Ekspresja i oczyszczanie ludzkiego wrażliwego na lipidy kanału kationowego TRPC3 do oznaczania strukturalnego za pomocą mikroskopii krioelektronowej pojedynczych cząstek
7 stycznia 2019
Ten protokół opisuje techniki używane do określania struktur kanałów jonowych za pomocą mikroskopii krioelektronowej, w tym system bakulowirusa używany do efektywnej ekspresji genów w komórkach ssaków przy minimalnym wysiłku i toksyczności, ekstrakcję białek, oczyszczanie i kontrolę jakości, przygotowanie siatki próbek i badanie przesiewowe, a także zbieranie i przetwarzanie danych.
Protokół ten pozwolił nam rozwiązać problem struktury ludzkiego TRPC3, członka ważnej, ale niedostatecznie zbadanej rodziny kanałów jonowych. Główną zaletą tej techniki jest wysoka skuteczność, z jaką można ją stosować do ekspresji i oczyszczania różnych białek, zarówno do badań strukturalnych, jak i funkcjonalnych. Metoda ta może zapewnić wydajny system ekspresji i oczyszczania białek, do wykorzystania w badaniu biochemii i biofizyki białek i może być stosowana do szerokiej gamy kanałów jonowych i innych białek błonowych.
Po pierwsze, sprawdź względną ekspresję wirusa, przeglądając fluorescencję GFP wirusa w próbce kultury produkującej wirusa. W kolbie hodowlanej Erlenmeyera o odpowiedniej wielkości z przegrodą należy przygotować pożądaną objętość hodowli zawiesinowej komórek ssaków HEK293 o stężeniu od 3,5 do 3,8 miliona komórek na mililitr w pożywce ekspresyjnej, uzupełnionej 1% sterylnym FBS. Dodać 8% objętościowo przygotowanego roztworu podstawowego wirusa P2 i inkubować w wytrząsarce orbitalnej w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 135 obr./min.
Po 12 do 18 godzinach od zakażenia dodać 10 milimolowy maślan sodu, inkubować w temperaturze 30 stopni Celsjusza przez czas niezbędny do optymalnej ekspresji białka. Następnie odwiruj pod ciśnieniem 2 880 razy większym niż grawitacja przez 20 minut, aby zebrać komórki. Umyj i ponownie zawieś komórki w około 100 mililitrach TBS na litr zebranych komórek.
Odwirować ponownie przy 2 880 razy grawitacji przez 20 minut i zebrać osad komórkowy. Zbieraj również małe, jednomililitrowe granulki komórkowe w różnych punktach czasowych i rozpuszczaj przez dwie godziny w temperaturze czterech stopni Celsjusza z mieszaniem w obecności różnych detergentów i / lub dodatków. Klarować te małe, rozpuszczone próbki całokomórkowe przez ultrawirowanie w temperaturze 235 000 razy większej niż grawitacja i w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez 10 minut.
Następnie uruchom je jako próbki o pojemności 30 mikrolitrów na kolumnie chromatograficznej SEC, aby określić najlepszy czas na ekspresję i najlepsze warunki rozpuszczania. Rozmrozić osad w 100 mililitrach buforu na litr zebranych komórek. Po rozmrożeniu komórek odpipetuj je lub wymieszaj, aby upewnić się, że roztwór jest jednorodny.
Pozwól komórkom rozpuszczeć się w temperaturze czterech stopni Celsjusza w zlewce zanurzonej w lodzie na dwie godziny, mieszając mieszadłem. Następnie usuń wszelkie resztki komórek przez ultrawirowanie w temperaturze 235 000 razy większej niż grawitacja i w czterech stopniach Celsjusza przez jedną godzinę. Uruchomić 30-mikrolitrową próbkę supernatantu na kolumnie SCC za pomocą HPLC, aby zweryfikować ilość białka i uwidocznić docelowe białko za pomocą sygnału wyjściowego GFB.
Nałożyć supernatant związany z żywicą kobaltową zawierający rozpuszczone białko do kolumny grawitacyjnej i zebrać przepływ. Uruchom 30-mikrolitrową próbkę przepływu na kolumnie SCC, aby sprawdzić, czy białko wiąże się z żywicą. Następnie przemyj żywicę 10 objętościami buforu w kolumnie.
