Profilowanie ekspresji genów zakażonych drobnoustrojów za pomocą cyfrowej platformy kodów kreskowych

Ogólnym celem niniejszego eksperymentu jest dokładny pomiar ekspresji genów patogenu in vivo, aby wyjaśnić, w jaki sposób patogen adaptuje się do środowiska infekcyjnego i powoduje uszkodzenia organizmu gospodarza. Technika ta utorowała drogę badaczom z dziedziny chorób zakaźnych do analizy dynamiki ekspresji genów patogenu podczas rzeczywistej infekcji w różnych typach tkanek i w wielu punktach czasowych. Główną zaletą tej metody jest jej wysoka czułość oraz niezwykna powtarzalność.

Metoda ta umożliwia ilościowe określenie ekspresji genów patogenu z niewielkiej ilości tkanek pobranych z rzeczywistej infekcji. Aby rozpocząć przygotowywanie odczynników, dodać 2-merkaptoetanol do buforu RLT i dokładnie wymieszać. Przygotować mieszaninę roztworu fenol-chloroform-alkohol izoamylowy w proporcji 25:24:1.

Oznakuj probówki do homogenizacji typu M i schłodź je w lodzie. Oznakuj probówki z nakrętką o pojemności dwóch mililitrów i dodaj do każdej z nich około 300 µL kulek cyrkonowych. Przygotuj do użycia następujące instrumenty: dysocjator tkanek, homogenizator kulkowy (bead beater), wirówkę stołową z adapterami do probówek 50 ml i płytek 96-dołkowych oraz fotometr.

Wyjmij wcześniej zamrożone nerki wyizolowane z myszy zainfekowanych C.albicans z zamrażarki ustawionej na 80 stopni celsius i umieść je w lodzie. Dodaj 1,2 milliliters buforu RLT do każdej nerki. Następnie przelej każdą nerkę wraz z buforem do probówki do homogenizacji typu M.

Ilość użytego buforu RLT jest określana empirycznie. Zbyt duża ilość buforu RLT spowoduje rozcieńczenie stężenia próbki, natomiast zbyt mała sprawi, że homogenat będzie bardzo lepki i niezwykle trudny w obróbce. Następnie, używając homogenizatora tkanek z zaprogramowanym ustawieniem RNA 2.01, należy zhomogenizować nerki.

Następnie odwiruj próbki przy 1000 x G przez jedną minutę. Przenieś 600 µL każdego homogenatu do probówki z zakrętką zawierającej kulki cyrkonowe, a pozostały homogenat przechowuj na lodzie. Do każdej probówki dodaj 600 µL fenolo-chloroformu z alkoholem izoamylowym, szczelnie zamknij nakrętki i homogenizuj w beaterze kulkowym przez trzy minuty w temperaturze 4 °C.

Wirować przy 15 000 G przez pięć minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Ostrożnie przenieść fazę wodną do nowej probówki do mikrocentryfugi o pojemności 1,5 mililitra, dodając równą objętość 70% etanolu. Następnie nanieść na kolumnę wirową i wirować przy 8 000 x G. Każdą kolumnę wirową przemyć raz 700 mikrolitrami buforu RW, a następnie dwukrotnie 500 mikrolitrami buforu RPE.

Przenieś kolumny do suchych probówek zbiorczych i wiruj przez dodatkową minutę, aby usunąć pozostałą ciecz. Na koniec użyj 50 µL wody do elucji RNA. Następnie wykorzystaj spektrofotometr przy OD 216 nm, aby zmierzyć stężenie RNA.

Aby przeprowadzić profilowanie ekspresji genów przy użyciu cyfrowego kodowania kreskowego, należy rozpocząć od rozmrożenia zestawu kodów reporterowych oraz zestawu kodów przechwytujących na lodzie. Do zestawu kodów reporterowych należy dodać 130 µL buforu hybrydyzacyjnego. Odwrócić probówkę w celu wymieszania i odwirować.

