Prosta metoda ekstrakcji i analizy glukozynolanu za pomocą wysokociśnieniowej chromatografii cieczowej (HPLC)
15 marca 2017
Tutaj opisujemy bardzo szczegółowo sprawdzony i solidny protokół ekstrakcji glukozynolanów z mielonych materiałów roślinnych. Po zastosowaniu sulfatazy w kolumnie ekstraktów, desulfoglucozynolany są eluowane i analizowane za pomocą wysokociśnieniowej chromatografii cieczowej.
Ogólnym celem tego protokołu jest przeprowadzenie łatwej i prostej analizy glukozynolanów w roślinach i innych próbkach biologicznych. Ta metoda, do ekstrakcji i analizy glukozynolanów, może być wykorzystana do udzielenia odpowiedzi na kluczowe pytania z zakresu ekologii roślin i owadów, patologii roślin, hodowli roślin i nauk o żywności. Główną zaletą tej techniki jest to, że jest dobrze zwalidowana i ma szerokie zastosowanie do szerokiego zakresu próbek biologicznych.
Chociaż metoda ta jest stosowana głównie do ilościowego oznaczania glukozynolanów w materiałach roślinnych, może być również stosowana do gleby lub przygotowanych środków spożywczych. Ta procedura ekstrakcji może być wykonywana w prawie każdym laboratorium, ponieważ najczęściej używa się standardowego sprzętu laboratoryjnego. Ogólnie rzecz biorąc, osoby, które są nowicjuszami w tej metodzie, będą lepiej wykonywać analizy i inspekcje, jeśli przeczytają i obejrzą film przynajmniej raz.
Aby rozpocząć procedurę, wymieszaj 10 gramów usieciowanego żelu dekstrynowego G-25 ze 125 mililitrami ultraczystej wody. Przechowuj mieszaninę w zakorkowanej butelce w temperaturze 4 stopni Celsjusza. Następnie rozpuść 10 000 jednostek arylosulfatazy typu H-1 w 30 mililitrach ultraczystej wody.
Dodaj do tego 30 mililitrów absolutnego etanolu i dobrze wymieszaj mieszaninę. Odwirować mieszaninę w temperaturze 2 650 razy G przez 20 minut w temperaturze pokojowej. Połączyć supernatant z 90 mililitrami absolutnego etanolu w zlewce.
Wymieszaj i wlej nowe probówki wirówkowe. Odwirować mieszaninę w temperaturze 1 030 razy G przez 15 minut w temperaturze pokojowej. Odrzucić supernatant.
Rozpuść i połącz granulki w sumie 25 mililitrach ultraczystej wody. Dobrze zwiruj mieszaninę, a następnie przenieś mieszaninę do 1-mililitrowych probówek. Próbki siarczanów należy przechowywać w temperaturze 20 stopni Celsjusza przez okres do jednego roku.
Następnie zważ około 90 miligramów sinogramu i zapisz wagę z dokładnością do 1 mikrograma. Następnie rozpuść monohydrat sinogramu w 10 mililitrach ultraczystej wody. Z tego roztworu podstawowego sinogramu przygotować pięć roztworów odniesienia o stężeniach w zakresie od 50 do 750 mikromolowych.
Roztwory referencyjne należy przechowywać w probówkach o pojemności 1,5 mililitra w temperaturze 20 stopni Celsjusza. Następnie, dla każdej próbki i odniesienia, oznacz 2-mililitrową probówkę wirówkową w pozycji stojaka kolumnowego. Przebić każdą nakrętkę probówki mikrowirówki igłą preparacyjną w celu późniejszego liofilizacji.
Umieść oznaczone rury w bloku w tej samej konfiguracji i odstępach, co oznaczone kolumny. Aby przygotować szklane kolumny do pipet, użyj drewnianego lub szklanego pręta, aby delikatnie wcisnąć do pipety kawałek waty szklanej o wymiarach 1 centymetr na 1 centymetr. Owiń watę szklaną w miejscu przejścia cylindra pipety do trzpienia.
Umieść kolumnę pipety w każdej oznaczonej pozycji na stojaku. Umieść stojak nad tacą na odpady. Odetnij koniec plastikowej końcówki pipety o pojemności 1 mililitra.
Dobrze wstrząśnij przygotowanym żelem dekstryny. A następnie użyj poszerzonej końcówki pipety, aby załadować 0,5 mililitra przygotowanego żelu dekstrynowego do każdej kolumny. Sprawdź kolumny pod kątem wyciekającego żelu dekstrynowego i wymień wszelkie nieszczelne kolumny.
