Name: Prosta metoda ekstrakcji i analizy glukozynolanu za pomocą wysokociśnieniowej chromatografii cieczowej (HPLC) (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-03-15T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 9 s
Description: Poznaj prostą metodę ekstrakcji i analizy glukozynolanów z roślin za pomocą chromatografii HPLC. Ta sprawdzona technika umożliwia badania w ekologii roślin, patologii i naukach o żywności.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

NMvD dziękuje dr Michaelowi Reicheltowi (Instytut Ekologii Chemicznej im. Maxa Plancka, Jena, Niemcy) za dostarczenie pierwszych próbek referencyjnych, kiedy zaczęła stosować tę metodę 16 lat temu. Ciska Raaijmakers (NIOO-KNAW, Wageningen, Holandia), Sebastian Krosse (B-Ware, Nijmegen, Holandia) i Christian Ristok (iDiv, Lipsk) są doceniani za ulepszenie protokołu na przestrzeni lat. Mirka Macel i Martine Huberty (Uniwersytet w Tybindze, Niemcy) zostały uznane za upoważnione do wykorzystania chromatogramu Rorippa. Autorzy dziękują za wsparcie ze strony Niemieckiego Centrum Integracyjnych Badań nad Bioróżnorodnością (iDiv) Halle-Jena-Leipzig, ufundowane przez Niemiecką Fundację Badawczą (FZT 118).

