Derywatyzacja po kolumnie przy użyciu wysokosprawnych kolumn do chromatografii cieczowej z przepływem reakcji
26 kwietnia 2016
Przedstawiono protokół użycia wysokosprawnych kolumn do chromatografii cieczowej z przepływem reakcji dla metod wykorzystujących derywatyzację po kolumnie (PCD).
Ogólnym celem tej metody jest poprawa wydajności i czułości wysokosprawnej chromatografii cieczowej po derywatyzacji kolumnowej lub metody PCD poprzez zastosowanie kolumny przepływowej reakcji. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinach takich jak farmacja, biomedycyna i nauki o środowisku, gdzie analizowane są związki o niskiej odpowiedzi na detektory HPLC. Główną zaletą tej techniki jest to, że nie są potrzebne cewki reakcyjne.
Ponieważ mieszanie odczynnika odpływającego z kolumny i odczynnika derywatyzującego zachodzi bardziej efektywnie niż metody konwencjonalne. Ta metoda została wykorzystana do zapewnienia wglądu w przeciwutleniacze, aminokwasy i fenole. Może być również stosowany do związków innych klas, takich jak tiole, metale, antybiotyki i toksyny.
Chociaż cała próbka nie jest derywatyzowana, ze względu na mniejsze poszerzenie pasma, stężenie analitu w strumieniu przepływu ścieków jest wyższe niż w konwencjonalnej analizie derywatyzacji po kolumnie. Aby rozpocząć tę procedurę, należy przygotować przyrząd HPLC ze 100% wodą na linii A i 100% metanolem na linii B jako fazą ruchomą, przedmuchując pompy zgodnie z wymaganiami producenta. Ustawić komponenty instrumentalne HPLC i dodatkową pompę do derywatyzacji.
Następnie ustaw detektor UV/VIS na analizę na długości fali 520 nanometrów. Podłącz wlot kolumny przepływu reakcyjnego lub RF do przyrządu HPLC. Podłącz wylotowy port peryferyjny do detektora UV/VIS za pomocą rurki o długości 15 centymetrów i średnicy wewnętrznej 0.13 milimetra.
Następnie podłącz przewód pompy DPPH do portu peryferyjnego na wylocie kolumny RF. Zablokuj nieużywany port peryferyjny na wylocie kolumny RF za pomocą ogranicznika kolumny. Podłącz rurkę o długości 15 centymetrów i średnicy wewnętrznej 0.13 milimetra do centralnego portu wylotowego kolumny RF.
Doprowadzić natężenie przepływu pompy HPLC do jednego milimetra na minutę przy 100% metanolu. Następnie równoważyć kolumnę ze 100% metanolem przez 10 minut. W tym momencie przygotuj 0,1 miligrama na mililitr roztworu DPPH i metanolu.
Sonikować kolbę zawierającą odczynnik DPPH przez 10 minut. Przedmuchnąć pompę DPPH przygotowanym odczynnikiem DPPH zgodnie z wymaganiami producenta. Następnie weź dwa suche i czyste naczynia i oznacz jedno jako środkowe"a drugie jako peryferyjne"Dokładnie zważ oba naczynia.
Zbieraj ścieki wychodzące z portu centralnego do naczynia oznaczonego jako "central" przez jedną minutę. Po ponownym zważeniu centralnego statku portowego należy obliczyć masę przepływu z portu centralnego. Powtórz poprzednie kroki dla ścieków wychodzących z UV/VIS, który jest podłączony do portu peryferyjnego kolumny RF.
Obliczyć masę statku z portem peryferyjnym. Następnie oblicz procent przepływu pochodzącego z portów centralnych i peryferyjnych. Powtarzaj poprzednie kroki, aż stosunek przepływu będzie prawidłowy, a następnie ustaw natężenie przepływu pompy DPPH na 0,5 mililitra na minutę.
Po zakończeniu przebiegu zatrzymaj przepływ pompy odczynnika do derywatyzacji. Odłącz przewód pompy odczynnika DPPH od portu peryferyjnego i zakorkuj port. Zrównoważyć kolumnę z fazą ruchomą, w której ma być przechowywana, pozwalając fazie ruchomej przechodzić przez kolumnę z prędkością jednego milimetra na minutę przez 10 minut.
Następnie zatrzymaj przepływ pompy fazy bąbelkowej w przyrządzie HPLC. Na koniec zastąp odczynnik DPPH metanolem i oczyść dodatkową pompę. Pokazano tutaj dwa chromatogramy próbki kawy ristretto, derywatyzowanej rodnikiem DPPH przy użyciu zarówno konwencjonalnego oprzyrządowania PCD, jak i RF-PCD.
