Name: Szybkie przetwarzanie enzymatyczne białek w celu wykrywania stwardnienia rozsianego za pomocą mikroreaktora przepływowego (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-04-06T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 49 s
Description: Poznaj szybkie trawienie enzymatyczne białek w mikroreaktorze przepływowym z trypsyną do identyfikacji metodą spektrometrii masowej ESI. Ta metoda jest szybka, tania i łatwa do integracji z platformami mikrofabrykacyjnymi w badaniach proteomicznych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez grant NSF/DBI-1255991 dla IML.

1. Przygotowanie mikroreaktora kapilarnego
<ol>
	<li>Przyciąć kapilarnę o średnicy wewnętrznej 100 μm (ID) x 360 μm średnicy zewnętrznej (OD) na długość 7-8 cm, a kapilarnę o średnicy wewnętrznej 20 μm x 90 μm OD na 3-5 cm za pomocą szklanego tasaka kapilarnego; sprawdzić pod mikroskopem, czy oba końce kapilary mają czyste, proste cięcie, bez wystających zadziorów.</li>
	<li>Włóż kapilarnę o średnicy zewnętrznej 20 μm x 90 μm do jednego końca kapilary o średnicy zewnętrznej 100 μm üm ø x 360 μm, na długość ~6 mm; w razie potrzeby obserwuj tę operację pod mikroskopem.</li>
	<li>Nałóż małą kroplę kleju E6000 wokół połączenia kapilar 90 μm OD/100 μm ID z końcem końcówki Q i pozwól klejowi utwardzić się O/N przy RT.</li>
	<li>Przyciąć włożoną kapilarnę o średnicy wewnętrznej 20 μm x 90 μm średnicy zewnętrznej na długość ~10-15 mm; będzie to emiter jonizacji elektrorozpylania.</li>
	<li>Wstępnie przyciąć rurki PTFE 1/32" OD PEEK, 1/16" OD PEEK i 1/16" OD PTFE na kawałki o długości 4-5 cm; będą to tuleje stosowane w złączkach kapilarnych w celu zapewnienia szczelnego połączenia.</li>
	<li>Podłącz przeciwległy koniec kapilary o średnicy wewnętrznej 100 μm x 360 μm do złączki PEEK; użyj tulei PEEK 1/32", aby zapewnić szczelne połączenie.</li>
	<li>Włóż/dokręć kawałek rurki PTFE 1/16" o długości ~5 cm do przeciwległego końca złącza.</li>
	<li>Zważyć ~4 mg cząstek C18 (5 μm) we wstępnie oczyszczonej/wysuszonej szklanej fiolce o pojemności 2 ml; dodać 0,5 ml izopropanolu, zamknąć fiolkę i rozproszyć zawiesinę w kąpieli ultradźwiękowej.</li>
	<li>Pobrać za pomocą strzykawki o pojemności 250 μl około 200 μl zawiesiny, włożyć igłę strzykawki do rurki PTFE 1/16" złącza PEEK i powoli dozować zawiesinę do kapilary o średnicy zewnętrznej 100 μm ID x 360 μm; obserwować pod mikroskopem, jak kapilara wypełnia się cząstkami, aż do uzyskania długości wypełnienia 2-3 mm; będzie to mikroreaktor (rysunek 1). Kapilara ID o średnicy wewnętrznej 20 μm zatrzymuje cząstki w mikroreaktorze dzięki efektowi Keystone. 15</li>
	<li>Przepłukać mikroreaktor ~50 μl roztworuH2O/CH3CN 50:50 v/v, a następnie ~50 μl roztworuH2O/CH3CN 98:2 v/v.</li>
</ol>
2. Przygotowanie roztworów próbek
Uwaga: Operacje, które obejmują obchodzenie się z rozpuszczalnikami organicznymi i kwasami oraz przygotowanie roztworu, powinny być wykonywane w dygestorium. Nosić okulary, rękawice i odzież ochronną.
<ol>
	<li>Przepłukać CH3OH i osuszyć kilka szklanych fiolek (4 ml) oraz probówki polipropylenowe (15 ml).</li>
	<li>Przygotować 10 ml roztworuH2O/CH3CN (98:2 v/v) w probówce polipropylenowej o pojemności 15 ml, mieszając 9,8 mlH2Oz 200 μlCH3CN; wymieszać metodą sonikacji.</li>
	<li>Przygotować 10 ml roztworuH2O/CH3CN (50:50 v/v) w probówce polipropylenowej o pojemności 15 ml, mieszając 5 mlH2Oz 5 mlCH3CN; wymieszać metodą sonikacji.</li>
	<li>Przygotować 4 ml zakwaszonego roztworu wodnego (TFA 0,01% v/v) dodając 4 μl TFA(10%) do 4 ml H2O/CH3CN (98:2 v/v) w szklanej fiolce o pojemności 4 ml; wymieszać metodą sonikacji.</li>
	<li>Przygotować 4 ml zakwaszonego roztworu organicznego (TFA 0,01% v/v) dodając 4 μl TFA(10%) do 4 ml H2O/CH3CN (50:50 v/v) w szklanej fiolce o pojemności 4 ml; wymieszać metodą sonikacji.</li>
	<li>Zważyć 16 mg NH4HCO3 za pomocą mikrowagi analitycznej w szklanej fiolce o pojemności 4 ml; dodać 4 ml roztworu H2O/CH3CN (98:2 v/v) i rozproszyć przez sonikację; w wyniku czego otrzymamy 50 mM roztwór NH4HCO3 (pH ~ 7,8) w buforze wodnym.</li>
	<li>Odważyć 5 mg wzorcowego białka (np. albuminy surowicy bydlęcej, hemoglobiny α/β, cytochromu C, anhydrazy węglanowej, glikoproteiny α-2-HS itp.) za pomocą mikrowagi analitycznej w szklanej fiolce o pojemności 4 ml; dodać 4 ml wody demineralizowanej i zdyspergować za pomocą sonikacji; zwykle daje to roztwór o wysokim stężeniu μM.</li>
	<li>Przygotować 1 ml roztworu białkowego (1-2 μM) przez rozcieńczenie roztworu o wysokim stężeniu μM odpowiednią objętością buforu wodnego NH4HCO3 (50 mM); wymieszać przez sonikację.</li>
	<li>Przygotować roztwór trypsyny (5 μM) rozpuszczając 20 μg trypsyny do sekwencjonowania w 170 μl NH4HCO3 (50 mM) buforze wodnym; rozproszyć przez sonikację.</li>
</ol>
3. Konfiguracja eksperymentalna 
Uwaga: System LTQ-MS jest wyposażony w zmodyfikowane źródło ESI, które zawiera domowy stolik XYZ, który umożliwia połączenie spektrometru masowego z różnymi podejściami do wprowadzania próbek.
<ol>
	<li>Odłącz mikroreaktor kapilarny od złącza PEEK i podłącz do trójnika PEEK.</li>
	<li>Włóż drut Pt o długości ~2 cm do bocznego ramienia trójnika PEEK; użyj tulei PEEK 1/32", aby zapewnić szczelne połączenie i zaizolować drut Pt.</li>
	<li>Podłącz kapilarnę do przenoszenia próbki o średnicy wewnętrznej 50 μm x 360 μm (~0,5 m długości) do przeciwległego końca trójnika PEEK; użyj tulei PEEK 1/32", aby zapewnić szczelne połączenie.</li>
	<li>Zabezpiecz trójnik PEEK na stoliku XYZ i umieść emiter ESI w odległości ~ 2 mm od kapilary wlotowej spektrometru mas.</li>
