Name: Profilowanie ekspresji genów zakażonych drobnoustrojów za pomocą cyfrowej platformy kodów kreskowych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-01-13T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 13 s
Description: Poznaj metodę profilowania ekspresji genów patogenów in vivo przy użyciu cyfrowej platformy kodów kreskowych. Technika ta umożliwia badanie dynamiki ekspresji genów C. albicans w tkankach zakażonych myszy.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Ta praca była częściowo wspierana przez granty NIH R21 DE023311 (APM), R56 AI111836 (APM & SGF), R01 AI054928 (SGF) i R01 DE017088 (SGF).

Wszystkie procedury dla zwierząt zostały zatwierdzone przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt w Instytucie Badań Biomedycznych w Los Angeles (protokół 011000) i przeprowadzone zgodnie z wytycznymi National Institutes of Health (NIH) dotyczącymi etycznego traktowania zwierząt. Myszy trzymano w klatkach w akredytowanym przez AAALAC ośrodku znajdującym się na terenie kampusu Instytutu Badań i Edukacji Harbor-UCLA. Opiekę nad nimi sprawował pełnoetatowy lekarz weterynarii specjalizujący się w medycynie zwierząt laboratoryjnych. Trzymanie w klatkach i hodowla odbywały się zgodnie z wytycznymi zawartymi w publikacji amerykańskiej publicznej służby zdrowia "Przewodnik po opiece i użytkowaniu zwierząt laboratoryjnych". Dołożono wszelkich starań, aby traktować myszy w sposób humanitarny. Przeżywalność i stan zdrowia myszy monitorowano trzy razy dziennie. Oczywiście chore, ospałe myszy zostały oddzielone od grupy i poddane eutanazji, aby zminimalizować cierpienie. Myszy zostały poddane eutanazji przez przedawkowanie pentobarbitalu (210 mg/kg), zgodnie z zaleceniami Panelu ds. Eutanazji Amerykańskiego Towarzystwa Lekarzy Weterynaryjnych.
1. Przygotowanie tkanek, odczynników i narzędzi
<ol>
	<li>Do wszystkich badań należy używać samców myszy Balb/c o wadze 20-22 g. Zaszczep dożylnie trzy myszy na grupę eksperymentalną komórkami C. albicans 1 x 106 fazy drożdżowej. Składaj zwierzęta w ofierze i pobieraj nerki w określonych punktach czasowych po zakażeniu. Umieść każdą nerkę w probówce z nakrętką, zamroź błyskawicznie w ciekłym azocie i przechowuj w temperaturze -80 °C do późniejszej ekstrakcji RNA6, 
	Uwaga: Doświadczenia na zwierzętach przeprowadzono zgodnie ze szczegółowym opisem w Xu i wsp.Lokal mieszkalny</li>
	<li>Przed wyjęciem nerek z zamrażarki w temperaturze -80 °C należy przygotować następujące odczynniki i narzędzia:
	<ol>
		<li>Otwórz zestaw do ekstrakcji całkowitego RNA. Dodać 2-merkaptoetanol (1% v/v) do buforu RLT i dobrze wymieszać (przygotować 2 ml na każdą próbkę).</li>
		<li>Przygotować fenol : chloroform : alkohol izoamylowy 25:24:1 (potrzeba 600 μl na każdą próbkę).</li>
		<li>Oznaczyć probówki homogenizacyjne typu M (rurka M) i schłodzić na lodzie.</li>
		<li>Oznacz probówki z nakrętką o pojemności 2 ml i dodaj około 300 μl kulek cyrkonu do każdej probówki.</li>
		<li>Dostępne są przyrządy do sprawdzania: dysocjator tkanek, bijak do kulek, wirówka stołowa z adapterami do probówek 50 ml i płytek 96-dołkowych, fotometr.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Ekstrakcja RNA z zakażonych tkanek 
<ol>
	<li>Wyjąć probówki z nerkami z zamrażarki o temperaturze -80 °C i umieścić na lodzie. Dodać 1,2 ml buforu RLT z 2-merkaptoetanolem do każdej nerki. Zdekantować nerkę z buforem do probówek homogenizacyjnych typu M.</li>
	<li>Homogenizować nerkę za pomocą dysocjatora tkankowego przy wstępnie załadowanym ustawieniu RNA_02.01.</li>
	<li>Wirować przy 1 000 x g przez 1 minutę w wirówce stołowej w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Przenieść 600 μl homogenatu do rurki z nakrętką zawierającą kulki cyrkonu. Zachowaj pozostały homogenat na lodzie.</li>
	<li>Dodać 600 μl fenolu : chloroform : alkohol izoamylowy 25:24:1 do probówek z poprzedniego kroku.</li>
	<li>Zamknij szczelnie pokrywki i wiruj na ubijaku przez 3 minuty w chłodni o temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Odwirować probówki o stężeniu 15 000 x g przez 5 minut w chłodni o temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Ostrożnie przenieś fazę wodną do nowej probówki do mikrofugi o pojemności 1,5 ml, dobrze wymieszaj z równą objętością 70% etanolu, a następnie załaduj na kolumnę wirową (załaduj dwukrotnie).</li>
	<li>Przemyć kolumnę wirową raz buforem RW o pojemności 700 μl, a następnie dwukrotnie buforem RPE o pojemności 500 μl. Odwirować jedną dodatkową minutę w suchej probówce, aby usunąć pozostałą ciecz z kolumny wirowej. Wykonaj wszystkie etapy wirowania przy 8 000 x g.</li>
	<li>Elute RNA za pomocą 50 μl H2O. Zmierzyć stężenie RNA przy OD260 za pomocą spektrofotometru.</li>
</ol>
3. Profilowanie ekspresji genów za pomocą cyfrowego kodu kreskowego
<ol>
	<li>Zestaw kodów rozmrażania reportera (zielona rurka nasadkowa) i zestaw kodów przechwytywania (szara rurka nasadkowa) na lodzie.</li>
	<li>Dodaj 130 μl buforu hybrydyzacyjnego do zestawu kodów reportera, odwróć, aby wymieszać i odwirować.</li>
	<li>Dodać 20 μl mieszanki do każdej z 12 probówek reakcyjnych.</li>
	<li>Dodać 10 μg całkowitego tkankowego RNA (w objętości 5 μl) do każdej probówki. Wymieszać pipetując.</li>
	<li>Dodaj zestaw kodów przechwytywania 5 μl do każdej probówki. Wymieszaj, obracając rurkę, a następnie szybko odwiruj.</li>
	<li>Inkubować reakcje w temperaturze 65 °C w termocyklerze z podgrzewaną pokrywką O/N (~18 godzin).</li>
	<li>Wyjąć jeden wkład z próbką w temperaturze -20 °C i pozostawić do ogrzania do temperatury pokojowej.</li>
	<li>Wyjąć dwie płytki z odczynnikiem z 4 °C i odwirować przy 670 x g przez 2 minuty w wirówce stołowej.</li>
	<li>Skonfiguruj stację przygotowawczą, postępując zgodnie z instrukcjami krok po kroku wyświetlanymi na ekranie, wybierz opcję wysokiej czułości.</li>
	<li>Usuń reakcje z termocyklera i natychmiast załaduj stację przygotowawczą. Wybierz, aby uruchomić program o wysokiej czułości (3 godziny).</li>
	<li>Po zakończeniu programu stacji przygotowawczej wyjmij wkład i uszczelnij tory przezroczystą taśmą. Nałóż olej mineralny na spód wkładu (tylko dla pierwszej generacji nCounter, późniejsze generacje nie wymagają tego kroku), a następnie załaduj wkład do analizatora cyfrowego.</li>
	<li>Skonfiguruj analizator cyfrowy, postępując zgodnie z instrukcjami krok po kroku wyświetlanymi na ekranie, wybierz opcję skanowania w wysokiej rozdzielczości.</li>
	<li>Wybierz opcję wysokiej rozdzielczości (600 pól), uruchom program skanowania (~4,5 godziny).</li>
	<li>Po zakończeniu programu skanowania pobierz wyniki (lub wybierz opcję otrzymywania wyników pocztą e-mail) i zaimportuj nieprzetworzone dane do oprogramowania producenta. Oprogramowanie automatycznie sprawdzi jakość danych i podniesie flagi, jeśli jakość danych wykracza poza normalny zakres. Wykonaj regulację techniczną za pomocą wbudowanej funkcji (opcjonalnie, postępuj zgodnie z instrukcjami w oprogramowaniu), a następnie wyeksportuj dane jako plik Excel.</li>
	<li>Znormalizuj dane przy użyciu jednej z następujących metod: całkowita liczba wszystkich genów w zestawie kodów; jeden lub kilka genów kontroli wewnętrznej; średnia geometryczna genów o wysokiej ekspresji (patrz dyskusja).</li>
	<li>Oblicz średnie wartości ekspresji dla każdego genu (jeśli eksperyment przeprowadzono w powtórzeniach lub trzech powtórzeniach), a następnie oblicz stosunek poziomów ekspresji między różnymi grupami eksperymentalnymi.</li>
	<li>(opcjonalnie) Analizuj i wizualizuj wyniki profilowania za pomocą funkcji wbudowanych w oprogramowanie nSolver lub program do klastrowania, taki jak MultiExperiment Viewer10.</li>
</ol>