Obliczone granice oznaczalności i wykrywania dla każdego z aminokwasów analizowanych zarówno w trybie RF-PCD, jak i konwencjonalnym PCD są wymienione tutaj. Przedstawiono chromatogram czterech aminokwasów analizowanych konwencjonalną metodą PCD, metodą RF-PCD oraz niederywatyzowanego strumienia z metody RF-PCD. Przedstawiono tutaj porównanie sygnałów uzyskanych dla pików spowodowanych glicyną i leucyną przy użyciu zarówno konwencjonalnych metod PCD, jak i RF-PCD.
Przedstawiono porównanie szerokości piku tryptofanu podczas analizy przy użyciu konwencjonalnej metody PCD, metody RF-PCD oraz strumienia niederywatyzowanego z metody RF-PCD. 21-składnikowa próbka testowa, która zawierała niektóre składniki, które wykazują reakcję na schemat derywatyzacji, a niektóre, które tego nie robią, zostały oddzielone, derywatyzowane i wykryte. Ta sama mieszanina została również oddzielona i wykryta jako niederywatyzowana dla porównania.
Przedstawiono tutaj porównanie kształtu piku para-krezolu, zarówno derywatyzowanego przy użyciu kolumny RF-PCD, jak i niederywatyzowanego. Po opanowaniu technikę tę można skonfigurować w tym samym czasie, co konwencjonalną analizę derywatyzacji po kolumnie. Podczas wykonywania tej procedury należy pamiętać, aby być jak najbardziej zbliżonym do zalecanych proporcji przepływu.
Zgodnie z tą procedurą można użyć innych odczynników do derywatyzacji po kolumnie, takich jak OPA, ninhydryna lub halogeny w celu analizy innych związków. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś mieć dobry pomysł, jak skonfigurować i dostroić kolumnę przepływu reakcji.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejszy artykuł przedstawia protokół zwiększający wydajność i czułość pochodniowania po kolumnie (PCD) w wysokosprawnej chromatografii cieczowej (HPLC) z wykorzystaniem kolumn przepływowych do reakcji. Metoda ta jest szczególnie przydatna przy analizie związków o niskiej odpowiedzi w detektorach HPLC w różnych dziedzinach nauki.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Nauki farmaceutyczne
- Nauki biomedyczne
- Nauki o środowisku
Wstęp
- Wysokosprawna chromatografia cieczowa jest powszechnie stosowana do analizy związków.
- Deratyzacja pokolumnowa zwiększa czułość detekcji.
- Tradycyjne metody często wymagają zastosowania cewek reakcyjnych, co w tej metodzie zostaje wyeliminowane.
- Osiągnięto efektywne mieszanie eluatu z kolumny z odczynnikami.
Cel badania
- W celu zwiększenia wydajności metod HPLC PCD.
- Do analizy związków o niskiej odpowiedzi detektora.
- Aby uzyskać wgląd w różne klasy związków.
Zastosowane metody
- Zastosowanie kolumn do wysokosprawnej chromatografii cieczowej z przepływem reakcyjnym.
- Techniki pochodniowania po kolumnie.
- Analiza przeciwutleniaczy, aminokwasów i fenoli.
- Zastosowanie w analizie tioli, metali, antybiotyków i toksyn.
Główne wyniki
- Zwiększona wydajność i czułość w detekcji związków.
- Eliminacja cewek reakcyjnych poprawia skuteczność metody.
- Skuteczne zastosowanie w wielu klasach związków.
- Poznanie mechanizmów złożonych oddziaływań biochemicznych.
Wnioski
- Metoda kolumny przepływowej do reakcji znacząco usprawnia HPLC PCD.
- Technika ta jest wszechstronna i znajduje zastosowanie w wielu obszarach badawczych.
- Przyszłe badania mogą rozszerzyć jej wykorzystanie w innych dziedzinach analityki.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Derywatyzacja po kolumnie (PCD) zwiększa czułość detekcji analitów o niskiej odpowiedzi w badaniach farmaceutycznych i biomedycznych, jednak konwencjonalne metody obarczone są rozszerzeniem pasm ze względu na zastosowanie długich cewek reakcyjnych. PCD z przepływem reakcyjnym (RF-PCD) eliminuje to ograniczenie poprzez umożliwienie wydajnego mieszania wewnątrz kolumny, co poprawia efektywność rozdziału oraz stosunek sygnału do szumu. Ten postęp pozwala na wiarygodne oznaczanie ilościowe związków takich jak aminokwasy, przeciwutleniacze i fenole, co bezpośrednio wpływa na czułość analiz w procesach wczesnego etapu odkrywania leków.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne etapy odkrywania i walidacja celu
- Wartość naukowa: Umożliwia detekcję niepochodnych analitów z portu centralnego, co pozwala na równoległe monitorowanie gatunków natywnych i zmodyfikowanych w celu uzyskania wglądu w mechanizmy reakcji.
