Ocena odpowiedzi liści na metabolity drugorzędne mikroorganizmów przy użyciu formatu o wysokiej przepustowości
5 grudnia 2025
Protokół ten opisuje podejście o wysokiej przepustowości do oceny wycieku jonów roślinnych, aktywności peroksydazy oraz produkcji kalloz w tej samej próbce.
Moje laboratorium zajmuje się interakcjami mikroorganizmów roślinnych, a ostatecznym celem jest poprawa odporności na rośliny fok przy użyciu genetyki. Najnowsze osiągnięcia wykazały, że metabolity wtórne mikroorganizmów odgrywają kluczową rolę w zwiększaniu podatności lub oporności roślin. Na początek użyj korkowego otworu o średnicy czterech milimetrów, aby zebrać trzy tarcze liściowe na roślinę, unikając środkowej żyłki.
Ostrym końcem wykonaj ruch skręcający, aby zapobiec maceracji tkanki. Dodaj metabolity wtórne lub preparaty rozpuszczalniki w pożądanym stężeniu do pojedynczych dołków płyty 96-dołkowej, aby uzyskać ostateczną objętość 200 mikrolitrów. Delikatnie umieść tarcze liściowe w dołkach.
Włóż płytkę z 96 dołkami z wyjętą pokrywką do słoika z dyszą próżniową. Następnie podłącz wąż próżniowy do dyszy dzwonka i włącz ciśnienie podciśnieniowe na 9,8 funta na cal kwadratowy na 10 sekund. Wyłącz podciśnienie i powoli zwalniaj ciśnienie przez 10 sekund, a następnie powtórz cykl próżniowy.
Teraz załóż pokrywkę z powrotem na płytę z 96 dołkami i inkubuj ją na orbitalnym shakerze pod źródłem światła. Ustaw 23 centymetry nad shakerem przez cztery godziny. Umyj sondę w ultraczystej wodzie i lekko osusz ją chusteczką bez kłaczków, aby wyschła.
Zwróć uwagę na odczyt przewodności wody na przyszłość. Między czterema a sześcioma godzinami po zabiegu mierz i rejestruj przewodność w poszczególnych dołkach, zanurzając sondę w cieczy otaczającej tarczę liściową. Trzymaj płytkę pod kątem 45 stopni, aby upewnić się, że sonda jest całkowicie zanurzona.
Po wcześniejszym płukaniu sondy można czasem sprawdzić przewodność wody, aby potwierdzić jej stabilność. Następnie nałoż plastikową folię sufitową na płytę z 96 dołkami i przenieś ją do orbitalnego wstrząsacza na nocną inkubację. Aby przygotować podłoże z nadoksydazą, podgrzej 40 mililitrów destylowanej sterylnej wody do 70 stopni Celsjusza w zlewce z batonem mieszającym bar.
Rozpuścić 50 miligramów pięcio-aminosalicylowego kwasu w podgrzewanej wodzie. Następnie dodaj dodatkową wodę, aby całkowita objętość wynieść 50 mililitrów i dostosuj pH do sześciu za pomocą wodorotlenku sodu. Chroń roztwór wrażliwy na światło, przykrywając pojemnik folią aluminiową.
W stożkowej rurce bursztynowej o średnicy 50 mililitrów przygotuj roztwór nadtlenku wodoru o wartości 1% w ultraczystej wodzie. Następnie dodaj 10 mikrolitrów 1% roztworu nadtlenku wodoru na mililitr roztworu pięciu aminosalicylowych potrzebnych do wygenerowania medium testowego. W pożądanym momencie wymieszaj pięć razy, a następnie przelej 50 mikrolitrów z każdego dołku płytki próbki na nową płytę.
Dodaj 50 mikrolitrów podłoża do testu i inkubuj w temperaturze pokojowej przez trzy minuty. Aby zatrzymać reakcję, należy dodać 20 mikrolitrów dwóch normalnych wodorotlenków sodu do każdego dołku i użyć czytnika płyt, aby zmierzyć absorpcję każdego dołku w odległości 595 nanometrów. Woda i 0,1% dimetylosulfoksyd powodowały podobne poziomy wycieku jonów i aktywności peroksydazy, co potwierdza ich zastosowanie jako negatywną kontrolę.
