Name: Derywatyzacja po kolumnie przy użyciu wysokosprawnych kolumn do chromatografii cieczowej z przepływem reakcji (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-04-26T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 25 s
Description: Poznaj metodę derywatyzacji po kolumnie HPLC z wykorzystaniem kolumn reakcyjnych flow. Technika eliminuje cewki reakcyjne, zwiększając wykrywalność związków o niskiej odpowiedzi detektora w naukach farmaceutycznych, biomedycznych i środowiskowych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez UWS i ThermoFisher Scientific. Jeden z autorów (DK) potwierdza otrzymanie australijskiej nagrody podyplomowej.

Uwaga: Przed użyciem należy zapoznać się z kartami charakterystyki substancji niebezpiecznych (MSDS) dla wszystkich materiałów i odczynników (tj. Karty charakterystyki dla metanolu). Należy zapewnić stosowanie wszystkich odpowiednich praktyk bezpieczeństwa podczas obchodzenia się z rozpuszczalnikami i eluentem z wysokosprawnej chromatografii cieczowej (HPLC). Należy zapewnić właściwe wykorzystanie kontroli inżynieryjnych HPLC, wagi analitycznej i oprzyrządowania detektora oraz zapewnić stosowanie środków ochrony osobistej (okulary ochronne, rękawice, fartuch laboratoryjny, długie spodnie i buty z zakrytymi palcami).
Uwaga: Protokół ten opisuje 3 metody technik derywatyzacji pokolumnowej (RF-PCD), z których każda zawiera inny odczynnik specyficzny dla charakteru związku chemicznego będącego przedmiotem zainteresowania. Analiza ROS znajduje się w sekcji "1. Wykrywanie ROS za pomocą DPPH•", w celu analizy amin pierwszorzędowych, patrz rozdział "2. Wykrywanie amin pierwszorzędowych za pomocą fluoreskaminy", a w celu analizy związków fenolowych przejdź do sekcji "3. Wykrywanie fenoli za pomocą 4-aminoantypirenu i żelazocyjanku potasu". Używaj ultraczystej wody (np. wody Milli-Q) przez cały czas.
Uwaga: Podłączenie kolumny RF odbywa się prawie w taki sam sposób, jak w przypadku konwencjonalnej kolumny HPLC, przy czym główną różnicą jest liczba łączników końcowych na kolumnie RF. Łączniki używane do łączenia standardowej kolumny HPLC z systemem HPLC mogą być używane do łączenia kolumny RF z systemem HPLC.
1. Wykrywanie ROS za pomocą DPPH•
<ol>
	<li>Konfiguracja przyrządu do HPLC
	<ol>
		<li>Przygotować przyrząd do HPLC ze 100% wodą na linii A i 100% metanolem na linii B jako fazę ruchomą. Przedmuchnąć pompy zgodnie z wymaganiami producenta.</li>
		<li>Ustawić komponenty instrumentalne HPLC i dodatkową pompę do derywatyzacji, jak pokazano na rysunku 4A.</li>
		<li>Ustaw detektor UV-VIS na analizę na długości fali 520 nm.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Konfiguracja kolumny RF
	<ol>
		<li>Podłącz wlot kolumny RF do przyrządu HPLC.</li>
		<li>Podłącz rurkę o średnicy wewnętrznej 0.13 mm o długości 15 cm do centralnego portu wylotowego kolumny RF.</li>
		<li>Podłącz wyjściowy port peryferyjny do detektora UV-Vis za pomocą rurki o średnicy wewnętrznej 0,13 mm o długości 15 cm.</li>
		<li>Podłącz przewód pompy DPPH• do portu peryferyjnego na wylocie kolumny RF.</li>
		<li>Zablokuj nieużywany port peryferyjny na wylocie kolumny RF za pomocą ogranicznika kolumny.</li>
		<li>Doprowadzić natężenie przepływu pompy HPLC do 1 ml min-1 przy 100% linii B - 100% metanolu.</li>
		<li>Równoważyć kolumnę ze 100 % fazą ruchomą metanolu przez 10 minut, aby uzyskać kolumnę o średnicy wewnętrznej 4,6 mm x długości 100 mm. Czas ten powinien być przeskalowany zgodnie z wymiarami innych kolumn, z których użytkownik może skorzystać.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotowanie odczynnika DPPH•
	<ol>
		<li>Przygotować 0,1 mg/ml roztwór DPPH• w metanolu.</li>
		<li>Sondować kolbę zawierającą odczynnik DPPH• przez 10 minut.</li>
		<li>Przykryć kolbę folią, aby zapobiec ekspozycji na światło.</li>
		<li>Przedmuchnąć pompę DPPH• przygotowanym odczynnikiem DPPH• zgodnie z wymaganiami producenta.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Dostrajanie wylotu kolumny RF
	<ol>
		<li>Dokładnie zważ dwa czyste i suche naczynia. Oznacz jedno naczynie jako centralne, a drugie jako peryferyjne.</li>
		<li>Zbieraj ścieki wychodzące z portu centralnego do naczynia oznaczonego jako centralne przez 1,0 min.</li>
		<li>Ponownie zważyć statek portu centralnego i obliczyć masę przepływu z portu centralnego w następujący sposób: 
		Masa statku portu centralnego (g) = końcowa waga statku portu centralnego (g) - masa początkowa statku portu centralnego (g)</li>
		<li>Powtórzyć kroki 1.4.2 i 1.4.3 dla ścieków wychodzących z UV-Vis, który jest podłączony do portu peryferyjnego kolumny RF i obliczyć masę dla statku portu obwodowego w następujący sposób: 
		Masa portu peryferyjnego (g) = Końcowa waga statku portu peryferyjnego (g) - Początkowa masa statku portu peryferyjnego (g)</li>
		<li>Oblicz procent przepływu pochodzącego z portów centralnych i peryferyjnych w następujący sposób: 
		% portu centralnego = waga portu centralnego (g) / (waga portu centralnego (g) + waga portu peryferyjnego (g)) x 100 
		% Port peryferyjny = Waga portu peryferyjnego (g) / (Waga portu centralnego (g) + Waga portu peryferyjnego (g)) x 100</li>
		<li>Upewnij się, że stosunek segmentacji między przepływem centralnym a przepływem obwodowym wynosi 30:70 (centralny:peryferyjny). Jeśli przepływ centralny przekracza 30%, zmniejsz ilość przepływu wychodzącego, dodając rurkę o średnicy wewnętrznej 0.13 mm do wylotu portu centralnego. Jeśli przepływ centralny jest poniżej 30%, zmniejsz długość rurki 0,13 mm od portu centralnego.</li>
		<li>Powtarzać kroki od 1.4.1 do 1.4.6, aż do uzyskania współczynnika segmentacji 30:70 (centralny:peryferyjny).</li>
		<li>Ustaw natężenie przepływu pompy odczynnika DPPH• na 0.5 ml min-1. 
		Uwaga: Kolumna RF skonfigurowana z odczynnikiem DPPH• jest teraz gotowa do analizy. Próbki mogą być teraz wstrzykiwane.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Warunki zamknięcia po uruchomieniu
	<ol>
		<li>Po wstrzyknięciu wszystkich próbek, wskazując, że przebieg został zakończony, zatrzymać przepływ pompy odczynnika do derywatyzacji.</li>
		<li>Wyjmij przewód pompy odczynnika DPPH• z portu peryferyjnego i zakorkuj port.</li>
		<li>Zrównoważyć kolumnę z fazą ruchomą, w której ma być przechowywana, pozwalając fazie ruchomej przejść przez kolumnę w temperaturze 1 ml min-1 przez 10 minut.</li>
		<li>Zatrzymać przepływ ruchomej pompy fazowej w przyrządzie HPLC.</li>
		<li>Zastąp odczynnik DPPH• metanolem i oczyść dodatkową pompę. 
		Uwaga: System HPLC można teraz wyłączyć.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Wykrywanie amin pierwotnych za pomocą fluoreskaminy
<ol>
	<li>Przygotowanie fazy mobilnej
	<ol>
		<li>Przygotować 1 l 10 mM roztworu octanu amonu, dostosowując pH roztworu do 9,0 za pomocą 5 M wodorotlenku amonu przed rozcieńczeniem do objętości.</li>
		<li>Dodać 52,6 ml acetonitrylu (ACN) do buforu octanu amonu, aby uzyskać wstępnie zmieszaną fazę ruchomą w stosunku 95:05 (bufor: ACN).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Konfiguracja przyrządu do HPLC
	<ol>
		<li>Przygotować przyrząd do HPLC ze wstępnie zmieszanym przygotowanym buforem na linii A jako fazę ruchomą. Oczyść pompę zgodnie z wymaganiami producenta.</li>
		<li>Ustawić komponenty instrumentalne HPLC i dodatkową pompę do derywatyzacji, jak pokazano na rysunku 4A.</li>