1. Przygotowanie roztworów niezbędnych do ekstrakcji glukozynolatów
<ol>
	<li>Przygotować 500 mL 70% metanolu (MeOH) w wodzie (ultraczystej) w szklanej butelce. Dla 100 próbek i 5 wzorców wymagane jest 420 mL 70% MeOH.</li>
	<li>Przygotować 20 mM octanu sodu (NaOAc) (pH = 5.5) poprzez dodanie 0,82 g NaOAc lub 1,36 g NaOAc x 3 H2O do 500 mL wody; pH skorygować za pomocą chlorku wodoru (HCl). Przechowywać NaOAc w lodówce. Dla 100 próbek i 5 wzorców wymagane jest 370 mL 20 mM NaOAc (pH = 5.5) w wodzie.</li>
	<li>W celu przygotowania materiału do kolumny zmieszać 10 g sieciowanego żelu dekstranowego (typ G-25) ze 125 mL wody ultraczystej. Powstałą mieszaninę przechowywać w lodówce (4 °C).</li>
	<li>Przygotowanie roztworu sulfatazy
	<ol>
		<li>Rozpuścić 10 000 jednostek arylsulfatazy (typ H-1 z Helix pomatia) w 30 mL wody ultraczystej i dodać 30 mL etanolu bezwodnego (EtOH). Dokładnie wymieszać roztwór i przelać go do jednej probówki wirówkowej o pojemności 250 mL lub do kilku mniejszych probówek, w zależności od dostępności.</li>
		<li>Wirować mieszaninę przy 2 650 x g przez 20 min w temperaturze pokojowej (RT). Przenieść nadpłyn(y) do zlewki; dodać 90 mL EtOH i wymieszać. Wirować mieszaninę w jednej lub kilku probówkach wirówkowych przy 1 030 x g przez 15 min w RT.</li>
		<li>Odlać nadpłyny. Rozpuścić i połączyć osady w łącznie 25 mL wody ultraczystej. Dokładnie wymieszać na wortexie, rozdzielić do probówek 1-mL i przechowywać w zamrażarce w temperaturze -20 °C; roztwór zachowa stabilność przez co najmniej rok.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotowanie roztworu wzorcowego sinigryny
	<ol>
		<li>Odważyć około 9 mg monohydratu sinigryny z dokładnością do 1 µg (np. 8,769 mg). Przenieść go do kolby miarowej o pojemności 10 mL i rozpuścić monohydrat sinigryny w 10,0 mL wody ultraczystej.</li>
		<li>Obliczyć molarność roztworu zapasowego i przygotować pięć wzorców sinigryny o stężeniach od 50 do 750 µM poprzez rozcieńczenie roztworu zapasowego. Szczegółowy przykład znajduje się w <a href="http://cloudfront.jove.com/files/ftp_upload/55425/20160918GrosservanDamJoVEGlucosinolates_S1.docx" target="_blank">Pliku uzupełniającym S1</a>.</li>
		<li>Rozdzielić poszczególne wzorce sinigryny do probówek reakcyjnych 1,5-mL i zamrozić je w temperaturze -20 °C. W każdej partii ekstrakcji należy uwzględnić serię pięciu wzorców sinigryny. Podczas obliczania stężeń zawsze należy używać aktualnych wartości molarności dla stosowanych wzorców sinigryny.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Przygotowanie układu do ekstrakcji
<ol>
	<li>Przygotować statyw na kolumny z pipet Pasteura (przygotowanie kolumn opisano w kroku 3.1). Oznaczyć statyw lub kolumny, aby zachować kontrolę nad numeracją próbek (patrz Rycina 1).</li>
	<li>Przygotować blok zawierający taką samą liczbę oznakowanych probówek do mikrowirówki o pojemności 2 mL (patrz krok 3.3 oraz Rycina 1)</li>
</ol>
<img alt="System do chromatograficznego rozdziału DNA; zestaw obejmuje dołki na próbki i pipety, schemat badawczy." src="/files/ftp_upload/55425/55425fig1.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1: Statyw do ekstrakcji glukozynolatów. Widok z przodu (lewo) i z góry (prawo) wykonanego samodzielnie statywu i bloku kolumnowego do ekstrakcji glukozynolatów. Wysokość: 100 mm, odległość między przesuniętymi otworami (do trzymania kolumn z pipet Pasteura): 30 mm (oś x) x 15 mm (oś y). <a href="http://cloudfront.jove.com/files/ftp_upload/55425/55425fig1large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
3. Przygotowanie kolumn i probówek do mikrowirówki
<ol>
	<li>Przygotuj jedną kolumnę na każdą próbkę oraz pięć dodatkowych kolumn dla pięciu próbek referencyjnych sinigryny.
	<ol>
		<li>Do każdej szklanej pipety włóż kawałek wełny szklanej o wymiarach około 1 cm x 1 cm. Za pomocą drewnianego lub szklanego pręcika dociśnij wełnę szklaną do miejsca, w którym pipeta się zwęża. Wełna szklana powinna zapobiegać wysypywaniu się materiału kolumny, jednak nie należy używać jej zbyt dużo, aby nie spowolnić elucji z kolumn. Podczas pracy z wełną szklaną należy nosić rękawiczki.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Umieść kolumny w statywie do kolumn (patrz Rysunek 1). Statyw do kolumn ustaw w kuwecie laboratoryjnej (pojemniku na odpady), aby zbierać eluenty zużyte podczas kolejnych przemywań kolumn.</li>
	<li>Odetnij pierwsze 5 mm końcówki plastikowego tipsa o pojemności 1 mL i naniósz 0,5 mL przygotowanego materiału kolumny (żel G-25 w wodzie, patrz krok 1.3) do każdej kolumny. Przed pipetowaniem dobrze wstrząśnij butelką z materiałem kolumny. Kolumny nieszczelne (w których materiał G-25 wypływa przez warstwę wełny szklanej) należy odrzucić i zastąpić nowymi.
	<ol>
		<li>Po naniosieniu materiału do kolumn dodaj 1 mL wody ultrapure, aby przepłukać i ubić materiał.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotuj jedną probówkę reakcyjną o pojemności 2 mL na każdą próbkę oraz pięć probówek dla pięciu próbek referencyjnych sinigryny; opisz je. Za pomocą igły preparacyjnej wykonaj otwory w zakrętkach na potrzeby późniejszej liofilizacji i umieść przygotowane probówki w bloku na probówki w dokładnie takim samym układzie jak kolumny (krok 2.2, patrz Rysunek 1).</li>
</ol>
4. Ekstrakcja glukozynolanów
<ol>
	<li>Odważ liofilizowany i drobno zmielony materiał roślinny (zazwyczaj 50,0-100,0 mg suchej masy; końcowe stężenia glukozynolanów w ekstrakcie powinny mieścić się w zakresie krzywej wzorcowej) z dokładnością do 0,1 mg do opisanych probówek reakcyjnych o objętości 2 mL z okrągłym dnem. Do każdej probówki dodaj dwie małe kulki metalowe (o średnicy 3 mm) jako inhibitory wrzenia. 
	UWAGA: Protokół można zastosować również do świeżych materiałów błyskawicznie zamrożonych, które zostały zmielone w ciekłym azocie i przechowywane w zamrożeniu do momentu ekstrakcji. W celu skompensowania rozcieńczenia wodą zawartą w materiałach, należy zwiększyć ilość odważonego materiału do ekstrakcji oraz zwiększyć stężenie MeOH w cieczy ekstrakcyjnej do 85%19.</li>
	<li>Do każdej probówki pipetuj 1 mL 70% MeOH i krótko wymieszaj na wortexie. Zamknij probówki i zabezpiecz je korkami ochronnymi, a następnie umieść je jak najszybciej w łaźni wodnej (90-92 °C) na kilka minut (~5 min), aż 70% MeOH zacznie wrzeć. Uwaga: Podczas tego kroku należy nosić okulary ochronne!</li>
	<li>Umieść probówki z próbkami w kąpieli ultradźwiękowej na 15 min. W międzyczasie wyjmij sulfatazę oraz pięć wzorców sinigryny z zamrażarki, aby rozmroziły się w temperaturze pokojowej (RT).</li>
	<li>Po sonikacji odwiruj probówki z próbkami w wirówce stołowej przy 2 700 x g przez 10 min w RT; w każdej probówce powinien powstać osad. Przenieś nadsączniki do opisanych kolumnek i pipetuj pięć próbek wzorcowych na osobne kolonki.
	<ol>
		<li>Podczas pipetowania nadsączników trzymaj końcówkę wysoko nad osadem, aby uniknąć pobrania materiału roślinnego. Należy pamiętać, że w przypadku stosowania próbek suchych objętość nadsącznika będzie mniejsza niż 1,0 mL.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Do pozostałych osadów w probówkach z próbkami dodaj 1 mL 70% MeOH i wymieszaj probówki na wortexie, a następnie umieść je w kąpieli ultradźwiękowej na 15 min. Ponownie odwiruj probówki, zgodnie z krokiem 4.4, i przenieś nadsączniki do odpowiednich kolumnek; ze względu na właściwości materiału kolumienki, ujemnie naładowana grupa siarczanowa glukozynolanów zostanie specyficznie zatrzymana na kolumnie.</li>
	<li>Przemyj kolonki ekstraktami w trzech kolejnych krokach.
	<ol>
		<li>Pipetuj 2 x 1 mL 70% MeOH na każdą kolonkę. Odczekaj, aż kolumna całkowicie wyschnie przed dodaniem kolejnego 1 mL; pozwoli to usunąć z ekstraktów więcej związków apolarnych (np. chlorofilu).</li>
		<li>Wypłucz MeOH, dodając 1 mL wody ultrapurej do każdej kolonki.</li>
		<li>Pipetuj 2 x 1 mL buforu 20 mM NaOAc do każdej kolonki, aby stworzyć optymalne warunki dla reakcji sulfatazy.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wyjmij statyw z kolonkami z tacki na odpady i osusz stopki statywu chusteczką. Umieść statyw nad blokiem z fiolkami i opisanymi probówkami. Upewnij się, że każda końcówka kolonki znajduje się w odpowiadającej jej opisanej probówce 2-mL (patrz Rysunek 1).</li>
	<li>Dodaj 20 µL roztworu sulfatazy do kolumnek. Upewnij się, że sulfataza dotarła do powierzchni materiału kolumienki. Pipetuj 50 µL buforu NaOAc na każdą kolonkę, aby wypłukać sulfatazę w dół. Przykryj kolonki folią aluminiową i pozostaw na noc. 
	UWAGA: Dzięki aktywności sulfatazy grupa siarczanowa zostanie usunięta, uwalniając desulfoglukozynolany z kolumny, co umożliwi ich elucję wodą. Szczegółowy opis znajduje się w pracy Crocoll et al.19.</li>
	<li>Następnego dnia eluuj desulfoglukozynolany, pipetując 2 x 0,75 mL wody ultrapurej na każdą kolonkę. Gdy wszystkie kolonki wyschną, podnieś statyw i wyjmij go z probówek reakcyjnych.
	<ol>
		<li>Zakręć probówki (upewnij się, że w korkach znajdują się otwory) i zamroź je w ciekłym azocie lub w zamrażarce -80 °C przez 30 min. Liofilizuj próbki przez 12-24 h (w zależności od liczby próbek i wydajności liofilizatora), aby usunąć całą wodę.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Po liofilizacji rozpuść pozostałość w dokładnej objętości (zazwyczaj 1,0 mL) wody ultrapurej. Przenieś próbki oraz pięć wzorców sinigryny do opisanych fiolek HPLC. Przechowuj próbki w lodówce (4 °C) do dwóch tygodni lub w zamrażarce (-20 °C) do jednego roku przed analizą metodą HPLC.</li>
	<li>Pozostaw szklane kolonki do wyschnięcia pod wyciągiem przez noc, a następnie zutylizuj je po wyschnięciu. Odzyskaj kulki metalowe z probówek z próbkami użytych w kroku 4.5 do ponownego wykorzystania, a probówki wyrzuć do pojemnika na odpady.</li>
</ol>
5. Pomiary HPLC ekstrahowanych próbek
<ol>
	<li>Rozdziel glukozynolaty na kolumnie C18 w fazie odwróconej (4,6 x 150 mm, 3 µm, 300 Å), stosując gradient acetonitrylan-woda (patrz Tabela 1), przepływ 0,75 mL/min oraz temperaturę kolumny 40 °C. Wykonaj detekcję i kwantyfikację przy 229 nm.</li>
	<li>Zmień pomiar wzorców sinigryny na tej samej kolumnie, ale przy zastosowaniu dostosowanej metody gradientowej w celu zmniejszenia zużycia rozpuszczalnika (patrz Tabela 2). Rozpocznij od wstrzyknięcia pięciu wzorców sinigryny, zaczynając od wzorca o najniższym stężeniu. Następnie wstrzykuj próbki, wykonując wtrysk metanolu (ślepa próba) po każdej dziesiątej próbce, aby oczyścić kolumnę i zapobiec przenoszeniu pików.</li>
</ol>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Czas [min]</td>
			<td>Przepływ [mL/min]</td>
			<td>Woda A</td>
			<td>% ACN (acetonitrylu)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1</td>
			<td>0.750</td>
			<td>98</td>
			<td>2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>35</td>
			<td>0.750</td>
			<td>65</td>
			<td>35</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>40</td>
			<td>0.750</td>
			<td>98</td>
			<td>2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">Temperatura kolumny 40 °C.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 1: Gradient acetonitrylno-wodny dla rozdziału i analizy glukozynolatów za pomocą HPLC w odwróconej fazie.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Czas [min]</td>
			<td>Przepływ [ml/min]</td>
			<td>Woda A</td>
			<td>% ACN (acetonitrylu)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1</td>
			<td>0.750</td>
			<td>98</td>
			<td>2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10</td>
			<td>0.750</td>
			<td>89.3</td>
			<td>10.7</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>11</td>
			<td>0.750</td>
			<td>98</td>
			<td>2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">Temperatura kolumny 40 °C.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 2: Skrócony gradient acetonitrylan-woda do oznaczania pięciu wzorców sinigryny wykorzystanych do ilościowego oznaczenia glukozynolatów.
6. Identyfikacja i oznaczanie ilościowe glukozynolanów
<ol>
	<li>Identyfikacja
	<ol>
		<li>Porównaj widma UV i czasy retencji piku w próbkach z komercyjnie dostępnymi, czystymi wzorcami glukozynolanów. Przykłady widm UV dla różnych klas glukozynolanów przedstawiono na Rysunku 2.</li>
		<li>Jeśli to możliwe, zidentyfikuj nieznane glukozynolany za pomocą standardów referencyjnych lub metodą LC-MS18,19.</li>
		<li>Jeśli to możliwe, zidentyfikuj nieznane glukozynolany za pomocą spektroskopii jądrowego rezonansu magnetycznego (NMR).</li>
		<li>Porównaj widma UV i czasy retencji pików z danymi na Rysunku 2 i w Tabeli 3, bazami danych lub literaturą przedmiotu.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
<img alt="Schemat widm absorpcji UV-Vis przedstawiający różne próbki analizowane pod kątem charakterystyki widmowej." src="/files/ftp_upload/55425/55425fig2.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rycina 2"> 
Rycina 2. Widma UV najczęstszych klas glukozynolanów. Widma absorpcji UV (200-350 nm) sześciu desulfoglukozynolanów (GSL), opracowane na podstawie roztworów przygotowanych z komercyjnie dostępnych związków wzorcowych wyekstrahowanych zgodnie z opisem, reprezentujące najczęstsze klasy strukturalne. Podano nazwę zwyczajową, nazwę strukturalną (w nawiasach) oraz klasę strukturalną. (A) Sinigryna (2-propenylowy GSL), alkenylowy; (B) glukoerucyna (4-metyltiobutylowy GSL), tioalkenylowy; (C) glukorafanina (4-metylsulfinylobutylowy GSL), sulfinylowy; (D) glukobrassycyna (indol-3-ylo-metylowy GSL), indolowy; (E) glukonasturtiina (2-fenyloetylowy GSL), aromatyczny; (F) sinalbina (4-hydroksybenzylowy GSL), aromatyczny. <a href="http://cloudfront.jove.com/files/ftp_upload/55425/55425fig2large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<ol start="2">
	<li>Oznaczanie ilościowe
	<ol>
		<li>Oblicz pole pod pikami dla pięciu wzorców sinigryny oraz dla próbek.</li>
		<li>Wyznacz krzywą kalibracyjną dla pięciu zmierzonych wzorców sinigryny na podstawie obliczonego pola. Użyj równania linii regresji (patrz Równanie 1), aby obliczyć interpolowaną ilość glukozynolanów (patrz Równanie 2).</li>
		<li>Aby obliczyć stężenie poszczególnych glukozynolanów, pomnóż interpolowaną ilość (x) przez współczynnik odpowiedzi (M) dla detekcji przy 229 nm według EC (1990)16, Buchnera (1987)15 lub Browna et al. (1993)17; konsensusowe współczynniki odpowiedzi dla najczęściej wykrywanych desulfoglukozynolanów podano w Tabeli 3. 
		UWAGA: Współczynniki odpowiedzi mogą różnić się w zależności od systemu – może to być przyczyną podawania różnych wartości w różnych źródłach (patrz Bibliografia 15-17). Niemniej jednak wartości te są zazwyczaj zbliżone i mieszczą się w podobnym zakresie dla poszczególnych klas strukturalnych. Zgodnie z przyjętą konwencją, przyjmij współczynnik odpowiedzi dla niezidentyfikowanych glukozynolanów równy 1, choć w przypadku nieznanych glukozynolanów indolowych o spektrum UV podobnym do glukobrassycyny i innych glukozynolanów indolowych (Rycina 2), zaleca się użycie wartości 0,25 jako współczynnika odpowiedzi, aby uzyskać realistyczną szacunkową wartość stężenia (Tabela 3).</li>
		<li>Aby obliczyć końcową ilość glukozynolanów (xt) w próbce, uwzględnij czynnik rozcieńczenia (D) oraz masę próbki (w) użytej do analizy (patrz Równanie 3). 
		<img alt="Równanie liniowe y=mx+c symbolizuje postać równania prostej z nachyleniem i wyrazem wolnym, kluczową dla nauki algebry." src="/files/ftp_upload/55425/55425eq1.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Równanie"> (1) 
		<img alt="Równanie liniowe rozwiązane dla x, formuła: \(x=\frac{y-c}{m}\)." src="/files/ftp_upload/55425/55425eq2.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Równanie"> (2) 