<ol><li>Cairns, T., Minuzzi, F., Bignell, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+host-infecting+fungal+transcriptome%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+Microbiol+Lett%22%5BJournal%5D)">The host-infecting fungal transcriptome.</a> FEMS Microbiol Lett. 307 (1), 1-11 (2010).</li>
<li>Westermann, A. J., Gorski, S. A., Vogel, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dual+RNA-seq+of+pathogen+and+host%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Dual RNA-seq of pathogen and host.</a> Nat Rev Microbiol. 10 (9), 618-630 (2012).</li>
<li>Creecy, J. P., Conway, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+bacterial+transcriptomics+with+RNA-seq%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Quantitative bacterial transcriptomics with RNA-seq.</a> Curr Opin Microbiol. 23C, 133-140 (2015).</li>
<li>Geiss, G. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+multiplexed+measurement+of+gene+expression+with+color-coded+probe+pairs%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Direct multiplexed measurement of gene expression with color-coded probe pairs.</a> Nat Biotechnol. 26 (3), 317-325 (2008).</li>
<li>Malkov, V. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiplexed+measurements+of+gene+signatures+in+different+analytes+using+the+Nanostring+nCounter+Assay+System%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Res+Notes%22%5BJournal%5D)">Multiplexed measurements of gene signatures in different analytes using the Nanostring nCounter Assay System.</a> BMC Res Notes. 2, 80(2009).</li>
<li>Xu, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+and+Alliance+of+Regulatory+Pathways+in+C.+albicans+during+Mammalian+Infection%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biology%22%5BJournal%5D)">Activation and Alliance of Regulatory Pathways in C. albicans during Mammalian Infection.</a> PLoS Biology. 13, e1002076(2015).</li>
<li>O'Meara, T. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Cryptococcus+neoformans+Rim101+Transcription+Factor+Directly+Regulates+Genes+Required+for+Adaptation+to+the+Host%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">The Cryptococcus neoformans Rim101 Transcription Factor Directly Regulates Genes Required for Adaptation to the Host.</a> Mol Cell Biol. 34 (4), 673-684 (2014).</li>
<li>Cheng, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Profiling+of+Candida+albicans+Gene+Expression+During+Intra-Abdominal+Candidiasis+Identifies+Biologic+Processes+Involved+in+Pathogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Infect+Dis%22%5BJournal%5D)">Profiling of Candida albicans Gene Expression During Intra-Abdominal Candidiasis Identifies Biologic Processes Involved in Pathogenesis.</a> J Infect Dis. 208 (9), 1529-1537 (2013).</li>
<li>Fanning, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Divergent+Targets+of+Candida+albicans+Biofilm+Regulator+Bcr1+in+Vitro+and+In+Vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Eukaryot+Cell%22%5BJournal%5D)">Divergent Targets of Candida albicans Biofilm Regulator Bcr1 in Vitro and In Vivo.</a> Eukaryot Cell. 11 (7), 896-904 (2012).</li>
<li>Saeed, A. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TM4%3A+a+free%2C+open-source+system+for+microarray+data+management+and+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">TM4: a free, open-source system for microarray data management and analysis.</a> Biotechniques. 34 (2), 374-378 (2003).</li>
</ol>