	<li>Podłącz przewód Pt do źródła zasilania ESI spektrometru masowego.</li>
	<li>Podłącz przeciwległy koniec kapilary do przenoszenia próbki do złączki ze stali nierdzewnej; użyj tulei PEEK 1/16", aby zapewnić szczelne połączenie.</li>
	<li>Podłącz rurkę 1/16" z PTFE o długości 4-5 cm do przeciwległego końca złączki ze stali nierdzewnej i włóż igłę strzykawki o pojemności 250 μl do rurki PTFE; włącz pompę i ustaw natężenie przepływu na żądaną wartość (np. 2 μl/min).</li>
	<li>Wprowadź parametry akwizycji danych MS w tandemie do pakietu oprogramowania sterującego urządzeniem MS i zapisz jako plik metody, aby przygotować konfigurację do przeprowadzenia analizy; dla systemu LTQ-MS należy użyć następujących parametrów analizy zależnej od danych: dynamiczne wyłączanie włączone na 180 sekund z szerokością masy wykluczenia ±1,5 m/z; jeden skan MS, a następnie jeden zoom i MS2 Skanuje 5 najbardziej intensywnych szczytów, szerokość skanowania w powiększeniu ±5 m/z; parametry dysocjacji wywołanej kolizją (CID) ustawione na szerokość izolacji 3 m/z, znormalizowana energia zderzenia 35%, aktywacja Q 0,25 i czas aktywacji 30 ms.</li>
</ol>
4. Konfiguracja mikroprzepływowa 
<ol>
	<li>Przygotuj urządzenie mikroprzepływowe z podłoży szklanych lub polimerowych; 16-18 układ urządzenia przedstawiono na rysunku 2A, składającego się z mikroreaktora (1) (0,13 mm szerokości x 2 mm długości x 50 μm głębokości) podłączonego do wlotu (2), wylotu (3) i portu bocznego (4); Kanały łączące do manipulacji płynami mają szerokość ~110 μm i głębokość ~50 μm; Struktura wielokanałowa (5), składająca się z mikrokanalików o głębokości ~1,5-2 μm x szerokości 10 μm x długości 100 μm umieszczonych w odległości 25 μm od siebie, będzie działać jako filtr zatrzymujący cząstki w mikroreaktorze.</li>
	<li>Umożliwiają one podłączanie płynów do układu scalonego poprzez przyklejenie specjalistycznych złączy do portów wlotowych lub poprzez opracowanie polimerowej podstawy, w której mieszczą się złączki do dostarczania płynów (ilustracja 2B). 16</li>
	<li>Przygotować zawiesinę cząstek C18 (5 μm) zgodnie z opisem w kroku 1.8; dostarczyć zawiesinę do mikroreaktora za pomocą strzykawki za pomocą rurki PTFE 1/16" podłączonej do portu po stronie chipa (4); uszczelnić port po załadowaniu cząstek klejem epoksydowym i utwardzać przez 1 godzinę w piecu w temperaturze 90 °C.16</li>
	<li>Włóż kapilatę (20 μm ID x 90 μm OD x 10 mm długości) do portu wylotowego, uszczelnij klejem E6000 i pozwól utwardzić O/N; stanie się to emiterem ESI (6).</li>
	<li>Podłączyć kapilarnę do przenoszenia próbki o średnicy wewnętrznej 50 μm × 360 μm (~0,5 m długości) do portu wlotowego chipa (2); podłączyć przeciwległy koniec kapilary do strzykawki o pojemności 250 μl i pompy strzykawkowej, jak opisano w ppkt 3.6-3.7.</li>
	<li>Umieść lekkie złącze trójnikowe PEEK na linii przesyłowej próbki tuż przed portem wlotowym (2) i włóż drut Pt na boczne ramię trójnika, jak opisano w 3.2; będzie to elektroda ESI.</li>
	<li>Zabezpieczyć urządzenie mikroprzepływowe na stoliku XYZ z emiterem ESI umieszczonym w odległości ~2 mm od kapilary wlotowej spektrometru masowego; przygotować MS do analizy, jak opisano w ppkt 3.8.</li>
</ol>
5. Ładowanie próbki, trawienie proteolityczne i elucja do analizy MS
Uwaga: Wszystkie etapy transferu roztworu/próbki są wykonywane za pomocą pompy strzykawkowej i powinny pozwolić na kilka dodatkowych minut na zakończenie, aby skompensować martwe objętości związane z liniami przesyłowymi do i z mikroreaktora; niezbędny czas będzie zależał od natężeń przepływu.
<ol>
	<li>Przepłukać mikroreaktor i przygotować go do analizy, wlewając wodny roztwór NH4HCO3 (50 mM) w H2O/CH3CN (98:2 v/v) przy 2 μl/min przez 5 minut; użyć strzykawki o pojemności 250 μl.</li>
	<li>Załadować próbkę białka (1 μM) do mikroreaktora, podając roztwór próbki z prędkością 2 μl/min przez 5 minut; użyć strzykawki o pojemności 250 μl.</li>
	<li>Roztwór trypsyny (5 μM) nasycić zaadsorbowanym białkiem w mikroreaktorze z prędkością 2 μl/min przez 1-3 minuty.</li>
	<li>Ugasić proces trawienia proteolitycznego przez przepłukanie mikroreaktora zakwaszonym wodnym roztworem TFA (0,01% v/v) w H2O/CH3CN (98:2 v/v) przy 2 μl/min przez 5 min; użyć strzykawki o pojemności 250 μl.</li>
	<li>Rozpocznij elucję trawienia białka z mikroreaktora, podając zakwaszony roztwór organiczny TFA (0,01% v/v) w H2O/CH3CN (50:50 v/v) przy 300 nl/min.</li>
	<li>Włącz proces akwizycji danych MS i napięcie ESI (~2,000 V); pobierz dane MS przy użyciu parametrów akwizycji danych podanych w kroku 3.8; obserwuj elucję peptydów tryptycznych.</li>
</ol>
6. Przetwarzanie danych
<ol>
	<li>Przetwarzaj tandemowe dane MS za pomocą wyszukiwarki zgodnej z surowym formatem danych MS.
	<ol>
		<li>Przetwarzaj surowe pliki LTQ-MS przy użyciu specyficznej dla organizmu minimalnie nadmiarowej bazy danych białek; prześlij surowe dane do wyszukiwarki, ustaw tolerancje masy jonów macierzystych i fragmentów odpowiednio na 2 i 1 Da, a do wyszukiwania używaj tylko w pełni tryptycznych fragmentów z maksymalnie dwoma pominiętymi rozszczepieniami; nie dopuszczaj modyfikacji potranslacyjnych; ustaw wskaźniki fałszywych odkryć o wysokim i średnim poziomie ufności (FDR) na 1% i 3%, i nie zezwalaj na modyfikacje potranslacyjne.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przefiltruj dane, aby wybrać tylko peptydy o wysokim poziomie ufności dopasowania do białek w bazie danych; oceń wyniki na poziomie białka i peptydu.</li>
</ol>