		<img alt="Równanie równowagi statycznej ze zmiennymi i symbolami w formule edukacyjnej." src="/files/ftp_upload/55425/55425eq3.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Równanie"> (3) 
		y = Pole piku 
		m = nachylenie 5-punktowej krzywej regresji wzorca 
		c = punkt przecięcia linii regresji z osią y 
		x = ilość glukozynolanów w ekstrakcie 
		xt = stężenie glukozynolanów w próbce roślinnej 
		D = czynnik rozcieńczenia 
		M = współczynnik odpowiedzi dla detekcji przy 229 nm według Buchnera (1987) lub Browna et al. (1993) 
		w = masa próbki użytej do ekstrakcji</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Hartmann, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((From+waste+products+to+ecochemicals%3A+Fifty+years+research+of+plant+secondary+metabolism%5BTitle%5D)+AND+%22Phytochemistry%22%5BJournal%5D)">From waste products to ecochemicals: Fifty years research of plant secondary metabolism.</a> Phytochemistry. 68 (22-24), 2831-2846 (2007).</li>
<li>Will, H., Laubenheimer, A. <a target="_blank" href="http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/jlac.18791990109/abstract">Ueber das Glucosid des weissen Senfsamens.</a> Justus Liebigs Annalen der Chemie. 199 (1), 150-164 (1879).</li>
<li>Agerbirk, N., Olsen, C. E. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/22405332">Glucosinolate structures in evolution.</a> Phytochemistry. 77, 16-45 (2012).</li>
<li>Halkier, B. A., Gershenzon, J. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/16669764">Biology and biochemistry of glucosinolates.</a> Ann Rev Plant Biol. 57, 303-333 (2006).</li>
<li>Sønderby, I. E., Geu-Flores, F., Halkier, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biosynthesis+of+glucosinolates+-+gene+discovery+and+beyond%5BTitle%5D)+AND+%22TIPS%22%5BJournal%5D)">Biosynthesis of glucosinolates - gene discovery and beyond.</a> TIPS. 15 (5), 283-290 (2010).</li>
<li>Kliebenstein, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+control+of+natural+variation+in+Arabidopsis+glucosinolate+accumulation%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiol%22%5BJournal%5D)">Genetic control of natural variation in Arabidopsis glucosinolate accumulation.</a> Plant Physiol. 126 (2), 811-825 (2001).</li>
<li>van Leur, H., Raaijmakers, C. E., van Dam, N. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+heritable+glucosinolate+polymorphism+within+natural+populations+of+Barbarea+vulgaris%5BTitle%5D)+AND+%22Phytochemistry%22%5BJournal%5D)">A heritable glucosinolate polymorphism within natural populations of Barbarea vulgaris.</a> Phytochemistry. 67 (12), 1214-1223 (2006).</li>
<li>Kelly, P. J., Bones, A., Rossiter, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sub-cellular+immunolocalization+of+the+glucosinolate+sinigrin+in+seedlings+of+Brassica+juncea%5BTitle%5D)+AND+%22Planta%22%5BJournal%5D)">Sub-cellular immunolocalization of the glucosinolate sinigrin in seedlings of Brassica juncea.</a> Planta. 206 (3), 370-377 (1998).</li>
<li>van Dam, N. M., Tytgat, T. O. G., Kirkegaard, J. A. <a target="_blank" href="https://link.springer.com/article/10.1007/s11101-008-9101-9">Root and shoot glucosinolates: a comparison of their diversity, function and interactions in natural and managed ecosystems.</a> Phytochem Rev. 8 (1), 171-186 (2009).</li>
<li>Ratzka, A., Vogel, H., Kliebenstein, D. J., Mitchell-Olds, T., Kroymann, J. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/12161563">Disarming the mustard oil bomb.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 99 (17), 11223-11228 (2002).</li>
<li>Wittstock, U., Kliebenstein, D. J., Lambrix, V., Reichelt, M., Gershenson, J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWittstock%2C+U+%22Integrative+Phytochemistry%3A+From+ethnobotany+to+molecular+ecology%3A+Recent+Advances+in+Phytochemistry%22">Integrative Phytochemistry: From ethnobotany to molecular ecology: Recent Advances in Phytochemistry</a>. Romeo, J. T. 37, Ch. 5 Pergamon (2003).</li>
<li>Hopkins, R. J., van Dam, N. M., van Loon, J. J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+glucosinolates+in+insect-plant+relationships+and+multitrophic+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Rev+Entomol%22%5BJournal%5D)">Role of glucosinolates in insect-plant relationships and multitrophic interactions.</a> Ann Rev Entomol. 54 (1), 57(2009).</li>
<li>Kliebenstein, D. J., Gershenzon, J., Mitchell-Olds, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+quantitative+trait+loci+mapping+of+aliphatic%2C+indolic+and+benzylic+glucosinolate+production+in+Arabidopsis+thaliana+leaves+and+seeds%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Comparative quantitative trait loci mapping of aliphatic, indolic and benzylic glucosinolate production in Arabidopsis thaliana leaves and seeds.</a> Genetics. 159 (1), 359-370 (2001).</li>
<li>Mithen, R., Bennett, R., Marquez, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glucosinolate+biochemical+diversity+and+innovation+in+the+Brassicales%5BTitle%5D)+AND+%22Phytochemistry%22%5BJournal%5D)">Glucosinolate biochemical diversity and innovation in the Brassicales.</a> Phytochemistry. 71 (17-18), 2074-2086 (2010).</li>
<li>Buchner, R. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBuchner%2C+R+%22Glucosinolates+in+rapeseed%22">Glucosinolates in rapeseed</a>. Wathelet, J. P. , Martinus Nijhoff Publishers. 50-58 (1987).</li>
<li>Oil seeds - determination of glucosinolates High Perfomance Liquid Chromatography. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Official+Journal+of+the+European+Communities%22">Official Journal of the European Communities</a>. , L 170/28. Annex VIII 03.07 27-34 (1990).</li>
<li>Brown, P. D., Tokuhisa, J. G., Reichelt, M., Gershenzon, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Variation+of+glucosinolate+accumulation+among+different+organs+and+developmental+stages+of+Arabidopsis+thaliana%5BTitle%5D)+AND+%22Phytochemistry%22%5BJournal%5D)">Variation of glucosinolate accumulation among different organs and developmental stages of Arabidopsis thaliana.</a> Phytochemistry. 62 (3), 471-481 (2003).</li>
<li>Glauser, G., Schweizer, F., Turlings, T. C. J., Reymond, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+Profiling+of+Intact+Glucosinolates+in+Arabidopsis+Leaves+by+UHPLC-QTOFMS+Using+a+Charged+Surface+Hybrid+Column%5BTitle%5D)+AND+%22Phytochem+Analysis%22%5BJournal%5D)">Rapid Profiling of Intact Glucosinolates in Arabidopsis Leaves by UHPLC-QTOFMS Using a Charged Surface Hybrid Column.</a> Phytochem Analysis. 23 (5), 520-528 (2012).</li>
<li>Crocoll, C., Halkier, B. A., Burow, M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aCrocoll%2C+C+%22Current+Protocols+in+Plant+Biology%22">Current Protocols in Plant Biology</a>. , John Wiley & Sons, Inc. (2016).</li>
<li>Griffiths, D. W., Bain, H., Deighton, N., Botting, N. P., Robertson, A. A. B. <a target="_blank" href="https://pubag.nal.usda.gov/pubag/article.xhtml?id=1446175">Evaluation of liquid chromatography-atmospheric pressure chemical ionisation-mass spectrometry for the identification and quantification of desulphoglucosinolates.</a> Phytochem Analysis. 11 (4), 216-225 (2000).</li>
<li>Gimsing, A. L., Kirkegaard, J. A. <a target="_blank" href="https://link.springer.com/article/10.1007/s11101-008-9105-5">Glucosinolates and biofumigation: fate of glucosinolates and their hydrolysis products in soil.</a> Phytochem Rev. 8 (1), 299-310 (2009).</li>
<li>Fahey, J. W., Zalcmann, A. T., Talalay, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+chemical+diversity+and+distribution+of+glucosinolates+and+isothiocyanates+among+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Phytochemistry%22%5BJournal%5D)">The chemical diversity and distribution of glucosinolates and isothiocyanates among plants.</a> Phytochemistry. 56, 5-51 (2001).</li>
<li>de Graaf, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+identification+of+4-%CE%B1-rhamnosyloxy+benzyl+glucosinolate+in+Noccaea+caerulescens+showing+intraspecific+variation%5BTitle%5D)+AND+%22Phytochemistry%22%5BJournal%5D)">Isolation and identification of 4-α-rhamnosyloxy benzyl glucosinolate in Noccaea caerulescens showing intraspecific variation.</a> Phytochemistry. 110 (0), 166-171 (2015).</li>
<li>van Dam, N. M., Raaijmakers, C. E. <a target="_blank" href="https://link.springer.com/article/10.1007/s00049-005-0323-7">Local and systemic induced responses to cabbage root fly larvae (Delia radicum) in Brassica nigra and B. oleracea.</a> Chemoecology. 16 (1), 17-24 (2006).</li>
<li>Gols, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S1439179106000892">Temporal changes affect plant chemistry and tritrophic interactions.</a> Bas Appl Ecol. 8 (5), 421-433 (2007).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Największymi zaletami tej uznanej i szeroko stosowanej metody jest to, że jest solidna, dość prosta i stosunkowo tania w przeliczeniu na próbkę. Większość sprzętu potrzebnego do ekstrakcji i analizy powinna być dostępna w standardowym laboratorium lub może być zbudowana samodzielnie, z wyjątkiem HPLC-PDA. Kolejną zaletą jest to, że desulfoglucozynolany rozpuszczone w wodzie są chemicznie dość stabilne, gdy są przechowywane w chłodnych i hermetycznych fiolkach (HPLC), dzięki czemu ekstrakty można łatwo wysłać do analizy HPLC w inne miejsce. W przeciwieństwie do platform LC-MS, które wymagają specjalistycznego szkolenia i rozległego doświadczenia praktycznego w zarządzaniu oprogramowaniem i analizie danych, HPLC-UV/PDA można łatwo uruchomić po krótkim okresie szkolenia. To nie tylko obniża koszty zabiegu, ale także sprawia, że metoda ta jest bardziej dostępna dla szerokiego grona naukowców, w tym studentów.
Ogólnie rzecz biorąc, przy starannym przestrzeganiu opisanych powyżej procedur powinno wystąpić kilka problemów. Ogólnie rzecz biorąc, piki glukozynolanu są bardzo dobrze oddzielone w chromatogramie. Jeśli tak nie jest, program gradientu można dostosować poprzez zmniejszenie szybkości wzrostu acetonitrylu w eluencie. Alternatywnie, zbudowanie nowej kolumny wstępnej (200-500 wstrzyknięć) lub kolumny (1500-2000 wstrzyknięć) może rozwiązać ten problem. Niekiedy chromatogramy pojedynczych próbek w partii mogą wykazywać bardzo małe piki lub nie wykazywać ich wcale. Jest to zwykle spowodowane błędami pipetowania podczas dodawania sulfatazy (np . kolumna została pominięta lub sulfataza nie została prawidłowo wypłukana do kolumny). Alternatywnie, stężenie glukozynolanu w materiałach doświadczalnych mogło być niższe niż oczekiwano, a do ekstrakcji użyto zbyt małej ilości materiału. W tym drugim przypadku objętość wstrzykniętego ekstraktu można zwiększyć do 100 μl lub zagęścić dokładną podwielokrotność (np . 800 μl) ekstraktu. To ostatnie można osiągnąć poprzez liofilizację ekstraktu, rozpuszczenie pozostałości w mniejszej objętości (np . 100 μl) wody i ponowne wstrzyknięcie przy użyciu tej samej krzywej odniesienia. W obliczeniach dotyczących pierwotnego stężenia ekstraktu liczby należy pomnożyć przez współczynnik rozcieńczenia. Jeśli to nie rozwiąże problemu, materiały należy ponownie wydobyć przy użyciu większej ilości materiału wyjściowego. Jeżeli jest to więcej niż 100 mg, objętość rozpuszczalników ekstrakcyjnych i rozmiar probówek należy dostosować proporcjonalnie, aby utrzymać wydajność ekstrakcji.
Dodatkowym atutem jest to, że metoda ta została dobrze zwalidowana. Wynika to z faktu, że została ona opisana jako standardowa metoda oznaczania ilościowego glukozynolanów w rzepaku, dla której procedury i dokładność zostały potwierdzone w kilku laboratoriach16. Ponadto podłoże genetyczne, biosynteza i funkcje biologiczne glukozynolanów są przedmiotem intensywnych badań, m.in. nad modelowym gatunkiem roślin Arabidopsis thaliana 4,6,12. W związku z tym wiele czynników odpowiedzi dla dokładnej kwantyfikacji desulfoglucozynolianów w odniesieniu do sinigryny jest dobrze zdefiniowanych i publicznie dostępnych15,17. Mimo że protokoły oparte na LS-MS są bardziej przepustowe, bardziej czułe i są w stanie (wstępnie) zidentyfikować glukozynolany, dla których nie są dostępne żadne normy 18,19,20, brak uniwersalnych współczynników odpowiedzi dla LC-MS ogranicza dokładną kwantyfikację stężeń glukozynolanu18. Co więcej, metody te zwykle nie obejmują etapu liofilizacji, a ilość wody w świeżym materiale roślinnym nie jest uwzględniana w obliczeniach, co utrudnia dokładne określenie ilościowe. Wreszcie, ponieważ nasza metoda ekstrakcji obejmuje etap oczyszczania i zatężania oparty na kolumnie, może być również stosowana do "brudnych" próbek o niskim stężeniu glukozynolanów, takich jak gleby21.
W porównaniu z metodami opartymi na LC-MS, które zwykle ekstrahują świeżo zamrożone materiały, używają 96-dołkowych płytek do ekstrakcji i nie zawierają krokusulfatazy 18,19, nasza metoda jest stosunkowo czasochłonna i pracochłonna. Dzięki stojakom kolumnowym opisanym w tym artykule, jedna osoba może pobrać około 100-150 próbek w ciągu jednego dnia. Elucja (następnego dnia), liofilizacja (przez noc) i ponowne rozpuszczenie mogą nastąpić w ciągu następnych dwóch dni. Dzięki zautomatyzowanemu wtryskiwaczowi HPLC, czasowi pracy i równoważenia wynoszącemu 40-45 minut na wstrzyknięcie oraz braku nieprzewidzianych zdarzeń, uzyskanie danych dla tego zestawu próbek zajęłoby 3-4 dni. W przypadku gdy oprogramowanie HPLC umożliwia automatyczną kwantyfikację na podstawie krzywej sinigryny, ręczna kontrola chromatogramów i przypisania pików dla 100 próbek może zająć tylko kolejną 1 lub 2 godziny, zanim dane będą mogły być wykorzystane do analiz statystycznych.
Pomimo rosnącej dostępności wzorców glukozynolanu, tylko niewielka część z ponad 130 kandydatów może być obecnie kupiona na rynku. Jednak z kilkoma odniesieniami dla każdej z klas biosyntezy; dostęp do baz danych literaturowych określających związki występujące wcześniej w gatunkach roślin (np. Fahey i wsp.Rozdział 22); podstawowa znajomość zasad chromatograficznych, takich jak logika szeregów eluotropowych (np. dla rosnącej liczby C w łańcuchu bocznym w związkach alifatycznych, rysunki 3 i 4); oraz walidację pojedynczych próbek na LC-MS19 lub izolowanych glukozynolanów na NMR23, można łatwo przezwyciężyć to ograniczenie. Większość protokołów analiz glukozynolanu wykorzystuje wewnętrzne krzywe odniesienia (tj. określone stężenie do ekstrakcji sinigryny lub sinalbiny do rozpuszczalnika ekstrakcyjnego 16,17,19). Zasadniczo wewnętrzne krzywe odniesienia są bardziej odpowiednie do korygowania błędów przetwarzania poszczególnych próbek, a tym samym teoretycznie zapewniają wyższą precyzję. Pomimo tej przewagi preferujemy stosowanie pięciopunktowej zewnętrznej krzywej odniesienia, ponieważ często analizujemy różne dzikie gatunki, z których niektóre zawierają wysoki poziom sinigryny (np. Brassica nigra24) lub sinalbiny (np. Sinapis alba25), dwóch odniesień glukozynolanu, dla których dostępne są czynniki odpowiedzi. Co więcej, dodanie wewnętrznych wzorców do każdej próbki zwiększa koszt analiz, ponieważ wzorce referencyjne glukozynolanu wysokiej jakości są zwykle dość drogie.
Podsumowując, pomimo czasochłonnych kroków, protokół ten zapewnia prostą i dostępną metodę ekstrakcji i ilościowego oznaczania glukozynolanów w próbkach roślinnych. Należy jednak wziąć pod uwagę, że poziomy glukozynolanu same w sobie są jedynie wskaźnikiem potencjalnej aktywności biologicznej, postrzeganej jako konieczność reakcji z mirozynazą, a różnice w produktach reakcji mogą wynikać z pojedynczego glukozynolanu11. W celu potwierdzenia znaczenia biologicznego należy przeprowadzić testy walidacyjne.

