Szybkie przetwarzanie enzymatyczne białek w celu wykrywania stwardnienia rozsianego za pomocą mikroreaktora przepływowego

Przedstawiono szybki protokół trawienia proteolitycznego za pomocą własnego mikroreaktora tryptycznego sprzężonego ze spektrometrem masowym z jonizacją elektrorozpylania (ESI). Opisano sposób wytwarzania mikroreaktora, układ doświadczalny i proces pozyskiwania danych.

Ogólnym celem tego protokołu jest opisanie wytwarzania przepływowego tryptycznego mircoreaktora, który przeprowadza szybkie trawienie enzymatyczne białek w celu umożliwienia identyfikacji białek za pomocą spektrometru masowego z jonizacją elektrorozpylającą. Metoda ta może pomóc w zilustrowaniu sekwencji aminokwasów wyizolowanych i oczyszczonych białek, aby wesprzeć dalszą charakterystykę struktury i funkcji. Główną zaletą tego protokołu jest to, że jest szybki, opłacalny i podatny na integrację z przepływami pracy wykorzystującymi platformy mikrofabrykowane.

Na początek użyj szklanego tasaka kapilarnego, aby przyciąć większą szklaną rurkę kapilarną na długość od siedmiu do ośmiu centymetrów, a mniejszą na długość od trzech do pięciu centymetrów. Użyj mikroskopu, aby sprawdzić, czy oba końce kapilar mają czyste, proste cięcie, bez wystających zadziorów. Włóż mniejszą kapilę około sześciu milimetrów do jednego końca większej.

Następnie za pomocą patyczka higienicznego nałóż niewielką kroplę kleju wokół połączenia naczyń włosowatych i pozwól klejowi utwardzić się przez noc w temperaturze pokojowej. Następnie przytnij włożoną kapilarnę na długość około 10 do 15 milimetrów. Ten koniec będzie działał jako emiter jonizacji elektronatrysku.

Włóż przeciwległy koniec kapilary o większej średnicy do rurki PEEK o średnicy 1/32 cala, która została wstępnie przycięta o długości od czterech do pięciu centymetrów i podłączona do złączki PEEK. Następnie włóż i dokręć pięciocentymetrowy kawałek rurki PTFE 1/16 do przeciwległego końca złącza. W czystym, suchym szklanym pilniku o pojemności dwóch mililitrów odważ cztery miligramy cząstek C18, a następnie dodaj 0,5 mililitra izopropanolu.

Zamknąć fiolkę. Umieść go w kąpieli ultradźwiękowej i poddaj sonizacji, aby równomiernie rozproszyć cząstki w roztworze. Następnie użyj strzykawki o pojemności 250 mikrolitrów, aby pobrać 200 mikrolitrów gnojowicy C18.

Włóż strzykawkę do rurki PTFE 1/16 cala i powoli dozuj zawiesinę do dużej kapilary. Obserwuj pod mikroskopem, jak kapilara wypełnia się cząstkami, aż do uzyskania dwóch do trzech milimetrów upakowania cząstek. Mniejsza rurka kapilarna zatrzymuje te cząstki w mikroreaktorze dzięki efektowi zwornika.

Na koniec przepłukać mikroreaktor 50 mikrolitrami 50-50 roztworu wody i acetonitrylu, a następnie 50 mikrolitrami roztworu zawierającego 49 mikrolitrów wody, zmieszanym z jednym mikrolitrem acetonitrylu. Odłącz mikroreaktor kapilarny od złącza PEEK i podłącz go do PEEK-T. Następnie włóż dwucentymetrowy drut platynowy, izolowany tuleją PEEK 1/32 cala, aby zapewnić szczelne połączenie z bocznym ramieniem PEEK-T.

Podłącz kapilarnę do przenoszenia próbki o długości pół metra do przeciwległego końca PEEK-T. Użyj tulei PEEK 1/32 cala, aby zapewnić szczelne połączenie. Zabezpiecz PEEK-T na stoliku XYZ.

I umieść emiter jonizacji elektrorozpylania w odległości około dwóch milimetrów od kapilary wlotowej spektrometru mas. Następnie podłącz przewód platynowy do źródła zasilania jonizacji elektrorozpylania spektrometru masowego. Podłącz również przeciwległy koniec kapilary do przenoszenia próbki do złącza ze stali nierdzewnej za pomocą tulei PEEK 1/16 cala, aby zapewnić szczelne połączenie.

Następnie podłącz kawałek rurki PTFE o długości od czterech do pięciu centymetrów do przeciwległego końca złącza ze stali nierdzewnej. Wprowadź parametry akwizycji danych MS w tandemie zgodnie z opisem w dołączonym protokole tekstowym do pakietu oprogramowania sterującego przyrządem MS. Zapisz je jako plik metody, aby przygotować konfigurację do przeprowadzenia analizy.