<ol><li>Petersen, D. H. Microfluidic Bioreactors. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aPetersen%2C+DH+%22Encyclopedia+of+Microfluidics+and+Nanofluidics%22">Encyclopedia of Microfluidics and Nanofluidics</a>. , Springer Science+Business Media. New York. (2014).</li>
<li>Matosevic, S., Szita, N., Baganz, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fundamentals+and+applications+of+immobilized+microfluidic+enzymatic+reactors%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Chem.+Technol.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Fundamentals and applications of immobilized microfluidic enzymatic reactors.</a> J. Chem. Technol. Biotechnol. 86 (3), 325-334 (2011).</li>
<li>Liu, Y., Liu, B., Yang, P., Girault, H. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidic+enzymatic+reactors+for+proteome+research%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Bioanal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Microfluidic enzymatic reactors for proteome research.</a> Anal. Bioanal. Chem. 390 (1), 227-229 (2008).</li>
<li>Wu, H., Zhai, J., Tian, Y., Lu, H., Wang, X., Jia, W., Liu, B., Yang, P., Xu, Y., Wang, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidic+enzymatic-reactors+for+peptide+mapping%3A+strategy%2C+characterization%2C+and+performance%5BTitle%5D)+AND+%22LabChip%22%5BJournal%5D)">Microfluidic enzymatic-reactors for peptide mapping: strategy, characterization, and performance.</a> LabChip. 4 (6), 588-597 (2004).</li>
<li>Jin, L. J., Ferrance, J., Sanders, J. C., Landers, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+microchip-based+proteolytic+digestion+system+driven+by+electroosmotic+pumping%5BTitle%5D)+AND+%22LabChip%22%5BJournal%5D)">A microchip-based proteolytic digestion system driven by electroosmotic pumping.</a> LabChip. 3 (1), 11-18 (2003).</li>
<li>Asanomi, Y., Yamaguchi, H., Miyazaki, M., Maeda, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enzyme-immobilized+microfluidic+process+reactors%5BTitle%5D)+AND+%22Molecules%22%5BJournal%5D)">Enzyme-immobilized microfluidic process reactors.</a> Molecules. 7 (16), 6041-6059 (2011).</li>
<li>Aravamudhan, S., Joseph, P. J., Kuklenyik, Z., Boyer, A. E., Barr, J. R. Integrated microfluidic enzyme reactor mass spectrometry platform for detection of anthrax lethal factor. 31.st. Annual International Conference of the IEEE EMBS, , 1071-1074 (2009).</li>
<li>Liu, X., Lo, R. C., Gomez, F. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fabrication+of+a+microfluidic+enzyme+reactor+utilizing+magnetic+beads%5BTitle%5D)+AND+%22Electrophoresis%22%5BJournal%5D)">Fabrication of a microfluidic enzyme reactor utilizing magnetic beads.</a> Electrophoresis. 30 (12), 2129-2133 (2009).</li>
<li>Liu, Y., Xue, Y., Ji, J., Chen, X., Kong, J., Yang, P., Girault, H. H., Liu, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gold+nanoparticle+assembly+microfluidic+reactor+for+efficient+on-line+proteolysis%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell.+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Gold nanoparticle assembly microfluidic reactor for efficient on-line proteolysis.</a> Mol. Cell. Proteomics. 6 (8), 1428-1436 (2007).</li>
<li>Wu, H., Tian, Y., Liu, B., Lu, H., Wang, X., Zhai, J., Jin, H., Yang, P., Xu, Y., Wang, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Titania+and+alumina+sol-gel-derived+microfluidics+enzymatic-reactors+for+peptide+mapping%3A+design%2C+characterization%2C+and+performance%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Proteome+Res%22%5BJournal%5D)">Titania and alumina sol-gel-derived microfluidics enzymatic-reactors for peptide mapping: design, characterization, and performance.</a> J. Proteome Res. 3 (6), 1201-1209 (2004).</li>
<li>Ji, J., Zhang, Y., Zhou, X., Kong, J., Tang, Y., Liu, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+protein+digestion+through+the+confinement+of+nanozeolite-assembled+microchip+reactors%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Enhanced protein digestion through the confinement of nanozeolite-assembled microchip reactors.</a> Anal. Chem. 80 (7), 2457-2463 (2008).</li>
<li>Hustoft, H. K., Brandtzaeg, O. K., Rogeberg, M., Misaghian, D., Torsetnes, S. B., Greibrokk, T., Reubsaet, L., Wilson, S. R., Lundanes, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrated+enzyme+reactor+and+high+resolving+chromatography+in+%26%2334%3Bsub-chip%26%2334%3B+dimensions+for+sensitive+protein+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Integrated enzyme reactor and high resolving chromatography in &#34;sub-chip&#34; dimensions for sensitive protein mass spectrometry.</a> Scientific Reports. 3 (3511), 1-7 (2013).</li>
<li>Pramanik, B. N., Mirza, U. A., Ing, Y. H., Liu, Y. H., Bartner, P. L., Weber, P. C., Bose, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microwave-enhanced+enzyme+reaction+for+protein+mapping+by+mass+spectrometry%3A+A+new+approach+to+protein+digestion+in+minutes%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Sci%22%5BJournal%5D)">Microwave-enhanced enzyme reaction for protein mapping by mass spectrometry: A new approach to protein digestion in minutes.</a> Protein Sci. 11 (11), 2676-2687 (2002).</li>
<li>Olszowy, P. P., Burns, A., Ciborowski, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pressure-assisted+sample+preparation+for+proteomic+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Pressure-assisted sample preparation for proteomic analysis.</a> Anal. Biochem. 438 (1), 67-72 (2013).</li>
<li>Lord, G. A., Gordon, D. B., Myers, P., King, B. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tapers+and+restrictors+for+capillary+electrochromatography+and+capillary+electrochromatography-mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Chromatogr.+A%22%5BJournal%5D)">Tapers and restrictors for capillary electrochromatography and capillary electrochromatography-mass spectrometry.</a> J. Chromatogr. A. 768, 9-16 (1997).</li>
<li>Lazar, I. M., Kabulski, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidic+LC+Device+with+Orthogonal+Sample+Extraction+for+On-Chip+MALDI-MS+Detection%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">Microfluidic LC Device with Orthogonal Sample Extraction for On-Chip MALDI-MS Detection.</a> Lab Chip. 13 (11), 2055-2065 (2013).</li>
<li>Harrison, D. J., Manz, A., Fan, Z. H., Ludi, H., Widmer, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Capillary+electrophoresis+and+sample+injection+systems+on+a+planar+glass+chip%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Capillary electrophoresis and sample injection systems on a planar glass chip.</a> Anal. Chem. 64 (17), 1926-1932 (1992).</li>
<li>Jacobson, S. C., Hergenroder, R., Koutny, L. B., Warmack, R. J., Ramsey, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+Injection+Schemes+and+Column+Geometry+on+the+Performance+of+Microchip+Electrophoresis+Devices%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Effects of Injection Schemes and Column Geometry on the Performance of Microchip Electrophoresis Devices.</a> Anal. Chem. 66 (7), 1107-1113 (1994).</li>
<li>Armenta, J. M., Perez, M. J., Yang, X., Shapiro, D., Reed, D., Tuli, L., Finkielstein, C. V., Lazar, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fast+Proteomic+Protocol+for+Biomarker+Fingerprinting+in+Cancerous+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Chromatogr.+A%22%5BJournal%5D)">Fast Proteomic Protocol for Biomarker Fingerprinting in Cancerous Cells.</a> J. Chromatogr. A. 1217, 2862-2870 (2010).</li>
<li>Doucette, A., Craft, D., Li, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mass+Spectrometric+Study+of+the+Effects+of+Hydrophobic+Surface+Chemistry+and+Morphology+on+the+Digestion+of+Surface-Bound+Proteins%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Soc.+Mass+Spectrom%22%5BJournal%5D)">Mass Spectrometric Study of the Effects of Hydrophobic Surface Chemistry and Morphology on the Digestion of Surface-Bound Proteins.</a> J. Am. Soc. Mass Spectrom. 14, 203-214 (2003).</li>
<li>Lazar, I. M., Trisiripisal, P., Sarvaiya, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidic+Liquid+Chromatography+System+for+Proteomic+Applications+and+Biomarker+Screening%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Microfluidic Liquid Chromatography System for Proteomic Applications and Biomarker Screening.</a> Anal. Chem. 78 (15), 5513-5524 (2006).</li>
<li>Lazar, I. M., Karger, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple+Open-Channel+Electroosmotic+Pumping+System+for+Microfluidic+Sample+Handling%2C%26%2334%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Multiple Open-Channel Electroosmotic Pumping System for Microfluidic Sample Handling,&#34.</a> Anal. Chem. 74 (24), 6259-6268 (2002).</li>
<li>Lazar, I. M., Rockwood, A. L., Lee, E. D., Sin, J. C. H., Lee, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-speed+TOFMS+Detection+for+Capillary+Electrophoresis%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">High-speed TOFMS Detection for Capillary Electrophoresis.</a> Anal. Chem. 71 (13), 2578-2581 (1999).</li>
</ol>