		<li>Podłącz cewkę tłumika impulsów do pompy derywatyzacji.</li>
		<li>Ustawić detektor fluorescencji (FLD) o długości fali wzbudzenia 390 nm i długości fali emisyjnej 475 nm.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Konfiguracja kolumny RF
	<ol>
		<li>Podłącz wlot kolumny RF do przyrządu HPLC.</li>
		<li>Podłącz rurkę o średnicy wewnętrznej 0.13 mm o długości 15 cm do centralnego portu wylotowego kolumny RF.</li>
		<li>Podłącz wyjściowy port peryferyjny kolumny RF do detektora FLD za pomocą rurki o średnicy wewnętrznej 0.13 mm o długości 15 cm.</li>
		<li>Podłącz przewód pompy do derywatyzacji do portu peryferyjnego na wylocie kolumny RF.</li>
		<li>Zablokuj nieużywany port peryferyjny na wylocie kolumny RF za pomocą ogranicznika kolumny.</li>
		<li>Doprowadzić natężenie przepływu pompy HPLC do 1 ml min-1 przy 100% linii A - 10 mM buforze octanu amonu o pH 9, wstępnie zmieszanym z 5% ACN.</li>
		<li>Zrównoważyć kolumnę ze 100 % linią A fazą ruchomą przez 10 minut dla kolumny o średnicy wewnętrznej 4,6 mm x długości 100 mm. Czas ten może być skalowany zgodnie z wymiarami innych kolumn, z których użytkownik może korzystać.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotowanie odczynnika fluorescaminy
	<ol>
		<li>Przygotować 100 ml 0,1 mg ml-1 odczynnika fluoreskaminowego.</li>
		<li>Sonikacja przez 1 minutę.</li>
		<li>Przykryj folią, aby zapobiec ekspozycji na światło.</li>
		<li>Przedmuchnąć pompę odczynnika przygotowanym odczynnikiem fluorescaminy zgodnie z wymaganiami producenta.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Dostrajanie wylotu kolumny RF
	<ol>
		<li>Dokładnie zważ dwa czyste i suche naczynia. Oznacz jedno naczynie jako centralne, a drugie jako peryferyjne.</li>
		<li>Zbieraj ścieki wychodzące z portu centralnego do naczynia oznaczonego jako centralne przez 1,0 min.</li>
		<li>Ponownie zważyć statek centralny i obliczyć masę przepływu z portu centralnego w następujący sposób jak opisano w kroku 1.4.3.</li>
		<li>Powtórz kroki od 2.5.2 do 2.5.3 dla ścieków wychodzących z FLD, który jest podłączony do portu peryferyjnego kolumny RF i oblicz wagę dla urządzenia peryferyjnego w następujący sposób w kroku 1.4.4.</li>
		<li>Obliczyć procent przepływu pochodzącego z portów centralnych i peryferyjnych w następujący sposób w kroku 1.4.5.</li>
		<li>Upewnij się, że stosunek segmentacji między przepływem centralnym a przepływem obwodowym wynosi 43:57 (centralny:peryferyjny). Jeśli przepływ centralny przekracza 43%, zmniejsz ilość przepływu wychodzącego, dodając rurkę o średnicy wewnętrznej 0,13 mm do wylotu portu centralnego. Jeśli przepływ centralny jest mniejszy niż 43%, zmniejsz długość rurki 0.13 mm od portu centralnego.</li>
		<li>Powtarzaj kroki od 2.5.1 do 2.5.6, aż do uzyskania współczynnika segmentacji 43:57 (centralny:peryferyjny).</li>
		<li>Ustawić natężenie przepływu ruchomej pompy fazowej na 0,7 ml min-1.</li>
		<li>Ustawić pompę do derywatyzacji na przepływ 0,1 ml min-1, 
		Uwaga: Kolumna RF wyposażona w odczynnik fluoreskaminowy jest teraz gotowa do analizy. Próbki mogą być teraz wstrzykiwane.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Warunki zamknięcia po uruchomieniu
	<ol>
		<li>Po wstrzyknięciu wszystkich próbek, co oznacza, że przebieg został zakończony, zatrzymać pompę derywatyzacyjną.</li>
		<li>Wyjmij przewód pompy do derywatyzacji z portu peryferyjnego i korka.</li>
		<li>Zrównoważyć kolumnę z fazą ruchomą, w której ma być przechowywana, pozwalając fazie ruchomej przejść przez kolumnę w temperaturze 1 ml min-1 przez 10 minut.</li>
		<li>Zatrzymać przepływ ruchomej pompy fazowej.</li>
		<li>Zastąp odczynnik fluorescaminy acetonitrylem i oczyścić pompę do derywatyzacji. 
		Uwaga: System HPLC można teraz wyłączyć.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Wykrywanie fenoli za pomocą 4-aminoantypirenu i żelazocyjanku potasu
<ol>
	<li>Przygotowanie fazy mobilnej
	<ol>
		<li>Przygotować 1 l 100 mM roztworu octanu amonu, dostosowując pH roztworu do 9,0 za pomocą 5 M wodorotlenku amonu przed rozcieńczeniem do objętości.</li>
		<li>Dodać 52,6 ml metanolu do buforu octanu amonu, aby uzyskać wstępnie zmieszaną fazę ruchomą w stosunku 95:5 (bufor: metanol).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Konfiguracja przyrządu do HPLC
	<ol>
		<li>Przygotować przyrząd do HPLC ze wstępnie zmieszanym przygotowanym buforem na linii A jako fazę ruchomą. Oczyść pompę zgodnie z wymaganiami producenta.</li>
		<li>Ustawić komponenty instrumentalne HPLC i dwie dodatkowe pompy odczynników, jak pokazano na rysunku 4B.</li>
		<li>Podłącz cewkę tłumika impulsów do każdej z pomp odczynników.</li>
		<li>Ustaw detektor UV-VIS na analizę na długości fali 500 nm.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Konfiguracja kolumny RF
	<ol>
		<li>Podłącz wlot kolumny RF do przyrządu HPLC.</li>
		<li>Podłącz rurkę o średnicy wewnętrznej 0.13 mm o długości 15 cm do centralnego portu wylotowego kolumny RF.</li>
		<li>Podłącz peryferyjny port wyjściowy kolumny RF do detektora UV-Vis za pomocą rurki o średnicy wewnętrznej 0.13 mm o długości 15 cm.</li>
		<li>Podłącz każdy przewód pompy odczynnika (tj. 4-aminoantypirenu i żelazocyjanku potasu) do portu peryferyjnego na wylocie kolumny RF.</li>
		<li>Doprowadzić natężenie przepływu pompy HPLC do 1 ml min-1 przy 100% linii A - 100 mM bufor octanu amonu o pH 9, wstępnie zmieszany z 5% metanolem.</li>
		<li>Zrównoważyć kolumnę ze 100 % linią A fazą ruchomą przez 10 minut dla kolumny o średnicy wewnętrznej 4,6 mm x długości 100 mm. Czas ten może być skalowany zgodnie z wymiarami innych kolumn, z których użytkownik może korzystać.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotowanie odczynnika 4-aminoantypirenowego
	<ol>
		<li>Przygotować bufor octanu amonu o pH 9, postępując zgodnie z krokiem 3.1.1.</li>
		<li>Odważyć 150 mg 4-aminoantypirenu i rozpuścić w 100 ml przygotowanego buforu octanu amonu (pH 9).</li>
		<li>Sonikacja przez 1 minutę.</li>
		<li>Przykryj folią, aby zapobiec ekspozycji na światło.</li>
		<li>Przedmuchnąć pierwszą pompę odczynnika przygotowanym odczynnikiem 4-aminoantypirenowym zgodnie z wymaganiami producenta.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotowanie odczynnika żelazocyjanku potasu
	<ol>
		<li>Odważyć 150 mg żelazocyjanku potasu i rozpuścić w 100 ml buforu octanu amonu (pH 9) przygotowanego zgodnie z krokiem 3.1.1.</li>
		<li>Sonikacja przez 1 minutę.</li>
		<li>Przykryj folią, aby zapobiec ekspozycji na światło.</li>
		<li>Przedmuchnąć drugą pompę odczynnika przygotowanym odczynnikiem żelazocyjanowym potasu zgodnie z wymaganiami producenta.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Strojenie kolumny RF
	<ol>
		<li>Dokładnie zważ dwa czyste i suche naczynia. Oznacz jedno naczynie jako centralne, a drugie jako peryferyjne.</li>
		<li>Zbieraj ścieki wychodzące z portu centralnego do naczynia oznaczonego jako centralne przez 1,0 min.</li>
		<li>Ponownie zważyć statek centralny i obliczyć masę przepływu z portu centralnego w następujący sposób jak opisano w kroku 1.4.3.</li>
		<li>Powtórzyć kroki od 3.6.2 do 3.6.3 dla ścieków wychodzących z UV-Vis, który jest podłączony do portu peryferyjnego kolumny RF i obliczyć wagę dla urządzenia peryferyjnego w następujący sposób w kroku 1.4.4.</li>
