exploratory+Tool+for+Single-Particle+Cryo-EM%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">Frealign: An Exploratory Tool for Single-Particle Cryo-EM.</a> Methods in Enzymology. 579, 191-226 (2016).</li>
<li>Emsley, P., Lohkamp, B., Scott, W. G., Cowtan, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Features+and+development+of+Coot%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Crystallographica+Section+D%3A+Biological+Crystallography%22%5BJournal%5D)">Features and development of Coot.</a> Acta Crystallographica Section D: Biological Crystallography. 66 (Pt 4), 486-501 (2010).</li>
<li>Afonine, P. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Towards+automated+crystallographic+structure+refinement+with+phenix.refine%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Crystallographica+Section+D%3A+Biological+Crystallography%22%5BJournal%5D)">Towards automated crystallographic structure refinement with phenix.refine.</a> Acta Crystallographica Section D: Biological Crystallography. 68 (Pt 4), 352-367 (2012).</li>
<li>Chen, V. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MolProbity%3A+all-atom+structure+validation+for+macromolecular+crystallography%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Crystallographica+Section+D%3A+Biological+Crystallography%22%5BJournal%5D)">MolProbity: all-atom structure validation for macromolecular crystallography.</a> Acta Crystallographica Section D: Biological Crystallography. 66 (Pt 1), 12-21 (2010).</li>
<li>Scheres, S. H. W., Chen, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prevention+of+overfitting+in+cryo-EM+structure+determination%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Prevention of overfitting in cryo-EM structure determination.</a> Nature Methods. 9 (9), 853-854 (2012).</li>
<li>Scheres, S. H. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RELION%3A+Implementation+of+a+Bayesian+approach+to+cryo-EM+structure+determination%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">RELION: Implementation of a Bayesian approach to cryo-EM structure determination.</a> Journal of Structural Biology. 180 (3), 519-530 (2012).</li>
<li>Grigorieff, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Frealign%3A+An+Exploratory+Tool+for+Single-Particle+Cryo-EM%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">Frealign: An Exploratory Tool for Single-Particle Cryo-EM.</a> Methods in Enzymology. 579, 191-226 (2016).</li>
<li>Chen, V. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MolProbity%3A+all-atom+structure+validation+for+macromolecular+crystallography%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Crystallographica+Section+D-Biological+Crystallography%22%5BJournal%5D)">MolProbity: all-atom structure validation for macromolecular crystallography.</a> Acta Crystallographica Section D-Biological Crystallography. 66, 12-21 (2010).</li>
<li>Emsley, P., Lohkamp, B., Scott, W. G., Cowtan, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Features+and+development+of+Coot%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Crystallographica+Section+D-Biological+Crystallography%22%5BJournal%5D)">Features and development of Coot.</a> Acta Crystallographica Section D-Biological Crystallography. 66, 486-501 (2010).</li>
<li>Green, E. M., Au, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thermostabilization%2C+Expression%2C+Purification%2C+and+Crystallization+of+the+Human+Serotonin+Transporter+Bound+to+S-citalopram%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Thermostabilization, Expression, Purification, and Crystallization of the Human Serotonin Transporter Bound to S-citalopram.</a> Journal of Visualized Experiments. (117), e54792(2016).</li>
<li>Mesa, P., Deniaud, A., Montoya, G., Schaffitzel, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Directly+from+the+source%3A+endogenous+preparations+of+molecular+machines%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">Directly from the source: endogenous preparations of molecular machines.</a> Current Opinion in Structural Biology. 23 (3), 319-325 (2013).</li>
<li>Bayburt, T. H., Sligar, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Membrane+Protein+Assembly+into+Nanodiscs%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+letters%22%5BJournal%5D)">Membrane Protein Assembly into Nanodiscs.</a> FEBS letters. 584 (9), 1721-1727 (2010).</li>
<li>Winkler, P. A., Huang, Y., Sun, W., Du, J., Lü, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electron+cryo-microscopy+structure+of+a+human+TRPM4+channel%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Electron cryo-microscopy structure of a human TRPM4 channel.</a> Nature. 552, 200-204 (2017).</li>
<li>Autzen, H. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+of+the+human+TRPM4+ion+channel+in+a+lipid+nanodisc%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Structure of the human TRPM4 ion channel in a lipid nanodisc.</a> Science. 359 (6372), 228-232 (2017).</li>
<li>Guo, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structures+of+the+calcium-activated%2C+non-selective+cation+channel+TRPM4%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Structures of the calcium-activated, non-selective cation channel TRPM4.</a> Nature. 552 (7684), 205-209 (2017).</li>
<li>Parmar, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+a+SMALP+platform+to+determine+a+sub-nm+single+particle+cryo-EM+membrane+protein+structure%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta+%28BBA%29-Biomembranes%22%5BJournal%5D)">Using a SMALP platform to determine a sub-nm single particle cryo-EM membrane protein structure.</a> Biochimica et Biophysica Acta (BBA)-Biomembranes. 1860 (2), 378-383 (2018).</li>
<li>Gulati, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detergent-free+purification+of+ABC+%28ATP-binding-cassette%29+transporters%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+Journal%22%5BJournal%5D)">Detergent-free purification of ABC (ATP-binding-cassette) transporters.</a> Biochemical Journal. 461 (2), 269-278 (2014).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Strukturalne oznaczanie białek za pomocą cryo-EM zrewolucjonizowało dziedzinę biologii strukturalnej w ciągu ostatnich kilku lat, dzięki opracowaniu nowych kamer i algorytmów, które znacznie przyspieszają określanie struktury białek, które nie krystalizują łatwo, w szczególności białek błonowych. Pomimo wszystkich ostatnich postępów w technice cryo-EM, przygotowanie oczyszczonych białek o jakości i ilości wystarczającej do umożliwienia obrazowania wysokiej jakości często pozostaje czasochłonne, kosztowne i stanowi wyzwan...

