Ekspresja i oczyszczanie ludzkiego wrażliwego na lipidy kanału kationowego TRPC3 do oznaczania strukturalnego za pomocą mikroskopii krioelektronowej pojedynczych cząstek

Protokół ten pozwolił nam rozwiązać problem struktury ludzkiego TRPC3, członka ważnej, ale niedostatecznie zbadanej rodziny kanałów jonowych. Główną zaletą tej techniki jest wysoka skuteczność, z jaką można ją stosować do ekspresji i oczyszczania różnych białek, zarówno do badań strukturalnych, jak i funkcjonalnych. Metoda ta może zapewnić wydajny system ekspresji i oczyszczania białek, do wykorzystania w badaniu biochemii i biofizyki białek i może być stosowana do szerokiej gamy kanałów jonowych i innych białek błonowych.

Po pierwsze, sprawdź względną ekspresję wirusa, przeglądając fluorescencję GFP wirusa w próbce kultury produkującej wirusa. W kolbie hodowlanej Erlenmeyera o odpowiedniej wielkości z przegrodą należy przygotować pożądaną objętość hodowli zawiesinowej komórek ssaków HEK293 o stężeniu od 3,5 do 3,8 miliona komórek na mililitr w pożywce ekspresyjnej, uzupełnionej 1% sterylnym FBS. Dodać 8% objętościowo przygotowanego roztworu podstawowego wirusa P2 i inkubować w wytrząsarce orbitalnej w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 135 obr./min.

Po 12 do 18 godzinach od zakażenia dodać 10 milimolowy maślan sodu, inkubować w temperaturze 30 stopni Celsjusza przez czas niezbędny do optymalnej ekspresji białka. Następnie odwiruj pod ciśnieniem 2 880 razy większym niż grawitacja przez 20 minut, aby zebrać komórki. Umyj i ponownie zawieś komórki w około 100 mililitrach TBS na litr zebranych komórek.

Odwirować ponownie przy 2 880 razy grawitacji przez 20 minut i zebrać osad komórkowy. Zbieraj również małe, jednomililitrowe granulki komórkowe w różnych punktach czasowych i rozpuszczaj przez dwie godziny w temperaturze czterech stopni Celsjusza z mieszaniem w obecności różnych detergentów i / lub dodatków. Klarować te małe, rozpuszczone próbki całokomórkowe przez ultrawirowanie w temperaturze 235 000 razy większej niż grawitacja i w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez 10 minut.

Następnie uruchom je jako próbki o pojemności 30 mikrolitrów na kolumnie chromatograficznej SEC, aby określić najlepszy czas na ekspresję i najlepsze warunki rozpuszczania. Rozmrozić osad w 100 mililitrach buforu na litr zebranych komórek. Po rozmrożeniu komórek odpipetuj je lub wymieszaj, aby upewnić się, że roztwór jest jednorodny.

Pozwól komórkom rozpuszczeć się w temperaturze czterech stopni Celsjusza w zlewce zanurzonej w lodzie na dwie godziny, mieszając mieszadłem. Następnie usuń wszelkie resztki komórek przez ultrawirowanie w temperaturze 235 000 razy większej niż grawitacja i w czterech stopniach Celsjusza przez jedną godzinę. Uruchomić 30-mikrolitrową próbkę supernatantu na kolumnie SCC za pomocą HPLC, aby zweryfikować ilość białka i uwidocznić docelowe białko za pomocą sygnału wyjściowego GFB.

Nałożyć supernatant związany z żywicą kobaltową zawierający rozpuszczone białko do kolumny grawitacyjnej i zebrać przepływ. Uruchom 30-mikrolitrową próbkę przepływu na kolumnie SCC, aby sprawdzić, czy białko wiąże się z żywicą. Następnie przemyj żywicę 10 objętościami buforu w kolumnie.

Uruchom 30-mikrolitrową próbkę płukania na kolumnie SCC, aby sprawdzić, czy nie ma utraty białka. Za pomocą buforu wymyj ludzki TRPC3 związany z żywicą. Uruchomić 90-mikrolitrową próbkę eluantu, która została rozcieńczona w stosunku 1 do 100 na kolumnie SSC, aby sprawdzić, czy białko zostało eluowane i zweryfikować obecność sygnału GFP w pozycji odpowiadającej docelowej wielkości białka.

