Połączenie mikroskopii oczyszczającej i fluorescencyjnej w celu wizualizacji zmian w ekspresji genów i reakcjach fizjologicznych na Plasmodiophora brassicae

Plasmodiophora brassicae jest przenoszonym przez glebę obowiązkowym patogenem biotroficznym, który atakuje rośliny z rodziny Brassicaceae. Po zakażeniu patogen wywołuje rozwój galasów w podziemnych częściach rośliny, stąd nazwa choroby maczuga. Rozwojowi galasów towarzyszy bardzo złożone przeprogramowanie.

Dlatego możliwość śledzenia zmian wewnętrznych podczas choroby ma kluczowe znaczenie dla zrozumienia tej interakcji między rośliną a patogenem. Nasz protokół poprawia obrazowanie złożonych, grubych i galasów. Ułatwia wizualizację zmian w ekspresji genów, reakcjach fizjologicznych, równowadze fitohormonów, postępie choroby, rozmieszczeniu zarodników i miejscowej zdrewnieniu.

Protokół zachowuje białka fluorescencyjne w próbkach, umożliwiając przechowywanie i przetwarzanie obiektów przez długi czas. Umożliwia również śledzenie zmian biochemicznych i strukturalnych towarzyszących postępowi choroby. Procedurę zademonstrują Sara Blicharz, doktor habilitowany w naszej grupie, Deeksha Singh, doktorantka z naszego laboratorium oraz Kornel Michalak, doktorant z grupy prof. Agnieszki Bagniewskiej-Zadwornej z Uniwersytetu im. Adama Mickiewicza.

Zacznij od przygotowania tkanki roślinnej. Ostrożnie usuń glebę z systemów korzeniowych roślin zakażonych i niezainfekowanych. Dokładnie wyczyść wodą i zbierz hipokotyle i galasy do probówek do mikrowirówki.

Utrwalić próbki w 200 do 500 mikrolitrach utrwalacza paraformaldehydu na jedną godzinę w temperaturze pokojowej, stosując stałą próżnię 700 milibarów za pomocą pompy próżniowej. Upewnij się, że przedmiot jest całkowicie zanurzony w roztworze paraformaldehydu. Użyj 4% agarozy do osadzania niezakażonych hipokotyli i zakażonych galasów.

Zagotuj roztwór, aby rozpuścić agarozę i wlej go, gdy ostygnie, gdy jest jeszcze lepki. Lekko osusz przedmiot na chusteczce przez kilka sekund, aby usunąć nadmiar paraformaldehydu. Użyj wykałaczek lub kleszczy, aby ostrożnie osadzić i zorientować obiekt roślinny w agarozie.

Aby zapobiec ukośnym sekcjom, upewnij się, że przedmiot jest prawidłowo zorientowany i uformowany, tak aby jego oś była prostopadła do płaszczyzny ostrza wibratomu. Aby przyspieszyć krzepnięcie agarozy, umieść płytkę Petriego lub wielokulturową w temperaturze czterech stopni Celsjusza na 10 minut. Za pomocą ostrza ostrożnie wytnij i uformuj przedmiot w bloku agarozy, zwracając uwagę na preferowaną orientację do cięcia.

Przyklej blok agarozy lub dużą żółć, aby prawidłowo zamontować go na uchwycie próbki za pomocą cyjanoakrylanu lub kleju błyskawicznego i taśmy maskującej. Dostosuj grubość sekcji, prędkość i amplitudę drgań zgodnie z grubością i rozmiarem galasa. Dodaj wodę destylowaną do łaźni wodnej i zacznij od dzielenia na sekcje.

Ostrożnie zbierz skrawki za pomocą kleszczy lub szczotki i przenieś je do probówki mikrowirówkowej zawierającej jeden mililitr buforu 1X PBS. Usuń 1X PBS z probówki mikrowirówki i dodaj od 200 do 500 mikrolitrów roztworu czyszczącego. Wymień roztwór czyszczący na nowy, jeśli jego kolor zmieni się po pewnym czasie podczas przetwarzania próbki.

Przeprowadzić barwienie kalkofluorowo-białe ścian komórkowych nakładających się komórek roślinnych, przygotowując 5% białego barwnika kalkofluorowego w roztworze czyszczącym. Następnie barwić komórki w ciemności przez co najmniej pięć minut. Wybarwić lipidy czerwienią nilową, a ligniny barwieniem ligniną metodą Fuchsin, zgodnie z opisem w rękopisie tekstowym, a następnie zamontować oczyszczone skrawki na szkiełku mikroskopowym.

Następnie obserwuj komórki pod mikroskopem epifluorescencyjnym lub konfokalnym. Korzystaj z wielu trybów akwizycji do jednoczesnego obrazowania więcej niż jednego widma fluorescencji. Dynamikę choroby i akumulację patogenów śledzono w galasach skolonizowanych przez Plasmodiophora brassicae, a po barwieniu czerwienią nilową obserwowano duże komórki z zarodnikami spoczynkowymi P. brassicae.

Zmiany w różnicowaniu ksylemu po zakażeniu P.brassicae uwidoczniono za pomocą podstawowego barwienia fuchsyną. Rośliny Arabidopsis zawierające konstrukt pHCA2:erRFP wykorzystano do wizualizacji ekspresji genu HCA2 w tkance łyka w galasach klubowych. HCA2 kolokalizował się z łykiem w późnych stadiach rozwoju żółci wywołanego przez P. brassicae, a aktywność genu odzwierciedlała mechanizm, dzięki któremu P.brassicae zwiększa złożoność łyka.

Po 16 dniach od inokulacji oceniano różnicową odpowiedź cytokininy między zakażonymi i niezakażonymi roślinami, sprawdzając ekspresję markera TCS:GFP w rozwijających się galasach. Odpowiedzi cytokininowe wydają się być znacznie zmniejszone w zakażonych galasach, podczas gdy pozostały silne, zwłaszcza w puli łyka, u niezakażonych roślin. Najbardziej krytycznymi etapami są utrwalanie w PFA, osadzanie i cięcie.

Do cięcia wibratomu należy zoptymalizować i starannie dostosować parametry prędkości, amplitudy i grubości, aby uzyskać dobrej jakości sekcje. Techniki cięcia wibratomu i oczyszczania tkanek utorowały drogę do usprawnienia analizy mikroskopowej reakcji fizjologicznych podczas interakcji roślina-mikroorganizm i tkanek wykazujących wtórny wzrost o złożonej anatomii komórkowej.