Po załadowaniu wszystkich kolumn żelem dekstrynowym umyj każdą kolumnę 1 mililitrem ultraczystej wody. Odważ od 50 do 100 miligramów drobno zmielonego materiału roślinnego o swobodnym kroku w 2-mililitrowej probówce reakcyjnej z nasadką zabezpieczającą i zapisz masę z dokładnością do 0,1 miligrama. Umieść dwie metalowe kulki o średnicy 3 milimetrów w każdej tubie.
Dodaj do każdej probówki 1 mililitr 70% metanolu w ultraczystej wodzie i krótko zmieszaj każdą mieszaninę. Zamknij rurki dodatkowymi nasadkami zabezpieczającymi i natychmiast umieść je w łaźni wodnej o temperaturze od 90 do 92 stopni Celsjusza. Podgrzej rurki, aż piła zacznie wrzeć.
Przenieś probówki do łaźni ultradźwiękowej i podgrzewaj próbki sonicznie przez 15 minut. Podczas sonikacji należy rozpocząć rozmrażanie próbki siarczanu i odniesień do sinogramu. Po sonikacji odwirować próbki w temperaturze 2 700 razy G przez 10 minut w temperaturze pokojowej.
Załaduj supernatanty i rozmrożone odniesienia do sinogramu do odpowiednich kolumn, uważając, aby nie wciągnąć materii roślinnej do pipety. Dodaj 1 mililitr 70% metanolu do każdej probówki. Zwiruj mieszaniny.
I ultradźwięki podgrzewają mieszaniny przez 15 minut. Ponownie odwirować probówki w tych samych warunkach, co poprzednio. Załaduj supernatanty do odpowiednich kolumn.
Dodaj dwie porcje 1 mililitra 70% metanolu do każdej kolumny, pozwalając kolumnom wyschnąć między każdą porcją. Przepłukać resztki metanolu z każdej kolumny 1 mililitrem ultraczystej wody. Następnie przemyj każdą kolumnę dwiema 1 mililitrowymi porcjami 20-milimolowego buforu octanu sodu o pH 5,5.
Gdy ostatnie porcje buforu octanu sodu spłyną do stojaka na odpady, wyjmij stojak z tacki na odpady i osusz nóżki stojaka chusteczką. Umieść stojak nad blokiem oznaczonych probówek do mikrowirówek, tak aby końcówki kolumn znajdowały się w odpowiednich probówkach. Załaduj 20 mikrolitrów roztworu siarczanu na każdą kolumnę, upewniając się, że roztwór dotrze do powierzchni materiału kolumny.
Przepłukać roztwór siarczanu do materiału kolumny za pomocą 50 mikrolitrów buforu octanu sodu. Bardzo ważne jest, aby siarczan był spłukiwany do kolumny. Enzym musi znajdować się na kolumnie, aby reagować z nienaruszonymi glukozynolanami związanymi na kolumnie.
Po wypłukaniu roztworu siarczanu na każdą kolumnę, przykryj kolumny folią aluminiową. Pozostaw kolumny na noc. Następnie nawiąż do desulfoglukozynolanów z każdej kolumny za pomocą dwóch 0,75 mililitra porcji ultraczystej wody.
Gdy kolumny wyschną, wyjmij stojak kolumny i przykryj każdą rurkę. Zamroź probówki w ciekłym azocie lub w temperaturze 80 stopni Celsjusza przez co najmniej 30 minut. Próbki należy suszyć przez liofilizację przez 12 do 24 godzin.
Rozpuść każdą pozostałość w 1 mililitrze ultraczystej wody. A następnie przenieś każdą próbkę i odniesienie do znakowanych fiolek z próbkami HPLC. Oddzielić ekstrakty na kolumnie CAT z odwróconymi fazami.
Użyj długości fali detekcji 229 nanometrów. Po oddzieleniu za pomocą HPLC glukozynolany można zidentyfikować poprzez porównanie czasów retencji i widm UV ze znanymi wzorcami glukozynolanu. Stężenia glukozynolanu w próbce oblicza się na podstawie krzywej kalibracyjnej sinogramu i wartości literaturowych dla czynników odpowiedzi.
Na tej podstawie można określić stężenia glukozynolanu w oryginalnej próbce roślinnej. W zastosowanych warunkach HPLC niezdrowa progowitryna stosunkowo wcześnie pojawia się i jest oddzielana od biologicznie korzystnej glukorafaniny. Endoglukozynolany są również dobrze oddzielone.