Leczenie jednym mikromolarem FLG 22 istotnie indukowało wyciek jonów, aktywność peroksydazy oraz produkcję kallo, potwierdzając jego status solidnej pozytywnej kontroli. Leczenie Gramillinem powodowało znaczne wycieki jonów i produkcję kallo, ale miało różny wpływ na aktywność nadoksydazy. Surfaktyna na poziomie 10 mikromolarów indukowała zarówno aktywność peroksydazy, jak i produkcję kallosów, podczas gdy wyciek jonów pozostał niezmieniony.
Leczenie toksyną T-2 hamowało aktywność nadoksydazy, jednocześnie indukując produkcję kalloz i nie wpływając na wyciek jonów. Nasz hydro assay pozwala badaczom pobrać próbkę trzech różnych reakcji stresowych w tej samej próbce, co pozwala w pełni wykorzystać ograniczone ilości metabolitów wtórnych mikroorganizmów. Możliwość porównania 96 próbek na tej samej płytce pozwala badaczom przeprowadzać badania genetyczne na poziomie populacji lub biologii systemowej w celu zrozumienia interakcji mikroorganizmów roślinnych.
Moje badania będą nadal koncentrować się na interakcjach z mikroorganizmami roślin oraz charakteryzowaniu genów roślinnych, które możemy wykorzystać do rozwoju odporności na choroby w uprawach zbóż.
Przegląd
Niniejszy protokół opisuje wysokoprzepustowe podejście do oceny wycieku jonów z roślin, aktywności peroksydazy oraz produkcji kalozy w tej samej próbce. Metoda ta pozwala badaczom na jednoczesną ocenę wielu odpowiedzi stresowych, co zwiększa efektywność eksperymentów z wykorzystaniem mikrobiologicznych metabolitów wtórnych.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Biologia roślin
- Interakcje mikrobowo-roślinne
- Ocena odpowiedzi na stres
Wstęp
- Zrozumienie reakcji roślin na metabolity mikrobów jest kluczowe dla zwiększenia odporności upraw.
- Wyciek jonów, aktywność peroksydazy oraz produkcja kallozy są kluczowymi wskaźnikami reakcji roślin na stres.
- Metody wysokoprzepustowe ułatwiają jednoczesną analizę wielu próbek.
- Niniejsze badanie koncentruje się na wpływie różnych zabiegów na te wskaźniki stresu.
Cel badania
- Opracowanie protokołu oceny odpowiedzi roślin na mikrobiologiczne metabolity wtórne.
- Umożliwienie badaczom przeprowadzania przesiewów na poziomie genetyki populacyjnej.
- Pogłębienie zrozumienia oddziaływań między roślinami a mikroorganizmami.
Zastosowane metody
- Pobieranie krążków liściowych za pomocą wycinaka korkowego.
- Opracowanie krążków liściowych z użyciem metabolitów drobnoustrojów w płytce 96-dołkowej.
- Pomiar wycieku jonów oraz aktywności peroksydazy za pomocą testów konduktometrycznych i absorbancyjnych.
- Porównanie efektów traktowania w odniesieniu do wskaźników stresu.
Główne wyniki
- Traktowanie FLG 22 znacząco indukowalo wyciek jonów, aktywność peroksydazy oraz produkcję kallozy.
- Traktowanie gramilliną wykazało zmienny wpływ na aktywność peroksydazy, ale indukowalo znaczący wyciek jonów i produkcję kallozy.
- Surfaktyna indukowala aktywność peroksydazy i produkcję kallozy, nie wpływając na wyciek jonów.
- Toksyna T-2 hamowała aktywność peroksydazy, indukując jednocześnie produkcję kallozy.
Wnioski
- Opracowany test hydrodynamiczny umożliwia wydajne pobieranie próbek wielu odpowiedzi stresowych.
- Metoda ta maksymalizuje wykorzystanie ograniczonych ilości wtórnych metabolitów drobnoustrojów.
