Name: Dostrajanie kolumny przepływu z równoległymi segmentami i włączanie detekcji multipleksowej (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-12-15T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 1 s
Description: Poznaj metodę dostrajania kolumny przepływu z równoległymi segmentami w HPLC, umożliwiającą detekcję multipleksową. Technika ta przyspiesza analizę złożonych próbek, takich jak kawa czy wino, wspierając identyfikację ich składu chemicznego i bioaktywnego.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez UWS i ThermoFisher Scientific. Jeden z autorów (DK) potwierdza otrzymanie australijskiej nagrody podyplomowej.

Uwaga: Ten protokół zawiera instrukcje, jak używać kolumny PSF w systemie HPLC sprzężonym z wieloma detektorami do detekcji multipleksowej. Protokół został napisany przy założeniu, że czytelnik posiada podstawową wiedzę i doświadczenie w zakresie chromatografii i różnych metod detekcji HPLC.
Uwaga: Proszę zapoznać się z kartami charakterystyki substancji niebezpiecznych (MSDS) dla wszystkich materiałów i odczynników przed użyciem (np. MSDS dla metanolu). Należy zapewnić stosowanie wszystkich odpowiednich praktyk bezpieczeństwa podczas obchodzenia się z rozpuszczalnikami i eluentem z wysokosprawnej chromatografii cieczowej (HPLC). Należy zapewnić właściwe wykorzystanie kontroli inżynieryjnych HPLC, wagi analitycznej i oprzyrządowania detektora oraz zapewnić stosowanie środków ochrony osobistej (okulary ochronne, rękawice, fartuch laboratoryjny, długie spodnie i buty z zakrytymi palcami).
1. Konfiguracja instrumentu HPLC
<ol>
	<li>Przygotować przyrząd do HPLC z ultraczystą wodą (np. 100% wodą Milli-Q) dla linii A i 100% metanolem dla linii B jako fazą ruchomą i przepłukać pompy zgodnie z wymaganiami producenta. Jeśli jednym z używanych detektorów jest stwardnienie rozsiane, tak jak w tym przypadku, dodaj 0,1% kwasu mrówkowego do obu faz ruchomych A i B.</li>
	<li>Skonfiguruj komponenty instrumentalne i detektory HPLC, jak pokazano na rysunku 2. Wymaga to wygodnego rozmieszczenia detektorów względem kolumny, tak aby zminimalizować martwą objętość między detektorem a kolumną. Pożądana jest elastyczność w konfiguracji systemu HPLC.</li>
</ol>
2. Konfiguracja detektorów UV-Vis i MS
<ol>
	<li>Ustaw detektor UV-Vis na żądaną długość fali w zależności od interesującej nas próbki (np. 280 nm).</li>
	<li>Ustaw detektor MS w trybie dodatnim do analizy całkowitej liczby jonów (TIC) przy użyciu metody wykrywania Full Scan. Dostosuj również odpowiednio następujące parametry MS: temperatura parownika 500 °C, temperatura kapilary 350 °C, gaz osłonowy ustawiony na szybkość 60 jednostek, przepływ gazu pomocniczego 40 i przepływ gazu wymiatającego na poziomie 5 jednostek oraz napięcie natrysku 3,5 kV. Ustawienia te można później dostosować do konkretnych wymagań użytkownika w zależności od analizowanej próbki.</li>
</ol>
3. Przygotowanie odczynnika 2,2-difenylo-1-pikrylohydrazylu (DPPH•) Konfiguracja odczynnika DPPH• Detektor systemu
<ol>
	<li>Odważyć 25 mg DPPH i rozpuścić w 250 ml metanolu w kolbie miarowej.</li>
	<li>Dodać 250 μl kwasu mrówkowego do odczynnika DPPH•. Przykryć kolbę folią, aby zapobiec ekspozycji na światło.</li>
	<li>Sondować kolbę zawierającą odczynnik DPPH• przez 10 minut.</li>
	<li>Przedmuchnąć pompę DPPH• przygotowanym odczynnikiem DPPH• zgodnie z wymaganiami producenta.</li>
	<li>Skonfiguruj system DPPH• zgodnie z rysunkiem 2, podłączając przewód pompy do wlotu trójnika.</li>
	<li>Podłącz cewkę reakcyjną o pojemności 100 μl do wylotu trójnika, a drugi koniec cewki reakcyjnej podłącz do detektora.</li>
	<li>Zamknąć cewkę reakcyjną w grzałce kolumnowej i ustawić temperaturę grzałki kolumnowej na 60 °C.</li>
	<li>Ustaw detektor DPPH• UV-Vis na 520 nm.</li>
</ol>
4. Konfiguracja kolumny PSF
<ol>
	<li>Podłączyć wlot kolumny PSF do przyrządu HPLC.</li>
	<li>Podłącz centralny port do detektora MS za pomocą rurki o średnicy wewnętrznej 0.13 mm o długości 15 cm.</li>
	<li>Podłącz port peryferyjny do detektora UV-Vis za pomocą rurki o średnicy wewnętrznej 0,13 mm o długości 15 cm.</li>
	<li>Podłącz kolejny port peryferyjny do trójnika systemu detekcji DPPH• za pomocą rurki o długości 15 cm z rurką identyfikacyjną 0.13 mm.</li>
	<li>Zablokuj nieużywany port peryferyjny za pomocą ogranicznika kolumny.</li>
	<li>Doprowadzić natężenie przepływu pompy HPLC do 1 ml min-1 przy 100% linii B - 100% metanolu (0,1% kwasu mrówkowego).</li>
	<li>Zrównoważyć kolumnę fazą ruchomą 100% metanolu przez 20 minut, aby uzyskać kolumnę o średnicy wewnętrznej 4,6 mm x długości 250 mm. Czas ten jest skalowany zgodnie z wymiarami innych kolumn, z których użytkownik może skorzystać.</li>
</ol>
5. Dostrajanie kolumny PSF do detekcji multipleksowej
<ol>
	<li>Zmierzyć masę co najmniej dwóch pustych naczyń zbiorczych (jednego dla portu podłączonego do detektora UV-Vis i jednego dla detektora DPPH•) za pomocą wagi analitycznej.</li>
	<li>Zebrać fazę ruchomą z portów UV-Vis i DPPH• do dwóch oddzielnych, wstępnie zważonych naczyń zbiorczych (5.1). Zapisz okres zbierania danych. Zebrać co najmniej 500 mg rozpuszczalnika w każdym naczyniu.</li>
	<li>Zważyć naczynia zbiorcze i określić masę fazy ruchomej. Biorąc pod uwagę, że gęstość metanolu wynosi 0,791 g ml-1, określ objętość fazy ruchomej pobranej z każdego portu.</li>
	<li>Różnica, to znaczy nominalne natężenie przepływu zestawu pompy pomniejszone o natężenie przepływu przez porty przepływu detektora DPPH• i detektora UV-Vis, określ natężenie przepływu do detektora MS. Każdą proporcję przepływu należy wyrazić jako procent całkowitego przepływu. 
	Uwaga: Idealnie, procentowe wartości przepływu wynoszą: do MS wynosi 18% całkowitego natężenia przepływu, do UV-Vis 22%, do detektora DPPH• 60%.</li>
	<li>Jeśli nie, wyreguluj procenty przepływu, zmieniając ciśnienie wsteczne w detektorze UV-Vis. Na przykład, jeśli przepływ do UV-Vis jest zbyt duży, zmniejsz proporcję, dodając 15-centymetrowy odcinek rurki o średnicy wewnętrznej 0,13 mm do wylotu detektora UV-Vis. Następnie powtórz kroki od 5.1 do 5.5.</li>
</ol>
6. Ostateczne warunki konfiguracji
<ol>
	<li>Ustaw natężenie przepływu pompy odczynnika DPPH• na takie samo natężenie przepływu wychodzącego z portu wylotowego podłączonego do detektora DPPH•. 
	Uwaga: Kolumna PSF multipleksowana za pomocą UV-Vis, DPPH• i MS jest teraz gotowa do analizy.</li>
</ol>