Wapń bierze udział w większości procesów komórkowych, w tym w kaskadach sygnałowych, kontroli transkrypcji, uwalnianiu neuroprzekaźników i syntezie cząsteczek hormonów1,2,3. Homeostatyczne utrzymanie wolnego wapnia cytozolowego ma kluczowe znaczenie dla zdrowia i funkcjonowania komórek. Jednym z głównych mechanizmów wewnątrzkomórkowej homeostazy wapnia jest wejście wapnia w magazynie (SOCE), proces, w którym wyczerpanie wapnia zmagazynowanego w retikulum endoplazmatycznym (ER) wyzwala otwarcie kanałów jonowych na błonie plazmatycznej, aby ułatwić uzupełnienie wapnia ER, który może być następnie wykorzystany w dalszej sygnalizacji4,5,6. Przejściowe kanały potencjału receptora (TRPC), które są przepuszczalnymi dla wapnia kanałami należącymi do nadrodziny TRP, zostały zidentyfikowane jako główny uczestnik SOCE7,8,9 .
Wśród siedmiu członków rodziny TRPC, TRPC3, TRPC6 i TRPC7 tworzą podgrupę homologów i są unikalne pod względem zdolności do aktywacji przez wtórny przekaźnik lipidowy diacyloglicerol (DAG), produkt degradacji sygnalizacyjnego lipidu fosfatydyloinozytolu 4,5-bisfosforanu (PIP2)10,11. TRPC3 ulega silnej ekspresji w mięśniach gładkich oraz w obszarach mózgowych i móżdżku mózgu, gdzie odgrywa istotną rolę w sygnalizacji wapniowej, która wpływa na neuroprzekaźnictwo i neurogenezę12,13. Dysfunkcja TRPC3 została powiązana z zaburzeniami ośrodkowego układu nerwowego, zaburzeniami sercowo-naczyniowymi i niektórymi nowotworami, takimi jak gruczolakorak jajnika14,15,16. W związku z tym TRPC3 jest obiecującym celem farmaceutycznym w leczeniu tych chorób. Rozwój specyficznie ukierunkowanych leków działających na TRPC3 był ograniczony przez brak zrozumienia mechanizmów aktywacji molekularnej TRPC3, w tym miejsc wiązania lipidów17,18. Opisaliśmy pierwszą strukturę o rozdzielczości atomowej ludzkiego kanału TRPC3 (hTRPC3) i jego dwóch miejsc wiązania lipidów w stanie zamkniętym, dostarczając ważnych informacji na temat tych mechanizmów19.
Kluczowym czynnikiem dla określenia struktury białka błonowego w wysokiej rozdzielczości jest uzyskanie białka o wysokiej jakości. Odpowiednie badania przesiewowe warunków ekspresji i oczyszczania niezbędnych do uzyskania wysokiej jakości białka mogą być czasochłonnym i kosztownym przedsięwzięciem. W tym miejscu przedstawiamy protokół opisujący szczegółowo, w jaki sposób identyfikujemy optymalne warunki do ekspresji i oczyszczania hTRPC3, który zachowywał się źle w naszym wstępnym badaniu przesiewowym. Przedstawiamy kilka kluczowych punktów dotyczących rozwiązywania problemów i optymalizacji zachowania białek, które stanowią solidną podstawę dla naszych badań nad mikroskopią krioelektronową (cryo-EM). Używamy zmodyfikowanego wektora generującego bakulowirusa (pEG), opracowanego przez Gouaux i współpracowników, który jest zoptymalizowany pod kątem testów przesiewowych i wydajnego generowania bakulowirusa w komórkach ssaków20. Ta metoda ekspresji jest odpowiednia do szybkiej i opłacalnej nadekspresji białek w błonie komórkowej ssaków. Łączymy użycie tego wektora z metodą wstępnego przesiewowego wykrywania fluorescencji opartą na chromatografii z wykluczeniem wielkości (FSEC)21. Metoda ta wykorzystuje znacznik białka zielonej fluorescencji (GFP) połączony z konstruktem będącym przedmiotem zainteresowania i poprawia wizualizację białka docelowego w małych, rozpuszczonych próbkach całokomórkowych. Pozwala to na badanie przesiewowe stabilności białek w obecności różnych detergentów i dodatków, z mutacjami termostabilizującymi, a także pozwala na wykorzystanie niewielkiej liczby komórek z transfekcji przejściowej na małą skalę. W ten sposób można szybko przebadać wiele warunków przed przejściem do oczyszczania białek na dużą skalę. Po ekspresji, badaniach przesiewowych i oczyszczeniu przedstawiamy protokół uzyskiwania i przetwarzania obrazów z cryo-EM w celu wygenerowania de novo określenia strukturalnego białka. Wierzymy, że opisane tutaj podejścia posłużą jako uogólniony protokół do badań strukturalnych receptorów kanałów TRP i innych białek błonowych.