Autorzy deklarują brak sprzecznych interesów finansowych.

Mikroreaktor opisany w tej pracy zapewnia łatwy do wdrożenia zestaw eksperymentalny do przeprowadzania enzymatycznego trawienia białek, aby umożliwić analizę i identyfikację MS w czasie krótszym niż 30 minut. Wyraźne zalety tego systemu, w porównaniu z konwencjonalnymi podejściami, to prostota, szybkość, niskie zużycie odczynników i niskie koszty. W szczególności nie ma potrzeby stosowania drogich unieruchomionych kulek i wkładów z trypsyną. Przygotowanie mikroreaktora kapilarnego jest proste (rysunek 1A...

Identyfikacja i charakterystyka oczyszczonych białek jest często osiągana za pomocą technik MS. Białko jest trawione przez enzym, a jego peptydy są dalej analizowane przez SM przy użyciu prostego zestawu eksperymentalnego do infuzji. Trawienie proteolityczne jest niezbędne do generowania małych fragmentów peptydów, które mieszczą się w użytecznym zakresie mas większości analizatorów MS i które można łatwo rozdrobnić poprzez dysocjację wywołaną zderzeniem o niskiej energii w celu wygenerowania informacji o sekwencji aminokwasów. W przypadku wyizolowanych białek lub prostych mieszanin białek nie ma już potrzeby chromatograficznego rozdzielania peptydów przed wykryciem stwardnienia rozsianego. Mieszaninę 25-50 peptydów można łatwo analizować, wprowadzając próbkę za pomocą pompy strzykawkowej bezpośrednio w źródle jonów MS.
Spektrometr masowy może przeprowadzić analizę i potwierdzić sekwencję białka w krótkim czasie. Dzięki nowoczesnym metodom pozyskiwania danych proces ten można zrealizować w ciągu kilku minut, a nawet sekund. Czynnikiem ograniczającym zakończenie całego procesu w krótkiej skali czasowej jest etap trawienia proteolitycznego. Zazwyczaj wykonuje się to w ciągu kilku godzin (lub O/N), w roztworze, w temperaturze 37 ºC, przy użyciu proporcji substratu do enzymu (50-100):1. Aby skrócić czas trawienia enzymatycznego do minut lub sekund, opisano unieruchomione mikroreaktory enzymatyczne, w postaci reaktorów mikroprzepływowych lub dostępnych na rynku wkładów. 1-6 Zazwyczaj enzym jest unieruchomiany przez adsorpcję kowalencyjną, niekowalencyjną/fizyczną, tworzenie kompleksu lub enkapsulację,3,6 przy czym zwiększona wydajność procesu enzymatycznego jest możliwa dzięki dużym stosunkom powierzchni do objętości i enzymu do substratu. Dodatkowe zalety unieruchomionych reaktorów obejmują zmniejszoną autolizę i interferencję enzymu w analizie SM, lepszą stabilność enzymu i możliwość ponownego użycia. Opisano różne podejścia wykorzystujące szklane lub polimerowe mikrofabrykowane urządzenia, wykorzystujące enzymy unieruchomione na kulkach magnetycznych przez interakcje przeciwciało-antygen,7,8 uwięzione w sieciach nanocząstek złota,9 zamknięte w zol-żelach tytanowo-tlenku glinu10 i nanozeolitach,11 lub wychwycone przez tworzenie kompleksu Ni-NTA lub His-Tag. 6 Alternatywnie, opracowano również naczynia włosowate z unieruchomionymi enzymami. 12 Co więcej, wykazano zwiększone rozszczepienie proteolityczne dzięki zastosowaniu kontrolowanego promieniowania mikrofalowego13 lub technologii wspomagania ciśnieniem lub cyklicznych zmian ciśnienia (PCT) w celu skrócenia czasu reakcji do 30-120 min.14
Pomimo wielu zalet unieruchomionych reaktorów enzymatycznych, koszty komercyjnych kartridży są wysokie, dostępność urządzeń mikroprzepływowych do rutynowego użytku jest ograniczona, a użycie technologii mikrofalowych lub PCT powoduje potrzebę dodatkowego oprzyrządowania. Celem tej pracy było opracowanie metody, która pozwala obejść te wady i którą można łatwo wdrożyć w każdym laboratorium, aby zapewnić naukowcom proste i skuteczne podejście do przeprowadzania enzymatycznego rozszczepiania białek w ramach przygotowań do analizy stwardnienia rozsianego w ciągu kilku minut. Podejście to opiera się na wykorzystaniu hydrofobowych cząstek C18, które są wstępnie załadowane w urządzeniu kapilarnym lub mikroprzepływowym, oraz na adsorpcji białka (interesujących białka) na tych cząstkach, a następnie trawieniu enzymatycznym podczas infuzji enzymu przez wypełnione złoże i wychwycone białko. W tym podejściu substrat jest unieruchamiany poprzez oddziaływania niekowalencyjne, a enzym jest podawany na unieruchomione białko. Wydajność trawienia proteolitycznego jest zwiększona dzięki dużym powierzchniom cząstek, które wystawiają białko na przetwarzanie enzymatyczne, zmniejszonym odległościom i czasom dyfuzji do i z powierzchni cząstek, lepszemu przenoszeniu masy, brakowi przyłączania kowalencyjnego, które może wpływać na aktywność enzymu, zdolności do szybkiej oceny kombinacji różnych enzymów, jednorazowości i multipleksowania, jeśli proces jest wykonywany w formacie mikroprzepływowym. Podejście to demonstruje się przy użyciu mieszaniny standardowych białek i trypsyny - najczęściej stosowanego enzymu do trawienia proteolitycznego przed wykryciem ESI-MS. Spektrometr masowy użyty do detekcji w tym badaniu był instrumentem z liniowym kwadrupolem pułapkowym (LTQ).