<ol><li>Camenzuli, M., Ritchie, H. J., Ladine, J. R., Shalliker, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+design+of+a+new+concept+chromatography+column%5BTitle%5D)+AND+%22Analyst%22%5BJournal%5D)">The design of a new concept chromatography column.</a> Analyst. 136 (24), 5127-5130 (2011).</li>
<li>Camenzuli, M., Ritchie, H. J., Ladine, J. R., Shalliker, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+separation+performance+using+a+new+column+technology%3A+Parallel+segmented+outlet+flow%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Chromatogr%2C+A%22%5BJournal%5D)">Enhanced separation performance using a new column technology: Parallel segmented outlet flow.</a> J. Chromatogr, A. 1232, 47-51 (2012).</li>
<li>Camenzuli, M., Ritchie, H. J., Ladine, J. R., Shalliker, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Active+flow+management+in+preparative+chromatographic+separations%3A+A+preliminary+investigation+into+enhanced+separation+using+a+curtain+flow+inlet+fitting+and+segmented+flow+outlet%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Active flow management in preparative chromatographic separations: A preliminary investigation into enhanced separation using a curtain flow inlet fitting and segmented flow outlet.</a> 35 (3), 410-415 (2012).</li>
<li>Camenzuli, M., Ritchie, H. J., Shalliker, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gradient+elution+chromatography+with+segmented+parallel+flow+column+technology%3A+A+study+on+4.6mm+analytical+scale+columns%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Chromatogr.%2C+A%22%5BJournal%5D)">Gradient elution chromatography with segmented parallel flow column technology: A study on 4.6mm analytical scale columns.</a> J. Chromatogr., A. 1270, 204-211 (2012).</li>
<li>Camenzuli, M., Ritchie, H. J., Shalliker, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improving+HPLC+separation+performance+using+parallel+segmented+flow+chromatography%5BTitle%5D)+AND+%22Microchem.+J%22%5BJournal%5D)">Improving HPLC separation performance using parallel segmented flow chromatography.</a> Microchem. J. 111, 3-7 (2013).</li>
<li>Shalliker, R. A., Ritchie, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Segmented+flow+and+curtain+flow+chromatography%3A+Overcoming+the+wall+effect+and+heterogeneous+bed+structures%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Chromatogr%2C+A%22%5BJournal%5D)">Segmented flow and curtain flow chromatography: Overcoming the wall effect and heterogeneous bed structures.</a> J. Chromatogr, A. 1335, 122-135 (2014).</li>
<li>Camenzuli, M., Ritchie, H. J., Shalliker, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluating+active+flow+technology+HPLC+columns+as+a+platform+for+multiplexed+detection%5BTitle%5D)+AND+%22Microchem.+J%22%5BJournal%5D)">Evaluating active flow technology HPLC columns as a platform for multiplexed detection.</a> Microchem. J. 110, 473-479 (2013).</li>
<li>Camenzuli, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Parallel+segmented+outlet+flow+high+performance+liquid+chromatography+with+multiplexed+detection%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chim.+Acta%22%5BJournal%5D)">Parallel segmented outlet flow high performance liquid chromatography with multiplexed detection.</a> Anal. Chim. Acta. 803, 154-159 (2013).</li>
<li>Shalliker, R. A., Camenzuli, M., Pereira, L., Ritchie, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Parallel+segmented+flow+chromatography+columns%3A+Conventional+analytical+scale+column+formats+presenting+as+a+%27virtual%27+narrow+bore+column%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Chromatogr.%2C+A%22%5BJournal%5D)">Parallel segmented flow chromatography columns: Conventional analytical scale column formats presenting as a 'virtual' narrow bore column.</a> J. Chromatogr., A. 1262, 64-69 (2012).</li>
<li>Soliven, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improving+the+performance+of+narrow-bore+HPLC+columns+using+active+flow+technology%5BTitle%5D)+AND+%22Microchem.+J%22%5BJournal%5D)">Improving the performance of narrow-bore HPLC columns using active flow technology.</a> Microchem. J. 116, 230-234 (2014).</li>
<li>Camenzuli, M., Ritchie, H. J., Dennis, G. R., Shalliker, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Parallel+segmented+flow+chromatography+columns+with+multiplexed+detection%3A+An+illustration+using+antioxidant+screening+of+natural+products%5BTitle%5D)+AND+%22Microchem.+J%22%5BJournal%5D)">Parallel segmented flow chromatography columns with multiplexed detection: An illustration using antioxidant screening of natural products.</a> Microchem. J. 110, 726-730 (2013).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Badanie to obejmuje charakterystykę i profilowanie kawy przy użyciu HPLC z detekcją multipleksową z wykorzystaniem kolumny o równoległym przepływie segmentowym (PSF). Multipleksowana HPLC z wykorzystaniem kolumn PSF umożliwia charakterystykę i identyfikację kluczowych jednostek chemicznych poprzez zmniejszenie złożoności danych próbki przy jednoczesnym uzyskaniu większego stopnia informacji specyficznych dla cząsteczki w ułamku czasu potrzebnego przy użyciu konwencjonalnych procesów wielokrotnej detekcji. Kolumna PSF umo...