<table><tbody><tr><td>pEG BacMam vector (pFastBacI)</td><td>addgene</td><td>31488</td><td></td></tr><tr><td>DH10&alpha; cells</td><td>Life Technologies</td><td>10361-012</td><td></td></tr><tr><td>S.O.C. media</td><td>Corning</td><td>46003CR</td><td>do transformacji komórek DH10&alpha; dla</td></tr><tr><td>płytek hodowlanych Bacmid Bacmam</td><td>Teknova</td><td>L5919</td><td>do hodowli przekształconych komórek DH10&alpha;</td></tr><tr><td>Wytrząsarka do inkubacji do komórek bakteryjnych</td><td>Infors HT</td><td>Multitron standard</td><td></td></tr><tr><td>Inkubowany wytrząsarka orbitalna do komórek owadów Inkubator</td><td></td> CO2 </sub<td>> Thermo-Fisher</td> SHKE8000 <td></td></tr><tr><td>Reach-in do komórek ssaków</td><td>Thermo-Fisher</td><td>3951</td><td></td></tr><tr><td>Wytrząsarka orbitalna stołowa</td><td>Thermo-Fisher</td><td>SHKE416HP stosowana</td><td>w inkubatorze CO2 Reach-in do komórek</td></tr> <tr><td>ssakówInkubator</td><td>VWR</td><td>1535</td><td>do płytek bakteryjnych</td></tr><tr><td>QIAprep Spin Miniprep Kit</td><td>Qiagen</td><td>27106</td><td>do ekstrakcji i oczyszczania plazmidu</td></tr><tr><td>Fenol:Chloroform:Alkohol izoamylowy</td><td>Invitrogen</td><td>15593031</td><td>do ekstrakcji DNA</td></tr><tr><td>Komórki Sf9</td><td>Life Technologies</td><td>12659017</td><td>komórki owadów do produkcji wirusa</td></tr><tr><td>Sf-900 podłoża</td><td>Gibco</td><td>12658-027</td><td>pożywka z komórek owadów</td></tr><tr><td>FBS</td><td>Atlanta Biologicals</td><td>S11550</td><td></td></tr><tr><td>Cellfectin II</td><td>Gibco</td><td>10362100</td><td>do transfekcji komórek owadów</td></tr><tr><td>lipofektamina, 2000</td><td>Invitrogen</td><td>11668-027</td><td>do transfekcji komórek sutkowych</td></tr><tr><td>Filtr strzykawkowy 0,2 mm</td><td>VWR</td><td>28145-501</td><td>do filtracji wirusa P1</td></tr><tr><td>Kolby filtracyjne 0,2 mm 500ml resevoir</td><td>Corning</td><td>430758</td><td>do filtrowania wirusa P2</td></tr><tr><td>Kolba hodowlana Erlenmeyera (płaskie dno 2L)</td><td>Gene Mate</td><td>F-5909-2000</td><td>do hodowli komórek owadów</td></tr><tr><td>Kolba hodowlana Erlenmeyera (z przegrodą 2L)</td><td>Gene Mate</td><td>F-5909-2000B</td><td>do hodowli komórek ssaków</td></tr><tr><td>Spektrofotometr nanodrop 2000</td><td>Thermo-Fisher</td><td>ND-2000</td><td>do oznaczania stężeń DNA i białek</td></tr><tr><td>HEK293</td><td>ATCC</td><td>CRL-3022</td><td>komórki ssaków do produkcji białka</td></tr><tr><td>Freestyle 293 ekspresja Medium</td><td>Gibco</td><td>1238-018</td><td>pożywka komórkowa ssaków do ekspresji białek</td></tr><tr><td>Kwas masłowy Sól sodowa</td><td>Acros</td><td>263195000</td><td>do amplifikacji ekspresji białek</td></tr><tr><td>PMSF</td><td>Acros</td><td>215740500</td><td>inhibitor proteazy</td></tr><tr><td>Aprotynina z płuc bydlęcych</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A1153-100MG</td><td>inhibitor proteazy</td></tr><tr><td>chlorowodorek leupeptyny</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>24125-16-4</td><td>inhibitor proteazy</td></tr><tr><td>pepstatyna A</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP2671-250</td><td>inhibitor proteazy</td></tr><tr><td>digitonina</td><td>EMD Millipore</td><td>300410</td><td>detergent - do rozpuszczania białka z błony</td></tr><tr><td>imidazol</td><td>Sigma</td><td>792527</td><td>do elucji białka z kolumny żywicznej</td></tr><tr><td>Żywica TALON</td><td>Clonetech</td><td>635504</td><td>do oczyszczania powinowactwa za pomocą kolumn inkubacyjnych His-tag</td></tr><tr><td>superose6</td><td>GE</td><td>29091596; 29091597</td><td>do HPLC i FPLC</td></tr><tr><td>Prominence