Następnie dodaj 20 µL mieszaniny do każdej z 12 probówek reakcyjnych. Do każdej probówki dodaj 10 µg całkowitego RNA z tkanki i wymieszaj poprzez pipetowanie. W zależności od modelu infekcji, wielkości inokulum oraz użytego szczepu patogenu, zawartość RNA patogenu w całkowitym RNA waha się od 0 do 2%. W związku z tym całkowita ilość RNA, którą należy dodać w każdym przypadku, powinna zostać zoptymalizowana empirycznie.

Teraz do każdej probówki należy dodać pięć µL zestawu kodów wychwytujących. Wymieszać poprzez odwracanie probówek i krótko wirাড়াও. Następnie inkubować reakcje w termocyklerze w temperaturze 65 °C z podgrzewaną pokrywą przez około 18 godzin.

Wyjmij jeden kartridż z próbkami z temperatury 20 °C i pozostaw go do ogrzania do temperatury pokojowej. Wyjmij dwie płytki z odczynnikami z temperatury 4 °C i wiruj w wirówce stołowej przy 670 ×g przez dwie minuty. Następnie przygotuj stację przygotowawczą, postępując zgodnie z instrukcjami krok po kroku wyświetlanymi na ekranie, wybierając opcję wysokiej czułości.

Następnie należy wyjąć reakcje z termocyklera i bezzwłocznie załadować je do stacji preparatywnej. Po uruchomieniu trzygodzinnego programu o wysokiej czułości, należy wyjąć kartridż i zabezpieczyć ścieżki za pomocą przezroczystej taśmy. W razie potrzeby nałożyć olej mineralny na spód kartridża.

Następnie należy umieścić kartridż w analizatorze cyfrowym. Skonfiguruj analizator cyfrowy zgodnie z instrukcjami krok po kroku wyświetlanymi na ekranie, wybierając opcję skanowania o wysokiej rozdzielczości. Po uruchomieniu programu skanującego pobierz wyniki lub wybierz opcję ich otrzymania drogą mailową, a następnie zaimportuj surowe dane do oprogramowania producenta.

Przeanalizuj dane zgodnie z protokołem tekstowym. Protokół zaprezentowany w tym filmie ma tę wyjątkową zaletę, że wykorzystuje zarówno sondę przechwytującą, jak i sondę raportującą, aby zwiększyć swoistość i zmniejszyć szum pochodzący z RNA gospodarza. Jak pokazano tutaj, surowe wartości tła z nieinfected próbki tkanki były wszystkie poniżej 10, podczas gdy surowe wartości z dwóch zainfekowanych próbek tkanki były wszystkie powyżej 10.

Surowe wartości zliczeń z dwóch próbek biologicznych wykazały bardzo dobrą korelację z wartością R kwadrat wynoszącą 0.945. Platforma zapewnia również wystarczający zakres dynamiczny, aby objąć naturalne poziomy ekspresji biologicznej. Przy użyciu zestawu sond specyficznych dla 248 genów odpowiedzi środowiskowej określono dwie fazy ekspresji genów patogenu.

Wczesna odpowiedź w zakresie ekspresji genów obejmuje geny, których poziomy RNA różnią się istotnie między próbkami inokulum a próbkami pobranymi 12 godzin po infekcji. Wykryto również późną odpowiedź w zakresie ekspresji genów, obejmującą geny o poziomach RNA istotnie różniących się między punktem czasowym 12 godzin a próbkami pobranymi 48 godzin po infekcji. Wyniki te wskazują, że ekspresja genów C.albicans jest dynamicznie regulowana podczas inwazyjnej infekcji organizmu ssaka.

Metoda ta jest prosta i szybka. Cała procedura, od pobrania tkanki do przedstawienia danych, trwa mniej niż 48 h. Czas pracy własnej wynosi około czterech godzin dla 12 próbek.

Choć metoda ta została opracowana w celu uchwycenia ekspresji genów patogenu in vivo, może ona zostać wykorzystana również do analizy ekspresji genów gospodarza. Dzięki temu badacze mogą jednocześnie pozyskać użyteczne informacje z obu stron procesu infekcji.