Kolumny technologii Active Flow
Kolumny chromatograficzne z technologią aktywnego przepływu (AFT) zostały niedawno opracowane w celu przezwyciężenia nieefektywności separacji związanej z niejednorodnością przepływu1-6, a także w celu umożliwienia detekcji multipleksowej. W tej konkretnej komunikacji szczegółowo opisujemy proces operacyjny kolumny z równoległym przepływem segmentowym (PSF) z detekcją multipleksową. Kluczowymi zaletami funkcjonalnymi kolumny PSF są: (1) przepływ z promieniowego obszaru centralnego łoża kolumny jest odizolowany od obwodowego lub ściennego obszaru przepływu, (2) objętość fazy ruchomej, która musi być przetworzona przez źródło detekcji, jest zmniejszona, oraz (3) źródła detekcji mogą być multipleksowane w celu rozszerzenia informacji o próbce bez wprowadzania opóźnień wykrywania w każdym procesie wykrywania, lub w związku z tym konieczne jest rozszczepienie strumienia przepływu na słupie7,8. Kluczową cechą konstrukcji kolumny PSF, która umożliwia korzystanie z detekcji multipleksowej, jest nowatorska armatura wylotowa i zespół frytki. Rysunek 1 przedstawia zdjęcie kolumny AFT w porównaniu z konwencjonalną kolumną. Ważne jest, aby zrozumieć, że proces podziału uzyskany przy użyciu równoległych segmentowanych kolumn przepływu nie jest taki sam, jak podział strumienia przepływu po kolumnie. W podzielonym strumieniu przepływu po kolumnie próbkowanie odbywa się równomiernie (tj. osiowo) w całym paśmie próbki od krawędzi natarcia do krańców ogona, w wyniku czego każdy strumień przepływu jest równy pod względem wydajności i czułości; Wielkość czułości jest w ten sposób dzielona przez liczbę rozdwojoną. Jednak w PSF proces rozdzielania próbkuje pasmo promieniowo, a nie osiowo. W związku z tym port centralny pobiera próbki z wierzchołka piku — najbardziej skoncentrowanego obszaru szczytu. W związku z tym czułość jest tutaj najwyższa, ponieważ pik nie jest rozcieńczany przez rozproszony obszar ogonowy. Elucja próbki z portów peryferyjnych nie jest tak wydajna jak w strefie centralnej, ale ponieważ pasmo jest próbkowane promieniowo, a nie osiowo, szerokość piku jest węższa niż w przypadku procesu próbkowania, który dzieli pik w kierunku osiowym, tj. podział kolumny końcowej. W związku z tym czułość z detektorem zależnym od stężenia nie jest zmniejszona.
W kolumnie PSF, złączka wylotowa składa się z wielu portów wyjściowych, a po wewnętrznej stronie tej końcowej złączki znajduje się pierścieniowa fryta. Wewnętrzna część tych pierścieniowych kanałów frytowych wypływa z kolumny przez promieniowy centralny port wylotowy, podczas gdy zewnętrzna promieniowa część kanałów wylotowych fryty wypływa z kolumny przez obwodowe lub ścienne porty wylotowe. Wewnętrzna i zewnętrzna część fryty wylotowej są oddzielone nieprzepuszczalną barierą, która zapobiega przepływowi krzyżowemu między tymi obszarami przepływu2. W wyniku tej konstrukcji centralny strumień promieniowy przepływający przez łoże słupa jest oddzielony od przepływu obszaru ściany wewnątrz słupa. Względna część przepływu z tych dwóch obszarów może być zmieniana do prawie dowolnego pożądanego stosunku poprzez zarządzanie ciśnieniem w celu optymalizacji różnych aspektów funkcjonalnych technologii kolumn, takich jak wydajność separacji lub czułość wykrywania. Zasadniczo, projekt ten skutecznie ustanawia w kolumnie o większym formacie "wirtualną" kolumnę o węższej średnicy wewnętrznej, a zatem kolumna funkcjonuje jako prawdziwa kolumna bezścienna, pokonując niejednorodność łoża kolumny i efekt ściany9,10.
Głównymi zaletami kolumn PSF są poprawa wydajności kolumn, minimalizacja przetwarzania rozpuszczalnika dla źródła (źródeł) detekcji i umożliwienie detekcji multipleksowej. Jednak dodatkową zaletą jest to, że ponieważ obszary ogonowe i czołowe dowolnego pasma są usuwane z ogólnego profilu elucji, substancja rozpuszczona podczas elucji lub wykrywania jest obecna w wyższym stężeniu, niż byłoby to obserwowane dla tego samego wtrysku substancji rozpuszczonej i obciążenia stężeniem na konwencjonalnej kolumnie, w zależności od zastosowanego współczynnika segmentacji. W konsekwencji często obserwuje się wzrost intensywności sygnału dla separacji przeprowadzanych na kolumnach PSF2. W rzeczywistości, jeśli współczynnik segmentacji zostanie dostosowany w taki sposób, że 25% przepływu wychodzi z każdego z czterech portów wyjściowych, intensywność sygnału obserwowana za pomocą detekcji ultrafioletowej (UV) pokazuje praktycznie dokładnie taką samą intensywność sygnału, jak pokazano przy użyciu konwencjonalnej kolumny, w której analizowana jest cała (100%) faza ruchoma7. Ponadto precyzyjne dostrojenie stosunku wylotu między obszarami przepływu centralnego i ściennego pozwala na optymalizację wydajności kolumny. Przyrost wydajności kolumny zaobserwowany przy użyciu kolumn AFT nie może być określony w jednej wartości, ponieważ ten przyrost wydajności jest funkcją trzech czynników: (1) natężenia przepływu, (2) współczynnika segmentacji i (3) współczynnika retencji substancji rozpuszczonej. Niemniej jednak prawie zawsze obserwuje się wzrost wydajności w porównaniu z konwencjonalnymi kolumnami, a czasami wzrost ten wynosi ponad 100% w liczbie teoretycznych tabliczek1,2. Możliwość dostrojenia współczynnika segmentacji pozwala analitykowi na skuteczne dopasowanie średnicy "wirtualnej" kolumny, a to jest ważny czynnik w odniesieniu do procesu detekcji. Na przykład wirtualna kolumna o średnicy wewnętrznej (ID) 2,1 mm jest tworzona z fizycznej kolumny o średnicy wewnętrznej 4,6 mm, gdy współczynnik segmentacji wynosi 21% elucji fazy ruchomej z promieniowego centralnego portu wyjściowego. W tych warunkach wirtualna kolumna o średnicy wewnętrznej 2,1 mm działa z wydajnością, która może być o ponad 70% większa niż konwencjonalna kolumna o średnicy wewnętrznej 2,1 mm, w zależności od natężenia przepływu i współczynnika retencji substancji rozpuszczonej10.
Obecny projekt kolumny PSF, który jest używany do detekcji multipleksowej, zawiera 4-portową złączkę wylotową, ale kolumna może być również wyposażona w 2-portową końcówkę, jednak ogranicza to wykrywanie tylko do dwóch detektorów. Podstawowa zasada działania tych kolumn jest jednak taka sama, z wyjątkiem tego, że cztery detektory mogą być jednocześnie sprzężone z 4-portową kolumną PSF na wyjściu, co rozszerza zakres detekcji multipleksowej. Oprócz rurek łączących przed i po kolumnie, jedynymi dodatkowymi wymaganiami dotyczącymi obsługi kolumny PSF są rurki, które można podłączyć do peryferyjnych portów wylotowych, oraz sposób, za pomocą którego można zmierzyć ilość fazy ruchomej przechodzącej przez każdą rurkę, zwykle pomiar masy lub pomiar objętościowy. Aby ułatwić strojenie, średnica wewnętrzna wszystkich rurek wylotowych powinna być taka sama. Stosunek przepływu między obwodowymi i promieniowymi centralnymi portami wyjściowymi jest następnie zmieniany za pomocą zarządzania ciśnieniem, po prostu poprzez zmianę długości rurki znajdującej się na obwodowej złączce wylotowej lub długości detektora przewodów na promieniowym centralnym porcie wylotowym.