Prominence Modular HPLC</td><td>System Shimadzu</td><td>Zobacz poniżej</td><td></td></tr><tr><td>Moduł kontrolera</td> <td>"</td><td>CBM20A</td><td></td></tr><tr><td>Solvent Delivery System</td><td>"</td> <td>LC30AD</td><td></td></tr><tr><td>Detektor fluorescencji</td> <td>"</td><td>RF20AXS</td><td></td></tr><tr><td>Autosampler z chłodzeniem</td><td>"</td><td>SIL20ACHT</td><td></td></tr><tr><td>Czysty system FPLC z frakcjonatorem</td><td>Akta</td><td></td><td></td></tr><tr><td>trombina (alfa)</td><td>Haematologic Technologies Incorporated</td><td>HCT-0020 Ludzka alfa</td><td>do rozszczepiania znacznika GFP</td></tr><tr><td>Amicon Ultra 15 ml 100K odśrodkowa rurka filtracyjna</td><td>Millipore</td><td>UFC910008</td><td>do zagęszczania białka</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Fisher</td><td>E478500</td><td>do stabilizacji białka</td></tr><tr><td>siatki miedziane powlekane węglem 400 mesh</td><td>Ted Pella Inc.</td><td>Kratki 01754-F</td><td>do plam ujemnych</td></tr><tr><td>Quantifoil dziurawa siatka węglowa (złoto, 1,2/1,3 i cienkie; &mu; m rozmiar/przestrzeń otworu, 300 oczek)</td><td>Mikroskopia elektronowa Nauki</td><td>Q3100AR1.3</td><td>siatki do Cryo-EM</td></tr><tr><td>Vitrobot Mark III</td><td>FEI</td><td></td><td>do przygotowania siatek próbek za pomocą ciekłego etanu zamrażanie</td></tr><tr><td>ciekłego azotu</td><td>Dura-Cyl</td><td>UN1977</td><td></td></tr><tr><td>etan gaz</td><td>Airgas</td><td>UN1035</td><td></td></tr><tr><td>Solarus Plasma System</td><td>Gatan</td><td>Model 950</td><td>do czyszczenia kratek przed zamrażanie próbek</td></tr><tr><td>Mikroskop elektronowy Tecnai Spirit</td><td>FEI</td><td></td><td>do obrazowania EM barwienia ujemnego</td></tr><tr><td>Mikroskop elektronowy Talos Arctica</td><td>FEI</td><td></td><td>do badań przesiewowych i obrazowania siatek Cryo-EM w niskiej rozdzielczości</td></tr><tr><td>Mikroskop elektronowy Titan Krios</td><td>FEI</td><td></td><td>do obrazowania Cryo-EM o wysokiej rozdzielczości</td></tr><tr><td>Oprogramowanie</td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td></td><td>Gautomatchhttp://www.mrc-lmb.cam.ac.uk/kzhang/Gautomatch/</td><td></td> <td>do wybierania cząstek z mikrofotografii</td></tr><tr><td>Oprogramowanie Relion 2.1</td><td>https://github.com/3dem/relion</td><td></td><td>do konstruowania klasyfikacji 2D i 3D</td></tr><tr><td>Oprogramowanie CryoSPARC</td><td>https://cryosparc.com/</td><td></td> <td>do generowania wstępnego modelu struktury</td></tr><tr><td>Oprogramowanie Frealign</td><td>http://grigoriefflab.janelia.org/frealign</td><td></td><td>do udoskonalania cząstki</td></tr><tr><td>Oprogramowanie Coot</td><td>https://www2.mrc-lmb.cam.ac.uk/personal/pemsley/coot/</td><td></td> <td>do budowy modelu</td></tr><tr><td>Oprogramowanie MolProbity</td><td>http://molprobity.biochem.duke.edu/</td><td></td> <td>do oceny geometrii modelu atomowego</td></tr><tr><td>Oprogramowanie SerialEM</td><td>http://bio3d.colorado.edu/SerialEM/</td><td></td> <td>do automatycznej akwizycji stosu obrazów szeregowych</td></tr><tr><td>Oprogramowanie</td> <td>MortionCor2</td><td></td> http://msg.ucsf.edu/em/software/motioncor2.html <td>do korekcji ruchu zsumowanych stosów filmowych</td></tr><tr><td>Oprogramowanie GCTF</td><td>https://www.mrc-lmb.cam.ac.uk/kzhang/Gctf/</td><td></td> <td>do pomiaru wartości rozmycia w stosach filmowych</td></tr><tr><td>Phenix.real_space_refine oprogramowanie</td><td>https://www.phenix-online.org/documentation/reference/real_space_refine.html</td><td></td><td>do udoskonalania początkowego modelu 3D w przestrzeni rzeczywistej</td></tr></tbody></table>

