Derywatyzacja po kolumnie przy użyciu wysokosprawnych kolumn do chromatografii cieczowej z przepływem reakcji
April 26th, 2016
Przedstawiono protokół użycia wysokosprawnych kolumn do chromatografii cieczowej z przepływem reakcji dla metod wykorzystujących derywatyzację po kolumnie (PCD).
Ogólnym celem tej metody jest poprawa wydajności i czułości wysokosprawnej chromatografii cieczowej po derywatyzacji kolumnowej lub metody PCD poprzez zastosowanie kolumny przepływowej reakcji. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinach takich jak farmacja, biomedycyna i nauki o środowisku, gdzie analizowane są związki o niskiej odpowiedzi na detektory HPLC. Główną zaletą tej techniki jest to, że nie są potrzebne cewki reakcyjne.
Ponieważ mieszanie odczynnika odpływającego z kolumny i odczynnika derywatyzującego zachodzi bardziej efektywnie niż metody konwencjonalne. Ta metoda została wykorzystana do zapewnienia wglądu w przeciwutleniacze, aminokwasy i fenole. Może być również stosowany do związków innych klas, takich jak tiole, metale, antybiotyki i toksyny.
Chociaż cała próbka nie jest derywatyzowana, ze względu na mniejsze poszerzenie pasma, stężenie analitu w strumieniu przepływu ścieków jest wyższe niż w konwencjonalnej analizie derywatyzacji po kolumnie. Aby rozpocząć tę procedurę, należy przygotować przyrząd HPLC ze 100% wodą na linii A i 100% metanolem na linii B jako fazą ruchomą, przedmuchując pompy zgodnie z wymaganiami producenta. Ustawić komponenty instrumentalne HPLC i dodatkową pompę do derywatyzacji.
Następnie ustaw detektor UV/VIS na analizę na długości fali 520 nanometrów. Podłącz wlot kolumny przepływu reakcyjnego lub RF do przyrządu HPLC. Podłącz wylotowy port peryferyjny do detektora UV/VIS za pomocą rurki o długości 15 centymetrów i średnicy wewnętrznej 0.13 milimetra.
Następnie podłącz przewód pompy DPPH do portu peryferyjnego na wylocie kolumny RF. Zablokuj nieużywany port peryferyjny na wylocie kolumny RF za pomocą ogranicznika kolumny. Podłącz rurkę o długości 15 centymetrów i średnicy wewnętrznej 0.13 milimetra do centralnego portu wylotowego kolumny RF.
Doprowadzić natężenie przepływu pompy HPLC do jednego milimetra na minutę przy 100% metanolu. Następnie równoważyć kolumnę ze 100% metanolem przez 10 minut. W tym momencie przygotuj 0,1 miligrama na mililitr roztworu DPPH i metanolu.
Sonikować kolbę zawierającą odczynnik DPPH przez 10 minut. Przedmuchnąć pompę DPPH przygotowanym odczynnikiem DPPH zgodnie z wymaganiami producenta. Następnie weź dwa suche i czyste naczynia i oznacz jedno jako środkowe"a drugie jako peryferyjne"Dokładnie zważ oba naczynia.
Zbieraj ścieki wychodzące z portu centralnego do naczynia oznaczonego jako "central" przez jedną minutę. Po ponownym zważeniu centralnego statku portowego należy obliczyć masę przepływu z portu centralnego. Powtórz poprzednie kroki dla ścieków wychodzących z UV/VIS, który jest podłączony do portu peryferyjnego kolumny RF.
Obliczyć masę statku z portem peryferyjnym. Następnie oblicz procent przepływu pochodzącego z portów centralnych i peryferyjnych. Powtarzaj poprzednie kroki, aż stosunek przepływu będzie prawidłowy, a następnie ustaw natężenie przepływu pompy DPPH na 0,5 mililitra na minutę.
Po zakończeniu przebiegu zatrzymaj przepływ pompy odczynnika do derywatyzacji. Odłącz przewód pompy odczynnika DPPH od portu peryferyjnego i zakorkuj port. Zrównoważyć kolumnę z fazą ruchomą, w której ma być przechowywana, pozwalając fazie ruchomej przechodzić przez kolumnę z prędkością jednego milimetra na minutę przez 10 minut.
Następnie zatrzymaj przepływ pompy fazy bąbelkowej w przyrządzie HPLC. Na koniec zastąp odczynnik DPPH metanolem i oczyść dodatkową pompę. Pokazano tutaj dwa chromatogramy próbki kawy ristretto, derywatyzowanej rodnikiem DPPH przy użyciu zarówno konwencjonalnego oprzyrządowania PCD, jak i RF-PCD.
Obliczone granice oznaczalności i wykrywania dla każdego z aminokwasów analizowanych zarówno w trybie RF-PCD, jak i konwencjonalnym PCD są wymienione tutaj. Przedstawiono chromatogram czterech aminokwasów analizowanych konwencjonalną metodą PCD, metodą RF-PCD oraz niederywatyzowanego strumienia z metody RF-PCD. Przedstawiono tutaj porównanie sygnałów uzyskanych dla pików spowodowanych glicyną i leucyną przy użyciu zarówno konwencjonalnych metod PCD, jak i RF-PCD.
Przedstawiono porównanie szerokości piku tryptofanu podczas analizy przy użyciu konwencjonalnej metody PCD, metody RF-PCD oraz strumienia niederywatyzowanego z metody RF-PCD. 21-składnikowa próbka testowa, która zawierała niektóre składniki, które wykazują reakcję na schemat derywatyzacji, a niektóre, które tego nie robią, zostały oddzielone, derywatyzowane i wykryte. Ta sama mieszanina została również oddzielona i wykryta jako niederywatyzowana dla porównania.