<table><tbody><tr><td>Pułapka jonowa ESI-MS</td><td>Thermo Electron</td><td>LTQ</td><td>Spektrometr masowy LTQ służy do pozyskiwania tandemowych danych MS</td></tr><tr><td>Stopień XYZ</td><td>Newport</td><td>Wiele części</td><td>Zbudowany w domu stopień XYZ służy do adaptacji komercyjnego źródła LTQ nano-ESI do odbierania danych wejściowych z różnych systemów dostarczania próbek</td></tr><tr><td>Mikroskop stereoskopowy</td><td>Edmund optyka</td><td>G81-278</td><td>Mikroskop służy do obserwacji procesu pakowania mikroreaktora</td></tr><tr><td>Waga analityczna/Metler</td><td>VWR</td><td>46600-204</td><td>Waga służy do ważenia próbek białek</td></tr><tr><td>Kąpiel ultradźwiękowa/Branson</td><td>VWR</td><td>33995-540</td><td>Kąpiel soniczna służy do mieszania/homogenizacji próbek i dyspersji zawiesiny cząstek C18</td></tr><tr><td>Pompa strzykawkowa 22</td><td>Aparatura Harvarda</td><td>552222</td><td>Mikropompa służy do ładowania, płukania i elucji próbki i enzymu na i z wypełnionego mikroreaktora kapilarnego</td></tr><tr><td>Milli-Q ultraczysty system wodny</td><td>EMD Millipore</td><td>ZD5311595&nbsp;</td><td>System wodny MilliQ służy do przygotowania oczyszczonej wody demineralizowanej</td></tr><tr><td>Pipettor/Eppendorf (1,000&nbsp; &mikro; l)</td><td>VWR</td><td>53513-410</td><td>Pipetor służy do pomiaru małych objętości roztworów próbek</td></tr><tr><td>Pipettor/Eppendorf (100&nbsp; &mikro; l)</td><td>VWR</td><td>53513-406</td><td>Pipetor służy do pomiaru małych objętości roztworów próbek</td></tr><tr><td>Pipettor/Eppendorf (10&nbsp; &mikro; l)</td> <td>VWR</td><td>53513-402</td><td>Pipetor służy do pomiaru małych objętości roztworów próbek</td></tr><tr><td>Kapilarna stopiona krzemionka (100 &mikro; m ID x 360 &mikro; m OD)</td><td>Polymicro Technologies</td><td>TSP100375</td><td>Ta kapilara służy do wytwarzania mikroreaktora</td></tr><tr><td>Kapilara ze stopionej krzemionki (20&nbsp; &mikro; m ID x 100 i mikro; m OD)</td><td>Polymicro Technologies</td><td>TSP020090</td><td>Ta kapilara służy do wytwarzania kapilary z topionej krzemionki emitera ESI</td></tr><tr><td>(50&nbsp; &mikro; m ID x 360 &mikro; m OD)</td><td>Polymicro Technologies</td><td>TSP050375</td><td>Ta kapilara służy do przenoszenia próbek i eluentu z pompy strzykawkowej do mikroreaktora kapilarnego</td></tr><tr><td>Tasak kapilarny</td><td>szklany Supelco</td><td>23740-U</td><td>Jest to narzędzie do cięcia kapilar ze stopionej krzemionki na żądaną długość</td></tr><tr><td>Klej</td><td>Produkty eklektyczne</td><td>E6000 Craft</td><td>Klej ten służy do mocowania emitera ESI do mikroreaktora kapilarnego lub chipa mikroprzepływowego</td></tr><tr><td>Klej epoksydowy</td><td>Epo-Tek</td><td>353NDT</td><td>Ten klej służy do uszczelniania mikroprzepływowego otworu wlotowego, przez który ładowane są cząstki C18</td></tr><tr><td>Cząstki C18 o odwróconej fazie (5&nbsp; &mikro; m)</td><td>Agilent Technologies</td><td>Zorbax 300SB-C18</td><td>Są to cząstki C18, na których adsorbowane są białka; Cząstki wyekstrahowano z 4&nbsp; mm x 20 cm Kolumna C18 LC firmy Agilent</td></tr><tr><td>Strzykawka/szkło (250 &micro; l)</td> <td>Hamilton</td><td>81130-1725RN</td><td>Szklane strzykawki służą do ładowania zawiesiny cząstek C18 do mikroreaktora kapilarnego oraz do dostarczania próbki i eluentów do mikroreaktora</td></tr><tr><td>Wewnętrzna redukcyjna złączka PEEK (1/16 "do 1/32")</td><td>Valco</td><td>ZRU1.5FPK</td><td>To złącze służy do podłączenia 250 & micro; l strzykawka do mikroreaktora do ładowania 5 & mikro; m zawiesina cząstek</td></tr><tr><td>Złącze ze stali nierdzewnej (1/16 ")</td><td>Valco</td><td>ZU1XC</td><td>Złączka ze stali nierdzewnej służy do łączenia szklanej igły strzykawki z kapilarą infuzyjną</td></tr><tr><td>Złącze trójnikowe Microvolume PEEK (1/32")</td><td>Valco</td><td>MT.5XCPK</td><td>Trójnik Peek służy do połączenia kapilary do przenoszenia próbki z mikroreaktorem kapilarnym; na jego bocznym ramieniu umożliwia włożenie łącznika trójnika z drutu Pt</td></tr><tr><td>(lekkiego)</td><td>Valco</td><td>C-NTXFPK</td><td>To złącze trójnikowe służy do podawania napięcia ESI do układu mikroprzepływowego przez linię przesyłu próbki</td></tr><tr><td>Drut Pt (0,404 mm)</td><td>VWR</td><td>66260-126</td><td>Przewód Pt zapewnia połączenie elektryczne do generowania ESI i jest podłączony do rurki PTFE zasilacza spektrometru mas ESI</td></tr><tr><td>(1/16" OD)</td><td>Valco</td><td>TTF115-10FT</td><td>Rurka teflonowa służy do umożliwienia hermetycznego połączenia między igłą strzykawki a złączką ze stali nierdzewnej&nbsp;</td></tr><tr><td>Rurki PEEK (0,015" Średnica wewnętrzna x 1/16" OD)</td><td>Upchurch Scientific</td><td>1565</td><td>Rurka Peek służy jako tuleja, aby umożliwić hermetyczne połączenie między złączem ze stali nierdzewnej a 50&nbsp; &mikro; m ID kapilarny kapilarny</td></tr><tr><td>PEEK (0,015 " Średnica wewnętrzna x 1/32" OD)</td><td>Valco</td><td>TPK.515-25</td><td>Rurka Peek służy jako tuleja, aby umożliwić szczelne połączenie między stopionymi kapilarami krzemionkowymi a</td></tr><tr><td>obcinakiem do rurek polimerowych</td> Peek Tee Clean-cut <td>Valco</td><td>JR-797</td><td>Ten nóż służy do wstępnego cięcia 1/16" i 1/32' Rurka polimerowa Peek, która służy jako tuleja do szczelnych połączeń w kawałkach o długości ~4-5 cm</td></tr><tr><td>Fiolka z bursztynem (2 ml)</td><td>Agilent&nbsp;</td><td>HP-5183-2069</td><td>Fiolki służą do przygotowania roztworów próbek i zawiesiny cząstek C18&nbsp;</td></tr><tr><td>Fiolka z bursztynową (4 ml)</td><td>VWR</td><td>66011-948</td><td>Fiolki służą do przygotowywania roztworów próbek</td></tr><tr><td>Probówka polipropylenowa (15&nbsp; ml)</td><td>Fisher</td><td>12-565-286D</td><td>Fiolki służą do przygotowania roztworów buforowych</td></tr><tr><td>Butla (100 ml)</td><td>VWR</td><td>24710-463</td><td>Butla służy do pomiaru objętości rozpuszczalnika</td></tr><tr><td>Butla (10 ml)</td><td>VWR</td><td>24710-441</td><td>Butla służy do pomiaru objętości rozpuszczalnika</td></tr><tr><td>Końcówki do pipet (1,000 &mikro; l)</td><td>VWR</td><td>83007-386</td><td>Końcówki do pipet służą do pomiaru małych objętości roztworów próbek</td></tr><tr><td>Końcówki do pipet (100 &mikro; l)</td><td>VWR</td><td>53503-781</td><td>Końcówki do pipet służą do pomiaru małych objętości roztworów próbek</td></tr><tr><td>Końcówki do pipet (10 &mikro; l)</td> <td>VWR</td><td>53511-681</td><td>Końcówki do pipet służą do pomiaru małych objętości roztworów próbek</td></tr><tr><td>Podłoża szklane</td><td>Nanofilm</td><td>B270 biała korona, 3" x 3"</td><td>Są to szklane podłoża do produkcji mikroczipów</td></tr><tr><td>Złączka z nakrętką męską (1/16")</td><td>Upchurch</td><td>P203X</td><td>Ta złączka służy do łączenia kapilar transferowych z układem mikroprzepływowym</td></tr><tr><td>Zespół Nanoport</td><td>Upchurch</td><td>N-122H</td><td>Ta złączka służy do łączenia kapilar transferowych z chipem mikroprzepływowym</td></tr><tr><td>Wzorce białkowe</td><td>Sigma</td><td>Multiple #</td><td></td></tr><tr><td>Acetonitryle, klasa HPLC</td><td>Metanol Fisher</td><td>A955</td><td></td></tr><tr><td>, klasa</td> <td>HPLCFisher</td><td>A452</td><td></td></tr><tr><td>Izopropanol, klasa HPLC</td><td>Sigma</td><td>650447</td><td></td></tr><tr><td>Kwas trifluorooctowy</td><td>Sigma</td><td>302031</td><td></td></tr><tr><td>Wodorowęglan amonu</td><td>Aldrich</td><td>A6141</td><td></td></tr><tr><td>Trypsyna, klasa sekwencjonowania</td><td>Promega</td><td>V5111</td><td></td></tr></tbody></table>