ekspresja i oczyszczanie ludzkiego wrażliwego na lipidy kanału kationowego trpc3 do oznaczania strukturalnego za pomocą mikroskopii krioelektronowej pojedynczych cząstek

Expression and Purification of the Human Lipid-sensitive Cation Channel TRPC3 for Structural Determination by Single-particle Cryo-electron Microscopy

Transient receptor potential channels (TRPCs) kanonicznej podrodziny TRP to nieselektywne kanały kationowe, które odgrywają istotną rolę w homeostazie wapnia, szczególnie w magazynowaniu wapnia, co jest kluczowe dla utrzymania prawidłowego funkcjonowania uwalniania pęcherzyków synaptycznych i wewnątrzkomórkowych szlaków sygnałowych. W związku z tym kanały TRPC są zaangażowane w różne choroby ludzkie, w tym zaburzenia sercowo-naczyniowe, takie jak przerost serca, zaburzenia neurodegeneracyjne, takie jak choroba Parkinsona i zaburzenia neurologiczne, takie jak ataksja rdzeniowo-móżdżkowa. W związku z tym kanały TRPC stanowią potencjalny cel farmakologiczny w chorobach człowieka. Jednak molekularne mechanizmy bramkowania w tych kanałach są nadal niejasne. Trudność w uzyskaniu dużych ilości stabilnego, jednorodnego i oczyszczonego białka była czynnikiem ograniczającym w badaniach nad określaniem struktury, szczególnie w przypadku białek błonowych ssaków, takich jak kanały jonowe TRPC. W tym miejscu przedstawiamy protokół ekspresji białek błonowych kanałów jonowych ssaków na dużą skalę przy użyciu zmodyfikowanego systemu transferu genów bakulowirusa i oczyszczania tych białek za pomocą chromatografii powinowactwa i wykluczania wielkości. Ponadto przedstawiamy protokół zbierania obrazów z mikroskopii krioelektronowej pojedynczych cząstek z oczyszczonego białka i wykorzystania tych obrazów do określenia struktury białka. Określanie struktury jest potężną metodą zrozumienia mechanizmów bramkowania i funkcji w kanałach jonowych.

Schematyczny przegląd protokołu ekspresji i oczyszczania hTRPC3 przedstawiono na Rysunku 1A. Obraz płytki z bacmidem hTRPC3 z idealnymi białymi koloniami, podobnymi do tych wybranych do oczyszczania DNA bacmidu, przedstawiono na Rysunku 1B. Ustalono, że 48 h jest czasem optymalnym dla wyraźnego barwienia Bluo-gal przy jednoczesnym zachowaniu odizolowanych kolonii. Szczyt produkcji wirusa P2 dla hTRPC3, wizualizowany za pomocą flu...

Ten protokół opisuje techniki używane do określania struktur kanałów jonowych za pomocą mikroskopii krioelektronowej, w tym system bakulowirusa używany do efektywnej ekspresji genów w komórkach ssaków przy minimalnym wysiłku i toksyczności, ekstrakcję białek, oczyszczanie i kontrolę jakości, przygotowanie siatki próbek i badanie przesiewowe, a także zbieranie i przetwarzanie danych.

