Ocena odpowiedzi liści na metabolity drugorzędne mikroorganizmów przy użyciu formatu o wysokiej przepustowości

Moje laboratorium zajmuje się interakcjami mikroorganizmów roślinnych, a ostatecznym celem jest poprawa odporności na rośliny fok przy użyciu genetyki. Najnowsze osiągnięcia wykazały, że metabolity wtórne mikroorganizmów odgrywają kluczową rolę w zwiększaniu podatności lub oporności roślin. Na początek użyj korkowego otworu o średnicy czterech milimetrów, aby zebrać trzy tarcze liściowe na roślinę, unikając środkowej żyłki.

Ostrym końcem wykonaj ruch skręcający, aby zapobiec maceracji tkanki. Dodaj metabolity wtórne lub preparaty rozpuszczalniki w pożądanym stężeniu do pojedynczych dołków płyty 96-dołkowej, aby uzyskać ostateczną objętość 200 mikrolitrów. Delikatnie umieść tarcze liściowe w dołkach.

Włóż płytkę z 96 dołkami z wyjętą pokrywką do słoika z dyszą próżniową. Następnie podłącz wąż próżniowy do dyszy dzwonka i włącz ciśnienie podciśnieniowe na 9,8 funta na cal kwadratowy na 10 sekund. Wyłącz podciśnienie i powoli zwalniaj ciśnienie przez 10 sekund, a następnie powtórz cykl próżniowy.

Teraz załóż pokrywkę z powrotem na płytę z 96 dołkami i inkubuj ją na orbitalnym shakerze pod źródłem światła. Ustaw 23 centymetry nad shakerem przez cztery godziny. Umyj sondę w ultraczystej wodzie i lekko osusz ją chusteczką bez kłaczków, aby wyschła.

Zwróć uwagę na odczyt przewodności wody na przyszłość. Między czterema a sześcioma godzinami po zabiegu mierz i rejestruj przewodność w poszczególnych dołkach, zanurzając sondę w cieczy otaczającej tarczę liściową. Trzymaj płytkę pod kątem 45 stopni, aby upewnić się, że sonda jest całkowicie zanurzona.

Po wcześniejszym płukaniu sondy można czasem sprawdzić przewodność wody, aby potwierdzić jej stabilność. Następnie nałoż plastikową folię sufitową na płytę z 96 dołkami i przenieś ją do orbitalnego wstrząsacza na nocną inkubację. Aby przygotować podłoże z nadoksydazą, podgrzej 40 mililitrów destylowanej sterylnej wody do 70 stopni Celsjusza w zlewce z batonem mieszającym bar.

Rozpuścić 50 miligramów pięcio-aminosalicylowego kwasu w podgrzewanej wodzie. Następnie dodaj dodatkową wodę, aby całkowita objętość wynieść 50 mililitrów i dostosuj pH do sześciu za pomocą wodorotlenku sodu. Chroń roztwór wrażliwy na światło, przykrywając pojemnik folią aluminiową.

W stożkowej rurce bursztynowej o średnicy 50 mililitrów przygotuj roztwór nadtlenku wodoru o wartości 1% w ultraczystej wodzie. Następnie dodaj 10 mikrolitrów 1% roztworu nadtlenku wodoru na mililitr roztworu pięciu aminosalicylowych potrzebnych do wygenerowania medium testowego. W pożądanym momencie wymieszaj pięć razy, a następnie przelej 50 mikrolitrów z każdego dołku płytki próbki na nową płytę.

Dodaj 50 mikrolitrów podłoża do testu i inkubuj w temperaturze pokojowej przez trzy minuty. Aby zatrzymać reakcję, należy dodać 20 mikrolitrów dwóch normalnych wodorotlenków sodu do każdego dołku i użyć czytnika płyt, aby zmierzyć absorpcję każdego dołku w odległości 595 nanometrów. Woda i 0,1% dimetylosulfoksyd powodowały podobne poziomy wycieku jonów i aktywności peroksydazy, co potwierdza ich zastosowanie jako negatywną kontrolę.

Leczenie jednym mikromolarem FLG 22 istotnie indukowało wyciek jonów, aktywność peroksydazy oraz produkcję kallo, potwierdzając jego status solidnej pozytywnej kontroli. Leczenie Gramillinem powodowało znaczne wycieki jonów i produkcję kallo, ale miało różny wpływ na aktywność nadoksydazy. Surfaktyna na poziomie 10 mikromolarów indukowała zarówno aktywność peroksydazy, jak i produkcję kallosów, podczas gdy wyciek jonów pozostał niezmieniony.

Leczenie toksyną T-2 hamowało aktywność nadoksydazy, jednocześnie indukując produkcję kalloz i nie wpływając na wyciek jonów. Nasz hydro assay pozwala badaczom pobrać próbkę trzech różnych reakcji stresowych w tej samej próbce, co pozwala w pełni wykorzystać ograniczone ilości metabolitów wtórnych mikroorganizmów. Możliwość porównania 96 próbek na tej samej płytce pozwala badaczom przeprowadzać badania genetyczne na poziomie populacji lub biologii systemowej w celu zrozumienia interakcji mikroorganizmów roślinnych.

Moje badania będą nadal koncentrować się na interakcjach z mikroorganizmami roślin oraz charakteryzowaniu genów roślinnych, które możemy wykorzystać do rozwoju odporności na choroby w uprawach zbóż.