- Wartość operacyjna: Eliminuje cewki reakcyjne, zmniejszając martwą objętość systemu i minimalizując poszerzenie pasma w celu zachowania rozdzielczości chromatograficznej.
Przesiewy i opracowanie testów
- Wartość naukowa: Poprawia stosunek sygnału do szumu dla związków występujących w niskich stężeniach, co zwiększa granice detekcji w analizach przeciwutleniaczy, aminokwasów i fenoli.
- Wartość operacyjna: Wykorzystuje standardowe komponenty HPLC z pompą do derywatyzacji, co umożliwia prostą integrację z istniejącymi platformami analitycznymi.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Wartość naukowa: Wspiera analizę różnorodnych klas związków, w tym tioli, metali, antybiotyków i toksyn, rozszerzając zakres zastosowań w badaniach nad profilowaniem metabolitów oraz bezpieczeństwem.
- Wartość operacyjna: Zachowuje kompatybilność z detekcją UV/VIS przy 520 nm, co umożliwia bezproblemowe wdrożenie bez konieczności zakupu nowej aparatury.
Integracja potoków i przepływów pracy
Metoda RF-PCD wpisuje się w kontinuum procesu odkrywania leków poprzez zwiększenie niezawodności detekcji w badaniach przesiewowych na wczesnym etapie, w których czułe oznaczanie ilościowe związków bioaktywnych pozwala na identyfikację i priorytetyzację związków wiodących.
- Biologia odkrywcza: Zwiększa pewność w wykrywaniu metabolitów i biomarkerów o niskiej odpowiedzi poprzez poprawę czułości analitycznej bez nieefektywności związanych z derywatyzacją.
- Przesiewanie: Zapewnia ilościowe, powtarzalne wyniki dzięki zminimalizowanej objętości reakcji i wydajnemu mieszaniu, co wspiera wysokoprzepustową ocenę związków.
- Analityka: Umożliwia bezpośrednie porównanie strumieni derywatyzowanych i niederywatyzowanych, zapewniając wewnętrzną kontrolę dla walidacji testów i normalizacji danych.
- Badania translacyjne: Ułatwia ciągłe monitorowanie analitów od etapu odkrywania po badania przedkliniczne poprzez zachowanie integralności analitów i wierności detekcji.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Wykorzystuje istniejącą infrastrukturę HPLC przy minimalnym zwiększeniu złożoności, co sprzyja standaryzacji międzywydziałowej i przenośności metod.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorczy
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność prognostyczną wykrywania analitycznych poprzez redukcję wyników fałszywie ujemnych wynikających z braku czułości oraz poprawę przejrzystości sygnału.
- Wartość operacyjna: Poprawia powtarzalność i skalowalność poprzez eliminację zmienności związanej z przygotowaniem cewki reakcyjnej i wydajnością mieszania.
- Wartość strategiczna: Wspiera lepsze podejmowanie decyzji o kontynuacji lub przerwaniu prac w optymalizacji wiodących związków poprzez dostarczanie dokładniejszych danych o relacji struktura-aktywność dzięki czułemu wykrywaniu.
- Wpływ na portfolio: Umożliwia dostosowany do ryzyka postęp kandydatów poprzez poprawę jakości danych w wczesnych testach przesiewowych ADME i toksyczności.
Wskazówki dotyczące wdrożenia
- Wymaga doświadczenia w opracowywaniu metod HPLC oraz optymalizacji szybkości przepływu w celu zrównoważenia przepływów odczynnika do derywatyzacji i fazy ruchomej.
- Wymagana jest dedykowana pompa do derywatyzacji oraz kompatybilne przewody (ID 0,13 mm) dla precyzyjnego dostarczania odczynnika do portów peryferyjnych.
- Konieczna jest standaryzacja stosunków przepływów pomiędzy portami centralnymi a peryferyjnymi, aby zapewnić spójną wydajność derywatyzacji w kolejnych analizach.
- Wymaga rutynowej konserwacji, takiej jak etapy płukania i równoważenia, aby zapobiec przenoszeniu odczynników i zapewnić stabilność kolumny.
- Metoda jest ograniczona do reakcji derywatyzacji jedno- lub dwuskładnikowych, w których oba odczynniki mogą być wprowadzane jednocześnie przez porty peryferyjne.