szybkie przetwarzanie enzymatyczne białek w celu wykrywania stwardnienia rozsianego za pomocą mikroreaktora przepływowego

Fast Enzymatic Processing of Proteins for MS Detection with a Flow-through Microreactor

Zdecydowana większość metod analizy białek opartych na spektrometrii mas (MS) obejmuje etap trawienia enzymatycznego przed wykryciem, zazwyczaj z trypsyną. Ten krok jest niezbędny do wytwarzania peptydów o małej masie cząsteczkowej, zwykle o MW < 3,000-4,000 Da, które mieszczą się w efektywnym zakresie skanowania oprzyrządowania spektrometrii mas. Konwencjonalne protokoły obejmują trawienie enzymatyczne O/N w temperaturze 37 ºC. Ostatnie postępy doprowadziły do opracowania różnych strategii, zazwyczaj obejmujących wykorzystanie mikroreaktora z unieruchomionymi enzymami lub szeregu uzupełniających się procesów fizycznych, które skracają czas niezbędny do trawienia proteolitycznego do kilku minut (np. mikrofale lub wysokociśnienie). W tej pracy opisujemy proste i opłacalne podejście, które można wdrożyć w każdym laboratorium w celu uzyskania szybkiego trawienia enzymatycznego białka. Białko (lub mieszanina białek) jest adsorbowane na cząstkach krzemionki z wysokosprawnej chromatografii cieczowej (HPLC) z wiązaniem C18 wstępnie załadowanych w kolumnie kapilarnej, a trypsyna w wodnym buforze jest podawana na cząstki przez krótki okres czasu. Aby umożliwić wykrywanie stwardnienia rozsianego w trybie on-line, peptydy tryptyczne są eluowane za pomocą systemu rozpuszczalnikowego o zwiększonej zawartości organicznej bezpośrednio w źródle jonów MS. Takie podejście pozwala uniknąć użycia drogich unieruchomionych cząstek enzymu i nie wymaga żadnej pomocy w zakończeniu procesu. Trawienie białek i pełną analizę próbki można przeprowadzić odpowiednio w czasie krótszym niż ~3 minuty i ~30 minut.

Reprezentatywny wynik procesu trawienia proteolitycznego przeprowadzonego jednocześnie na mieszaninie białek z wykorzystaniem opisanych powyżej mikroreaktorów (Rysunki 1 lub 2) przedstawiono w Tabeli 1. Tabela zawiera unikalne sekwencje peptydów identyfikujące konkretne białko, wynik korelacji wzajemnej (Xcorr) (t.j. wynik charakteryzujący jakość dopasowania danych eksperymentalnych do teoretycznych dla odpowiadającego im widma masowego tandemowe...

Przedstawiono szybki protokół trawienia proteolitycznego za pomocą własnego mikroreaktora tryptycznego sprzężonego ze spektrometrem masowym z jonizacją elektrorozpylania (ESI). Opisano sposób wytwarzania mikroreaktora, układ doświadczalny i proces pozyskiwania danych.

Szybkie przetwarzanie enzymatyczne białek w celu wykrywania stwardnienia rozsianego za pomocą mikroreaktora przepływowego

The vast majority of mass spectrometry (MS)-based protein analysis methods involve an enzymatic digestion step prior to detection, typically with trypsin. ...