Ekspresja i oczyszczanie ludzkiego wrażliwego na lipidy kanału kationowego TRPC3 do oznaczania strukturalnego za pomocą mikroskopii krioelektronowej pojedynczych cząstek

Transient receptor potential channels (TRPCs) of the canonical TRP subfamily are nonselective cation channels that play an essential role in calcium ...

Protokół ten pozwolił nam rozwiązać problem struktury ludzkiego TRPC3, członka ważnej, ale niedostatecznie zbadanej rodziny kanałów jonowych. Główną zaletą tej techniki jest wysoka skuteczność, z jaką można ją stosować do ekspresji i oczyszczania różnych białek, zarówno do badań strukturalnych, jak i funkcjonalnych. Metoda ta może zapewnić wydajny system ekspresji i oczyszczania białek, do wykorzystania w badaniu biochemii i biofizyki białek i może być stosowana do szerokiej gamy kanałów jonowych i innych białek błonowych.Po pierwsze, sprawdź względną ekspresję wirusa, przeglądając fluorescencję GFP wirusa w próbce kultury produkującej wirusa. W kolbie hodowlanej Erlenmeyera o odpowiedniej wielkości z przegrodą należy przygotować pożądaną objętość hodowli zawiesinowej komórek ssaków HEK293 o stężeniu od 3,5 do 3,8 miliona komórek na mililitr w pożywce ekspresyjnej, uzupełnionej 1% sterylnym FBS. Dodać 8% objętościowo przygotowanego roztworu podstawowego wirusa P2 i inkubować w wytrząsarce orbitalnej w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 135 obr./min.Po 12 do 18 godzinach od zakażenia dodać 10 milimolowy maślan sodu, inkubować w temperaturze 30 stopni Celsjusza przez czas niezbędny do optymalnej ekspresji białka. Następnie odwiruj pod ciśnieniem 2 880 razy większym niż grawitacja przez 20 minut, aby zebrać komórki. Umyj i ponownie zawieś komórki w około 100 mililitrach TBS na litr zebranych komórek.Odwirować ponownie przy 2 880 razy grawitacji przez 20 minut i zebrać osad komórkowy. Zbieraj również małe, jednomililitrowe granulki komórkowe w różnych punktach czasowych i rozpuszczaj przez dwie godziny w temperaturze czterech stopni Celsjusza z mieszaniem w obecności różnych detergentów i / lub dodatków. Klarować te małe, rozpuszczone próbki całokomórkowe przez ultrawirowanie w temperaturze 235 000 razy większej niż grawitacja i w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez 10 minut.Następnie uruchom je jako próbki o pojemności 30 mikrolitrów na kolumnie chromatograficznej SEC, aby określić najlepszy czas na ekspresję i najlepsze warunki rozpuszczania. Rozmrozić osad w 100 mililitrach buforu na litr zebranych komórek. Po rozmrożeniu komórek odpipetuj je lub wymieszaj, aby upewnić się, że roztwór jest jednorodny.Pozwól komórkom rozpuszczeć się w temperaturze czterech stopni Celsjusza w zlewce zanurzonej w lodzie na dwie godziny, mieszając mieszadłem. Następnie usuń wszelkie resztki komórek przez ultrawirowanie w temperaturze 235 000 razy większej niż grawitacja i w czterech stopniach Celsjusza przez jedną godzinę. Uruchomić 30-mikrolitrową próbkę supernatantu na kolumnie SCC za pomocą HPLC, aby zweryfikować ilość białka i uwidocznić docelowe białko za pomocą sygnału wyjściowego GFB.Nałożyć supernatant związany z żywicą kobaltową zawierający rozpuszczone białko do kolumny grawitacyjnej i zebrać przepływ. Uruchom 30-mikrolitrową próbkę przepływu na kolumnie SCC, aby sprawdzić, czy białko wiąże się z żywicą. Następnie przemyj żywicę 10 objętościami buforu w kolumnie.Uruchom 30-mikrolitrową próbkę płukania na kolumnie SCC, aby sprawdzić, czy nie ma utraty białka. Za pomocą buforu wymyj ludzki TRPC3 związany