Protokół ten został opracowany w laboratorium dr Aarona P. Mitchella na Uniwersytecie Carnegie Mellon. Publikacja tego manuskryptu jest sponsorowana przez NanoString Technologies.

Protokół ten został opracowany w celu optymalizacji profilowania transkrypcyjnego zakażonych drobnoustrojów przy użyciu platformy nanoString nCounter. Cała procedura, od pobrania tkanek do danych dotyczących odciągu, zajmuje mniej niż 48 godzin. Czas pracy wynosi około 4 godzin dla 12 próbek. Jedną z kluczowych zmiennych w tym protokole jest ilość buforu RLT dodawanego do tkanki na samym początku. Zbyt duża ilość buforu rozcieńczy homogenat i doprowadzi do obniżenia stężenia RNA, podczas gdy zbyt mała ilość buforu może prowadzić do powstania lepkich żeli po etapie ekstrakcji chloroformu fenolowego i nie pozostawić fazy wodnej do odzyskania RNA. Empirycznie wyznaczone optymalne objętości buforu RLT dla tkanek myszy (przy typowych rozmiarach) to: nerka (1,2 ml), język (1,0 ml) i płuca (2,0 ml). W przypadku patogenów mikrobiologicznych, zwłaszcza tych uprawianych w postaci nitkowatej, etap ubijania koralików pomaga rozbić grubą ścianę komórkową, aby w pełni uwolnić zawartość komórkową. Na etapie elucji, w celu zwiększenia końcowego stężenia RNA, eluat z pierwszej rundy można dodać z powrotem do kolumny i wymywać po raz drugi. Z jednej kolumny wirowej RNeasy można odzyskać około 100 μg całkowitego tkankowego RNA (~2 μg/μl x 50 μl). Jeśli potrzebna jest większa ilość RNA, można wykonać drugi preparat z pozostałego homogenatu tkankowego. Na wszelki wypadek nie wyrzucaj pozostałego homogenatu, dopóki nie zostanie zmierzone stężenie RNA.
W zależności od modelu infekcji, wielkości inokulum i szczepu patogenu, procent RNA patogenu w całkowitym RNA tkanki waha się od 0%-2% i zwykle mieści się w zakresie 0,05%-0,5%. Na przykład 10 μg całkowitego tkankowego RNA z nerki zakażonej C. albicans może wygenerować surową liczbę równą 10 ng czystego RNA C. albicans z hodowli in vitro (10 ng/10 μg = 0,1%). Ponieważ procent RNA patogenu w całkowitym tkankowym RNA różni się w szerokim zakresie, trudno jest określić ilość RNA patogenu w danej ilości całkowitego RNA. Aby uniknąć marnowania zestawu kodów (dla reakcji 250 genów x 192 koszt reakcji wynosi około 200 USD) na próbkach z RNA patogenu poniżej poziomu wykrywania, można przeprowadzić etap kontroli jakości RNA w celu określenia poziomu RNA patogenu w każdej próbce. Można to zrobić za pomocą Q-RTPCR lub małego zestawu kodów zawierającego kilka genów porządkowych.
Normalizacja za pomocą genów patogenów jest krytycznym krokiem, zanim profile ekspresji będą mogły być porównane między różnymi próbkami. Istnieją trzy powszechnie stosowane metody normalizacji. 1. Użyj całkowitej liczby wszystkich genów w zestawie kodów. 2. Użyj jednego lub kilku genów "sprzątania". 3. Użyj średniej geometrycznej (N-ty pierwiastek z iloczynu N liczb) genów o wysokiej ekspresji. W przypadku dużego zestawu kodowego (>100 genów) zawierającego losowo wybrane sondy, dobrym wyborem może być użycie całkowitej liczby do normalizacji, ponieważ całkowita liczba niepowiązanych genów może wiernie odzwierciedlać ilość wejściowego RNA. W przypadku małego zestawu kodowego (<100 genów) zawierającego sondy skoncentrowane na określonym procesie (takim jak wzrost strzępek, biorąc pod uwagę, że geny wzrostu strzępek mają tendencję do współregulacji), niezbędny jest wybór jednego lub kilku genów porządkowych jako kontroli normalizacji. TDH3, gen metaboliczny o silnej ekspresji, dobrze służył jako kontrola w wielu eksperymentach. Trzecia metoda jest hybrydą metody 1 i 2, z naciskiem na równy udział genów o wysokiej ekspresji.
Chociaż platforma nCounter nie obejmuje całego genomu, umożliwia ilościowe określenie poziomu ekspresji dla maksymalnie 800 genów w jednym teście. Dlatego wybór najbardziej pouczających genów do analizy ma kluczowe znaczenie dla powodzenia profilowania. Zastosowano dwa podejścia do wyboru sond. Pierwsze podejście jest "oparte na wiedzy". Informacje z opublikowanych danych dotyczących ekspresji i funkcji są kompilowane w celu zbadania genów, które mogą być interesujące dla obecnego badania, takich jak geny odpowiedzi środowiskowej6-9. Takie podejście umożliwia łatwe porównywanie danych profilowania in vivo z wieloma istniejącymi zestawami danych, zapewniając w ten sposób kontekst do interpretacji danych. Drugie podejście jest "oparte na eksploracji". Do badań wybiera się kategorię genów w genomie drobnoustrojów, taką jak wszystkie geny określające czynniki transkrypcyjne, kinazy lub białka ściany komórkowej. Podejście to pozwala na identyfikację nowych czynników wirulencji i odkrycie nowych zależności regulacyjnych w oparciu o dane z profilowania in vivo 6.