Szacuje się, że rośliny produkują ponad 200 000 różnych rodzajów związków chemicznych1. Wydaje się, że tylko mniejszość tych związków odgrywa rolę w pierwotnym metabolizmie roślin, który napędza wzrost i rozmnażanie; Większość z nich to tak zwane metabolity wtórne. Pomimo swojej nazwy, metabolity wtórne są często krytyczne dla przetrwania i rozmnażania roślin, ponieważ służą do przyciągania zapylaczy lub obrony rośliny przed patogenami i roślinożercami1.
Glukozynolany to bardzo zróżnicowana klasa metabolitów wtórnych, które były badane przez ponad 150 lat2. Do tej pory zidentyfikowano ponad 130 strukturalnie różnych glukozynolanów3. Ogólnie rzecz biorąc, glukozynolany można podzielić na różne klasy w zależności od aminokwasu, z którego są syntetyzowane. Na przykład glukozynolany indolu są syntetyzowane z aminokwasu tryptofanu, podczas gdy fenyloalanina stanowi szkielet podstawowy do syntezy aromatycznych glukozynolanów4. W obrębie klas występuje wysoki poziom różnorodności strukturalnej, który jest spowodowany sekwencyjnymi etapami wydłużania łańcuchów w szlakach biosyntezy, takich jak klasa glikozynolanów alifatycznych, lub modyfikacjami łańcucha bocznego (np. hydroksylacja)4,5. Jeden gatunek rośliny glukozynolanu może zawierać do 37 różnych glukozynolanów należących do różnych klas strukturalnych6. Mimo że gatunki roślin mają typowe profile glukozynolanu, wewnątrzgatunkowe różnice w typach glukozynolanów są często spotykane wśród osobników i populacji6,7. Nienaruszone glukozynolany są przechowywane w wakuolach komórek roślinnych i można je znaleźć w każdym organie naziemnym lub podziemnym7,8,9. Po rozpadzie komórki (np. przez roślinożerność) glukozynolany są uwalniane i mieszane z enzymem mirozynazą, uruchamiając bombę z olejkiem musztardowym10. Ze względu na aktywność mirozynazy i w zależności od struktury glukozynolanu, warunków reakcji i obecności enzymów modyfikujących, powstają różne ostre, toksyczne lub szkodliwe związki, takie jak nitryle i (izo)tiocyjaniany11. Produkty reakcji mają wysoką aktywność biologiczną; Na przykład służą jako środki odstraszające owady roślinożerne12. Odziedziczalność i szlaki biosyntezy glukozynolanów są dobrze zbadane, głównie ze względu na ich znaczenie dla odporności roślinożerców i patogenów, ich wartość jako składników smakowych gorczycy i kapusty oraz ich negatywny (progoitryna) i pozytywny (glukorafanina) wpływ na zdrowie człowieka5,13,14.
Ze względu na duże zainteresowanie glukozynolanami jako związkami biologicznie aktywnymi, metody ekstrakcji i wykrywania oparte na wysokociśnieniowej chromatografii cieczowej z odwróconymi fazami (HPLC) wyposażonej w detektory ultrafioletowe (UV) lub fotodiodowe (PDA) są powszechnie stosowane od lat 80<klasa sup="xref">15. W oparciu o tę metodę Wspólnoty Europejskie wydały standardowy protokół, który został przetestowany i zatwierdzony w kilku laboratoriach do analizy glukozynolanów w nasionach oleistych (Brassica napus, colza, Canola16). Inni dodali do tej metody (np. poprzez określenie dodatkowych współczynników odpowiedzi dla glukozynolanów, które nie są obecne w rzepaku)17. Pomimo rosnącej dostępności platform chromatografii cieczowej ze spektrometrią mas (LC-MS) i wysokoprzepustowych protokołów do analizy glukozynolanu18,19, oryginalna metoda HPLC-UV/PDA jest nadal szeroko stosowana przez naukowców. Głównym powodem jest to, że metoda ta jest prosta, opłacalna i stosunkowo dostępna dla laboratoriów bez rozbudowanej infrastruktury wiedzy chemiczno-analitycznej. Aby służyć tej społeczności, szczegółowo opisujemy tutaj protokół ekstrakcji glukozynolanów z materiałów roślinnych i analizy ich desulfoform za pomocą HPLC-PDA.

