Dostrajanie kolumny przepływu z równoległymi segmentami i włączanie detekcji multipleksowej

Ogólnym celem niniejszej procedury HPLC jest dostrojenie równoległej kolumny z przepływem segmentowanym w celu umożliwienia detekcji multipleksowej. Metoda ta pozwala odpowiedzieć na kluczowe pytania w obszarach zdrowia i dobrostanu, nauk o środowisku, kryminalistyki oraz w każdej dziedzinie wymagającej analizy złożonych próbek, takich jak odkrycia biologiczne. Technika ta umożliwia kompleksową analizę próbek, dostarczając jednocześnie informacji o charakterze chemicznym i bioaktywnym substancji w złożonych mieszaninach.

Protokoły detekcji wielokrotnej pozwalają również na szybką analizę. Metoda ta umożliwia opracowanie strategii definiowania chemicznych odcisków palców złożonych mieszanin, takich jak kawa i wino, co pozwala producentom odróżnić ich produkty od tanich podróbek. Początkowo może wydawać się niekonwencjonalne, aby nie kierować całej próbki do jednego detektora w celu dokładnej analizy.

Jednakże stężenie analitytu w każdym strumieniu przepływu jest wyższe niż w całkowitym strumieniu przepływu w konwencjonalnej kolumnie. Na początek należy przygotować instrument HPLC, stosując 100% wody UE oraz czysty metanol odpowiednio jako fazy ruchome A i B. W przypadku użycia detektora MS do obu faz ruchomych należy dodać 0,1% kwasu mrówkowego, a następnie przepłukać pompy HPLC zgodnie z instrukcjami producenta.

Zmontuj detektory MS, UV, VS oraz DPPH zgodnie z instrukcjami producenta. Upewnij się, że komponenty są rozmieszczone w sposób zapewniający minimalną objętość martwą w liniach detektorów.

Następnie ustaw długość fali detektora UV VISTA na wartość właściwą dla danej próbki. Dla detektora MS ustaw 280 nanometrów. W celu przeprowadzenia analizy całkowitej liczby jonów (TIC) zastosuj tryb dodatni przy metodzie detekcji pełnego skanowania.

Ustabilizuj temperaturę i przepływ gazów detektora MS do następujących wartości: temperatura waporyzatora 500 °C, temperatura kapilary 350 °C, przepływ gazu pomocniczego 40 jednostek, przepływ gazu płuczącego 5 jednostek, szybkość przepływu gazu osłonowego 60 jednostek oraz napięcie rozpylania 3,5 kV. Aby przygotować odczynnik rodnikowy DPPH, rozpuść 25 mg rodnika DPPH w 250 ml metanolu w kolbie miarowej.

Dodaj 250 µL kwasu mrówkowego do roztworu i poddaj go sonikacji przez 10 minut. Następnie przykryj kolbę folią, aby zapobiec ekspozycji na światło. Kolejno, zgodnie z zaleceniami producenta, przepłucz pompę roztworem rodnika DPPH, aby przygotować system do pomiaru rodników DPPH.

Należy upewnić się, że przewód pompy jest przymocowany do wlotu trójnika, a następnie podłączyć cewkę reakcyjną o pojemności 100 µL do wylotu trójnika. Detektor należy przyłączyć do drugiego końca obudowy cewki reakcyjnej ENC, cewki reakcyjnej oraz grzałki kolumny. Na koniec należy ustawić detektor UV dla rodników DPPH na 520 nm.

Aby zbudować kolumnę do równoległego przepływu segmentowanego (PSF), najpierw podłącz wlot kolumny do urządzenia HPLC. Następnie za pomocą odcinka rurki połącz port centralny z detektorem MS. Używając rurek o tych samych wymiarach, podłącz jeden z obwodowych portów kolumny do detektora UV VS, a kolejny do trójnika systemu detekcji rodników DPPH.

Zablokuj niewykorzystane porty peryferyjne za pomocą zatyczek do kolumn. Ustaw szybkość przepływu HPLC na 1 ml/min 100% fazy ruchomej B dla kolumny o średnicy wewnętrznej 4,6 mm i długości 250 mm. Równoważ przez 20 minut.

Aby rozpocząć strojenie systemu PSF, najpierw przygotuj puste naczynia zbiorcze. Użyj tych fiolek do osobnego zbierania fazy ruchomej z portów UV VS oraz DPPH radical. Zanotuj czas zbierania i zgromadź co najmniej 500 mg rozpuszczalnika w każdym naczyniu.

Następnie zważ naczynia zbiorcze, aby określić masę fazy ruchomej, i podziel masę przez gęstość metanolu, aby obliczyć objętość fazy ruchomej zebraną z każdego portu. Na koniec wyznacz przepływ do detektora MS i oblicz udziały przepływu dla wszystkich detektorów jako procent całkowitego przepływu, zgodnie z opisem w protokole tekstowym. Jeśli udziały przepływu znacząco odbiegają od wartości idealnych, dodaj w razie potrzeby dodatkowe przewody, aby dostosować ciśnienie wsteczne, a następnie powtórz proces zbierania i obliczeń.

Na koniec ustaw prędkość przepływu pompy z odczynnikiem rodnikowym DPPH tak, aby odpowiadała prędkości przepływu w porcie wylotowym podłączonym do detektora. Przeprowadzono analizę HPLC w trybie multipleksowym na próbce kawy. Możliwość jednoczesnego rejestrowania chromatogramów UV i MS dla rodnika DPPH pozwala na łatwe dopasowanie związków w próbce, które zareagowały pozytywnie na rodnik DPPH, do widma UV.

W przypadku odpowiedzi MS opartych na dopasowaniu czasu retencji, w których odnotowano pozytywną odpowiedź z detektora MSS TIC, zapisano masę cząsteczkową piku. Łatwość dopasowywania pików między różnymi procesami detekcji umożliwia szybką i bardziej wydajną formę przesiewania i charakteryzacji złożonej próbki, takiej jak kawa. Po opanowaniu tej techniki, można ją przygotować w około godzinę i przystąpić do analizy próbki zgodnie z tą procedurą. W celu uzyskania dodatkowych informacji o próbce można zastosować inne detektory, takie jak detektor współczynnika załamania światła, fluorescencyjny oraz detekcję opartą na chemii, np. chemiluminescencję.

Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo rozumieć znaczenie multipleksowania procesów detekcji dla lepszego zrozumienia złożonej próbki. Ponadto detekcja multipleksowa z wykorzystaniem równoległych kolumn przepływu segmentowego jest niezwykle wydajnym sposobem prowadzenia eksploracji biologicznej.