Wykrywanie multipleksowane za pomocą kolumn PSF 
Ważną zaletą kolumn PSF jest to, że każdy z portów wyjściowych może być podłączony bezpośrednio do źródła detekcji, umożliwiając w ten sposób detekcję multipleksową. W dobrze zaprojektowanym systemie detekcji pojedyncza analiza z detekcją multipleksową może dostarczyć istotnych informacji na temat charakteru składników w próbce. Co ważne, badania niszczące i nieniszczące mogą być prowadzone dokładnie w tym samym czasie, bez opóźnień w wykrywaniu. Pozwala to na bezwzględne przypisanie np. przeciwutleniaczy za pomocą odczynnika DPPH•, przy czym zaobserwowano, że składniki eluują się w odpowiedzi wykrywania UV i/lub spektrometrii mas (MS)7,11. Dzięki temu cztery niezależne detektory mogą pracować jednocześnie, a odpowiednie porcje przepływu są kierowane do każdego detektora przez dowolny z czterech portów wylotowych. Ponieważ przepływ przez te porty można łatwo regulować, ilość substancji rozpuszczonej docierającej do dowolnego z detektorów można dostosować do czułości danego źródła detektora. Należy jednak zauważyć, że najbardziej efektywną migrację substancji rozpuszczonej obserwuje się przez promieniowy centralny port wylotowy. Każdy z portów peryferyjnych oferuje równoważną wydajność separacji, która po ustawieniu na 25% przez każdy port jest tylko nieznacznie mniej wydajna niż konwencjonalna kolumna. W związku z tym ważne jest, aby detektor ilościowy był ustawiony na analizę próbki z promieniowego centralnego portu wyjściowego.
Podczas ustawiania kolumny PSF w celu wykrywania multipleksowania należy wziąć pod uwagę szereg czynników, które należy wziąć pod uwagę, aby osiągnąć efektywne i wysokiej jakości wyniki; to są wymiary lamp dla każdego portu, wybór portu dla typu detektora i regulacja przepływu.
Wymiary rurki dla każdego portu
W chromatografii długość rurki po kolumnie odgrywa kluczową rolę w efektywności i wydajności separacji. Duża objętość martwa wynikająca z długich lub szerokich przewodów o średnicy wewnętrznej od wylotu kolumny do detektora spowoduje utratę wydajności, rozdzielczości i czułości. W związku z tym podczas ustawiania kolumny PSF należy zastosować odpowiednie wymiary przewodów, aby osiągnąć maksymalny potencjał w zapewnieniu wydajnej separacji przy jednoczesnym zapewnieniu korzyści płynących z multipleksowania.
Port do detektora 
Rysunek 2 jest ilustracją przykładowej konfiguracji detekcji multipleksowanej (wykrywanie ultrafioletowo-widzialnej (U-Vis), spektrometru masowego (MS) i 2,2-difenylo-1-pikrylohydrazylu (DPPH•)). Ilustracja pokazuje, że port centralny jest podłączony do detektora MS, podczas gdy detektory DPPH• i UV-Vis są podłączone do portów peryferyjnych. Ponieważ MS jest najbardziej czułym detektorem z trzech, przepływ do tego detektora był kierowany z centralnego portu wylotowego. Ponieważ detekcja DPPH• jest selektywna w stosunku do obecności przeciwutleniaczy, a najmniej czuła i najbardziej tolerancyjna na poszerzanie pasma, przepływ do tego detektora był kierowany z portu peryferyjnego. UV-Vis był wtórnym detektorem "ogólnym", więc przepływ do tego detektora był kierowany z drugiego portu peryferyjnego.
Regulacja przepływu
Po podłączeniu odpowiedniego przewodu z portu do detektora, przepływ wyjściowy z każdego z detektorów może być dostosowany do wymaganej ilości. Prostym sposobem pomiaru wielkości przepływu wychodzącego z każdego detektora jest zważenie ilości fazy ruchomej, która wymywa się przez każdy port w danym okresie czasu. W ten sposób można określić przepływ procentowy, a współczynniki przepływu można regulować poprzez skrócenie lub wydłużenie rurki podłączonej do przewodu wylotowego detektorów, odpowiednio do wymagań wybranych detektorów. Różne detektory mają różne wymagania dotyczące przepływu, na przykład cela przepływowa detektora fluorescencyjnego (FLD) nie jest ograniczona natężeniem przepływu, ale należy zachować ostrożność, aby uniknąć nadmiernego ciśnienia w komorze przepływowej. W związku z tym kontrolę przepływu przez FLD uzyskuje się zwykle poprzez regulację spadku ciśnienia na innych detektorach, a pozostała część przepływu przechodzi następnie przez FLD. Detektorem, który jest czuły na wielkość dostarczanego przepływu, jest MS. Ogólnie rzecz biorąc, obecne wysokiej klasy spektrometry masowe mogą z łatwością przetwarzać około 1 do 1,5 ml / min umiarkowanie wodnej fazy ruchomej. Powyżej tego natężenia przepływu zalanie źródła może spowodować, że MS nie będzie działał. Jednak czułość wykrywania w większości spektrometrów masowych jest korzystna dzięki zastosowaniu niższych natężeń przepływu; w związku z tym możliwości rozdzielania przepływu PSF są niezwykle przydatne w zastosowaniach związanych z wykrywaniem stwardnienia rozsianego. Można wykorzystać wysokie objętościowe natężenia przepływu w kolumnie, ale przy małych obciążeniach transportowanych do detektora MS. Dostrojenie przepływu do detektora MS musi być jednak wykonane poprzez regulację spadku ciśnienia przed detektorem MS, a nie po MS. W tym przypadku bardzo przydatne jest zastosowanie wężyka o wąskim otworze (średnica wewnętrzna 0,1 mm), ponieważ ciśnienie można łatwo regulować bez dodawania nieodpowiedniej objętości martwej.
W zależności od typu detektora, dostosowanie współczynnika segmentacji może być wykonane zarówno przed jak i po detektorze. Jeśli używany jest detektor nieniszczący, taki jak UV-Vis, procent przepływu zostanie zmierzony i dostrojony po detektorze. Jeśli w konfiguracji multipleksu używany jest pojedynczy detektor niszczący, procent przepływu jest określany przez wsteczne obliczenia w odniesieniu do innych procentów przepływu w portach. Jeśli używany jest detektor oparty na odczynniku, taki jak DPPH•, procent przepływu jest mierzony po detektorze bez dodawania odczynnika; A jeśli używane są dwa lub więcej detektorów niszczących, wówczas stosunek przepływu jest mierzony przez detektor wstępny. Systemy detekcji, które mogą wymagać dodatkowego oprzyrządowania, takie jak DPPH•, będą miały dodatkowe ciśnienie w układzie, które może zmienić procent przepływu po podłączeniu do systemu wykrywania. Dlatego należy zwrócić szczególną uwagę na ciśnienie w układzie detektora niszczącego podczas regulacji procentowego przepływu detektora wstępnego. Niezależnie od współczynnika przepływu, który jest ustalany przez którykolwiek z portów, informacje ilościowe powinny być uzyskiwane poprzez odpowiednią standaryzację. Jednak po ustaleniu stosunków przepływu są one wytrzymałe i nie zmieniają się nawet w warunkach elucji gradientowej7,
Szczegółowy protokół wideo towarzyszący temu rękopisowi ma na celu pokazanie, jak używać i dostroić kolumnę PSF działającą w multipleksowanym trybie wykrywania.