		<li>Obliczyć procent przepływu pochodzącego z portów centralnych i peryferyjnych w następujący sposób w kroku 1.4.5.</li>
		<li>Upewnij się, że stosunek segmentacji między przepływem centralnym a przepływem obwodowym wynosi 50:50 (centralny:peryferyjny). Jeśli przepływ centralny przekracza 50%, zmniejsz ilość przepływu wychodzącego, dodając rurkę o średnicy wewnętrznej 0.13 mm do centralnego portu wylotowego. Jeśli przepływ centralny jest mniejszy niż 50%, zmniejsz długość rurki 0.13 mm od portu centralnego.</li>
		<li>Powtarzać kroki od 3.6.1 do 3.6.6, aż do uzyskania stosunku segmentacji 50:50 (centralny:peryferyjny).</li>
		<li>Ustawić natężenie przepływu pompy 4-aminoantypirenowej na 0,5 ml min-1.</li>
		<li>Ustawić natężenie przepływu pompy żelazocyjanku potasu na 0.25 ml min-1. 
		Uwaga: Kolumna RF skonfigurowana z odczynnikami dwuskładnikowymi jest teraz gotowa do analizy. Próbki mogą być teraz wstrzykiwane.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Warunki zamknięcia po uruchomieniu
	<ol>
		<li>Po wstrzyknięciu wszystkich próbek przebieg został zakończony, co wskazuje, że przebieg został zakończony, zatrzymać obie pompy odczynników.</li>
		<li>Odłącz przewody pompy odczynnika z portów peryferyjnych i zastąp je 15-centymetrowym kawałkiem rurki 0.13 mm.</li>
		<li>Zrównoważyć kolumnę z fazą ruchomą, w której ma być przechowywana, pozwalając fazie ruchomej przejść przez kolumnę w temperaturze 1 ml min-1 przez 10 minut.</li>
		<li>Zatrzymać przepływ ruchomej pompy fazowej w przyrządzie HPLC.</li>
		<li>Wymień oba odczynniki na pompach odczynników na metanol i wyczyść dodatkowe pompy zgodnie z wymaganiami producenta. 
		Uwaga: System HPLC można teraz wyłączyć.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Srijaranai, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+1-%282-pyridylazo%29-2-naphthol+as+the+post+column+reagent+for+ion+exchange+chromatography+of+heavy+metals+in+environmental+samples%5BTitle%5D)+AND+%22Microchem.+J%22%5BJournal%5D)">Use of 1-(2-pyridylazo)-2-naphthol as the post column reagent for ion exchange chromatography of heavy metals in environmental samples.</a> Microchem. J. 99, 152-158 (2011).</li>
<li>Kubickova, A., Kubicek, V., Coufal, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((UV-VIS+detection+of+amino+acids+in+liquid+chromatography%3A+online+post-column+solid-state+derivatization+with+Cu%28II%29+ions%5BTitle%5D)+AND+%22J+Sep+Sci%22%5BJournal%5D)">UV-VIS detection of amino acids in liquid chromatography: online post-column solid-state derivatization with Cu(II) ions.</a> J Sep Sci. 34, 3131-3135 (2011).</li>
<li>Quinto, M., Spadaccino, G., Palermo, C., Centonze, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determination+of+aflatoxins+in+cereal+flours+by+solid-phase+microextraction+coupled+with+liquid+chromatography+and+post-column+photochemical+derivatization-fluorescence+detection%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Chromatogr.+A%22%5BJournal%5D)">Determination of aflatoxins in cereal flours by solid-phase microextraction coupled with liquid chromatography and post-column photochemical derivatization-fluorescence detection.</a> J. Chromatogr. A. 1216, 8636-8641 (2009).</li>
<li>Lee, M., Lee, Y., Soltermann, F., von Gunten, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+N-nitrosamines+and+other+nitro%28so%29+compounds+in+water+by+high-performance+liquid+chromatography+with+post-column+UV+photolysis%2FGriess+reaction%5BTitle%5D)+AND+%22Water+Res%22%5BJournal%5D)">Analysis of N-nitrosamines and other nitro(so) compounds in water by high-performance liquid chromatography with post-column UV photolysis/Griess reaction.</a> Water Res. 47, 4893-4903 (2013).</li>
<li>Niu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+isoflavonoids+in+Radix+Puerariae+for+quality+control+using+on-line+high+performance+liquid+chromatography-diode+array+detector-electrospray+ionization-mass+spectrometry+coupled+with+post-column+derivatization%5BTitle%5D)+AND+%22Food+Res+Int%22%5BJournal%5D)">Identification of isoflavonoids in Radix Puerariae for quality control using on-line high performance liquid chromatography-diode array detector-electrospray ionization-mass spectrometry coupled with post-column derivatization.</a> Food Res Int. 48, 528-537 (2012).</li>
<li>Zacharis, C. K., Tzanavaras, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Liquid+chromatography+coupled+to+on-line+post+column+derivatization+for+the+determination+of+organic+compounds%3A+a+review+on+instrumentation+and+chemistries%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chim.+Acta%22%5BJournal%5D)">Liquid chromatography coupled to on-line post column derivatization for the determination of organic compounds: a review on instrumentation and chemistries.</a> Anal. Chim. Acta. 798, 1-24 (2013).</li>
<li>Dousa, M., Brichac, J., Gibala, P., Lehnert, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+hydrophilic+interaction+chromatography+determination+of+lysine+in+pharmaceutical+preparations+with+fluorescence+detection+after+postcolumn+derivatization+with+o-phtaldialdehyde%5BTitle%5D)+AND+%22J+Pharm+Biomed+Anal%22%5BJournal%5D)">Rapid hydrophilic interaction chromatography determination of lysine in pharmaceutical preparations with fluorescence detection after postcolumn derivatization with o-phtaldialdehyde.</a> J Pharm Biomed Anal. 54, 972-978 (2011).</li>
<li>Iijima, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimization+of+an+Online+Post-Column+Derivatization+System+for+Ultra+High-Performance+Liquid+Chromatography+%28UHPLC%29+and+Its+Applications+to+Analysis+of+Biogenic+Amines%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Sci%22%5BJournal%5D)">Optimization of an Online Post-Column Derivatization System for Ultra High-Performance Liquid Chromatography (UHPLC) and Its Applications to Analysis of Biogenic Amines.</a> Anal Sci. 29, 539-545 (2013).</li>
<li>Cunico, R. L., Schlabach, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+Ninhydrin+and+o-Phthalaldehyde+Postcolumn+Detection+Techniques+for+High+Performance+Liquid+Chromatography+of+Free+Amino%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Chromatogr.+A%22%5BJournal%5D)">Comparison of Ninhydrin and o-Phthalaldehyde Postcolumn Detection Techniques for High Performance Liquid Chromatography of Free Amino.</a> J. Chromatogr. A. 1983, 461-470 (1983).</li>
<li>Donahue, E. P., Brown, L. L., Flakoll, P. J., Abumrad, N. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+Measurement+of+Leucine-specific+Activity+in+Biological+Fluids+by+Ion-exchange+Chromatography+and+Post-column+Ninhydrin+Detection%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Chromatogr.+A%22%5BJournal%5D)">Rapid Measurement of Leucine-specific Activity in Biological Fluids by Ion-exchange Chromatography and Post-column Ninhydrin Detection.</a> J. Chromatogr. A. 571, 29-36 (1998).</li>
<li>Udenfriend, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescamine%3A+A+Reagent+for+Assay+of+Amino+Acids%2C+Peptides%2C+Proteins+and+Primary+Amines+in+the+Picomole+Range%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Fluorescamine: A Reagent for Assay of Amino Acids, Peptides, Proteins and Primary Amines in the Picomole Range.</a> Science. 1972, 871-872 (1972).</li>