z żywicą. Uruchomić 90-mikrolitrową próbkę eluantu, która została rozcieńczona w stosunku 1 do 100 na kolumnie SSC, aby sprawdzić, czy białko zostało eluowane i zweryfikować obecność sygnału GFP w pozycji odpowiadającej docelowej wielkości białka.Dodać trombinę w stosunku od 1 do 20 molowych i dodać 10 milimoli EDTA do eluowanej próbki. Inkubować w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez trzy godziny. Następnie przenieś eluant do 15-mililitrowej odśrodkowej rurki filtracyjnej.Zakręć probówką pod ciśnieniem 2 800 razy większym niż grawitacja i w czterech stopniach Celsjusza w pięciominutowych odstępach, aby stężyć eluant do 500 mikrolitrów lub mniej. Pipetować roztwór białka w górę i w dół między wirowaniami, aby ponownie zawiesić białko i zapobiec nadmiernemu zagęszczeniu. Załaduj koncentrat do kolumny SSC w buforze.Uruchom szybką chromatografię cieczową białek i zbierz 300 mikrolitrowych frakcji. Następnie połącz frakcje pików, które zawierają tetramer TRPC3, jak to jest uwidocznione przez sygnał absorbancji UV. I ponownie skoncentrować do końcowego stężenia co najmniej pięciu miligramów na mililitr.Ludzki TRPC3 jest rozpuszczony w całych komórkach w różnych detergentach o krytycznym stężeniu miceli od 0,01 do 20 mikromolowców i był prowadzony w buforze zawierającym DDM / CHS. Chociaż DDM/CHS wykazuje najwyższą rozpuszczalność ludzkiego TRPC3, pozycja piku wydaje się zbyt duża, aby być tetramerycznym ludzkim TRPC3. Po sorozpulizacji całych komórek resztki lizy komórek są usuwane, a rozpuszczone białko jest ładowane na kolumnę SSC i uruchamiane na HPLC w detergencie DDM / CHS zawierającym bufor, w celu porównania bezwzględnej rozpuszczalności i objętości szczytowej ludzkiego TRPC3 w różnych warunkach w stosunku do kontroli TRPM4.Wszystkie różne próbki TRPC3 rozpuszczone w detergentach wykazują pozycje szczytowe około 11,9 mililitrów, co jest prawdopodobnie zbyt duże, ponieważ tetrameryczna forma ludzkiego TRPC3 ma mniejszą masę cząsteczkową niż pozytywna kontrola ludzka TRPM4. Następnie testowane są dwa różne solubilizacyjne i robocze zawierające DDM/CHS i digitoninę. Przebieg białka w buforze zawierającym digitoninę daje najwyższy pik w rozsądnej pozycji w stosunku do kontroli dodatniej.Podczas gdy oczyszczanie na małą skalę przy użyciu 25 mililitrów komórek wykazuje kilka szerokich pików, białko wykazuje cechy pojedynczego tetramerycznego ludzkiego kanału TRPC3 w klasyfikacji 2D według barwienia ujemnego. Dodatki są następnie badane pod kątem fizjologicznego charakteru ludzkiego TRPC3. EDTA wykazuje niezwykły wpływ na stabilizację ludzkiego TRPC3 w nienaruszonej pozycji piku tetramerycznego i znacznie zwiększył liczbę cząstek w mikrofotografii krio-EM i zmniejszył szum w tle.Jakość wyników końcowych zależy od dobrego rozwiązywania problemów z profilami FSCC na HPLC. I po szybkim wykonaniu wszystkich etapów oczyszczania, najlepiej w ciągu jednego dnia. Po tej procedurze można przeprowadzić oznaczenie strukturalne, wytwarzanie przeciwciał i badania funkcjonalne, takie jak testy wiązania lub elektrofizjologia.Technika ta może być i została zaadaptowana do badania innych kanałów jonowych i rodzin białek oraz do produkcji oczyszczonych białek do zastosowań wykraczających poza determinację strukturalną. Należy podjąć odpowiednie środki ostrożności w celu zarządzania zagrożeniami biologicznymi związanymi z hodowlami komórkowymi, takie jak praca w kapturze z przepływem laminarnym, noszenie odzieży ochronnej i właściwe usuwanie odpadów.