Dynamika ekspresji genów zawiera istotne informacje o tym, jak komórka reaguje na zmiany środowiskowe. W przypadku zakażonego drobnoustroju dane dotyczące ekspresji genów mogą dostarczyć klinicznie istotnych informacji na temat tego, w jaki sposób patogen przystosowuje się do środowiska infekcji i powoduje uszkodzenia gospodarza. W ciągu ostatnich dwóch dekad badania ekspresji genów, zarówno in vitro, jak i in vivo, przyniosły dużą ilość danych i stworzyły podstawy do zrozumienia biologii zakażeń1-3. Jednak obecne technologie profilowania, w tym mikromacierze i RNAseq, nie są optymalne do profilowania ekspresji genów patogenów podczas infekcji. RNA gospodarza stanowi przytłaczającą część (zwykle > 99%) całkowitego RNA wyizolowanego z zakażonych próbek tkanek. RNA gospodarza przyczynia się do wysokiego tła w mikromacierzach i dominuje w odczytach sekwencji z RNAseq. Izolacja komórek patogenu z zakażonej tkanki teoretycznie może pomóc we wzbogaceniu o RNA patogenu, ale stwarza dodatkowe problemy: wymaga dużych ilości zakażonej tkanki; procedura może być żmudna; a co najważniejsze, trudno jest zachować stan natywny lub integralność RNA podczas długotrwałego procesu. Aby uzyskać bardziej kompleksowe i dokładne dane na temat ekspresji genów patogenów podczas rzeczywistych infekcji, postanowiliśmy opracować protokół, który umożliwia wiarygodną i opłacalną kwantyfikację mniejszościowych gatunków RNA w mieszanej populacji RNA.
NanoString nCounter to niedawno opracowana platforma, która dokonuje bezpośredniego, multipleksowanego pomiaru ekspresji genów za pomocą cyfrowych par sond4, 5 z kodem kreskowym. Platforma ta ma poziom czułości porównywalny z QRT-PCR, ale nie wymaga amplifikacji enzymatycznej. Technologia nie obejmuje całego genomu, pozwala na wykrycie do 800 różnych genów w każdym teście. Dlatego tak ważne jest, aby wybrać geny informacyjne jako sondy do profilowania. Tutaj używamy badania profilowania ekspresji genów głównego ludzkiego patogenu, Candida albicans, podczas infekcji inwazyjnej jako przykładu, aby wykazać: 1) szczegóły techniczne procedur eksperymentalnych (protokół), 2) czułość, odtwarzalność i zakres dynamiczny tej metody (reprezentatywne wyniki) oraz 3) Ważne kwestie dotyczące projektowania i przeprowadzania eksperymentów w oparciu o ten protokół (dyskusja). Protokół ten można łatwo dostosować do różnych patogenów i został z powodzeniem zastosowany w wielu modelach infekcji6-9.