<table><tbody><tr><td>Metanol HiPerSolv CHROMANORM&reg; klasa gradientowa do HPLC VWR</td><td></td><td>20864.320</td><td></td></tr><tr><td>Octan sodu (NaOAc)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>W302406-1KG-K</td><td></td></tr><tr><td>HCl</td><td>VWR</td><td>1.09057.1000</td><td></td></tr><tr><td>Sephadex</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A25120-10G</td><td></td></tr><tr><td>(&minus;)-Sinigrin hydrate z chrzanu&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S1647-500MG</td><td></td></tr><tr><td>Sulfataza arylowa</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9626-10KU</td><td></td></tr><tr><td>Etanol</td><td>VWR</td><td>20816.298</td><td></td></tr><tr><td>Pipeta Pasteura</td><td>Carl Roth</td><td>4518.1</td><td></td></tr><tr><td>Wełna szklana</td><td>Carl Roth</td><td>7377.1</td><td></td></tr><tr><td>Szklany/drewniany patyczek</td><td>VWR</td><td>HERE1080766</td><td></td></tr><tr><td>2 ml probówki reakcyjne</td><td>VWR</td><td>211-2120</td><td></td></tr><tr><td>Igła preparcyjna</td><td>Carl Roth</td><td>KX93.1</td><td></td></tr><tr><td>Naczynia laboratoryjne Rotilabo</td><td>Carl Roth</td><td>0772.1</td><td>Taca na odpady</td></tr><tr><td>Klipsy uszczelniające Rotilabo</td><td>Carl Roth</td><td>N217.1</td><td></td></tr><tr><td>Liofilizator Freezone 12 L</td><td>Labconco</td><td>7960030</td><td></td></tr><tr><td>Acetonitryl o super gradiencie</td><td>VWR</td><td>83639.320</td><td></td></tr><tr><td>Łaźnia wodna</td><td>VWR</td><td>462-5112</td><td></td></tr><tr><td>Kąpiel ultradźwiękowa</td><td>Fisher Scientific</td><td>FB 15061</td><td></td></tr><tr><td>Elektroda PH</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>STARA2115</td><td></td></tr><tr><td>Wirówka Heraeus Multifuge X1</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>75004210</td><td></td></tr><tr><td>Kolumna wstępna</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>69697</td><td>Kolumna C18 (4,6 x 10 mm, 5 &mikro; m, 300 & Aring ;)&nbsp;</td></tr><tr><td>Kolumna Acclaim 300</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>60266</td><td>Kolumna C18 (4,6 x 150 mm, 3 i mikro; m, 300 & Aring ;)&nbsp;</td></tr><tr><td>HPLC Ultimate 3000</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td></td><td>z piecem kolumnowym i detektorem UV lub PDA</td></tr><tr><td>Kolba 1 000 ml</td><td>VWR</td><td>215-1595</td><td></td></tr><tr><td>Związki referencyjne glukozynolanu</td><td>Phytoplan</td><td>różne</td><td>http://www.phytoplan.de/</td></tr></tbody></table>