- Przyszłe badania skoncentrują się na charakterystyce genów roślin odpowiedzialnych za odporność upraw na choroby.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Wysokoprzepustowa kwantyfikacja reakcji roślin na stres wywołany wtórnymi metabolitami drobnoustrojów umożliwia systematyczną analizę interakcji roślina-drobnoustrój na dużą skalę. To zmultipleksowane podejście wspiera szybką analizę porównawczą między genotypami i wariantami traktowania, co przyspiesza wczesne odkrywanie i walidację celów w badaniach i rozwoju (R&D) nad ochroną roślin. Zdolność tej metody do równoległego rozróżniania wielu markerów stresu zwiększa pewność prognostyczną w dalszych etapach opracowywania bioprotektorów i cech użytkowych.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Umożliwia funkcjonalną ocenę odpowiedzi roślin na różnorodne metabolity mikrobiologiczne.
- Wspiera identyfikację związków modulujących stres w celu dalszych badań mechanistycznych.
- Ułatwia mapowanie genetyczne poprzez porównywanie odpowiedzi w różnych populacjach roślin.
- Zapewnia multipleksowe odczyty dla solidnej walidacji celów w układach roślina-mikrob.
Przesiewy i opracowywanie testów
- Zapewnia standaryzowane, ilościowe wyniki w zakresie wycieku jonów, aktywności peroksydazy oraz produkcji kallozy.
- Umożliwia wysokoprzepustowe przesiewanie bibliotek chemicznych lub biologicznych w formacie 96-dołkowym.
- Pozwala na powtarzalną, równoległą ocenę wielu wariantów traktowania oraz kontroli.
- Przygotowuje zwalidowane systemy biologiczne do dalszych etapów analiz genomiki funkcjonalnej lub genetyki chemicznej.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Powiązuje fenotypy odpowiedzi stresowej z interwencjami genetycznymi lub chemicznymi w celu odkrywania biomarkerów translacyjnych.
- Zapewnia ciągłość od wczesnej fazy odkrywania po przedkliniczną walidację cech bioprotekcyjnych.
- Umożliwia zaawansowanie kandydatów na związki lub cech genetycznych z uwzględnieniem ryzyka w oparciu o multipleksowe dane fenotypowe.
Integracja rurociągu i przepływu pracy
Ten test wysokoprzepustowy integruje się z kontinuum od odkrycia do badań przedklinicznych w rozwoju cech upraw i bioprotektorów.
- Biologia odkrywcza: Umożliwia multipleksowe testowanie hipotez dotyczących szlaków interakcji roślina-mikrob.
- Przesiewanie: Zapewnia gotowość testową i powtarzalność w celu oceny związków lub genotypów na dużą skalę.
- Analityka: Generuje ilościowe, porównawcze wyniki do analizy międzywarunkowej.
- Badania translacyjne: Łączy markery odpowiedzi na stres z postępami w badaniach nad potencjalnymi cechami lub związkami.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Służy jako platforma wielokrotnego użytku dla różnorodnych badań nad genetyką chemiczną lub interakcjami roślina-mikrob.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorczy
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność predykcyjną i redukuje niejednoznaczność mechanistyczną w badaniach nad reakcją roślin na stres.
- Wartość operacyjna: Standaryzuje i skaluje multipleksowe fenotypowanie w celu efektywnego wykorzystania zasobów.
- Wartość strategiczna: Umożliwia podejmowanie świadomych decyzji o kontynuacji lub przerwaniu prac oraz selekcję portfolio w oparciu o solidne dane porównawcze.
- Wpływ na portfolio: Wspiera priorytetyzację kandydatów na bioprotektory i cechy w sposób uwzględniający ryzyko.
Uwagi dotyczące wdrożenia
- Wymaga wiedzy specjalistycznej z zakresu fizjologii roślin oraz testów odpowiedzi na stres.
- Wymaga dostępu do aparatury do płytek 96-dołkowych oraz czytników płytek do pomiarów absorbancji i przewodnictwa.
- Wymaga międzyzespołowej standaryzacji protokołów testowych i kontroli.
- Możliwość adaptacji do różnych gatunków roślin i bibliotek metabolitów mikrobiologicznych poprzez optymalizację protokołu.
- Ograniczone dostępnością wysokiej jakości metabolitów wtórnych oraz zwalidowanych kontroli pozytywnych i negatywnych.