<table><tbody><tr><td>gentleMACS Disocjator</td><td>Miltenyl Biotec</td><td>130-093-235</td><td></td></tr><tr><td>rurka gentelMACS M</td><td>Miltenyl Biotec</td><td>130-093-236</td><td></td></tr><tr><td>RNeasy Mini Kit</td><td>QIAGEN</td><td>74104</td><td></td></tr><tr><td>2-merkaptoetanol</td><td>Sigma</td><td>M-3148</td><td></td></tr><tr><td>Fenol: CHCl3:IAA</td><td>Sigma</td><td>P-2069</td><td></td></tr><tr><td>Koraliki cyrkonowe</td><td>Biospec Products</td><td>11079110zx</td><td></td></tr><tr><td>Mini-Beadbeater-16</td><td>Biospec Products</td><td>607</td><td></td></tr><tr><td>System analizy</td><td>nCounter Technologie</td><td></td><td></td>nanoString</tr><tr><td>Zestawy kodów ekspresji genów</td><td>nCounter Technologie</td><td></td><td></td></tr><tr><td>nSolver Narzędzie analityczne</td><td>nanoString Technologies</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

profilowanie ekspresji genów zakażonych drobnoustrojów za pomocą cyfrowej platformy kodów kreskowych

Gene Expression Profiling of Infecting Microbes Using a Digital Bar-coding Platform

Dla większości patogenów ssaków, badania profilowania ekspresji genów były ograniczone przez trudności techniczne w dokładnym ilościowym określeniu transkryptów genów patogenów z zakażonych tkanek. RNA patogenu stanowi niewielką część całkowitego RNA wyizolowanego z zakażonych próbek tkanek. Zarówno technologie mikromacierzy, jak i RNAseq mają trudności z generowaniem wiarygodnych odczytów dla genów patogenów o słabej ekspresji. Zmutowane szczepy patogenów o zmniejszonej proliferacji in vivo stanowią jeszcze większe wyzwanie. W tym miejscu opisujemy protokół profilowania ekspresji genów in vivo, który jest bardzo szybki, niezwykle czuły i wysoce powtarzalny. Protokół ten opracowaliśmy podczas naszych badań patogenu grzybowego Candida albicans w mysim modelu kandydozy rozsianej hematogennie. Korzystając z tego protokołu, udokumentowaliśmy przebiegi czasowe dynamicznie regulowanej ekspresji genu C. albicans podczas infekcji nerek i odkryliśmy nieoczekiwane cechy odpowiedzi ekspresji genów na leczenie lekami przeciwgrzybiczymi in vivo.

Głównym wyzwaniem w profilowaniu ekspresji genów patogenów in vivo jest uzyskanie wystarczającej liczby odczytów z RNA patogenu. Ze względu na niski procent transkryptów patogenu w całkowitym RNA, do każdej reakcji należy użyć dużej ilości całkowitego RNA (&gt;10 µg). Platforma ta posiada unikalną zaletę w tym zakresie: wykorzystuje zarówno sondę wychwytującą, jak i sondę raportującą w celu zwiększenia swoistości, dzięki czemu przytłaczająca ilość RNA gospodarza nie powoduje znaczącego poziomu szumu. Jak pokazano na Rysunku 1 (zaadaptowano z Ref. 6), surowe wartości tła z próbki tkanki niezakażonej (czerwone kropki) były wszystkie poniżej 10, podczas gdy surowe wartości z dwóch próbek tkanek zakażonych (niebieskie kropki) były wszystkie powyżej 10. Dane dotyczące ekspresji wygenerowane przy użyciu tego protokołu są wysoce powtarzalne. Jak pokazano na Rysunku 1 (zaadaptowano z Ref. 6), surowe wartości z dwóch replikatów biologicznych (niebieskie kropki, próbki nerek 48 h po zakażeniu) wykazały bardzo dobrą korelację, z wartością R-kwadrat równą 0,945. Platforma zapewnia również wystarczający zakres dynamiczny, aby objąć naturalne poziomy ekspresji biologicznej (Rysunek 1, surowe wartości mieściły się w zakresie od 101 do 106).
Wykorzystując zestaw sond specyficznych dla 248 genów odpowiedzi środowiskowej, udało nam się wyróżnić dwie fazy ekspresji genów patogenu (Ryc. 2, zaadaptowano z Ref. 6): wczesna odpowiedź w zakresie ekspresji genów obejmuje geny, których poziomy RNA różnią się znacząco pomiędzy inokulum a próbkami pobranymi 12 h po infekcji (P&lt;0.05 i zmiana ekspresji &gt;2-krotna), natomiast późna odpowiedź w zakresie ekspresji genów obejmuje geny, których poziomy RNA różnią się znacząco pomiędzy punktem czasowym 12 h a próbkami pobranymi 48 h po infekcji (P&lt;0.05 i zmiana ekspresji &gt;2-krotna). Wyniki te wskazują, że ekspresja genów C. albicans jest dynamicznie regulowana podczas inwazyjnej infekcji gospodarza ssającego.
<img alt="Wykres rozrzutu pokazujący korelację R²=0,9447; niebieski dla okresu po zakażeniu, czerwony dla kontroli; sygnał względem tła." src="/files/ftp_upload/53460/53460fig1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1. Surowe wartości zliczeń z zakażonych i niezakażonych tkanek nerek (zaadaptowano z Ref. 6). Liczba sond dla dwóch zakażonych (48 hr po zakażeniu, niebieskie punkty danych) i jednej niezakażonej (czerwone punkty danych) próbki nerek przedstawiona na wykresie rozrzutu. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53460/53460fig1large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Mapa ciepła ekspresji genów pokazująca wczesną i późną aktywność genów po infekcji w czasie; schemat." src="/files/ftp_upload/53460/53460fig2.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 2"> 
Rycina 2. Ekspresja genów C. albicans reagujących na środowisko podczas infekcji inwazyjnej (zaadaptowano z Ref. 6). Zmiany poziomów ekspresji podczas inwazji nerek myszy dla 248 genów C. albicans przedstawiono w formie mapy ciepła. Przedstawiono wartości średnie z powtórzeń biologicznych dla nadrzędnej regulacji (żółty) i regulacji w dół (niebieski) genów w 12, 24 i 48 h po infekcji w stosunku do średnich poziomów inokulum (0 h). Nasycenie koloru reprezentuje zakres zmiany ekspresji, przy pełnym nasyceniu dla 10-krotnej regulacji w górę lub w dół. Fragmenty mapy ciepła zostały powiększone, aby zilustrować reprezentatywne geny wcześnie regulowane w górę (góra), geny późne (środek) oraz geny wcześnie regulowane w dół (dół). W tych fragmentach poszczególne próbki przedstawiono oddzielnie, aby zilustrować powtarzalność. Zmiany ekspresji wczesnej definiujemy jako istotne różnice między inokulum a próbkami z 12 h. Zmiany ekspresji późnej definiujemy jako istotne różnice między próbkami z 12 i 48 h. Istotność odnosi się do zmian >2-krotnych i wartości p <0,05. Dane dla każdej próbki zostały znormalizowane do poziomów RNA genu kontrolnego TDH3 przed obliczeniem wartości średnich. Nasze kryteria przypisania pozwalają niektórym genom regulowanym dynamicznie na przynależność zarówno do klasy ekspresji wczesnej, jak i późnej. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53460/53460fig2large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.</a>