prosta metoda ekstrakcji i analizy glukozynolanu za pomocą wysokociśnieniowej chromatografii cieczowej (hplc)

A Straightforward Method for Glucosinolate Extraction and Analysis with High-pressure Liquid Chromatography (HPLC)

Glukozynolany to dobrze zbadana i bardzo zróżnicowana klasa naturalnych związków roślinnych. Odgrywają ważną rolę w odporności roślin, jakości oleju rzepakowego, aromatach spożywczych i zdrowiu ludzi. Aktywność biologiczna glukozynolanów jest uwalniana po uszkodzeniu tkanki, gdy są one mieszane z enzymem mirozynazą. Powoduje to powstawanie ostrych i toksycznych produktów rozpadu, takich jak izotiocyjaniany i nitryle. Obecnie zidentyfikowano ponad 130 strukturalnie różnych glukozynolanów. Struktura chemiczna glukozynolanu jest ważnym wyznacznikiem powstającego produktu, co z kolei decyduje o jego aktywności biologicznej. Te ostatnie mogą wahać się od szkodliwych (np. progoittryna) do korzystnych (np. glukorafanina). Każdy gatunek rośliny zawierający glukozynolany ma swój specyficzny profil glukozynolanu. Z tego powodu ważne jest, aby prawidłowo zidentyfikować i wiarygodnie określić ilościowo różne glukozynolany obecne w liściach kapustnych, nasionach i roślinach okopowych lub, w przypadku badań ekologicznych, u ich dzikich krewnych. W tym miejscu przedstawiamy dobrze zwalidowaną, ukierunkowaną i solidną metodę analizy profili glukozynolanu w szerokim zakresie gatunków roślin i organów roślinnych. Nienaruszone glukozynolany są ekstrahowane ze zmielonych materiałów roślinnych za pomocą mieszaniny metanolu i wody w wysokich temperaturach, aby wyłączyć aktywność mirozynazy. Następnie otrzymany ekstrakt przenosi się do kolumny jonowymiennej w celu oczyszczenia. Po leczeniu sulfatazą desulfogozynolany są eluowane wodą, a eluat jest liofilizowany. Pozostałość jest pobierana w dokładnej objętości wody, która jest analizowana za pomocą wysokociśnieniowej chromatografii cieczowej (HPLC) z detektorem fotodiodowym (PDA) lub ultrafioletowym (UV). Detekcję i kwantyfikację uzyskuje się poprzez porównanie czasów retencji i widm UV komercyjnych wzorców referencyjnych. Stężenia są obliczane na podstawie krzywej referencyjnej sinigryny i dobrze ustalonych współczynników odpowiedzi. Omówiono tutaj zalety i wady tej prostej metody w porównaniu z szybszymi i bardziej zaawansowanymi technologicznie metodami.

Metoda ta umożliwia detekcję i rozdzielenie powszechnie występujących desulfoglukozynolanów ze wszystkich klas strukturalnych (Rysunek 3). Szkodliwy 2-hydroksyglukozynolan progoitryna pojawia się stosunkowo wcześnie na chromatogramie i jest wyraźnie oddzielony od korzystnego glukozynolanu glukorafaniny, jedynego metylowylowyglukozynolanu w tej próbce. Sinigryna, glukonapina i glukobrassikanapina tworzą szereg eluotropowy alkenylowych glukozynolanów o zwiększającej się długości łańcucha bocznego (odpowiednio C3, C4 i C5). Podobny logiczny szereg jest widoczny dla dwóch metylotioalkenylowych glukozynolanów: glukoiberweryny (C3) i glukoerucyny (C4). Piki trzech glukozynolanów indolowych – glukobrassycyny oraz jej pochodnych 4-hydroksy- i 1-metoksyglukobrassycyny (neoglukobrassycyny) – są również wyraźnie rozdzielone. Należy zauważyć, że piki neoglukobrassycyny i glukoerucyny, a także glukonasturtyny, jedynego aromatycznego glukozynolanu w tej próbce, są szczególnie wysokie w tym ekstrakcie z Brassica ze względu na dodanie ekstraktów z korzeni do mieszaniny9.
<img alt="Analiza chromatograficzna; związki chemiczne; dane spektroskopowe; chromatogram; identyfikacja piku." src="/files/ftp_upload/55425/55425fig3.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rycina 3"> 
Rysunek 3: Chromatogram ekstraktu glukozynolanów. Szczegółowy widok (1-32 min) chromatogramu HPLC uzyskanego z analizy połączonych próbek korzeni i pędów z Brassica nigra, B. rapa, i B. oleracea. Etykiety pików wskazują czas retencji oraz skróty zidentyfikowanych desulfoglukozynolatów (GSL). PRO = progoitryna (GSL 2-OH-3-butenyl); RAPH = glukorafanina (GSL 4-metylsulfinylobutylowa); SIN = sinigryna (GSL 2-propenylowa); GNA = glukonapina (GSL 3-butenylowa); 4OH = 4-hydroksyglukobrassycyna; IBV = glukoiberweryna (GSL 3-metylotiopropylowa); GBN = glukobrassykanapina (GSL 4-pentenylowa); ERU = glukoerucyna (GSL 4-metylotiobutylowa); GBC = glukobrassycyna (GSL indol-3-ylo-metylowa); NAS = glukonasturtyina (GSL 2-fenyloetylowa); NEO = neoglukobrassycyna (1-MeOH-glukobrassycyna). <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/55425/55425fig3large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ilustracji.</a>
Metylsulfinylowe glukozynolaty o dłuższych łańcuchach, powszechnie występujące w roślinie modelowej Arabidopsis, wykazują również szereg eluotropowy, co widać w ekstrakcie z korzenia Rorippa austriaca. Glukohesperalina (C6), glukosiberina (C7), glukohirsutyna (C8) i glukoarabina (C9) pojawiają się w regularnych odstępach na chromatogramie (Rysunek 4). Wraz ze spektrami UV pików, takie logiczne szeregi eluotropowe mogą być wykorzystywane do klasyfikacji i wstępnej identyfikacji nieznanych glukozynolatów.
<img alt="Wynik chromatografii, wykres HPLC, czasy retencji związków, analiza chemiczna, identyfikacja pików." src="/files/ftp_upload/55425/55425fig4.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rysunek 4"> 
Rysunek 4: Chromatogram (ramka 9-30 min) desulfoglucozynolatów w ekstrakcie z korzenia Rorippa austriaca. Etykiety pików wskazują czas retencji oraz skróty dla zidentyfikowanych desulfoglucozynolatów (GSL). HES = glucohesperyna (6-metyłosulfinyloheksylowy GSL); SBE = glucosiberyna (7-metyłosulfinyloheptylowy GSL); GBC = glucobrassycyna (indol-3-ylo-metylowy GSL); HIR = glucohirsutyna (8-metyłosulfinylo-oktylowy GSL); ARA = glucoarabina (9-metyłosulfinylnonylowy glucozynolat); NEO = neoglucobrassycyna (1-MeOH-glucobrassycyna). <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/55425/55425fig4large.jpg" target="_blank">Prosimy kliknąć tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Nazwa pospolita</td>
			<td>Struktura łańcucha bocznego</td>
			<td>Rt (min)*</td>
			<td>229 nm</td>
			<td>referencja#</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>alifatyczne glukozynolaty</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glukokapparyna</td>
			<td>metylowy</td>
			<td>3.5</td>
			<td>1</td>
			<td>Brązowy</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Synigryna</td>
			<td>2-propenylo</td>
			<td>5.5</td>
			<td>1</td>
			<td>Brown, EC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gluconapin</td>
			<td>3-butenylowy</td>
			<td>9.5</td>
			<td>1.11</td>
			<td>EC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glukobrassikanapina</td>
			<td>4-pentenyl</td>
			<td>13.5</td>
			<td>1.15</td>
			<td>EC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glukoiberweryna</td>
			<td>3-metylotiopropyl</td>
			<td>10.9</td>
			<td>0.8</td>
			<td>Brązowy</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glukoerucyna</td>
			<td>4-metyltiobutylowy</td>
			<td>14.0</td>
			<td>0.9</td>
			<td>Brązowy</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucoiberina</td>
			<td>3-metylsulfinylopropyl</td>
			<td>3.7</td>
			<td>1.2</td>
			<td>Brązowy</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glukorafanin</td>
			<td>4-metylsulfinylobutyl</td>
			<td>4.9</td>
			<td>0.9</td>
			<td>Brązowy</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucoalysyna</td>
			<td>5-metylsulfinylo-pentylowy</td>
			<td>7.6</td>
			<td>0.9</td>
			<td>Brązowy</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glukohesperyna</td>
			<td>6-metylsulfinyloheksyl</td>
			<td>10.5</td>
			<td>1</td>
			<td>Brązowy</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glukosiberyna</td>
			<td>7-metylsulfinyloheptylowy</td>
			<td>13.5</td>
			<td>1</td>
			<td>Brązowy</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glukohirsutyna</td>
			<td>8-metylsulfinyloctyl</td>
			<td>16.8</td>
			<td>1.1</td>
			<td>Brązowy</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glukoarabina</td>
			<td>9-metylsulfinylnonyl</td>
			<td>20.5</td>
			<td>1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glukocheirolina</td>
			<td>3-metylsulfonylopropyl</td>
			<td>4.2</td>
			<td>0.9</td>
			<td>Brązowy</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Progoitryna</td>
			<td>2(R)-OH-3-butenyl</td>
			<td>4.5</td>
			<td>1.09</td>
			<td>Buchner, EC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glukonapoleiferyna</td>
			<td>2-hydroksy-5-pentenyl</td>
			<td>8.3</td>
			<td>1</td>
			<td>EC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>indolowe glukozynolaty</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-hydroksyglukobrassycyna</td>
			<td>4-hydroksyindolo-3-metylu</td>
			<td>11.2</td>
			<td>0.28</td>
			<td>Buchner, EC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glukobrassycyna</td>
			<td>indolo-3-metylu</td>
			<td>15.3</td>
			<td>0.29</td>
			<td>Buchner, EC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-metoksyglukobrasycyna</td>
			<td>4-metoksyindolo-3-ylo-metylowy</td>
			<td>18.2</td>
			<td>0.25</td>
			<td>Buchner, EC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neoglukobrasycyna</td>
			<td>1-metoksyindol-3-ylo-metylo</td>
			<td>22.5</td>
			<td>0.2</td>
			<td>Buchner, EC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>aromatyczne glukozynolaty</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sinalbina</td>
			<td>4-hydroksybenzylowy</td>
			<td>8.1</td>
			<td>0.5</td>
			<td>Buchner</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glukosibaryna</td>
			<td>2(R)-OH-2-fenyloetylo</td>
			<td>12.1</td>
			<td>0.95</td>
			<td>patrz dalej</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glukobarbaryna</td>
			<td>2(S)-OH-2-fenyloetyl</td>
			<td>12.7</td>
			<td>0.95</td>
			<td>lejek Buchnera</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glukotropaeolina</td>
			<td>benzylowy</td>
			<td>13.8</td>
			<td>0.95</td>
			<td>Buchner, EC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glukonasturtyina</td>
			<td>2-fenyloetylo</td>
			<td>18.0</td>
			<td>0.95</td>
			<td>Buchner, EC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>nieznana - widmo UV typu alifatycznego/aromatycznego</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>1</td>
			<td>EK</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>nieznana substancja – widmo podobne do indolu</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>0.25</td>
			<td>EC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="5">* przybliżony czas retencji (Rt) zaokrąglony do najbliższych 0,1 min (± 0,3 min w zależności od kolumny, jakości eluentu). Czas retencji wyznaczono na platformach ThermoFisher/Dionex Ultimate HPLC wyposażonych w C18 kolumna (150 x 4,6 mm, wielkość cząstek 3 mikrometry) plus C18 kolumna wstępna (10 x 4,6 mm, wielkość cząsteczek 5 μm) z programem gradientowym zgodnie z Tabela 1.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="5"># Referencje dla czynników odpowiedzi: Buchner, R. w Glucosinolates in rapeseed (red. J.P. Wathelet) 50-58 (Martinus Nijhoff Publishers, 1987); Brown, P. D., Tokuhisa, J. G., Reichelt, M. &amp; Gershenzon, J. Variation of glucosinolate accumulation among different organs and developmental stages of Arabidopsis thaliana. Phytochemistry. 62 (3), 471-481, doi:10.1016/S0031-9422(02)00549-6, (2003); EC. Nasiona oleiste – oznaczanie glukozynolanów metodą wysokosprawnej chromatografii cieczowej. Official Journal of the European Communities. L 170/28. Annex VIII 03.07.27-34 (1990).</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 3: Współczynniki odpowiedzi najczęściej występujących desulfo-glukozynolatów w ekstraktach roślinnych oraz ich przybliżone czasy retencji na kolumnach C18. Eluenty, gradient, temperatura kolumny i szybkość przepływu zgodnie z Tabelą 1.