Ogólnym celem niniejszego protokołu jest opis konstrukcji przepływowego mikroreaktora trypsynowego, który umożliwia szybkie trawienie enzymatyczne białek w celu ich identyfikacji za pomocą spektrometru mas z jonizacją w rozpylaczu elektrospray. Metoda ta może pomóc w ustaleniu sekwencji aminokwasowej wyizolowanych i oczyszczonych białek, co wspiera późniejszą charakterystykę ich struktury i funkcji. Główną zaletą tego protokołu jest to, że jest on szybki, kosztowo efektywny i predysponowany do integracji z przepływami pracy wykorzystującymi platformy mikrofabrykowane.Na początek należy użyć szklanego przecinaka do kapilar, aby przyciąć większą rurkę kapilarną do długości od siedmiu do ośmiu centymetrów, a mniejszą do długości od trzech do pięciu centymetrów. Za pomocą mikroskopu należy sprawdzić, czy oba końce kapilar są czyste i prosto przycięte, bez żadnych wystających zadziorów. Mniejszą kapilarę należy wprowadzić na około sześć milimetrów do jednego z końców większej kapilary.Następnie za pomocą patyczka higienicznego nanieś małą kroplę kleju wokół miejsca połączenia kapilar i pozostaw klej do utwardzenia przez noc w temperaturze pokojowej. Następnie przytnij wstawioną kapilarę do długości około 10 do 15 milimetrów. Ten koniec będzie pełnił funkcję emitera jonizacji przez rozpylanie elektrosprayowe.Wprowadź przeciwległy koniec kapilary o większej średnicy do rurki PEEK o średnicy 1/32 cala, która została wcześniej docięta do długości od czterech do pięciu centymetrów i połączona z złączem PEEK. Następnie wprowadź i dokręć pięciocentymetrowy odcinek rurki PTFE o średnicy 1/16 cala w przeciwległy koniec złącza. W czystej i suchej szklanej fiolce o pojemności 2 ml odważ 4 mg cząsteczek C18, a następnie dodaj 0,5 ml izopropanolu.Zamknąć fiolkę. Umieścić ją w kąpieli ultradźwiękowej i poddać sonikacji w celu równomiernego rozproszenia cząstek w roztworze. Następnie, za pomocą strzykawki 250 µL, pobrać 200 µL zawiesiny C18.Wprowadź strzykawkę do rurki PTFE o średnicy 1/16 cala i powoli dozuj zawiesinę do dużej kapilary. Obserwuj pod mikroskopem, jak kapilara wypełnia się cząsteczkami, aż do uzyskania warstwy upakowanych cząsteczek o grubości od dwóch do trzech milimetrów. Mniejsza rurka kapilarna zatrzymuje te cząsteczki w mikroreaktorze dzięki efektowi klinowemu.Na koniec przepłucz mikroreaktor 50 µL roztworu wody i acetonitrylu w stosunku 50:50, a następnie 50 µL roztworu zawierającego 49 µL wody zmieszanej z 1 µL acetonitrylu. Odłącz kapilarny mikroreaktor od złącza PEEK i podłącz go do trójnika PEEK (PEEK-T). Następnie do bocznego ramienia trójnika PEEK wprowadź dwucentymetrowy drucik platynowy, izolowany tulejką PEEK o średnicy 1/32 cala, aby zapewnić szczelne połączenie.Podłączyć kapilarę do przenoszenia próbek o długości pół metra do przeciwległego końca PEEK-T. Aby zapewnić szczelne połączenie, należy zastosować tulejkę PEEK o średnicy 1/32 cala. Następnie należy przymocować PEEK-T na stoliku XYZ.Następnie należy umieścić emiter jonizacji z rozpylaniem elektrostatycznym w odległości około dwóch milimetrów od kapilary wlotowej spektrometru mas. Potem należy podłączyć drucik platynowy do źródła zasilania jonizacji z rozpylaniem elektrostatycznym spektrometru mas. Należy również podłączyć przeciwległy koniec kapilary do przenoszenia próbki do złącza ze stali nierdzewnej, używając tulejki z PEEK o średnicy 1/16 cala, aby zapewnić szczelne połączenie.Następnie podłącz odcinek rurki PTFE o długości od czterech do pięciu centymetrów i średnicy 1/16 cala do przeciwległego końca stalowej złączki. Wprowadź parametry akwizycji danych tandemowej spektrometrii mas (MS), opisane w towarzyszącym protokole tekstowym, do pakietu oprogramowania sterującego instrumentem MS. Zapisz je jako plik metody, aby przygotować konfigurację do przeprowadzenia analizy.System LTQ MS jest wyposażony w zmodyfikowane źródło ESI, które zawiera własnoręcznie zbudowaną platformę XYZ, umożliwiającą połączenie spektrometru mas z różnymi metodami wprowadzania próbek. Napełnij strzykawkę o pojemności 250 µL wodnym roztworem 50 mM wodorowęglanu rozpuszczonego w 2% acetonitrylu. Następnie podłącz strzykawkę do mikroreaktora i umieść ją w pompie strzykawkowej.Wypłucz mikroreaktor przepływem 2 µL/min przez 5 minut, aby przygotować go do analizy. Następnie nabierz badaną próbkę białka do strzykawki o pojemności 250 µL i wprowadź roztwór próbki z prędkością 2 µL/min przez 5 minut. Następnie umieść pod pompą strzykawkową strzykawkę o pojemności 250 µL wypełnioną 5 µM roztworem trypsyny i wprowadź go na zaabsorbowane białko w mikroreaktorze z prędkością 2 µL/min przez od 1 do 3 minut.Kluczowe jest, aby przed każdym eksperymentem na świeżo rozmrozić i przygotować roztwór trypsyny. Zapewni to zachowanie aktywności enzymu proteolitycznego oraz właściwego pH pracy mikroreaktora, które wynosi około 8. Napełnij kolejną strzykawkę o pojemności 250 µL roztworem wodnym składającym się z 0%1% kwasu trifluorooctowego dodanego do 2% acetonitrylu.Należy użyć tego roztworu, aby zatrzymać proces trawienia proteolitycznego, płucząc mikroreaktor z przepływem 2 µL/min przez 5 minut. Następnie należy przełączyć na strzykawkę wypełnioną 0,1% kwasem trifluorooctowym dodanym do 50% acetonitrylu i uruchomić proces akwizycji danych MS, ustawiając napięcie jonizacji elektrosprayowej na około 2000 V. Należy użyć zakwaszonego roztworu, aby rozpocząć elucję produktów trawienia białek z mikroreaktora z przepływem 300 nL/min przez 20 do 30 minut.Należy zebrać dane z spektrometrii mas, korzystając z parametrów akwizycji danych podanych w towarzyszącym protokole tekstowym. Pliki raw z LTQ MS należy przetworzyć, korzystając z minimalnie redundantnej bazy białek, najpierw przesyłając surowe dane do wyszukiwarki. Następnie należy ustawić tolerancję masy jonów prekursorowych i fragmentacyjnych odpowiednio na 2 i 1 daltona oraz do wyszukiwania wykorzystać wyłącznie fragmenty w pełni tryptyczne z maksymalnie dwoma pominięciami miejsc cięcia.Dodatkowo ustaw wskaźniki fałszywych odkryć (FDR) dla wysokiego i średniego poziomu ufności odpowiednio na 1% oraz 3% i nie dopuszczaj modyfikacji potranslacyjnych, chyba że poszukuje się konkretnych modyfikacji. Na koniec przefiltruj dane, aby wybrać tylko dopasowania peptydów o wysokim poziomie ufności. Przedstawione tutaj widmo masowe składa się z peptydów trypsynowych powstałych z mieszaniny białek poddanej proteolizie w mikroreaktorze.Etykiety te reprezentują najintensywniejsze jony peptydów tryptycznych i podają ich sekwencję oraz odpowiadający im identyfikator białka. Ten mikroreaktor zapewnia łatwy do wdrożenia układ eksperymentalny do przeprowadzania trawienia enzymatycznego białek i umożliwia analizę masową oraz identyfikację w czasie krótszym niż 30 minut. Podczas wykonywania tej procedury należy pamiętać, że zachowanie czystości fiolek i aparatury mającej kontakt z roztworami jest kluczowe dla uniknięcia kontaminacji próbek.Po wykonaniu tej procedury można zastosować inne metody pozyskiwania danych z spektrometrii mas, aby umożliwić lepszą charakterystykę peptydów generatywnych i odpowiedzieć na dodatkowe pytania dotyczące struktury białek. Po opracowaniu technika ta utorowała drogę badaczom w dziedzinie proteomiki do stworzenia szybszych protokołów analizy białek oraz zbadania rozwoju nowych platform mikroanalitycznych, które umożliwiają wysokoprzepustową analizę próbek biologicznych. Technika ta jest ograniczona do analizy dość prostych mieszanin białek, które generują od 25 do 50 peptydów.Peptydy te można analizować za pomocą prostych eksperymentów z infuzją, co eliminuje konieczność rozdziału chromatograficznego w fazie ciekłej przed analizą MS. Należy pamiętać, że praca z rozpuszczalnikami organicznymi może być niezwykle niebezpieczna, dlatego podczas wykonywania tej procedury należy zawsze przestrzegać środków ostrożności, takich jak unikanie otwartego ognia.