<li>Samejima, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Separation+of+Fluorescamine+Derivitices+of+Aliphatic+Diamines+and+Polyamines+by+High+Speed+Liquid+Chromatography%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Chromatogr.+A%22%5BJournal%5D)">Separation of Fluorescamine Derivitices of Aliphatic Diamines and Polyamines by High Speed Liquid Chromatography.</a> J. Chromatogr. A. 96, 250-254 (1974).</li>
<li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+antioxidant+activity+of+ten+compounds+in+different+tea+samples+by+means+of+an+on-line+HPLC-DPPH+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Food+Res+Int%22%5BJournal%5D)">Evaluation of antioxidant activity of ten compounds in different tea samples by means of an on-line HPLC-DPPH assay.</a> Food Res Int. 53, 847-856 (2013).</li>
<li>Niu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+the+anti-oxidants+in+Flos+Chrysanthemi+by+HPLC-DAD-ESI%2FMS%28n%29+and+HPLC+coupled+with+a+post-column+derivatisation+system%5BTitle%5D)+AND+%22Phytochem+Anal%22%5BJournal%5D)">Identification of the anti-oxidants in Flos Chrysanthemi by HPLC-DAD-ESI/MS(n) and HPLC coupled with a post-column derivatisation system.</a> Phytochem Anal. 24, 59-68 (2013).</li>
<li>Raudonis, R., Bumblauskiene, L., Jakstas, V., Pukalskas, A., Janulis, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimization+and+validation+of+post-column+assay+for+screening+of+radical+scavengers+in+herbal+raw+materials+and+herbal+preparations%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Chromatogr.+A%22%5BJournal%5D)">Optimization and validation of post-column assay for screening of radical scavengers in herbal raw materials and herbal preparations.</a> J. Chromatogr. A. 1217, 7690-7698 (2010).</li>
<li>Raudonis, R., Raudone, L., Jakstas, V., Janulis, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+evaluation+of+post-column+free+radical+scavenging+and+ferric+reducing+antioxidant+power+assays+for+screening+of+antioxidants+in+strawberries%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Chromatogr.+A%22%5BJournal%5D)">Comparative evaluation of post-column free radical scavenging and ferric reducing antioxidant power assays for screening of antioxidants in strawberries.</a> J. Chromatogr. A. 1233, 8-15 (2012).</li>
<li>Zakrzewski, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determination+of+Methimazole+in+Pharmaceutical+Preparations+using+an+HPLC+Method+Coupled+with+an+Iodine-Azide+Post-Column+Reaction%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Liq.+Chrom.+Rel.+Technol%22%5BJournal%5D)">Determination of Methimazole in Pharmaceutical Preparations using an HPLC Method Coupled with an Iodine-Azide Post-Column Reaction.</a> J. Liq. Chrom. Rel. Technol. 32, 383-398 (2008).</li>
<li>Zakrzewski, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+and+validation+of+a+reversed-phase+HPLC+method+with+post-column+iodine-azide+reaction+for+the+determination+of+thioguanine%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Development and validation of a reversed-phase HPLC method with post-column iodine-azide reaction for the determination of thioguanine.</a> J. Anal. Chem. 64, 1235-1241 (2009).</li>
<li>Gritti, F., Guiochon, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Accurate+measurements+of+the+true+column+efficiency+and+of+the+instrument+band+broadening+contributions+in+the+presence+of+a+chromatographic+column%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Chromatogr.+A%22%5BJournal%5D)">Accurate measurements of the true column efficiency and of the instrument band broadening contributions in the presence of a chromatographic column.</a> J. Chromatogr. A. 1327, 49-56 (2014).</li>
<li>Stewart, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Post+cotumn+derivatization+methodology+in+high+performance+liquid+chromatography+%28HPLC%29%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Post cotumn derivatization methodology in high performance liquid chromatography (HPLC).</a> Trends Anal. Chem. 1, 170-174 (1982).</li>
<li>Rigas, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Post-column+labeling+techniques+in+amino+acid+analysis+by+liquid+chromatography%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Bioanal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Post-column labeling techniques in amino acid analysis by liquid chromatography.</a> Anal. Bioanal. Chem. 405, 7957-7992 (2013).</li>
<li>Frei, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reaction+Detectors+in+Modern+Liquid+Chromatography%5BTitle%5D)+AND+%22Chromatographia%22%5BJournal%5D)">Reaction Detectors in Modern Liquid Chromatography.</a> Chromatographia. 15, 161-166 (1982).</li>
<li>Pravadil-Cekic, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+Reaction+Flow+Chromatography+for+the+Analysis+of+Amino+Acid%3A+Derivatisation+With+Fluorescamine+Reagent%5BTitle%5D)+AND+%22Microchem.+J%22%5BJournal%5D)">Using Reaction Flow Chromatography for the Analysis of Amino Acid: Derivatisation With Fluorescamine Reagent.</a> Microchem. J. , (Accepted Manuscript) (2015).</li>
<li>Camenzuli, M., Ritchie, H. J., Dennis, G. R., Shalliker, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Parallel+segmented+flow+chromatography+columns+with+multiplexed+detection%3A+An+illustration+using+antioxidant+screening+of+natural+products%5BTitle%5D)+AND+%22Microchem.+J%22%5BJournal%5D)">Parallel segmented flow chromatography columns with multiplexed detection: An illustration using antioxidant screening of natural products.</a> Microchem. J. 110, 726-730 (2013).</li>
<li>Koleva, I. I., Niederlander, H. A. G., van Beek, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+On-Line+HPLC+Method+for+Detection+of+Radical+Scavenging+Compounds+in+Complex+Mixtures%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Chem%22%5BJournal%5D)">An On-Line HPLC Method for Detection of Radical Scavenging Compounds in Complex Mixtures.</a> Anal Chem. 72, 2323-2328 (2000).</li>
<li>Selim, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Two-component+Post-column+Derivatisation+Method+Utilsing+Reaction+Flow+Chromatography%5BTitle%5D)+AND+%22Microchem.+J%22%5BJournal%5D)">A Two-component Post-column Derivatisation Method Utilsing Reaction Flow Chromatography.</a> Microchem. J. 116, 87-91 (2014).</li>
<li>Bigley, F. P., Grob, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determination+of+Phenols+in+Water+and+Wastewater+by+Post-column+Reaction+Detection+High-performance+Liquid+Chromatography%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Chromatogr.+A%22%5BJournal%5D)">Determination of Phenols in Water and Wastewater by Post-column Reaction Detection High-performance Liquid Chromatography.</a> J. Chromatogr. A. 350, 407-416 (1985).</li>
<li>Camenzuli, M., Ritchie, H. J., Dennis, G. R., Shalliker, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reaction+flow+chromatography+for+rapid+post+column+derivatisations%3A+The+analysis+of+antioxidants+in+natural+products%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Chromatogr.+A%22%5BJournal%5D)">Reaction flow chromatography for rapid post column derivatisations: The analysis of antioxidants in natural products.</a> J. Chromatogr. A. 1303, 62-65 (2013).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