<table><tbody><tr><td>Przyrząd</td><td></td><td></td> HPLC <td>Wiele detektorów do wyboru do wykrywania multipleksowego. Wybrane detektory mogą wymagać dodatkowego oprzyrządowania, np. , pompy.</td></tr><tr><td>Kolumna HPLC z przepływem równoległym</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Nie zdefiniowano</td><td>Wkrótce zostanie skomercjalizowany</td></tr><tr><td>Metanol</td><td>Dowolna marka</td><td></td><td>Rurki HPLC Grade</td></tr><tr><td>PEEK</td><td>Dowolna marka</td><td></td><td>Różne długości i średnica wewnętrzna</td></tr><tr><td>Ograniczniki kolumn</td><td>Dowolna marka</td><td></td><td>Do blokowania nieużywanych portów peryferyjnych.</td></tr><tr><td>Obcinak do rur PEEK</td><td>Dowolna marka</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Waga analityczna</td><td>Dowolna marka</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Stoper</td><td>Dowolna marka</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Naczynia do zbierania eluentów</td><td>Fiolki na próbki dowolnej marki</td><td></td><td>1-2 ml mogą być używane jako naczynia do zbierania eluentu</td></tr></tbody></table>

dostrajanie kolumny przepływu z równoległymi segmentami i włączanie detekcji multipleksowej