Obserwuje się szeregi liotropowe ze zwiększającymi się ogniwami łańcucha bocznego dla alkonolu, metylofolu-alkonolu i glukozynolanów metylosolfinolu o dłuższym łańcuchu. Nieznane glukozynolany można zatem wstępnie sklasyfikować na podstawie tych szeregów liotropowych w połączeniu z widmami UV. Przy odpowiednim przygotowaniu jedna osoba może pobrać od 150 do 200 próbek w ciągu jednego dnia roboczego.
Potrzeba jeszcze jednego dnia, aby nawiązywać do kolumn, które liofilizują próbki i przygotowują je do HPLC. Po tej procedurze można zastosować inne metody, takie jak LCMS, w celu identyfikacji nieznanych desulfoglukozynolanów w chromatogramie. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak ekstrahować glukozynolany z próbek biologicznych i analizować je za pomocą HPLC.
Nie zapominaj, że praca z metanolem może być bardzo niebezpieczna i zawsze powinna być wykonywana pod wyciągiem.
Przegląd
Niniejszy artykuł przedstawia szczegółowy protokół ekstrakcji glukozynolanów z materiałów roślinnych z wykorzystaniem wysokosprawnej chromatografii cieczowej. Metoda została opracowana tak, aby była prosta w wykonaniu i możliwa do zastosowania w przypadku różnych próbek biologicznych.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Ekologia roślin i owadów
- Fitopatologia
- Nauki o żywności
Wprowadzenie
- Glukozynolany są ważnymi związkami w roślinach.
- Odgrywają one istotną rolę w mechanizmach obronnych roślin.
- Zrozumienie poziomu ich stężenia może być pomocne w różnych badaniach biologicznych.
- Niniejszy protokół został zwalidowany dla szerokiego zakresu próbek.
Cel badania
- Zapewnienie wiarygodnej metody ekstrakcji i analizy glukozynolanów.
- Ułatwienie badań w dziedzinach związanych z roślinami.
- Umożliwienie oznaczania ilościowego glukozynolanów w zróżnicowanych próbkach.
Zastosowane metody
- Przygotowanie żelu dekstrynowego i roztworu sulfatazy.
- Ekstrakcja próbek przy użyciu metanolu i sonikacji.
- Analiza z wykorzystaniem wysokosprawnej chromatografii cieczowej.
- Porównanie czasów retencji i widm UV ze wzorcami.
Główne wyniki
- Skuteczna ekstrakcja glukozynolatów z materiałów roślinnych.
- Walidacja metody w różnych próbkach biologicznych.
- Identyfikacja glukozynolatów za pomocą HPLC.
- Potencjalne zastosowania w ekologii i naukach o żywności.
Wnioski
- Protokół ten jest skuteczny w analizie glukozynolanów.
- Można go stosować w różnych warunkach badawczych.
- Dalsze badania mogą rozszerzyć zakres jego zastosowań w naukach o roślinach.
Najczęściej zadawane pytania
Zastosowanie w przemyśle
Precyzyjne ilościowe oznaczenie glukozynolatów wspiera walidację celów w procesie odkrywania bioaktywnych związków pochodzenia roślinnego, umożliwiając mechanistyczne ograniczenie ryzyka w przypadku kandydatów na nutraceutyki i środki ochrony roślin. Metoda ta zapewnia wiarygodność predykcyjną w identyfikacji korzystnych i niekorzystnych profili glukozynolatów, co ułatwia identyfikację wiodących cząsteczek oraz selekcję portfela projektów w biotechnologii rolniczej i rozwoju żywności funkcjonalnej. Jej szeroka stosowalność w różnych tkankach roślinnych i próbkach biologicznych zwiększa ciągłość translacyjną od etapu odkryć do oceny przedklinicznej.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne etapy odkrywania i walidacja celu
- Wartość naukowa: Umożliwia weryfikację hipotez terapeutycznych poprzez powiązanie konkretnych struktur glukozynolatów z działaniami biologicznymi, takimi jak w przypadku progoitryny (szkodliwej) lub glukorafaniny (korzystnej).
- Wartość operacyjna: Wspiera ograniczanie ryzyka biologicznego dzięki niezawodnemu oznaczaniu ilościowemu nienaruszonych glukozynolatów po inaktywacji mirozynazy i traktowaniu sulfatazą.
- Wartość prognostyczna: Zwiększa pewność prognostyczną w walidacji celu poprzez generowanie danych ilościowych do analizy zależności struktura-aktywność.