Przedstawiono tutaj porównanie kształtu piku para-krezolu, zarówno derywatyzowanego przy użyciu kolumny RF-PCD, jak i niederywatyzowanego. Po opanowaniu technikę tę można skonfigurować w tym samym czasie, co konwencjonalną analizę derywatyzacji po kolumnie. Podczas wykonywania tej procedury należy pamiętać, aby być jak najbardziej zbliżonym do zalecanych proporcji przepływu.
Zgodnie z tą procedurą można użyć innych odczynników do derywatyzacji po kolumnie, takich jak OPA, ninhydryna lub halogeny w celu analizy innych związków. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś mieć dobry pomysł, jak skonfigurować i dostroić kolumnę przepływu reakcji.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Przegląd
Ten artykuł przedstawia protokół poprawy wydajności i czułości chromatografii cieczowej wysokiej efektywności (HPLC) po kolumnie pochodnych (PCD) z wykorzystaniem kolumn z przepływem reakcji. Ta metoda jest szczególnie przydatna w analizie związków o niskich odpowiedziach dla detektorów HPLC w różnych dziedzinach nauki.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Nauki farmaceutyczne
- Nauki biomedyczne
- Nauki środowiskowe
Tło
- Chromatografia cieczowa wysokiej efektywności jest szeroko stosowana do analizy związków.
- Po kolumnie pochodne poprawiają czułość wykrywania.
- Konwencjonalne metody często wymagają zwojów reakcyjnych, które ta metoda eliminuje.
- Osiąga się efektywne mieszanie wypływu kolumny i odczynników.
Cel badania
- Poprawa wydajności metod HPLC PCD.
- Analiza związków o niskich odpowiedziach detektorów.
- Dostarczenie wglądu w różne klasy związków.
Zastosowane metody
- Zastosowanie kolumn chromatografii cieczowej wysokiej efektywności z przepływem reakcji.
- Techniki po kolumnie pochodnych.
- Analiza przeciutleniaczow, aminokwasów i fenoli.
- Zastosowanie do tioli, metali, antybiotyków i toksyn.
Główne wyniki
- Poprawiona wydajność i czułość w wykrywaniu związków.
- Eliminacja zwojów reakcyjnych poprawia wydajność metody.
- Skuteczna aplikacja na różne klasy związków.
- Wgląd w złożone interakcje biochemiczne.
Wnioski
- Metoda kolumny z przepływem reakcji znacząco poprawia HPLC PCD.
- Ta technika jest wszechstronna dla różnych zastosowań naukowych.
- Przyszłe badania mogą rozszerzyć jej zastosowanie w innych dziedzinach analitycznych.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
Post column derivatization (PCD) enhances detection sensitivity for low-response analytes in pharmaceutical and biomedical research, but conventional methods suffer from band broadening due to large reaction coils. Reaction flow PCD (RF-PCD) eliminates this limitation by enabling efficient mixing within the column, improving separation efficiency and signal-to-noise ratio. This advancement supports reliable quantification of compounds such as amino acids, antioxidants, and phenols, directly impacting assay sensitivity in early discovery workflows.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables detection of underivatized analytes from the central port, allowing parallel monitoring of native and modified species for mechanistic insight.
- Operational Value: Eliminates reaction coils, reducing system dead volume and minimizing band broadening to preserve chromatographic resolution.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Improves signal-to-noise ratio for low-abundance compounds, enhancing detection limits in antioxidant, amino acid, and phenol assays.
- Operational Value: Uses standard HPLC components with a derivatization pump, enabling straightforward integration into existing analytical platforms.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Supports analysis of diverse compound classes including thiols, metals, antibiotics, and toxins, broadening applicability across safety and metabolite profiling studies.
- Operational Value: Maintains compatibility with UV/VIS detection at 520 nm, allowing seamless adoption without requiring new instrumentation.
Pipeline & Workflow Integration
RF-PCD fits within the discovery continuum by improving detection reliability in early-stage screening, where sensitive quantification of bioactive compounds informs lead identification and prioritization.
- Discovery Biology: Enhances confidence in detecting low-response metabolites and biomarkers by improving analytical sensitivity without derivatization inefficiencies.
- Screening: Delivers quantitative, reproducible outputs through minimized reaction volume and efficient mixing, supporting high-throughput compound evaluation.
- Analytics: Enables direct comparison of derivatized and underivatized streams, providing internal controls for assay validation and data normalization.
- Translational Research: Facilitates continuous monitoring of analytes from discovery through preclinical studies by preserving analyte integrity and detection fidelity.
- Enterprise Reuse: Leverages existing HPLC infrastructure with minimal added complexity, promoting cross-departmental standardization and method portability.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in analyte detection by reducing false negatives from insensitivity and improving signal clarity.
- Operational Value: Improves reproducibility and scalability by removing variability associated with reaction coil preparation and mixing efficiency.
- Strategic Value: Supports better go/no-go decisions in lead optimization by delivering more accurate structure-activity relationship data from sensitive detection.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted advancement of candidates by improving data quality in early ADME and toxicity screening assays.
Implementation Considerations
- Requires expertise in HPLC method development and flow rate optimization to balance derivatization reagent and mobile phase flows.
- Needs a dedicated derivatization pump and compatible tubing (0.13 mm ID) for precise reagent delivery to peripheral ports.
- Demands standardization of flow ratios between central and peripheral ports to ensure consistent derivatization efficiency across runs.
- Involves routine maintenance such as purging and equilibration steps to prevent reagent carryover and ensure column stability.
- Limited to one- or two-component derivatization reactions where both reagents can be introduced simultaneously via peripheral ports.