Tuning a Parallel Segmented Flow Column and Enabling Multiplexed Detection

Technologia aktywnego przepływu (AFT) to nowa forma technologii kolumnowej, która została zaprojektowana w celu przezwyciężenia niejednorodności przepływu w celu zwiększenia wydajności separacji pod względem wydajności i czułości oraz umożliwienia multipleksowanej detekcji. Ta forma AFT wykorzystuje kolumnę o przepływie równoległym (PSF). Końcówka wylotu kolumny PSF składa się z 2 lub 4 portów, które można multipleksować w celu podłączenia do 4 detektorów. Kolumna PSF umożliwia nie tylko platformę do detekcji multipleksowej, ale także na jednoczesne połączenie detektorów niszczących i nieniszczących, bez dodatkowych przewodów o martwej objętości. Wielkość przepływu przez każdy port można również dostosować za pomocą zarządzania ciśnieniem, aby dopasować ją do wymagań konkretnego detektora (detektorów). Aby osiągnąć detekcję multipleksową za pomocą kolumny PSF, istnieje szereg parametrów, które można kontrolować, aby zapewnić optymalną wydajność separacji i jakość wyników; To są wymiary rurki dla każdego portu, wybór portu dla każdego typu detektora i regulacja przepływu. Protokół ten ma na celu pokazanie, jak używać i dostrajać kolumnę PSF działającą w multipleksowanym trybie wykrywania.

Przeprowadzono multipleksową analizę HPLC z wykorzystaniem kolumny AFT w trybie PSF (Rysunek 1), zgodnie z układem przedstawionym na Rysunku 2. Taki układ umożliwił jednoczesną analizę próbki kawy przy użyciu detekcji UV-Vis, DPPH• oraz MS w trybie całkowitej liczby jonów (TIC). Związki w próbce kawy wykazujące odpowiedź na DPPH• można było następnie łatwo przypisać do odpowiedzi UV-Vis i MS-TIC na podstawie zgodności czasów retencji, co zilustrowano na Rysu...

Tutaj prezentujemy protokół działania i dostrajania kolumn chromatografii przepływowej z równoległymi segmentami, aby umożliwić detekcję multipleksowaną.

Dostrajanie kolumny przepływu z równoległymi segmentami i włączanie detekcji multipleksowej

Active flow technology (AFT) is new form of column technology that was designed to overcome flow heterogeneity to increase separation performance in terms ...