expression-purification-human-lipid-sensitive-cation-channel-trpc3

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemia

Opisano procedury całkowitego odtworzenia prototypu kanału potasowego bramkowanego napięciem do błon lipidowych. Odtworzone kanały nadają się do testów biochemicznych, zapisów elektrycznych, badań przesiewowych ligandów i badań krystalograficznych elektronów. Metody te mogą mieć ogólne zastosowanie w badaniach strukturalnych i funkcjonalnych innych białek błonowych.

Rekonstytucja kanału Kv do błon lipidowych w badaniach strukturalnych i funkcjonalnych

Heterologiczna ekspresja i oczyszczanie transbłonowego regulatora przewodnictwa mukowiscydozy (CFTR) są znaczącymi wyzwaniami i czynnikami ograniczającymi rozwój terapii lekowych mukowiscydozy. Protokół ten opisuje dwie metody izolacji miligramowych ilości CFTR odpowiednie do badań funkcjonalnych i strukturalnych.

Oczyszczanie białka transbłonowego regulatora przewodnictwa mukowiscydozy ulegającego ekspresji w Saccharomyces cerevisiae

Ten artykuł opisuje metodologię mikroskopii krioelektronowej, która jest używana do uzyskiwania wysokiej jakości mikroskopowych obrazów makrocząsteczek w ich stanie zbliżonym do natywnego. Metoda ta pozwala uzyskać obrazy nadające się do dalszego przetwarzania komputerowego przy użyciu podejścia pojedynczej cząstki, opracowanego w celu wygenerowania rekonstrukcji 3D makrocząsteczki.

Co robić, a czego nie robić w mikroskopii krioelektronowej: podstawa przygotowania próbek i gromadzenia wysokiej jakości danych do makromolekularnej rekonstrukcji 3D

Ten artykuł przedstawia protokół do przetwarzania obrazów cryo-EM za pomocą pakietu oprogramowania SPHIRE. Obecny protokół może być stosowany do prawie wszystkich projektów EM pojedynczych cząstek, które są ukierunkowane na rozdzielczość bliską atomowi.

Analiza pojedynczych cząstek w wysokiej rozdzielczości na podstawie obrazów kriomikroskopii elektronowej przy użyciu SPHIRE

Ten artykuł opisuje konkretne metody uzyskiwania biochemicznych ilości TRPV1 rozpuszczonego w detergentach do analizy spektroskopowej. Połączone protokoły zapewniają narzędzia biochemiczne i biofizyczne, które można dostosować w celu ułatwienia badań strukturalnych i funkcjonalnych kanałów jonowych ssaków w środowisku kontrolowanym przez błonę.

Oczyszczanie i rekonstytucja TRPV1 do analizy spektroskopowej

Oczyszczanie kanałów jonowych jest często wyzwaniem, ale gdy już zostanie osiągnięte, może potencjalnie umożliwić badania in vitro funkcji i struktur kanałów. W tym miejscu opisujemy etapowe procedury ekspresji i oczyszczania białek bestrofiny ssaków, rodziny kanałów Cl- aktywowanych przezCa2+.

Ekspresja i oczyszczanie kanałów jonowych bestrofiny ssaków

Określanie struktury kompleksów makromolekularnych za pomocą cryoEM stało się rutyną dla niektórych klas białek i kompleksów. W tym miejscu podsumowano ten proces (przygotowanie próbki, badanie przesiewowe, pozyskiwanie i przetwarzanie danych), a czytelnicy są kierowani do dalszych szczegółowych zasobów i zmiennych, które mogą ulec zmianie w przypadku trudniejszych próbek.

Mikroskopia krioelektronowa pojedynczych cząstek: od próbki do struktury

Na podstawie mechanizmu składania kompleksu białkowego INAD, w tym protokole, zmodyfikowano strategię oczyszczania powinowactwa i konkurencji w celu oczyszczenia endogennego kanału TRP Drosophila.

Oczyszczanie endogennych kanałów potencjału przejściowego receptora Drosophila

Ten protokół opisuje, jak używać mikroskopii TIRF do śledzenia poszczególnych kanałów jonowych i określania ich aktywności w obsługiwanych błonach lipidowych, definiując w ten sposób wzajemne oddziaływanie między bocznym ruchem błony a funkcją kanału. Opisano w nim, jak przygotować membrany, rejestrować dane i analizować wyniki.

Obrazowanie jednocząsteczkowe ruchliwości bocznej i aktywności kanałów jonowych w dwuwarstwach lipidowych przy użyciu mikroskopii fluorescencji całkowitego wewnętrznego odbicia (TIRF)

Ten manuskrypt opisuje, jak przeprowadzić badania przesiewowe pod kątem mutacji termostabilizujących, oczyścić ludzki transporter serotoniny, wygenerować przeciwciała o wysokim powinowactwie i skrystalizować kompleks transporter-przeciwciało serotoniny związany z lekiem przeciwdepresyjnym S-citalopram. Protokół ten można dostosować do badania innych trudnych transporterów błonowych, receptorów i kanałów.

Termostabilizacja, ekspresja, oczyszczanie i krystalizacja ludzkiego transportera serotoniny związanego z S-citalopramem

Poznaj metodę ekspresji i oczyszczania ludzkiego kanału TRPC3 w komórkach HEK293 przy użyciu systemu bakulowirusowego. Technika ta umożliwia oznaczanie strukturalne krio-EM białek błonowych.

Ekspresja i oczyszczanie ludzkiego wrażliwego na lipidy kanału kationowego TRPC3 do oznaczania strukturalnego za pomocą mikroskopii krioelektronowej pojedynczych cząstek (Wideo) | JoVE Journal

Ekspresja i oczyszczanie ludzkiego wrażliwego na lipidy kanału kationowego TRPC3 do oznaczania strukturalnego za pomocą mikroskopii krioelektronowej pojedynczych cząstek

Przeglądaj więcej filmów