Tutaj opisujemy bardzo szczegółowo sprawdzony i solidny protokół ekstrakcji glukozynolanów z mielonych materiałów roślinnych. Po zastosowaniu sulfatazy w kolumnie ekstraktów, desulfoglucozynolany są eluowane i analizowane za pomocą wysokociśnieniowej chromatografii cieczowej.

Prosta metoda ekstrakcji i analizy glukozynolanu za pomocą wysokociśnieniowej chromatografii cieczowej (HPLC)

Glucosinolates are a well-studied and highly diverse class of natural plant compounds. They play important roles in plant resistance, rapeseed oil ...

Ogólnym celem niniejszego protokołu jest przeprowadzenie prostej i przejrzystej analizy glukozynolanów w roślinach oraz innych próbkach biologicznych. Metoda ta, służąca do ekstrakcji i analizy glukozynolanów, może być wykorzystana do odpowiedzi na kluczowe pytania w ekologii roślin i owadów, patologii roślin, hodowli roślin oraz naukach o żywności. Główną zaletą tej techniki jest to, że jest ona dobrze zwalidowana i szeroko stosowalna w przypadku wielu rodzajów próbek biologicznych.Choć metoda ta jest głównie wykorzystywana do oznaczania ilości glukozynolanów w materiałach roślinnych, można ją również zastosować do gleb lub przetworzonej żywności. Niniejszą procedurę ekstrakcji można przeprowadzić w niemal każdym laboratorium, ponieważ wykorzystuje ona głównie standardowy sprzęt laboratoryjny. Zazwyczaj osoby rozpoczynające pracę z tą metodą przeprowadzą analizy i inspekcję dokładniej, jeśli przynajmniej raz przeczytają instrukcję i obejrzą film.Aby rozpocząć procedurę, zmieszaj 10 g żelu z sieciowanej dekstryny G-25 z 125 ml ultra-czystej wody. Przechowuj mieszaninę w zakręconej butelce w temperaturze 4 °C. Następnie rozpuść 10 000 jednostek arylsulfatazy typu H-1 w 30 ml ultra-czystej wody.Do tak przygotowanej mieszaniny dodać 30 ml absolutnego etanolu i dokładnie wymieszać. Odwirować mieszaninę przy 2 650 ×g przez 20 minut w temperaturze pokojowej. Połączyć supernatant z 90 ml absolutnego etanolu w zlewce.Wymieszać i przelać do nowych probówek do wirowania. Wirować mieszaninę z prędkością 1 030 ×g przez 15 minut w temperaturze pokojowej. Odrzucić nadsącz.Rozpuścić i połączyć pellety w łącznej objętości 25 mililitrów ultra-czystej wody. Dobrze wymieszać zawiesinę w wirówce typu vortex, a następnie przenieść ją do probówek o pojemności 1 mililitra. Próbki siarczanów przechowywać w temperaturze 20 stopni Celsjusza przez maksymalnie jeden rok.Następnie odważ około 90 mg sinogramu i zapisz masę z dokładnością do 1 µg. Potem rozpuść monohydrat sinogramu w 10 ml wody ultrapurej. Z tak przygotowanego roztworu zapasu sinogramu przygotuj pięć roztworów wzorcowych o stężeniach od 50 do 750 µM.Przechowywać roztwory wzorcowe w probówkach 1,5 ml w temperaturze 20 °C. Następnie, dla każdej próbki i wzorca, oznaczyć probówkę do mikrocentryfugi 2 ml w odpowiedniej pozycji w statywie kolumnowym. Przebić korek każdej probówki do mikrocentryfugi igłą sekcyjną w celu późniejszego liofilizowania.Umieść oznakowane probówki w bloku w takiej samej konfiguracji i odstępach, jak oznakowane kolumny. Aby przygotować szklane kolumny pipetowe, użyj drewnianego lub szklanego pręta, aby delikatnie wcisnąć kawałek wełny szklanej o wymiarach 1 cm na 1 cm do pipety. Upakuj wełnę szklaną w miejscu przejścia korpusu pipety w jej trzon.Umieść kolumnę pipetującą w każdej oznakowanej pozycji na statywie. Ustaw statyw nad tacką na odpady. Odetnij końcówkę plastikowego tipsa do pipety o pojemności 1 ml.Mocno wstrząsnąć przygotowanym żelem dekstrynowym. Następnie, używając poszerzonej końcówki pipety, nanieść 0,5 mililitra przygotowanego żelu dekstrynowego do każdej kolumny. Sprawdzić, czy z kolumn nie wycieka żel dekstrynowy, i wymienić wszystkie nieszczelne kolumny.Po napełnieniu wszystkich kolumn żelem dekstrynowym, przemyć każdą kolumnę 1 mililitrem wody ultrapure. Odważyć od 50 do 100 miligramów wolnego, drobno zmielonego materiału roślinnego do probówki reakcyjnej o pojemności 2 mililitrów z bezpieczną zakrętką i zapisać wagę z dokładnością do 0,1 miligrama. Do każdej probówki włożyć dwie metalowe kulki o średnicy 3 milimetrów.Do każdej probówki dodaj 1 ml 70% metanolu w wodzie ultrapure i krótko wymieszaj każdą zawiesinę za pomocą wortexa. Zamknij probówki dodatkowymi nakrętkami zabezpieczającymi i natychmiast umieść je w łaźni wodnej o temperaturze od 90 do 92 °C. Podgrzewaj probówki do momentu, aż zawartość zacznie wrzeć.Przenieś probówki do kąpieli ultradźwiękowej i poddaj próbki sonikacji z ogrzewaniem przez 15 minut. W trakcie sonikacji rozpocznij rozmrażanie próbki siarczanowej oraz referencji sinogramu. Po sonikacji odwiruj próbki z prędkością 2 700 ×g przez 10 minut w temperaturze pokojowej.Nanieś supernatanty oraz rozmrożone referencje sinogramu na odpowiednie kolumny, uważając, aby nie zassać materiału roślinnego do pipety. Do każdej probówki dodaj 1 ml 70% metanolu. Wymieszaj zawartość probówek za pomocą wortexa.Następnie podgrzewaj mieszaniny w kąpieli ultradźwiękowej przez 15 minut. Ponownie odwiruj probówki w tych samych warunkach co poprzednio. Nałóż nadnadkliniki na odpowiednie kolumny.Dodaj dwie porcje 1 ml 70% metanolu do każdej kolumny, pozwalając na całkowite przelanie każdej porcji przez kolumny. Przemyj pozostały metanol z każdej kolumny za pomocą 1 ml wody ultrazczyszczonej. Następnie przemyj każdą kolumnę dwiema porcjami 1 ml buforu octanu sodu o stężeniu 20 mM i pH 5,5.Gdy ostatnie porcje buforu octanu sodu spłyną do statywu na odpady, wyjmij statyw z tacki odbiorczej i osusz jego nóżki chusteczką. Umieść statyw nad blokiem oznakowanych probówek do mikrowirówki w taki sposób, aby końcówki kolumn znajdowały się w odpowiadających im probówkach. Nanieś 20 µL roztworu siarczanów na każdą kolumnę, upewniając się, że roztwór dotarł do powierzchni materiału kolumny.Przepłucz roztwór siarczanu do materiału kolumny za pomocą 50 µL buforu octanu sodu. Bardzo ważne jest, aby siarczan został wypłukany do wnętrza kolumny. Enzym musi znajdować się na kolumnie, aby mógł zareagować z nienaruszonymi glukozynolanami związanymi z kolumną.Po przemyciu każdej kolumny roztworem siarczanów, należy przykryć kolumny folią aluminiową. Pozostawić kolumny na noc. Następnie eluować desulfo-glukozynolaty z każdej kolumny, stosując dwie porcje wody ultrapurej o objętości 0,75 ml każda.Po całkowitym przelaniu kolumn należy wyjąć statyw z kolumnami i zakręcić każdą probówkę. Zamrozić probówki w ciekłym azocie lub w temperaturze -80 °C przez co najmniej 30 minut. Liofilizować próbki przez 12 do 24 godzin.Rozpuścić każdy osad w 1 mililitrze wody ultrapure. Następnie przenieść każdą próbkę i wzorzec do oznakowanych fiolek do próbek HPLC. Rozdzielić ekstrakty na kolumnie CAT w fazie odwróconej.Należy zastosować długość fali detekcji 229 nanometrów. Po rozdzieleniu metodą HPLC glukozynolaty można zidentyfikować poprzez porównanie czasów retencji i widm UV ze standardami znanych glukozynolatów. Stężenia glukozynolatów w próbce oblicza się na podstawie krzywej kalibracyjnej sinogramu oraz wartości współczynników odpowiedzi pochodzących z literatury.Na tej podstawie można określić stężenia glukozynolanów w oryginalnej próbce roślinnej. W zastosowanych warunkach HPLC niezdrowa progoitryna eluuje dość wcześnie i zostaje oddzielona od biologicznie korzystnej glukorafaniny. Endo-glukozynolany są również dobrze rozdzielone.Szeregi lyotropowe obserwuje się przy zwiększającej się liczbie wiązań łańcucha bocznego dla alkonolu, metylofol-alkonolu oraz metylo-solfinol-glukozynolatów o dłuższych łańcuchach. W związku z tym nieznane glukozynolaty mogą być wstępnie klasyfikowane na podstawie tych szeregów lyotropowych w połączeniu ze spektrami UV. Przy odpowiednim przygotowaniu jedna osoba może wyekstrahować od 150 do 200 próbek w ciągu jednego dnia roboczego.Przygotowanie próbek do analizy HPLC, w tym liofilizacja i oczyszczanie kolumn, zajmie kolejny dzień. Po zastosowaniu tej procedury można wykorzystać inne metody, takie jak LCMS, aby zidentyfikować nieznane desulfo-glukozynolaty w chromatogramie. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś mieć dobrą wiedzę na temat tego, jak ekstrahować glukozynolaty z próbek biologicznych i analizować je za pomocą HPLC.Należy pamiętać, że praca z metanolem może być niezwykle niebezpieczna i zawsze powinna być prowadzona pod wyciągiem (dygestorium).