RF-PCD pozwala na efektywne mieszanie odczynnika do derywatyzacji z postkolumną ściekową HPLC bez użycia cewek reakcyjnych, minimalizując efekty poszerzenia pasma i poprawiając wydajność separacji. Metody RF-PCD wykazały również poprawę odpowiedzi sygnału w odniesieniu do metody wykrywania. Camenzuli i wsp.Firma 28 jako pierwsza poinformowała o zastosowaniu kolumn przepływowych z DPPH• do wykrywania ROS w próbce kawy espresso. Ich badania obejmowały analizę i optymalizację warunków RF w cel...

Wysokosprawna chromatografia cieczowa (HPLC) w połączeniu z derywatyzacją po kolumnie (PCD) to potężne narzędzie, które jest przydatne w rozwiązywaniu wielu problemów w laboratorium analitycznym. Może być stosowany do wykrywania związków, które w inny sposób są niewykrywalne za pomocą zestawu detektorówdostępnych 1,2, zwiększania sygnału docelowego analitu, co pozwala na niższe granice wykrywania i oznaczania ilościowego3-5 lub selektywnego wyprowadzania docelowego analitu w celu uniknięcia efektów matrycowych6. Powszechnie stosowane reakcje PCD obejmują reakcję amin, takich jak aminokwasy, z orto-ftaladehydem7-9, ninhydryną9,10 lub fluoreskaminą11,12, derywatyzację reaktywnych form tlenu (ROS) z rodnikiem 2,2-difenylo-1-pikrylohydrazylu (DPPH•)13,14 lub kwasem 2,2'-azyno-bis(3-etylobenzotiazolino-6-sulfonowym (ABTS)15,16 oraz zastosowanie odczynnika jodkowo-azydkowego do pochodnej związków zawierających siarkęRozdział 17,18.
Istnieją jednak liczne wady stosowania reakcji PCD w systemach HPLC6. Głównym z nich jest zastosowanie cewek reakcyjnych między punktem dodawania odczynnika (odczynników) do derywatyzacji a detektorem, które dają czas na zmieszanie i zajście reakcji8. Te pętle reakcyjne często mają objętość 500 μl lub więcej, co jest znaczące w porównaniu z objętością pozostałej części systemu HPLC19. Zastosowanie tych pętli reakcyjnych o dużej objętości powoduje zwiększone poszerzenie piku w porównaniu z tym, co można by zaobserwować bez obecności pętli reakcyjnej. Skutkuje to krótszymi, szerszymi pikami, które mają wyższe granice oznaczalności i wykrywalności, co negatywnie wpływa na rozdzielczość chromatograficzną. Rysunki 1 i 2 podkreślają pogorszenie kształtu pików, które wynika z dodania różnych objętości pętli reakcyjnej po kolumnie. Analizę tę przeprowadzono przy użyciu fazy ruchomej składającej się z 94% metanolu i 6% wody Milli-Q. Natężenie przepływu w fazie ruchomej wynosiło 1 ml/min, objętość iniekcji wynosiła 20 μl, a długość fali analizy wynosiła 265 nm. Cewki o różnych objętościach martwych od 20 μl do 1 000 μl umieszczono między kolumną a detektorem, aby zasymulować efekty objętości martwej pętli reakcyjnej w metodach PCD. Pętle te zostały przygotowane z rurek ze stali nierdzewnej o średnicy wewnętrznej 0,5 mm. Eksperyment przeprowadzono na systemie HPLC składającym się ze sterownika (SCL-10AVP), zaworu gradientowego niskiego ciśnienia (FCL-10ALVP), pompy (LC-20AD), wtryskiwacza (SIL-10ADVP) i detektora pda (SPD-M10ADVP). Faza ruchoma została przepompowana przez odgazowywacz przed wprowadzeniem do systemu HPLC. Separację przeprowadzono za pomocą kolumny o wymiarach 250 mm x 4,6 mm średnicy wewnętrznej 5 μm. Warunki eksperymentalne zostały wybrane jako typowe dla reakcji PCD, które zostały niedawno opublikowane w literaturze.
Najprostszy, najczęściej spotykany system reaktora kolumnowego jest określany jako niesegmentowy reaktor rurowy, który jest w rzeczywistości długą, cienką rurką, przez którą może przepływać ciecz i zachodzić reakcja. W tym systemie poszerzenie piku zależy nie tylko od martwej objętości dodanej do systemu, ale także od wewnętrznej średnicy rurki, jak podkreślili Iijima i wsp.8. Ponadto geometria cewki odgrywa rolę w obserwowanym poszerzaniu marki. Stewart 20 stwierdził, że zwijanie reaktora zmienia wtórne profile przepływu, co skutkuje lepszym mieszaniem, co oznacza, że martwa objętość może być zminimalizowana. Stwierdzono, że poszerzenie piku nie jest znaczące w przypadku stosowania otwartej cewki z dzianiny rurkowej 21 . Gdy rozszerzenie piku jest zbyt duże, można również rozważyć inne typy reaktorów 20,22. Mogą to być reaktory ze złożem lub segmentowe reaktory przepływowe. Reaktory te są szczególnie przydatne w przypadku powolnych reakcji, które w przeciwnym razie wymagałyby dużych pętli reakcyjnych. Ponieważ niesegmentowe reaktory rurowe są najczęstszymi typami reaktorów stosowanych w zastosowaniach PCD, pozostała część tego artykułu dotyczy tego typu konfiguracji reaktorów.
Konstrukcja kolumny przepływu reakcyjnego (RF) zawiera wieloportową końcówkę, która umożliwia fazę ruchomą wyjście (lub wejście) do kolumny przez pojedynczy port znajdujący się w promieniowym centralnym obszarze kolumny lub trzy porty znajdujące się w obszarze zewnętrznej ściany kolumny (patrz Rysunek 3). Te dwa strumienie są oddzielone za pomocą złączki końcowej zawierającej centralną porowatą frytę, która jest otoczona nieprzepuszczalnym pierścieniem, który z kolei jest otoczony zewnętrzną porowatą frytą, która rozciąga się do ściany kolumny. Ze względu na centralny, nieprzepuszczalny pierścień, przepływ krzyżowy między dwoma porowatymi obszarami nie jest możliwy.
Podczas chromatografii przepływu reakcji, odczynniki do derywatyzacji są pompowane w kierunku przeciwnym do kierunku przepływu fazy ruchomej do jednego lub dwóch zewnętrznych portów kolumny przepływu reakcji. Eluent kolumnowy miesza się z odczynnikiem (odczynnikami) do derywatyzacji w frycie zewnętrznym i przekazuje do detektora przez wolny port zewnętrzny. Przepływ reakcji może być wykorzystany do derywatyzacji z pojedynczym odczynnikiem (1 port dla odczynnika do derywatyzacji, 1 port do przepuszczenia eluentu kolumnowego do detektora i 1 port zablokowany) lub do systemu podwójnego odczynnika (2 porty dla odczynników do derywatyzacji i 1 port do przepuszczenia eluentu kolumnowego do detektora). Przepływ ze strumienia centralnego może być wykorzystany do wykrycia niedostatecznie zawartościowanego eluentu kolumnowego, skutecznie multipleksując detekcję23, lub przekazany do odpadów.
Jedną z głównych technik dostrajania, która jest dostępna podczas przeprowadzania chromatografii RF-PCD, jest stosunek przepływu centralnego i obwodowego. Optymalny stosunek dla każdej derywatyzacji zależy od wielu czynników, takich jak to, czy centralny przepływ zostanie wykryty lub przekazany do odpadów. Dlatego po ustaleniu optymalnego stosunku należy upewnić się, że przed każdym uruchomieniem osiągnięto prawidłowy stosunek przepływu.
Stwierdzono, że użycie fryty do mieszania strumienia eluentu kolumnowego i odczynnika do derywatyzacji w RF-PCD skutkuje bardziej efektywnym mieszaniem w porównaniu z tradycyjnymi technikami mieszania, które zazwyczaj wykorzystują trójnik o zerowej objętości martwej lub kawałek W o niskiej objętości martwej do mieszania dwóch strumieni. Pozwoliło to na zastosowanie stosunkowo małych pętli reakcyjnych, a nawet na całkowite wyeliminowanie pętli reakcyjnej. Zmniejszenie rozmiaru pętli reakcyjnej skutkuje ostrzejszymi pikami w porównaniu z tradycyjnymi metodami derywatyzacji po kolumnie. Oznacza to, że pomimo faktu, że nie cały eluent kolumnowy jest derywatyzowany, obserwuje się większe stosunki sygnału do szumu, a tym samym można osiągnąć niższe granice wykrywalności i kwantyfikacji.
Chromatografia przepływu reakcji została opracowana w celu przezwyciężenia trudności z adaptacją reakcji PCD do nowoczesnych kolumn i systemów HPLC, szczególnie utraty wydajności spowodowanej poszerzeniem pasma spowodowanym dużymi objętościami martwymi po kolumnie, spowodowanymi potrzebą zastosowania pętli reakcyjnych o dużej objętości. Bardziej wydajne procesy mieszania w RF-PCD w porównaniu z konwencjonalnym PCD oznaczają, że można stosować mniejsze objętości pętli reakcyjnej, co prowadzi do wzrostu obserwowanej wydajności separacji. Co więcej, chromatografia RF-PCD wykazuje zarówno zwiększony sygnał, jak i zmniejszony szum w porównaniu z konwencjonalnymi technikami PCD, co skutkuje niższymi granicami wykrywalności i kwantyfikacji w porównaniu z konwencjonalnymi metodami PCD. Dodatkową zaletą RF-PCD w porównaniu z konwencjonalnymi metodami PCD jest możliwość monitorowania niedostatecznie wymywanego strumienia, który wymywa się z centralnego portu kolumny RF, a także strumienia derywatyzowanego, który wymywa się z peryferyjnego obszaru kolumny. RF-PCD jest stosunkowo nową, ale obiecującą techniką, która ma wiele zalet w porównaniu z tradycyjnymi metodami PCD.
Połączenie kolumny RF odbywa się prawie tak samo jak w przypadku konwencjonalnej kolumny HPLC, z tą różnicą, że główną różnicą jest liczba końcówek kolumny RF. Łączniki używane do łączenia standardowej kolumny HPLC z systemem HPLC mogą być używane do łączenia kolumny RF z systemem HPLC.