Ogólnym celem niniejszej procedury HPLC jest dostrojenie równoległej kolumny z przepływem segmentowanym w celu umożliwienia detekcji multipleksowej. Metoda ta pozwala odpowiedzieć na kluczowe pytania w obszarach zdrowia i dobrostanu, nauk o środowisku, kryminalistyki oraz w każdej dziedzinie wymagającej analizy złożonych próbek, takich jak odkrycia biologiczne. Technika ta umożliwia kompleksową analizę próbek, dostarczając jednocześnie informacji o charakterze chemicznym i bioaktywnym substancji w złożonych mieszaninach.Protokoły detekcji wielokrotnej pozwalają również na szybką analizę. Metoda ta umożliwia opracowanie strategii definiowania chemicznych odcisków palców złożonych mieszanin, takich jak kawa i wino, co pozwala producentom odróżnić ich produkty od tanich podróbek. Początkowo może wydawać się niekonwencjonalne, aby nie kierować całej próbki do jednego detektora w celu dokładnej analizy.Jednakże stężenie analitytu w każdym strumieniu przepływu jest wyższe niż w całkowitym strumieniu przepływu w konwencjonalnej kolumnie. Na początek należy przygotować instrument HPLC, stosując 100% wody UE oraz czysty metanol odpowiednio jako fazy ruchome A i B. W przypadku użycia detektora MS do obu faz ruchomych należy dodać 0,1% kwasu mrówkowego, a następnie przepłukać pompy HPLC zgodnie z instrukcjami producenta.Zmontuj detektory MS, UV, VS oraz DPPH zgodnie z instrukcjami producenta. Upewnij się, że komponenty są rozmieszczone w sposób zapewniający minimalną objętość martwą w liniach detektorów.Następnie ustaw długość fali detektora UV VISTA na wartość właściwą dla danej próbki. Dla detektora MS ustaw 280 nanometrów. W celu przeprowadzenia analizy całkowitej liczby jonów (TIC) zastosuj tryb dodatni przy metodzie detekcji pełnego skanowania.Ustabilizuj temperaturę i przepływ gazów detektora MS do następujących wartości: temperatura waporyzatora 500 °C, temperatura kapilary 350 °C, przepływ gazu pomocniczego 40 jednostek, przepływ gazu płuczącego 5 jednostek, szybkość przepływu gazu osłonowego 60 jednostek oraz napięcie rozpylania 3,5 kV. Aby przygotować odczynnik rodnikowy DPPH, rozpuść 25 mg rodnika DPPH w 250 ml metanolu w kolbie miarowej.Dodaj 250 µL kwasu mrówkowego do roztworu i poddaj go sonikacji przez 10 minut. Następnie przykryj kolbę folią, aby zapobiec ekspozycji na światło. Kolejno, zgodnie z zaleceniami producenta, przepłucz pompę roztworem rodnika DPPH, aby przygotować system do pomiaru rodników DPPH.Należy upewnić się, że przewód pompy jest przymocowany do wlotu trójnika, a następnie podłączyć cewkę reakcyjną o pojemności 100 µL do wylotu trójnika. Detektor należy przyłączyć do drugiego końca obudowy cewki reakcyjnej ENC, cewki reakcyjnej oraz grzałki kolumny. Na koniec należy ustawić detektor UV dla rodników DPPH na 520 nm.Aby zbudować kolumnę do równoległego przepływu segmentowanego (PSF), najpierw podłącz wlot kolumny do urządzenia HPLC. Następnie za pomocą odcinka rurki połącz port centralny z detektorem MS. Używając rurek o tych samych wymiarach, podłącz jeden z obwodowych portów kolumny do detektora UV VS, a kolejny do trójnika systemu detekcji rodników DPPH.Zablokuj niewykorzystane porty peryferyjne za pomocą zatyczek do kolumn. Ustaw szybkość przepływu HPLC na 1 ml/min 100% fazy ruchomej B dla kolumny o średnicy wewnętrznej 4,6 mm i długości 250 mm. Równoważ przez 20 minut.Aby rozpocząć strojenie systemu PSF, najpierw przygotuj puste naczynia zbiorcze. Użyj tych fiolek do osobnego zbierania fazy ruchomej z portów UV VS oraz DPPH radical. Zanotuj czas zbierania i zgromadź co najmniej 500 mg rozpuszczalnika w każdym naczyniu.Następnie zważ naczynia zbiorcze, aby określić masę fazy ruchomej, i podziel masę przez gęstość metanolu, aby obliczyć objętość fazy ruchomej zebraną z każdego portu. Na koniec wyznacz przepływ do detektora MS i oblicz udziały przepływu dla wszystkich detektorów jako procent całkowitego przepływu, zgodnie z opisem w protokole tekstowym. Jeśli udziały przepływu znacząco odbiegają od wartości idealnych, dodaj w razie potrzeby dodatkowe przewody, aby dostosować ciśnienie wsteczne, a następnie powtórz proces zbierania i obliczeń.Na koniec ustaw prędkość przepływu pompy z odczynnikiem rodnikowym DPPH tak, aby odpowiadała prędkości przepływu w porcie wylotowym podłączonym do detektora. Przeprowadzono analizę HPLC w trybie multipleksowym na próbce kawy. Możliwość jednoczesnego rejestrowania chromatogramów UV i MS dla rodnika DPPH pozwala na łatwe dopasowanie związków w próbce, które zareagowały pozytywnie na rodnik DPPH, do widma UV.W przypadku odpowiedzi MS opartych na dopasowaniu czasu retencji, w których odnotowano pozytywną odpowiedź z detektora MSS TIC, zapisano masę cząsteczkową piku. Łatwość dopasowywania pików między różnymi procesami detekcji umożliwia szybką i bardziej wydajną formę przesiewania i charakteryzacji złożonej próbki, takiej jak kawa. Po opanowaniu tej techniki, można ją przygotować w około godzinę i przystąpić do analizy próbki zgodnie z tą procedurą. W celu uzyskania dodatkowych informacji o próbce można zastosować inne detektory, takie jak detektor współczynnika załamania światła, fluorescencyjny oraz detekcję opartą na chemii, np. chemiluminescencję.Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo rozumieć znaczenie multipleksowania procesów detekcji dla lepszego zrozumienia złożonej próbki. Ponadto detekcja multipleksowa z wykorzystaniem równoległych kolumn przepływu segmentowego jest niezwykle wydajnym sposobem prowadzenia eksploracji biologicznej.

tuning-parallel-segmented-flow-column-enabling-multiplexed

Research

JoVE Journal

Chemistry

Chemia

Przedstawiono zautomatyzowaną metodę identyfikacji odpowiednich wypełnień do chromatografii oddziaływań hydrofobowych (HIC) do wykorzystania w procesie oczyszczania białek. Metoda ta wykorzystuje system średniociśnieniowej chromatografii cieczowej obejmujący zautomatyzowane mieszanie buforów, dynamiczny wtrysk próbki z pętli, sekwencyjny wybór kolumn, analizę wielodługościową oraz rozdzielcze zbieranie frakcji eluatu.