Opracowaliśmy protokół, który jest szybki, czuły i powtarzalny do profilowania ekspresji genów patogenów podczas infekcji.

Profilowanie ekspresji genów zakażonych drobnoustrojów za pomocą cyfrowej platformy kodów kreskowych

For most mammalian pathogens, gene expression profiling studies have been limited by technical difficulties to accurately quantify pathogen gene ...

Ogólnym celem niniejszego eksperymentu jest dokładny pomiar ekspresji genów patogenu in vivo, aby wyjaśnić, w jaki sposób patogen adaptuje się do środowiska infekcyjnego i powoduje uszkodzenia organizmu gospodarza. Technika ta utorowała drogę badaczom z dziedziny chorób zakaźnych do analizy dynamiki ekspresji genów patogenu podczas rzeczywistej infekcji w różnych typach tkanek i w wielu punktach czasowych. Główną zaletą tej metody jest jej wysoka czułość oraz niezwykna powtarzalność.Metoda ta umożliwia ilościowe określenie ekspresji genów patogenu z niewielkiej ilości tkanek pobranych z rzeczywistej infekcji. Aby rozpocząć przygotowywanie odczynników, dodać 2-merkaptoetanol do buforu RLT i dokładnie wymieszać. Przygotować mieszaninę roztworu fenol-chloroform-alkohol izoamylowy w proporcji 25:24:1.Oznakuj probówki do homogenizacji typu M i schłodź je w lodzie. Oznakuj probówki z nakrętką o pojemności dwóch mililitrów i dodaj do każdej z nich około 300 µL kulek cyrkonowych. Przygotuj do użycia następujące instrumenty: dysocjator tkanek, homogenizator kulkowy (bead beater), wirówkę stołową z adapterami do probówek 50 ml i płytek 96-dołkowych oraz fotometr.Wyjmij wcześniej zamrożone nerki wyizolowane z myszy zainfekowanych C.albicans z zamrażarki ustawionej na 80 stopni celsius i umieść je w lodzie. Dodaj 1,2 milliliters buforu RLT do każdej nerki. Następnie przelej każdą nerkę wraz z buforem do probówki do homogenizacji typu M.Ilość użytego buforu RLT jest określana empirycznie. Zbyt duża ilość buforu RLT spowoduje rozcieńczenie stężenia próbki, natomiast zbyt mała sprawi, że homogenat będzie bardzo lepki i niezwykle trudny w obróbce. Następnie, używając homogenizatora tkanek z zaprogramowanym ustawieniem RNA 2.01, należy zhomogenizować nerki.Następnie odwiruj próbki przy 1000 x G przez jedną minutę. Przenieś 600 µL każdego homogenatu do probówki z zakrętką zawierającej kulki cyrkonowe, a pozostały homogenat przechowuj na lodzie. Do każdej probówki dodaj 600 µL fenolo-chloroformu z alkoholem izoamylowym, szczelnie zamknij nakrętki i homogenizuj w beaterze kulkowym przez trzy minuty w temperaturze 4 °C.Wirować przy 15 000 G przez pięć minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Ostrożnie przenieść fazę wodną do nowej probówki do mikrocentryfugi o pojemności 1,5 mililitra, dodając równą objętość 70% etanolu. Następnie nanieść na kolumnę wirową i wirować przy 8 000 x G. Każdą kolumnę wirową przemyć raz 700 mikrolitrami buforu RW, a następnie dwukrotnie 500 mikrolitrami buforu RPE.Przenieś kolumny do suchych probówek zbiorczych i wiruj przez dodatkową minutę, aby usunąć pozostałą ciecz. Na koniec użyj 50 µL wody do elucji RNA. Następnie wykorzystaj spektrofotometr przy OD 216 nm, aby zmierzyć stężenie RNA.Aby przeprowadzić profilowanie ekspresji genów przy użyciu cyfrowego kodowania kreskowego, należy rozpocząć od rozmrożenia zestawu kodów reporterowych oraz zestawu kodów przechwytujących na lodzie. Do zestawu kodów reporterowych należy dodać 130 µL buforu hybrydyzacyjnego. Odwrócić probówkę w celu wymieszania i odwirować.Następnie dodaj 20 µL mieszaniny do każdej z 12 probówek reakcyjnych. Do każdej probówki dodaj 10 µg całkowitego RNA z tkanki i wymieszaj poprzez pipetowanie. W zależności od modelu infekcji, wielkości inokulum oraz użytego szczepu patogenu, zawartość RNA patogenu w całkowitym RNA waha się od 0 do 2%. W związku z tym całkowita ilość RNA, którą należy dodać w każdym przypadku, powinna zostać zoptymalizowana empirycznie.Teraz do każdej probówki należy dodać pięć µL zestawu kodów wychwytujących. Wymieszać poprzez odwracanie probówek i krótko wirাড়াও. Następnie inkubować reakcje w termocyklerze w temperaturze 65 °C z podgrzewaną pokrywą przez około 18 