Uruchom 30-mikrolitrową próbkę płukania na kolumnie SCC, aby sprawdzić, czy nie ma utraty białka. Za pomocą buforu wymyj ludzki TRPC3 związany z żywicą. Uruchomić 90-mikrolitrową próbkę eluantu, która została rozcieńczona w stosunku 1 do 100 na kolumnie SSC, aby sprawdzić, czy białko zostało eluowane i zweryfikować obecność sygnału GFP w pozycji odpowiadającej docelowej wielkości białka.
Dodać trombinę w stosunku od 1 do 20 molowych i dodać 10 milimoli EDTA do eluowanej próbki. Inkubować w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez trzy godziny. Następnie przenieś eluant do 15-mililitrowej odśrodkowej rurki filtracyjnej.
Zakręć probówką pod ciśnieniem 2 800 razy większym niż grawitacja i w czterech stopniach Celsjusza w pięciominutowych odstępach, aby stężyć eluant do 500 mikrolitrów lub mniej. Pipetować roztwór białka w górę i w dół między wirowaniami, aby ponownie zawiesić białko i zapobiec nadmiernemu zagęszczeniu. Załaduj koncentrat do kolumny SSC w buforze.
Uruchom szybką chromatografię cieczową białek i zbierz 300 mikrolitrowych frakcji. Następnie połącz frakcje pików, które zawierają tetramer TRPC3, jak to jest uwidocznione przez sygnał absorbancji UV. I ponownie skoncentrować do końcowego stężenia co najmniej pięciu miligramów na mililitr.
Ludzki TRPC3 jest rozpuszczony w całych komórkach w różnych detergentach o krytycznym stężeniu miceli od 0,01 do 20 mikromolowców i był prowadzony w buforze zawierającym DDM / CHS. Chociaż DDM/CHS wykazuje najwyższą rozpuszczalność ludzkiego TRPC3, pozycja piku wydaje się zbyt duża, aby być tetramerycznym ludzkim TRPC3. Po sorozpulizacji całych komórek resztki lizy komórek są usuwane, a rozpuszczone białko jest ładowane na kolumnę SSC i uruchamiane na HPLC w detergencie DDM / CHS zawierającym bufor, w celu porównania bezwzględnej rozpuszczalności i objętości szczytowej ludzkiego TRPC3 w różnych warunkach w stosunku do kontroli TRPM4.
Wszystkie różne próbki TRPC3 rozpuszczone w detergentach wykazują pozycje szczytowe około 11,9 mililitrów, co jest prawdopodobnie zbyt duże, ponieważ tetrameryczna forma ludzkiego TRPC3 ma mniejszą masę cząsteczkową niż pozytywna kontrola ludzka TRPM4. Następnie testowane są dwa różne solubilizacyjne i robocze zawierające DDM/CHS i digitoninę. Przebieg białka w buforze zawierającym digitoninę daje najwyższy pik w rozsądnej pozycji w stosunku do kontroli dodatniej.
Podczas gdy oczyszczanie na małą skalę przy użyciu 25 mililitrów komórek wykazuje kilka szerokich pików, białko wykazuje cechy pojedynczego tetramerycznego ludzkiego kanału TRPC3 w klasyfikacji 2D według barwienia ujemnego. Dodatki są następnie badane pod kątem fizjologicznego charakteru ludzkiego TRPC3. EDTA wykazuje niezwykły wpływ na stabilizację ludzkiego TRPC3 w nienaruszonej pozycji piku tetramerycznego i znacznie zwiększył liczbę cząstek w mikrofotografii krio-EM i zmniejszył szum w tle.
Jakość wyników końcowych zależy od dobrego rozwiązywania problemów z profilami FSCC na HPLC. I po szybkim wykonaniu wszystkich etapów oczyszczania, najlepiej w ciągu jednego dnia. Po tej procedurze można przeprowadzić oznaczenie strukturalne, wytwarzanie przeciwciał i badania funkcjonalne, takie jak testy wiązania lub elektrofizjologia.
Technika ta może być i została zaadaptowana do badania innych kanałów jonowych i rodzin białek oraz do produkcji oczyszczonych białek do zastosowań wykraczających poza determinację strukturalną. Należy podjąć odpowiednie środki ostrożności w celu zarządzania zagrożeniami biologicznymi związanymi z hodowlami komórkowymi, takie jak praca w kapturze z przepływem laminarnym, noszenie odzieży ochronnej i właściwe usuwanie odpadów.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Ten protokół opisuje techniki stosowane do określania struktur kanałów jonowych za pomocą kryo-mikroskopii elektronowej, koncentrując się na efektywnym ekspresji genów w komórkach ssaków. Obejmuje on metody ekstrakcji białek, ich oczyszczania i weryfikacji jakości, a także przygotowania siatki próbki i zbierania danych.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neuronauki
- Biologia strukturalna
- Biofizyka
Tło
- Kanały jonowe są niezbędne dla różnych funkcji komórkowych.