Zautomatyzowany dobór kolumny do hydrofobowej chromatografii oddzielania w celu oczyszczania białek

Przedstawiono protokół użycia wysokosprawnych kolumn do chromatografii cieczowej z przepływem reakcji dla metod wykorzystujących derywatyzację po kolumnie (PCD).

Derywatyzacja po kolumnie przy użyciu wysokosprawnych kolumn do chromatografii cieczowej z przepływem reakcji

Tutaj prezentujemy protokół do działania i optymalizacji kolumny Active Flow Technology (AFT) w trybie Curtain flow (CF) dla zwiększenia wydajności separacji.

Kolumna z przepływem kurtyny: optymalizacja wydajności i czułości

Przedstawiono szybki protokół trawienia proteolitycznego za pomocą własnego mikroreaktora tryptycznego sprzężonego ze spektrometrem masowym z jonizacją elektrorozpylania (ESI). Opisano sposób wytwarzania mikroreaktora, układ doświadczalny i proces pozyskiwania danych.

Szybkie przetwarzanie enzymatyczne białek w celu wykrywania stwardnienia rozsianego za pomocą mikroreaktora przepływowego

Wielokolorowa detekcja fluorescencji w mikrofluidyce kropelkowej zazwyczaj obejmuje nieporęczne i złożone systemy detekcji oparte na mikroskopie epifluorescencyjnym. Tutaj opisujemy kompaktowy i modułowy schemat detekcji wielokolorowej, który wykorzystuje szereg światłowodów do czasowego kodowania wielokolorowych danych zebranych przez pojedynczy fotodetektor.

Wielokolorowa detekcja fluorescencji dla mikrofluidyki kropelkowej z wykorzystaniem światłowodów

Prezentujemy platformę mikroprzepływową ze zintegrowaną siecią elektrod powierzchniowych, która łączy rezystancyjne wykrywanie impulsów (RPS) z wielokrotnym dostępem z podziałem kodu (CDMA), do wielokrotnego wykrywania i wymiarowania cząstek w wielu kanałach mikroprzepływowych.

Platforma mikroprzepływowa z multipleksowaną detekcją elektroniczną do przestrzennego śledzenia cząstek

Ten protokół demonstruje prosty, solidny i wysokoprzepustowy test rozciągania przepływu pojedynczej cząsteczki do badania jednowymiarowej (1D) dyfuzji cząsteczek wzdłuż DNA.

Prosta, solidna i wysokowydajna implementacja testu rozciągania przepływu pojedynczej cząsteczki do badania transportu cząsteczek wzdłuż DNA

Szczegółowe są tutaj protokoły działania i montażu modułowej platformy do badań przesiewowych mikroprzepływowych do systematycznej charakterystyki syntez koloidalnych półprzewodników nanokrystalicznych. Dzięki w pełni regulowanym układom systemów, wysoce wydajne zbieranie widm może być przeprowadzane w 4 skalach czasu reakcji rzędu wielkości w przestrzeni próbkowania kontrolowanej przeniesieniem masy.

Modułowa technologia mikroprzepływowa do systematycznych badań koloidalnych nanokryształów półprzewodnikowych

Tutaj prezentujemy protokół dla zoptymalizowanej procedury pakowania kolumn kapilarnych FlashPack. Zastosowanie zoptymalizowanego protokołu do powszechnej konfiguracji bomby ciśnieniowej 100 bar pozwala na 10-krotnie szybsze pakowanie i produkcję długich, ultra wysokowydajnych kolumn kapilarnych.

Prosta, wewnętrzna, ultra-wydajna produkcja kolumn kapilarnych dzięki podejściu FlashPack

Wizualna, jednocząsteczkowa biochemia badana za pomocą komór mikroprzepływowych jest znacznie ułatwiona dzięki szklanemu cylindrowi, gazoszczelnym strzykawkom, stabilnym połączeniom rurek z komórkami przepływowymi i eliminacji pęcherzyków poprzez umieszczenie zaworów przełączających między strzykawkami a rurkami. Protokół opisuje podwójne pułapki optyczne, które umożliwiają wizualizację transakcji DNA i oddziaływań międzycząsteczkowych.

Zastosowanie podwójnej pęsety optycznej i mikrofluidyki do badań pojedynczych cząsteczek

To badanie poprawia dokładność przepływomierza elektromagnetycznego poprzez optymalizację przebiegów wzbudzenia, zastosowanie wielostopniowego filtrowania i użycie prostowania opartego na Complex Programmable Logic Device (CPLD). Nowatorska metoda wykrywania pustych rur oparta na kształcie fal zwiększa niezawodność. Eksperymenty wykazały dokładność 0,1% w zakresie 0,1-15 m/s, co potwierdza możliwość zastosowania w przemyśle.

Precyzyjny przepływomierz elektromagnetyczny z wykrywaniem pustej rury za pomocą złożonego programowalnego systemu rozpoznawania przebiegów opartego na urządzeniach logicznych

Poznaj metodę dostrajania kolumny przepływu z równoległymi segmentami w HPLC, umożliwiającą detekcję multipleksową. Technika ta przyspiesza analizę złożonych próbek, takich jak kawa czy wino, wspierając identyfikację ich składu chemicznego i bioaktywnego.

Dostrajanie kolumny przepływu z równoległymi segmentami i włączanie detekcji multipleksowej

Przeglądaj więcej filmów