Przesiewy i opracowanie testów
- Wartość naukowa: Przygotowuje zwalidowane systemy biologiczne do dalszych etapów analizy poprzez dostarczenie desulfoglukozynolanów odpowiednich do detekcji i oznaczania ilościowego metodą HPLC.
- Wartość operacyjna: Zapewnia standaryzację i powtarzalność analizy dzięki krzywym kalibracyjnym opartym na sinigrynie oraz ustalonym czynnikom odpowiedzi.
- Skalowalność: Umożliwia przetwarzanie 150–200 próbek na osobę dziennie, co wspiera gotowość do wysokoprzepustowych analiz przesiewowych.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Ciągłość translacyjna: Łączy profilowanie glukozynolatów w fazie odkryć z walidacją przedkliniczną za pomocą systemów istotnych dla chorób w fitopatologii i naukach o żywności.
- Postęp dostosowany do ryzyka: Wspiera decyzje o kontynuacji lub przerwaniu badań (go/no-go) poprzez identyfikację szkodliwych produktów rozkładu (np. nitryli) w przeciwieństwie do korzystnych (np. izotiocyjanianów) na podstawie profili glukozynolatów.
- Korelacja z biomarkerami: Umożliwia rozwój translacyjnych biomarkerów poprzez korelację stężeń glukozynolatów z efektami fenotypowymi w badaniach ekologicznych i hodowlanych.
Integracja potoku i przepływu pracy
Metoda ta integruje się z kontinuum odkryć, począwszy od wczesnej walidacji celu, przez identyfikację związku wiodącego, aż po wsparcie przedkliniczne, szczególnie w procesach rozwoju nutraceutyków oraz cech użytkowych roślin uprawnych.
- Biologia odkrywcza: Wspiera testowanie hipotez i wyjaśnianie szlaków metabolicznych poprzez ilościowe określanie profili glukozynolanów, które warunkują powstawanie bioaktywnych produktów rozkładu.
- Przesiewanie: Dostarcza ilościowe wyniki gotowe do analizy za pomocą HPLC z detekcją PDA/UV, umożliwiając wiarygodną ocenę związków w różnorodnych matrycach roślinnych.
- Analityka: Zapewnia mierzalne odczyty (czasy retencji, widma UV, obliczenia stężeń), które pozwalają na porównywanie różnych warunków oraz klasyfikację opartą na strukturze.
- Badania translacyjne: Łączy się z ciągłością przedkliniczną poprzez zastosowania w bezpieczeństwie żywności i zdrowiu roślin, gdzie produkty rozkładu glukozynolanów wpływają na efekty biologiczne.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Służy jako wielokrotnego użytku platforma analityczna dzięki opieraniu się na standardowym sprzęcie laboratoryjnym i szerokiej kompatybilności próbek (rośliny, gleba, produkty spożywcze).
Wpływ operacyjny i przedsiębiorstwowy
- Wartość naukowa: Pewność predykcyjna w walidacji celu, redukcja niejednoznaczności mechanistycznej w identyfikacji związków bioaktywnych.
- Wartość operacyjna: Standaryzacja, powtarzalność i skalowalność w różnych laboratoriach przy użyciu dostępnego sprzętu.
- Wartość strategiczna: Usprawnienie decyzji o kontynuacji lub przerwaniu badań (go/no-go), efektywność kapitałowa oraz zredukowane ryzyko biologiczne na późnych etapach rozwoju związków bioaktywnych.
- Wpływ na portfolio: Decyzje dotyczące priorytetyzacji i rozwoju skorygowane o ryzyko, oparte na zwalidowanym ilościowym oznaczeniu glukozynolatów.
Uwagi dotyczące wdrożenia
- Wymagana jest wiedza specjalistyczna w zakresie przygotowania próbek roślinnych, obróbki enzymatycznej oraz obsługi układu HPLC.
- Metoda zależy od dostępu do wirówek, łaźni wodnych, myjek ultradźwiękowych, liofilizatorów oraz systemów HPLC z detekcją PDA/UV.
- Niezbędna jest standaryzacja międzyzespołowa w zakresie czasu ekstrakcji, inkubacji z sulfatazą oraz przygotowania krzywej referencyjnej.
- Należy uwzględnić modyfikacje dla różnych matryc roślinnych (liście, nasiona, korzenie) oraz próbek nier roślinnych (gleba, produkty spożywcze).
- Ograniczenia praktyczne obejmują zagrożenia związane z obsługą metanolu, wymagające pracy pod wyciągiem, oraz 12–24 godzinny etap liofilizacji, co wpływa na całkowity czas analizy.