fast-enzymatic-processing-proteins-for-ms-detection-with-flow-through

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioinżynieria

Cyfrowa mikroprzepływność to technika polegająca na manipulowaniu pojedynczymi kroplami (~nL - mL) na macierzy elektrod poprzez przykładanie pól elektrycznych. Jest ona odpowiednia do przeprowadzania szybkich, sekwencyjnych, zminiaturyzowanych zautomatyzowanych analiz biochemicznych. W niniejszej pracy przedstawiamy platformę zdolną do automatyzacji kilku etapów przetwarzania proteomicznego.

Cyfrowa mikroprzepływowość w zautomatyzowanym przetwarzaniu proteomicznym

W niniejszej pracy wyjaśniamy sposób wykonania i zastosowania mikropłynnego mieszalnika zdolnego do mieszania dwóch roztworów w czasie ~8 μs. Demonstrujemy również wykorzystanie tych mieszalników w detekcji spektroskopowej z użyciem fluorescencji UV oraz fluorescencyjnego transferu energii w rezonansie (FRET).

Miksery mikrofluidyczne do badania fałdowania białek

Elastyczność konformacyjna odgrywa kluczową rolę w funkcjonowaniu białek. W tym artykule opisujemy zastosowanie czasowo-rozdzielczej spektrometrii mas z jonizacją elektronrozpylającą sprzężoną z wymianą wodorowo-deuterową do badania szybkich zmian strukturalnych, które napędzają funkcję w uporządkowanych i nieuporządkowanych białkach.

Spektrometria mas z jonizacją wodorowo-deuterową z jonizacją elektrorozpylającą do badania struktury i dynamiki białek

Tutaj prezentujemy protokół monitorowania montażu i demontażu toksyny wąglika za pomocą interferometrii biowarstwowej (BLI). Po montażu/demontażu na powierzchni biosensora, duże kompleksy białkowe są uwalniane z powierzchni w celu wizualizacji i identyfikacji składników kompleksów za pomocą odpowiednio mikroskopii elektronowej i spektrometrii mas.

Analiza dynamicznych kompleksów białkowych składanych i uwalnianych z biosensora interferometrii biowarstwowej przy użyciu spektrometrii mas i mikroskopii elektronowej

Tutaj prezentujemy protokół techniki trawienia na błonie do przygotowania próbek do spektrometrii mas. Technika ta ułatwia wygodną analizę oddziaływań białko-białko.

Ocena interakcji białko-białko przy użyciu techniki trawienia na błonie

Cyfrowy mikrofluidyk oparty na elektrozwilżaniu to technika, która wykorzystuje sterowaną napięciem zmianę pozornego kąta zwilżania kropli o objętości mikrolitra, aby ułatwić jej manipulację. Połączenie tego z funkcjonalizowanymi kulkami magnetycznymi umożliwia integrację wielu operacji laboratoryjnych w celu przygotowania próbki i identyfikacji patogenów za pomocą testu immunoenzymatycznego (ELISA).

Cyfrowa platforma mikroprzepływowa oparta na elektrozwilżaniu do zautomatyzowanego testu immunoenzymatycznego

Syntetazy lantipeptydu katalizują wieloetapowe reakcje podczas biosyntezy naturalnych produktów peptydowych. W tym miejscu opisujemy ciągły, oddolny przepływ pracy spektrometrii mas z wymianą wodorowo-deuterową (HDX-MS), który można wykorzystać do badania dynamiki konformacyjnej syntetaz lantipeptydów, a także innych podobnych enzymów zaangażowanych w biosyntezę naturalnych produktów peptydowych.

Platforma spektrometrii mas z wymianą wodorowo-deuterową (HDX-MS) do badania biosyntetycznych enzymów peptydowych

Protokół ma na celu wprowadzenie użycia potrójnego kwadrupolowego spektrometru masowego do monitorowania wielu reakcji (MRM) białek z próbek klinicznych. Zapewniliśmy systematyczny przepływ pracy, począwszy od przygotowania próbki po analizę danych dla próbek klinicznych, z zachowaniem wszystkich niezbędnych środków ostrożności, które należy podjąć.

Ilościowy przebieg proteomiki z wykorzystaniem wykrywania białek z ludzkiej tkanki mózgowej w oparciu o monitorowanie wielu reakcji

Nowa platforma statyczna służy do charakteryzowania struktury białek i miejsc interakcji w natywnym środowisku komórkowym, wykorzystując technikę śladu białkowego zwaną szybkim fotochemicznym utlenianiem białek w komórce (IC-FPOP).

Inkubator platformowy z ruchomym stolikiem XY: nowa platforma do wdrażania szybkiego utleniania fotochemicznego białek w komórkach

Strukturalny zespół monomerycznej alfa-synukleiny wpływa na jej fizjologiczne funkcje i właściwości fizykochemiczne. Niniejszy protokół opisuje, w jaki sposób przeprowadzić spektrometrię mas z wymianą milisekundową wodór/deuter i późniejsze analizy danych w celu określenia informacji konformacyjnych na monomerze tego wewnętrznie nieuporządkowanego białka w warunkach fizjologicznych.

Spektrometria mas z wymianą milisekundową wodoru i deuteru do badania dynamiki strukturalnej alfa-synukleiny w warunkach fizjologicznych

Przedstawiamy protokół umożliwiający wychwytywanie i identyfikację specyficznych dla choroby interakcji białko-białko z komórek i tkanek rodzimych za pomocą sond chemicznych i spektrometrii mas. Uzyskane zbiory danych interakcji są analizowane za pomocą dedykowanej platformy internetowej, aby ujawnić dynamiczne dysfunkcje sieci oraz zmiany w ścieżkach związane z chorobą.

Mapowanie dysfunkcyjnych interakcji białko-białko w chorobach

Poznaj szybkie trawienie enzymatyczne białek w mikroreaktorze przepływowym z trypsyną do identyfikacji metodą spektrometrii masowej ESI. Ta metoda jest szybka, tania i łatwa do integracji z platformami mikrofabrykacyjnymi w badaniach proteomicznych.

Szybkie przetwarzanie enzymatyczne białek w celu wykrywania stwardnienia rozsianego za pomocą mikroreaktora przepływowego

Przeglądaj więcej filmów