<table><tbody><tr><td>Przyrząd HPLC</td><td>Agilent</td><td>1290 Series HPLC</td><td></td></tr><tr><td>Dodatkowa pompa (pompy) do systemu derywatyzacji</td><td>Kolumna</td><td></td> Shimadzu LC-20A <td></td></tr><tr><td>RF</td><td>Niekomercyjne</td>rurki PEEK Sigma Aldrich Z227307 Ograniczniki kolumn Wyposażony w kolumnę Obcinak do rur PEEK Sigma <td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td> Waga analityczna Aldrich</td><td>Z290882</td><td></td></tr><tr><td>4-punktowa</td><td></td><td></td><td>waga analityczna</td></tr><tr><td>Stoper</td><td></td><td></td><td>Sprzęt nienaukowy</td></tr><tr><td>Fiolki do zbierania eluentów</td><td></td><td></td><td>Wystarczy dowolna mała fiolka z płaskim dnem, np. , fiolki HPLC Fiolki</td></tr><tr><td></td><td></td><td>HPLC</td><td>Zależy od użytego</td></tr> <tr><td>instrumentuNaczynia do fazy ruchomej i roztworu(ów) do derywatyzacjiSigma</td> <td>Aldrich</td><td>Z232211</td><td></td></tr><tr><td>General Laboratory Szkło</td><td></td><td></td><td>Kolby miarowe, pipety, etc. Ilość i objętość będą zależeć od metody przygotowania próbki.</td></tr><tr><td>Metanol</td><td>Sigma Aldrich</td><td>34860</td><td></td></tr><tr><td>DPPH</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D9132</td><td></td></tr><tr><td>Octan amonu</td><td>Sigma Aldrich</td><td>17836</td><td></td></tr><tr><td>Amoniak</td><td>Sigma Aldrich</td><td>320145</td><td></td></tr><tr><td>acetonitryl</td><td>Sigma Aldrich</td><td>34998</td><td></td></tr><tr><td>Fluorescamine</td><td>Sigma Aldrich</td><td>F9015</td><td></td></tr><tr><td>4- Aminoantypiren&nbsp;</td><td>Acros Organics BVBA</td><td>AC103151000</td><td></td></tr><tr><td>Żelazocyjanek potasu&nbsp;</td><td>AnalaR</td><td>B10204-30</td><td></td></tr></tbody></table> powiedział:

derywatyzacja po kolumnie przy użyciu wysokosprawnych kolumn do chromatografii cieczowej z przepływem reakcji

Post Column Derivatization Using Reaction Flow High Performance Liquid Chromatography Columns

Przedstawiono protokół użycia wysokosprawnych kolumn do chromatografii cieczowej z przepływem reakcji dla metod wykorzystujących derywatyzację po kolumnie (PCD). Główną trudnością w dostosowaniu PCD do nowoczesnych systemów i kolumn HPLC jest potrzeba stosowania cewek reakcyjnych o dużej objętości, które umożliwiają mieszanie odczynników, a następnie zachodzi reakcja derywatyzacji. Ta duża objętość martwa po kolumnie prowadzi do poszerzenia pasma, co skutkuje utratą obserwowanej skuteczności separacji, a nawet czułości wykrywania. W przepływie reakcji po derywatyzacji kolumnowej (RF-PCD) odczynniki do derywatyzacji są pompowane w kierunku przeciwnym do przepływu fazy ruchomej do jednego lub dwóch zewnętrznych portów kolumny przepływu reakcyjnego, gdzie mieszają się ze ściekami z kolumny wewnątrz fryty umieszczonej w łączniku końcowym kolumny. Technika ta pozwala na bardziej efektywne mieszanie ścieków z kolumny i odczynników do derywatyzacji, co oznacza, że objętość pętli reakcyjnych może zostać zminimalizowana lub nawet całkowicie wyeliminowana. Stwierdzono, że metody RF-PCD działają lepiej niż konwencjonalne metody PCD pod względem obserwowanej skuteczności separacji i stosunku sygnału do szumu. Kolejną zaletą technik RF-PCD jest możliwość monitorowania ścieków pochodzących z portu centralnego w stanie niedosytowym. RF-PCD jest obecnie testowany w stosunkowo niewielkim zakresie reakcji po kolumnie, jednak obecnie nie ma powodu, aby sugerować, że RF-PCD nie może być dostosowany do żadnej istniejącej jedno- lub dwuskładnikowej (o ile oba odczynniki są dodawane w tym samym czasie) reakcji derywatyzacji po kolumnie.

Pierwszą metodą PCD, która została zaadaptowana do zastosowania w RF-PCD, była derywatyzacja przeciwutleniaczy z wykorzystaniem rodnika 2,2-difenylo-1-pikrylohydrazylu (DPPH•)24. Reakcja ta została wprowadzona przez Kolevę et al.25 i od tego czasu jest powszechnie stosowana. Detekcja opiera się na odbarwianiu rodnika DPPH• w obecności reaktywnych form tlenu, w związku z czym obecność przeciwutleniaczy skutkuje spadkiem obserwowanej absorbancji. W reakcji z DPPH•</...

Przedstawiono protokół użycia wysokosprawnych kolumn do chromatografii cieczowej z przepływem reakcji dla metod wykorzystujących derywatyzację po kolumnie (PCD).

Derywatyzacja po kolumnie przy użyciu wysokosprawnych kolumn do chromatografii cieczowej z przepływem reakcji

A protocol for the use of reaction flow high performance liquid chromatography columns for methods employing post column derivatization (PCD) is ...

Ogólnym celem tej metody jest zwiększenie wydajności i czułości wysokosprawnej chromatografii cieczowej z pochodniowaniem po kolumnie (metoda PCD) poprzez zastosowanie kolumny przepływowej do reakcji. Metoda ta może pomóc w odpowiedzi na kluczowe pytania w takich dziedzinach jak nauki farmaceutyczne, biomedyczne i środowiskowe, w których analizowane są związki wykazujące słabą odpowiedź w detektorach HPLC. Główną zaletą tej techniki jest brak konieczności stosowania cewek reakcyjnych.Ponieważ mieszanie eluatu z kolumny z odczynnikiem pochodnującym przebiega efektywniej niż w metodach konwencjonalnych, metoda ta była stosowana do analizy przeciwutleniaczy, aminokwasów oraz fenoli. Może ona zostać zastosowana również do innych klas związków, takich jak tirole, metale, antybiotyki i toksyny.Mimo że cała próbka nie zostaje poddana derywatyzacji, dzięki mniejszemu poszerzeniu pasm stężenie analitycznego w strumieniu eluentu jest wyższe niż w konwencjonalnej analizie z derywatyzacją pokolumnową. Aby rozpocząć tę procedurę, przygotować aparat HPLC z 100% wodą w linii A i 100% metanolem w linii B jako fazą ruchomą, przepłukując pompy zgodnie z wymaganiami producenta. Skonfigurować komponenty aparatu HPLC oraz dodatkową pompę do derywatyzacji.Następnie ustaw detektor UV/VIS na analizę przy długości fali 520 nanometrów. Podłącz wlot kolumny przepływowej reakcyjnej (RF) do urządzenia HPLC. Podłącz port peryferyjny wylotowy do detektora UV/VIS, używając rurki o długości 15 centymetrów i średnicy wewnętrznej 0,13 milimetra.Następnie podłącz linię pompy DPPH do portu peryferyjnego na wylocie kolumny RF. Nieużywany port peryferyjny na wylocie kolumny RF zablokuj za pomocą stopra do kolumny. Do centralnego portu wylotowego kolumny RF podłącz odcinek kapilary o długości 15 centymetrów i średnicy wewnętrznej 0,13 milimetra.Ustaw szybkość przepływu pompy HPLC na 1 mm/min przy użyciu 100% metanolu. Następnie równoważ kolumnę 100% metanolem przez 10 minut. W tym czasie przygotuj roztwór DPPH w metanolu o stężeniu 0,1 mg/mL.Próbówkę zawierającą odczynnik DPPH poddać sonikacji przez 10 minut. Przepłukać pompę DPPH przygotowanym odczynnikiem DPPH zgodnie z wymaganiami producenta. Następnie przygotować dwa suche i czyste naczynia, jedno z nich opisując jako „centralne”, a drugie jako „obwodowe”. Dokładnie zważyć oba naczynia.Zbierz effluent wypływający z portu centralnego do naczynia oznaczonego jako „central” przez jedną minutę. Po ponownym zważeniu naczynia portu centralnego oblicz masę przepływu z portu centralnego. Powtórz poprzednie kroki dla effluentu wypływającego z detektora UV/VIS, który jest podłączony do portu peryferyjnego kolumny RF.Oblicz wagę naczynia portu peryferyjnego. Następnie oblicz procent przepływu pochodzącego z portów centralnego i peryferyjnego. Powtarzaj poprzednie kroki, aż stosunek przepływów będzie prawidłowy, a następnie ustaw prędkość przepływu pompy DPPH na 0,5 milliliters per minute.Po zakończeniu pomiaru należy zatrzymać przepływ pompy z odczynnikiem do derywatyzacji. Wyjąć linię pompy z odczynnikiem DPPH z portu peryferyjnego i zamknąć port korkiem. Równoważyć kolumnę fazą ruchomą, w której będzie przechowywana, dopuszczając przepływ fazy ruchomej przez kolumnę z prędkością 1 mm/min przez 10 minut.Następnie zatrzymaj przepływ pompy fazy pęcherzykowej w urządzeniu HPLC. Na koniec zastąp odczynnik DPPH metanolem i przepłucz dodatkową pompę. Przedstawiono tutaj dwa chromatogramy próbki kawy ristretto, poddanej derywatyzacji rodnikiem DPPH przy użyciu konwencjonalnego detektora PCD oraz urządzenia RF-PCD.Obliczone granice oznaczalności i wykrywalności dla każdego z analizowanych aminokwasów w trybach RF-PCD oraz konwencjonalnym PCD są tutaj wymienione. Przedstawiono chromatogram czterech aminokwasów analizowanych przy użyciu konwencjonalnej metody PCD, metody RF-PCD oraz strumienia bez pochodnych z metody RF-PCD. Tutaj wyświetlono porównanie sygnałów uzyskanych dla pików glicyny i leucyny z zastosowaniem zarówno konwencjonalnej metody PCD, jak i metody RF-PCD.Przedstawiono tutaj porównanie szerokości piku tryptofanu podczas analizy z zastosowaniem konwencjonalnej metody PCD, metody RF-PCD oraz niepochodnejzowanej próbki z metody RF-PCD. Próbka testowa składająca się z 21 komponentów, zawierająca składniki reagujące i niereagujące na schemat pochodnowzowania, została poddana rozdzieleniu, pochodnowzowaniu i detekcji. Ta sama mieszanina została również rozdzielona i wykryta bez pochodnowzowania w celu porównania.Przedstawiono tutaj porównanie kształtu piku para-Krezolu, zarówno w wersji zderywatyzowanej przy użyciu kolumny RF-PCD, jak i bez derywatyzacji. Po opanowaniu ta technika może zostać skonfigurowana w tym samym czasie, co konwencjonalna analiza z derywatyzacją po kolumnie. Podczas wykonywania tej procedury należy pamiętać o zachowaniu proporcji przepływu jak najbliższych wartościom zalecanym.Zgodnie z tą procedurą, do analizy innych związków można zastosować pozostałe odczynniki do derywatyzacji po kolumnie, takie jak OPA, ninhydryna lub halogeny. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo wiedzieć, jak skonfigurować i dostroić kolumnę przepływową do reakcji.