godzin.Wyjmij jeden kartridż z próbkami z temperatury 20 °C i pozostaw go do ogrzania do temperatury pokojowej. Wyjmij dwie płytki z odczynnikami z temperatury 4 °C i wiruj w wirówce stołowej przy 670 ×g przez dwie minuty. Następnie przygotuj stację przygotowawczą, postępując zgodnie z instrukcjami krok po kroku wyświetlanymi na ekranie, wybierając opcję wysokiej czułości.Następnie należy wyjąć reakcje z termocyklera i bezzwłocznie załadować je do stacji preparatywnej. Po uruchomieniu trzygodzinnego programu o wysokiej czułości, należy wyjąć kartridż i zabezpieczyć ścieżki za pomocą przezroczystej taśmy. W razie potrzeby nałożyć olej mineralny na spód kartridża.Następnie należy umieścić kartridż w analizatorze cyfrowym. Skonfiguruj analizator cyfrowy zgodnie z instrukcjami krok po kroku wyświetlanymi na ekranie, wybierając opcję skanowania o wysokiej rozdzielczości. Po uruchomieniu programu skanującego pobierz wyniki lub wybierz opcję ich otrzymania drogą mailową, a następnie zaimportuj surowe dane do oprogramowania producenta.Przeanalizuj dane zgodnie z protokołem tekstowym. Protokół zaprezentowany w tym filmie ma tę wyjątkową zaletę, że wykorzystuje zarówno sondę przechwytującą, jak i sondę raportującą, aby zwiększyć swoistość i zmniejszyć szum pochodzący z RNA gospodarza. Jak pokazano tutaj, surowe wartości tła z nieinfected próbki tkanki były wszystkie poniżej 10, podczas gdy surowe wartości z dwóch zainfekowanych próbek tkanki były wszystkie powyżej 10.Surowe wartości zliczeń z dwóch próbek biologicznych wykazały bardzo dobrą korelację z wartością R kwadrat wynoszącą 0.945. Platforma zapewnia również wystarczający zakres dynamiczny, aby objąć naturalne poziomy ekspresji biologicznej. Przy użyciu zestawu sond specyficznych dla 248 genów odpowiedzi środowiskowej określono dwie fazy ekspresji genów patogenu.Wczesna odpowiedź w zakresie ekspresji genów obejmuje geny, których poziomy RNA różnią się istotnie między próbkami inokulum a próbkami pobranymi 12 godzin po infekcji. Wykryto również późną odpowiedź w zakresie ekspresji genów, obejmującą geny o poziomach RNA istotnie różniących się między punktem czasowym 12 godzin a próbkami pobranymi 48 godzin po infekcji. Wyniki te wskazują, że ekspresja genów C.albicans jest dynamicznie regulowana podczas inwazyjnej infekcji organizmu ssaka.Metoda ta jest prosta i szybka. Cała procedura, od pobrania tkanki do przedstawienia danych, trwa mniej niż 48 h. Czas pracy własnej wynosi około czterech godzin dla 12 próbek.Choć metoda ta została opracowana w celu uchwycenia ekspresji genów patogenu in vivo, może ona zostać wykorzystana również do analizy ekspresji genów gospodarza. Dzięki temu badacze mogą jednocześnie pozyskać użyteczne informacje z obu stron procesu infekcji.

gene-expression-profiling-infecting-microbes-using-digital-bar-coding

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Opracowaliśmy kompleksowe, nieobciążone systematycznie badania przesiewowe całego genomu, aby zrozumieć interakcje gen-lek oraz gen-środowisko. Przedstawiono metody przesiewania tych kolekcji mutantów.

Konkurencyjne przesiewy genomiczne z zastosowaniem bibliotek drożdży z kodami kreskowymi

Opisujemy metodę multipleksową do wykrywania mikroorganizmów w próbce z wykorzystaniem kulek fluorescencyjnych sprzężonych z oligonukleotydami. Amplikony wszystkich organizmów w próbce są hybrydyzowane z panelem kulek sprzężonych z sondami. Do analizy typu każdej kulki oraz sygnału hybrydyzacji wykorzystywany jest instrument Luminex lub Bio-Plex.

Multipleksowa detekcja bakterii w złożonych próbkach klinicznych i środowiskowych z wykorzystaniem mikrosfer fluorescencyjnych sprzężonych z oligonukleotydami

Scharakteryzowanie społeczności mikrobiologicznej było od dawna celem w mikrobiologii środowiskowej. Metody sekwencjonowania nowej generacji pozwalają obecnie na scharakteryzowanie społeczności drobnoustrojów na niespotykanej dotąd głębokości przy minimalnych kosztach i nakładzie pracy. Szczegółowo opisujemy tutaj nasze podejście do sekwencjonowania bakteryjnych genów rybosomalnego RNA 16S za pomocą sekwenatora laboratoryjnego.