a-straightforward-method-for-glucosinolate-extraction-analysis-with

Research

JoVE Journal

Chemistry

Chemia

Przedstawiono prostą metodę umożliwiającą szybką ekstrakcję i analizę wielu hormonów roślinnych z niewielkich próbek tkanek. Procedura wykorzystuje ekstrakcję w fazie gazowej jako jedyny etap oczyszczania. Próbki analizuje się za pomocą GC/MS z jonizacją chemiczną, która generuje głównie jony (M+1)+.

Monitorowanie hormonów roślinnych podczas odpowiedzi na stres

W tym filmie demonstrujemy ekstrakcję metabolitów z nerki dawcy za pomocą sondy SPME. Wyekstrahowane metabolity można wykorzystać do przeprowadzenia analizy metabolomicznej i lipidomicznej w celu oceny jakości narządu do przeszczepu.

Pobieranie próbek mikroekstrakcji do fazy stałej: technika ekstrakcji próbki z tkanek przeszczepu oparta na sondzie

Przedstawiono protokół kompleksowej ekstrakcji lipidów, metabolitów i białek z tkanek biologicznych przy użyciu jednej próbki.

Prosta metoda ekstrakcji frakcjonowanej do kompleksowej analizy metabolitów, lipidów i białek z pojedynczej próbki

Prezentujemy wygodną ekstrakcję do fazy stałej w połączeniu z wysokociśnieniową chromatografią cieczową (HPLC) z detekcją elektrochemiczną (ECD) do jednoczesnego oznaczania trzech neuroprzekaźników monoaminowych i dwóch ich metabolitów w moczu niemowląt. Identyfikujemy również metabolit MHPG jako potencjalny biomarker do wczesnej diagnostyki uszkodzeń mózgu u niemowląt.

Wygodna metoda ekstrakcji i analizy za pomocą wysokociśnieniowej chromatografii cieczowej neuroprzekaźników katecholaminy i ich metabolitów

Ten protokół opisuje pojedynczą przepustowość dla uzupełniających technik analitycznych i omicznych, której kulminacją jest w pełni sparowana charakterystyka naturalnej materii organicznej i proteomiki mikrobiologicznej w różnych ekosystemach. Podejście to pozwala na solidne porównania w celu identyfikacji szlaków i przemian metabolicznych ważnych dla opisu produkcji gazów cieplarnianych i przewidywania reakcji na zmiany środowiskowe.

Jednoprzepustowe komplementarne techniki analityczne o wysokiej rozdzielczości do charakteryzowania złożonych mieszanin naturalnej materii organicznej

Tutaj opisujemy wysokosprawną chromatografię cieczową z silną wymianą anionów siewek znakowanych [3H]-mio-inozytolem, która jest bardzo czułą metodą wykrywania i ilościowego oznaczania polifosforanów inozytolu w roślinach.

Ekstrakcja i oznaczanie ilościowe rozpuszczalnych, znakowanych radioaktywnie polifosforanów inozytolu z różnych gatunków roślin przy użyciu SAX-HPLC

Opracowana metoda znakowania 13C6-Glucose w połączeniu z chromatografią cieczową o wysokiej rozdzielczości spektrometrią mas jest wszechstronna i stanowi podstawę do przyszłych badań nad pierwotnymi organami i szlakami zaangażowanymi w syntezę metabolitów wtórnych w roślinach leczniczych, jak również kompleksowe wykorzystanie tych wtórnych metabolitów.

13C6-Znakowanie glukozy związane z LC-MS: Identyfikacja pierwotnych organów roślinnych w syntezie metabolitów wtórnych

Niniejsze badanie opracowało metodę chromatografii cieczowej wysokiej rozdzielczości połączoną ze spektrometrią mas z potrójnym kwarcykiem (HPLC-QQQ-MS) w celu identyfikacji i ilościowego określania alkaloidów tropanowych (hioscyjamina, anizodamina, skopolamina) w Anisodus tanguticus. Metoda ta okazała się szybką, dokładną i niezawodną dla analizy wysokowydajnej roślin leczniczych.

Skuteczną i szybką metodę HPLC-QQQ-MS do ilościowego oznaczania alkaloidów tropanowych w roślinach leczniczych

Nieukierunkowana metabolomika dostarcza hipotezy generującej migawkę profilu metabolicznego.  Protokół ten zademonstruje ekstrakcję i analizę metabolitów z komórek, surowicy lub tkanki.  Szereg metabolitów jest badany za pomocą ekstrakcji ciecz-faza cieczowa, ultraprzepływowej chromatografii cieczowej/spektrometrii mas o wysokiej rozdzielczości (UPLC-HRMS) w połączeniu z oprogramowaniem do analizy różnicowej.

Nieukierunkowana metabolomika ze źródeł biologicznych przy użyciu ultrasprawnej chromatografii cieczowej ze spektrometrią mas o wysokiej rozdzielczości (UPLC-HRMS)

Bakteryjna ściana komórkowa składa się z peptydoglikanu, makromolekularnej sieci nici cukrowych połączonych peptydami. Ultrasprawna chromatografia cieczowa zapewnia wysoką rozdzielczość i przepustowość dla nowatorskich odkryć składu peptydoglikanu. Przedstawiamy procedurę izolacji ścian komórkowych (woreczków) i ich późniejszego przygotowania do analizy za pomocą UPLC.

Izolacja i przygotowanie ścian komórkowych bakterii do analizy składu metodą ultra sprawnej chromatografii cieczowej

Poznaj prostą metodę ekstrakcji i analizy glukozynolanów z roślin za pomocą chromatografii HPLC. Ta sprawdzona technika umożliwia badania w ekologii roślin, patologii i naukach o żywności.

Prosta metoda ekstrakcji i analizy glukozynolanu za pomocą wysokociśnieniowej chromatografii cieczowej (HPLC)

Przeglądaj więcej filmów