post-column-derivatization-using-reaction-flow-high-performance

Research

JoVE Journal

Chemistry

Chemia

Tutaj prezentujemy protokół do działania i optymalizacji kolumny Active Flow Technology (AFT) w trybie Curtain flow (CF) dla zwiększenia wydajności separacji.

Kolumna z przepływem kurtyny: optymalizacja wydajności i czułości

Tutaj prezentujemy protokół dla zoptymalizowanej procedury pakowania kolumn kapilarnych FlashPack. Zastosowanie zoptymalizowanego protokołu do powszechnej konfiguracji bomby ciśnieniowej 100 bar pozwala na 10-krotnie szybsze pakowanie i produkcję długich, ultra wysokowydajnych kolumn kapilarnych.

Prosta, wewnętrzna, ultra-wydajna produkcja kolumn kapilarnych dzięki podejściu FlashPack

Profilowanie metabolitów nieukierunkowanych za pomocą ultra wydajnej chromatografii cieczowej w połączeniu ze spektrometrią mas (UPLC-MS) jest potężną techniką badania metabolizmu.  W tym artykule przedstawiono typowy przepływ pracy wykorzystywany do nieukierunkowanego profilowania metabolitów w surowicy, w tym organizację i przygotowanie próbki, pozyskiwanie danych, analizę danych, kontrolę jakości i identyfikację metabolitów.

Wielkoskalowe, nieukierunkowane profilowanie metabolomiczne surowicy za pomocą ultrasprawnej chromatografii cieczowej ze spektrometrią mas (UPLC-MS)

Nieukierunkowana metabolomika dostarcza hipotezy generującej migawkę profilu metabolicznego.  Protokół ten zademonstruje ekstrakcję i analizę metabolitów z komórek, surowicy lub tkanki.  Szereg metabolitów jest badany za pomocą ekstrakcji ciecz-faza cieczowa, ultraprzepływowej chromatografii cieczowej/spektrometrii mas o wysokiej rozdzielczości (UPLC-HRMS) w połączeniu z oprogramowaniem do analizy różnicowej.

Nieukierunkowana metabolomika ze źródeł biologicznych przy użyciu ultrasprawnej chromatografii cieczowej ze spektrometrią mas o wysokiej rozdzielczości (UPLC-HRMS)

Bakteryjna ściana komórkowa składa się z peptydoglikanu, makromolekularnej sieci nici cukrowych połączonych peptydami. Ultrasprawna chromatografia cieczowa zapewnia wysoką rozdzielczość i przepustowość dla nowatorskich odkryć składu peptydoglikanu. Przedstawiamy procedurę izolacji ścian komórkowych (woreczków) i ich późniejszego przygotowania do analizy za pomocą UPLC.

Izolacja i przygotowanie ścian komórkowych bakterii do analizy składu metodą ultra sprawnej chromatografii cieczowej

Tutaj prezentujemy protokół działania i dostrajania kolumn chromatografii przepływowej z równoległymi segmentami, aby umożliwić detekcję multipleksowaną.

Dostrajanie kolumny przepływu z równoległymi segmentami i włączanie detekcji multipleksowej

Fosfoinozydy to lipidy sygnalizacyjne, których względna obfitość szybko zmienia się w odpowiedzi na różne bodźce. W artykule opisano metodę pomiaru obfitości fosfoinozytydów poprzez metaboliczne znakowanie komórek 3 H-mio-inozytolem, a następnie ekstrakcję i deacylację. Wyekstrahowane glicero-inozytydy są następnie rozdzielane za pomocą wysokosprawnej chromatografii cieczowej i oznaczane ilościowo przez scyntylację przepływową.

Znakowanie radioaktywne i oznaczanie ilościowe poziomów komórkowych fosfoinozytydów za pomocą wysokosprawnej chromatografii cieczowej sprzężonej z przepływem

Przedstawiono nowatorską metodologię syntezy i programowania elastomerów ciekłokrystalicznych w łańcuchu głównym przy użyciu dostępnych na rynku monomerów wyjściowych. Szeroki zakres właściwości termomechanicznych został dostosowany poprzez dostosowanie ilości środka sieciującego, podczas gdy wydajność uruchamiania zależała od wielkości zastosowanego naprężenia podczas programowania.

Synteza programowalnych elastomerów ciekłokrystalicznych w łańcuchu głównym z wykorzystaniem dwuetapowej reakcji tiolowo-akrylowej

Tutaj opisujemy bardzo szczegółowo sprawdzony i solidny protokół ekstrakcji glukozynolanów z mielonych materiałów roślinnych. Po zastosowaniu sulfatazy w kolumnie ekstraktów, desulfoglucozynolany są eluowane i analizowane za pomocą wysokociśnieniowej chromatografii cieczowej.

Prosta metoda ekstrakcji i analizy glukozynolanu za pomocą wysokociśnieniowej chromatografii cieczowej (HPLC)

Prezentujemy wygodną ekstrakcję do fazy stałej w połączeniu z wysokociśnieniową chromatografią cieczową (HPLC) z detekcją elektrochemiczną (ECD) do jednoczesnego oznaczania trzech neuroprzekaźników monoaminowych i dwóch ich metabolitów w moczu niemowląt. Identyfikujemy również metabolit MHPG jako potencjalny biomarker do wczesnej diagnostyki uszkodzeń mózgu u niemowląt.

Wygodna metoda ekstrakcji i analizy za pomocą wysokociśnieniowej chromatografii cieczowej neuroprzekaźników katecholaminy i ich metabolitów

Poznaj metodę derywatyzacji po kolumnie HPLC z wykorzystaniem kolumn reakcyjnych flow. Technika eliminuje cewki reakcyjne, zwiększając wykrywalność związków o niskiej odpowiedzi detektora w naukach farmaceutycznych, biomedycznych i środowiskowych.

Derywatyzacja po kolumnie przy użyciu wysokosprawnych kolumn do chromatografii cieczowej z przepływem reakcji

Przeglądaj więcej filmów