Dodać trombinę w stosunku od 1 do 20 molowych i dodać 10 milimoli EDTA do eluowanej próbki. Inkubować w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez trzy godziny. Następnie przenieś eluant do 15-mililitrowej odśrodkowej rurki filtracyjnej.

Zakręć probówką pod ciśnieniem 2 800 razy większym niż grawitacja i w czterech stopniach Celsjusza w pięciominutowych odstępach, aby stężyć eluant do 500 mikrolitrów lub mniej. Pipetować roztwór białka w górę i w dół między wirowaniami, aby ponownie zawiesić białko i zapobiec nadmiernemu zagęszczeniu. Załaduj koncentrat do kolumny SSC w buforze.

Uruchom szybką chromatografię cieczową białek i zbierz 300 mikrolitrowych frakcji. Następnie połącz frakcje pików, które zawierają tetramer TRPC3, jak to jest uwidocznione przez sygnał absorbancji UV. I ponownie skoncentrować do końcowego stężenia co najmniej pięciu miligramów na mililitr.

Ludzki TRPC3 jest rozpuszczony w całych komórkach w różnych detergentach o krytycznym stężeniu miceli od 0,01 do 20 mikromolowców i był prowadzony w buforze zawierającym DDM / CHS. Chociaż DDM/CHS wykazuje najwyższą rozpuszczalność ludzkiego TRPC3, pozycja piku wydaje się zbyt duża, aby być tetramerycznym ludzkim TRPC3. Po sorozpulizacji całych komórek resztki lizy komórek są usuwane, a rozpuszczone białko jest ładowane na kolumnę SSC i uruchamiane na HPLC w detergencie DDM / CHS zawierającym bufor, w celu porównania bezwzględnej rozpuszczalności i objętości szczytowej ludzkiego TRPC3 w różnych warunkach w stosunku do kontroli TRPM4.

Wszystkie różne próbki TRPC3 rozpuszczone w detergentach wykazują pozycje szczytowe około 11,9 mililitrów, co jest prawdopodobnie zbyt duże, ponieważ tetrameryczna forma ludzkiego TRPC3 ma mniejszą masę cząsteczkową niż pozytywna kontrola ludzka TRPM4. Następnie testowane są dwa różne solubilizacyjne i robocze zawierające DDM/CHS i digitoninę. Przebieg białka w buforze zawierającym digitoninę daje najwyższy pik w rozsądnej pozycji w stosunku do kontroli dodatniej.

Podczas gdy oczyszczanie na małą skalę przy użyciu 25 mililitrów komórek wykazuje kilka szerokich pików, białko wykazuje cechy pojedynczego tetramerycznego ludzkiego kanału TRPC3 w klasyfikacji 2D według barwienia ujemnego. Dodatki są następnie badane pod kątem fizjologicznego charakteru ludzkiego TRPC3. EDTA wykazuje niezwykły wpływ na stabilizację ludzkiego TRPC3 w nienaruszonej pozycji piku tetramerycznego i znacznie zwiększył liczbę cząstek w mikrofotografii krio-EM i zmniejszył szum w tle.

Jakość wyników końcowych zależy od dobrego rozwiązywania problemów z profilami FSCC na HPLC. I po szybkim wykonaniu wszystkich etapów oczyszczania, najlepiej w ciągu jednego dnia. Po tej procedurze można przeprowadzić oznaczenie strukturalne, wytwarzanie przeciwciał i badania funkcjonalne, takie jak testy wiązania lub elektrofizjologia.

Technika ta może być i została zaadaptowana do badania innych kanałów jonowych i rodzin białek oraz do produkcji oczyszczonych białek do zastosowań wykraczających poza determinację strukturalną. Należy podjąć odpowiednie środki ostrożności w celu zarządzania zagrożeniami biologicznymi związanymi z hodowlami komórkowymi, takie jak praca w kapturze z przepływem laminarnym, noszenie odzieży ochronnej i właściwe usuwanie odpadów.