Sekwencjonowanie nowej generacji amplikonów genu rybosomalnego RNA 16S

Od czasu odkrycia genu białka zielonej fluorescencji, białka fluorescencyjne wpłynęły na biologię molekularną komórki. Protokół ten opisuje, w jaki sposób ekspresja odrębnych białek fluorescencyjnych za pomocą inżynierii genetycznej jest wykorzystywana do kodowania kreskowego poszczególnych komórek. Procedura umożliwia śledzenie odrębnych populacji w mieszaninie komórek, co jest idealne do zastosowań multipleksowanych.

Genetyczne kody kreskowe z białkami fluorescencyjnymi do zastosowań multipleksowych

Ten manuskrypt opisuje użycie najnowocześniejszej technologii dostarczanej przez mikromacierze DNA. Mikromacierze zapewniają przegląd zmian transkryptomicznych u bakterii powstałych w określonych warunkach. Ponadto podkreślamy łatwość, z jaką można analizować duże ilości danych za pomocą wygodnych, opracowanych przez nas pakietów oprogramowania.

Szybki i niezawodny proces analizy transkryptomu bakteryjnego Studium przypadku: Zależna od seryny regulacja genów w Streptococcus pneumoniae

Opisujemy użycie multipleksowanej platformy ekspresji genów o wysokiej przepustowości, która określa ilościowo ekspresję genów poprzez kodowanie kreskowe i liczenie cząsteczek w substratach biologicznych bez potrzeby amplifikacji. Wykorzystaliśmy platformę do ilościowego określenia ekspresji mikroRNA (miRNA) we krwi pełnej u osób z zespołem jelita drażliwego i bez niego.

Zaburzenia krążących miRNA w zespole jelita drażliwego wykryte za pomocą multipleksowanej platformy ekspresji genów o wysokiej przepustowości

Sekwencjonowanie pojedynczych komórek ujawnia niejednorodność genotypową w systemach biologicznych, ale obecnym technologiom brakuje przepustowości niezbędnej do głębokiego profilowania składu i funkcji społeczności. W tym miejscu opisujemy mikroprzepływowy przepływ pracy do sekwencjonowania &gt;50 000 genomów jednokomórkowych z różnych populacji komórek.

Ultraprzepustowa platforma mikroprzepływowa do sekwencjonowania genomu pojedynczej komórki

To oparte na molekularnym podejściu do określania sprawności bakterii umożliwia precyzyjne i dokładne wykrywanie mikroorganizmów za pomocą unikalnych kodów kreskowych genomowego DNA, które są określane ilościowo za pomocą cyfrowego PCR. W protokole opisano obliczanie indeksu konkurencyjnego dla szczepów Salmonella; Technologia ta jest jednak łatwa do zaadaptowania do protokołów wymagających bezwzględnej kwantyfikacji każdego genetycznie plastycznego organizmu.

Cyfrowy indeks konkurencyjności oparty na PCR do wysokoprzepustowej analizy sprawności w Salmonelli

Tutaj zaprezentowaliśmy metodę sekwencjonowania mRNA z multipleksowaną pojedynczą komórką do profilowania ekspresji genów w tkankach embrionalnych myszy. Metoda sekwencjonowania mRNA pojedynczej komórki oparta na kropelkach (scRNA-Seq) w połączeniu ze strategiami multipleksowania może profilować pojedyncze komórki z wielu próbek jednocześnie, co znacznie obniża koszty odczynników i minimalizuje eksperymentalne efekty wsadowe.

Multipleksowana analiza sekwencjonowania mRNA pojedynczej komórki komórek embrionalnych myszy

Protokół przedstawiony tutaj opisuje kompletny potok do analizy danych transkryptomu sekwencjonowania RNA, od surowych odczytów do analizy funkcjonalnej, w tym etapy kontroli jakości i wstępnego przetwarzania do zaawansowanych metod analizy statystycznej.

Wysokoprzepustowa analiza transkryptomu do badania interakcji gospodarz-patogen

Analiza obrazu z multipleksowanym kodowaniem kreskowym ostatnio poprawiła charakterystykę mikrośrodowiska guza, umożliwiając kompleksowe badania składu komórki, stanu funkcjonalnego i interakcji komórka-komórka. W niniejszym artykule opisano protokół barwienia i obrazowania z wykorzystaniem kodowania kreskowego przeciwciał sprzężonych z oligonukleotydami i obrazowania cyklicznego, który pozwala na zastosowanie techniki wysokowymiarowej analizy obrazu.

Multipleksowa analiza obrazu z kodowaniem kreskowym do charakterystyki immunoprofilowania i mapowania przestrzennego w analizie pojedynczej komórki próbek tkanek parafinowych

Poznaj metodę profilowania ekspresji genów patogenów in vivo przy użyciu cyfrowej platformy kodów kreskowych. Technika ta umożliwia badanie dynamiki ekspresji genów C. albicans w tkankach zakażonych myszy.

Profilowanie ekspresji genów zakażonych drobnoustrojów za pomocą cyfrowej platformy kodów kreskowych

Przeglądaj więcej filmów