Mikroskopia konfokalna Analiza sortowania białek do plazmodesmatów u Nicotiana benthamiana

Ten protokół opisuje wybór optymalnych markerów plazmodesmalnych do analiz opartych na mikroskopii konfokalnej białek ukierunkowanych na plazmodesmat podczas interakcji wirus-plazmodesmata lub transportu plazmodesmalnego.

Moje badania koncentrują się na różnych ruchach roślin z komórki do komórki i staram się zrozumieć mechanizmy różnych interakcji roślin podczas lokalnego rozprzestrzeniania się po infekcji. Niedawno odkryliśmy, że plazmodesmaty wyglądają tak, jakby plik białkowy mógł przemieszczać się z komórki do komórki u Nicotiana benthamiana. Wyniki te pomogą nam zrozumieć mechanizmy funkcjonowania plazmodesmatów w przyszłości.

Znajomość lokalizacji subkomórkowej białka jest bardzo ważna dla poznania jego funkcji. Protokół ten zapewnia dobre makra zlokalizowane plazmodesmatami, PDLP5 i TVCV MP, które mogą być stosowane w badaniach lokalizacji białek. Na początek uprawiaj nasiona nicotiana benthamiana w wilgotnej glebie w kontrolowanej komorze środowiskowej, ustawionej na 23 stopnie Celsjusza, utrzymując 16 godzin światła, a następnie osiem godzin ciemności.

Po przeniesieniu dwutygodniowych sadzonek do większych doniczek, hoduj rośliny w tych samych warunkach przez cztery do pięciu tygodni, aby przygotować je do eksperymentów agroinfiltracji. Smugi komórek agrobacterium tumefaciens EHA 105, zawierających pożądane wektory, na płytkach agarowych LB i inkubować je w temperaturze 28 stopni Celsjusza. Po dwóch dniach przenieś pojedynczą kolonię z płytki do dwóch mililitrów bulionu LB i inkubuj przez noc w temperaturze 28 stopni Celsjusza z mieszaniem z prędkością 250 obrotów na minutę.

Następnie usuń jeden mililitr z nocnej kultury i dodaj cztery mililitry świeżego bulionu LB do rekultury przez jedną godzinę w tych samych warunkach. Osadzać komórki przez odwirowanie. Następnie określ liczbę komórek zawiesiny bakteryjnej na głębokości 600 nanometrów i dostosuj gęstość optyczną do 0,1 lub 0,2 za pomocą bufora infiltracyjnego.

Zawiesinę bakteryjną inkubować w temperaturze pokojowej przez trzy godziny, delikatnie mieszając. Następnie naciekaj powierzchnię aosiową w pełni rozwiniętych liści różnych roślin za pomocą jednorazowej strzykawki bezigłowej o pojemności jednego mililitra. Zaznacz naciekany obszar, który będzie wyglądał na ciemniejszy niż otaczająca go nienaciekająca tkanka, za pomocą wodoodpornego pisaka.

Na początek uzyskaj liście nicotiana benthamiana naciekane komórkami agrobacterium tumefaciens, zawierającymi pożądane wektory. W celu wizualizacji plazmodesmatów dodać porcję 200 mikrolitrów 1% błękitu anilinowego na szkiełko mikroskopowe. Następnie za pomocą ostrza wyciąć naciekający obszar liścia z dala od żyły i przenieść go do roztworu błękitu anilinowego na szkiełku stroną aosijalną do góry.

Upewnij się, że próbka tkanki liścia jest całkowicie zanurzona przed przykryciem jej szkłem nakrywkowym. Umieścić szkiełko z próbką w eksykatorze podłączonym do pompy próżniowej. Ewakuuj się na dwie minuty przy temperaturze poniżej 0,8 paskala.

Następnie powoli zwolnij ciśnienie i inkubuj szkiełko w ciemności przez 30 minut w temperaturze pokojowej. Teraz zwizualizuj sygnał fluorescencyjny błękitu anilinowego pod laserowym skaningowym mikroskopem konfokalnym. Na początek uzyskaj roślinę Nicotiana benthamiana, naciekaną komórkami Agrobacterium tumefaciens, zawierającymi pożądane wektory.

W przypadku badań lokalizacji białek zbierz dwa liście z dwóch roślin w różnych punktach czasowych po infiltracji. Za pomocą ostrza pokrój strefę nacieku na plasterki z dala od żyły. Umieść próbkę tkanki stroną aosiową do góry na kropli sterylnej wody na środku szkiełka mikroskopowego.

Przykryj szkiełko szklanką nakrywkową, upewniając się, że nie utknęły w nim pęcherzyki. Wizualizacja sygnału fluorescencyjnego znaczników autofluorescencyjnych w infiltrowanym obszarze za pomocą laserowego skaningowego mikroskopu konfokalnego. Zbierz 20 obrazów dla każdego schorzenia, używając co najmniej dwóch niezależnych kontrprób biologicznych.

Ocenić lokalizację plazmodesmatu badanego białka na podstawie diagnostycznego punktowego pojawienia się sygnału na obrzeżach komórki. Białka TVCV, MP-EGFP i PDL5-EGFP wykazały wyraźną lokalizację punktową w stosunku do plazmodesmatów. Podczas gdy PDCB1-EGFP wykazał lokalizację zarówno plazmodesmy, jak i retikulum endoplazmatycznego w pierwszym dniu, po infiltracji zarówno MP, jak i PDLP5 zaczęły gromadzić się w plazmodesmacie pierwszego dnia, po infiltracji, osiągając maksymalną intensywność w drugim dniu i pozostawały stabilne przez pięć dni.

PDCB1 wykazywał silną lokalizację retikulum endoplazmatycznego do trzeciego dnia, po czym lokalizacja plazmodesmatów stała się widoczna w mniejszej liczbie komórek.