System LTQ MS jest wyposażony w zmodyfikowane źródło ESI, które zawiera domowy stolik XYZ, który umożliwia połączenie spektrometru masowego z różnymi podejściami do wprowadzania próbek. Załaduj strzykawkę o pojemności 250 mikrolitrów wodnym roztworem 50 milimolowego wodorowęglanu rozpuszczonego w 2% acetonitrylu. Następnie podłączyć strzykawkę do mikroreaktora i umieścić ją pod pompą strzykawkową.

Przepłukać mikroreaktor i dwa mikrolitry na minutę przez pięć minut, aby przygotować go do analizy. Następnie załaduj interesującą Cię próbkę białka do strzykawki o pojemności 250 mikrolitrów i podawaj roztwór próbki w ilości dwóch mikrolitrów na minutę przez pięć minut. Następnie umieść strzykawkę o pojemności 250 mikrolitrów wypełnioną pięciomikromolowym roztworem trypsyny pod pompą strzykawkową i wlej wchłonięte białko do mikroreaktora w ilości dwóch mikrolitrów na minutę przez jedną do trzech minut.

Bardzo ważne jest, aby świeżo rozmrozić i przygotować roztwór trypsyny przed każdym eksperymentem. Zapewni to, że enzym protolityczny zachowa swoją aktywność i operacyjne pH mikroreaktora, które wynosi pH około 8. Załaduj kolejną strzykawkę o pojemności 250 mikrolitrów roztworem wodnym składającym się z 0%1%kwasu trifluorooctowego dodanego do 2% acetonitrylu.

Użyj tego roztworu, aby wygasić proces trawienia proteolitycznego poprzez płukanie mikroreaktora z prędkością dwóch mikrolitrów na minutę przez pięć minut. Następnie przełącz się na strzykawkę wypełnioną 01% kwasem trifluorooctowym dodanym do 50% acetonitrylu i włącz proces akwizycji danych MS w napięciu jonizacji elektrorozpylania do około 2000 woltów. Użyj zakwaszonego roztworu, aby rozpocząć uwalnianie trawienia białka z mikroreaktora z prędkością 300 nanolitrów na minutę przez 20 do 30 minut.

Pozyskaj dane o specyfikacji masy, korzystając z parametrów akwizycji danych podanych w dołączonym protokole tekstowym. Przetwarzaj surowe pliki LTQ MS przy użyciu minimalnie nadmiarowej bazy danych białek, najpierw przesyłając surowe dane do wyszukiwarki. Następnie ustaw tolerancje masy jonów macierzystych i fragmentów odpowiednio na dwa i jeden daltony, a do wyszukiwania używaj tylko w pełni tryptycznych fragmentów z maksymalnie dwoma pominiętymi cięciami.

Ponadto należy ustawić wskaźniki fałszywych odkryć o wysokim i średnim poziomie ufności odpowiednio na 1% i 3% i nie zezwalać na modyfikacje potranslacyjne, chyba że konkretnie poszukuje się konkretnych modyfikacji. Na koniec przefiltruj dane, aby wybrać tylko dopasowania peptydów o wysokim poziomie ufności. Pokazane tutaj jest widmo masy składające się z peptydów tryptycznych, które zostały wygenerowane z mieszaniny białek, która została poddana proteolizie w mikroreaktorze.

Znaczniki te reprezentują najintensywniejsze jony peptydowe tryptyczne i zapewniają ich sekwencję oraz odpowiadający im identyfikator białka. Ten mikroreaktor zapewnia łatwy do przeprowadzenia eksperyment do przeprowadzania enzymatycznego trawienia białek i umożliwia analizę masy i identyfikację w czasie krótszym niż 30 minut. Podczas wykonywania tej procedury należy pamiętać, że zachowanie czystości fiolek i oprzyrządowania, które mają kontakt z roztworami, ma kluczowe znaczenie dla uniknięcia zanieczyszczenia próbki.

Zgodnie z tą procedurą, można zastosować inne metody pozyskiwania danych ze spektrometrii mas, aby umożliwić lepszą charakterystykę peptydów generatywnych i odpowiedzieć na dodatkowe pytania związane ze strukturą białek. Po opracowaniu technika ta utorowała drogę naukowcom zajmującym się proteonomiką do opracowania szybszych protokołów analizy białek i zbadania możliwości opracowania nowych platform mikrofalitycznych, które umożliwiają wysokoprzepustową eksplorację próbek biologicznych. Technika ta ogranicza się do analizy raczej prostych mieszanin białek, które generują od 25 do 50 peptydów.

Peptydy te mogą być analizowane za pomocą prostych eksperymentów infuzyjnych i nie wymagają separacji metodą chromatografii cieczowej przed analizą SM. Nie zapominaj, że praca z rozpuszczalnikami organicznymi może być bardzo niebezpieczna, a podczas wykonywania tej procedury należy zawsze podejmować środki ostrożności, takie jak unikanie otwartego ognia.