- TRPC3 jest słabo zbadanym członkiem rodziny kanałów jonowych.
- Kryo-mikroskopia elektronowa jest potężnym narzędziem do określania struktury.
- Efektywne systemy ekspresji białek są niezbędne do badania białek błonowych.
Cel badania
- Rozwiązanie struktury ludzkiego TRPC3.
- Opracowanie metody o wysokiej wydajności do ekspresji i oczyszczania białek.
- Ułatwienie badań nad biochemią i biofizyką białek.
Zastosowane metody
- Zastosowanie systemu bakulowirusowego do ekspresji genów w komórkach ssaków.
- Techniki ekstrakcji i oczyszczania białek.
- Przygotowanie siatki próbki do kryo-mikroskopii elektronowej.
- Zbieranie i przetwarzanie danych do analizy strukturalnej.
Główne wyniki
- Skuteczna ekspresja i oczyszczenie białka TRPC3.
- Przygotowanie wysokiej jakości próbek do kryo-mikroskopii elektronowej.
- Zdobyte informacje strukturalne na temat kanału jonowego TRPC3.
- Wykazana efektywność protokołu dla różnych białek błonowych.
Wnioski
- Protokół zapewnia niezawodną metodę badania kanałów jonowych.
- Ulepsza rozumienie TRPC3 i podobnych białek.
- Potencjalne zastosowania w badaniach strukturalnych i funkcjonalnych białek błonowych.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
Determining the structure of ion channels like TRPC3 enables mechanistic de-risking of therapeutic targets in cardiovascular, neurodegenerative, and neurologic diseases. This protocol provides a scalable expression and purification system for mammalian membrane proteins, supporting target validation and lead identification efforts. By facilitating high-resolution structural insights, it improves predictive confidence in early discovery decisions for ion channel modulators.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of TRPC3 gating mechanisms and functional target validation in disease-relevant systems.
- Operational Value: Provides purified protein for biochemical and biophysical assays to support hypothesis testing.
- Predictive Value: Structural data informs rational design of modulators and reduces mechanistic ambiguity in target selection.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Purified TRPC3 supports development of binding assays and functional readouts for compound screening.
- Operational Value: Standardized purification yields homogeneous protein suitable for assay reproducibility and scalability.
- Platform Utility: The baculovirus-HEK293 system can be adapted to other ion channels, enabling reusable infrastructure for membrane protein studies.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Structural insights link TRPC3 biology to disease phenotypes in cardiovascular and neurologic disorders.
- Operational Value: Purified protein enables preclinical validation of target engagement and mechanism of action.
- Risk Mitigation: Early structural data supports go/no-go decisions by clarifying target druggability and safety risks.
Pipeline & Workflow Integration
This method fits within the discovery continuum from target validation through lead identification to preclinical profiling, particularly for ion channel-focused programs.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification via structural and functional analysis of TRPC3.
- Screening: Purified protein enables assay development for high-throughput or secondary screening of ion channel modulators.
- Analytics: Cryo-EM and purification outputs provide quantitative structural and biophysical measurements for lead optimization.
- Translational Research: Structural data connects target biology to disease mechanisms, supporting biomarker alignment and preclinical continuity.
- Enterprise Reuse: The expression and purification platform is adaptable across ion channel families, reducing redundant development efforts.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: High-resolution structure enables mechanistic understanding of TRPC3 function and modulation.
- Operational Value: Scalable expression and purification ensure reproducibility and material supply for downstream studies.
- Strategic Value: Informs early go/no-go decisions by reducing biological risk in ion channel target programs.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization of TRPC3 and related ion channel targets in discovery portfolios.
Implementation Considerations
- Requires expertise in mammalian cell culture, baculovirus systems, and membrane protein biochemistry.
- Dependent on access to ultracentrifugation, affinity chromatography, HPLC, and cryo-EM instrumentation.
- Needs standardization across teams for detergent selection, solubilization conditions, and purification timing.
- Must account for protein stability challenges in different lipid environments and additive screening (e.g., EDTA).
- Practical limitations include time-sensitive purification steps and the need for rapid processing to maintain sample integrity.
