Obrazowanie potencjału błony za pomocą dwóch typów genetycznie kodowanych fluorescencyjnych czujników napięcia

Ogólnym celem tej procedury jest optyczne przedstawienie zmian potencjału błony za pomocą genetycznie zakodowanego wskaźnika napięcia. Metoda ta opisze mocne i słabe strony obrazowania za pomocą różnych genetycznie kodowanych sond fluorescencyjnych napięcia. Na przykład sondy oparte na FRET będą oferować przewagę obrazowania ratiometrycznego, ale będą dawać niższy sygnał.

Główną zaletą tej techniki jest to, że możemy wizualizować aktywność neuronalną w czasie rzeczywistym. Ogólnie rzecz biorąc, osoby, które dopiero zaczynają korzystać z tej metody, będą miały problemy, ponieważ stosunek sygnału do szumu nie jest zbyt duży i istnieje kilka źródeł szumów i wiele kroków, które mogą pójść nie tak. Nowi użytkownicy są często zdezorientowani, a zakłócenia są traktowane jako prawdziwe sygnały.

Wizualna demonstracja tej metody ma kluczowe znaczenie dla ustalenia poprawności używanych sond i tego, co faktycznie oznacza. Na potrzeby konfiguracji instalowany jest rozdzielacz obrazu między wolnymi i szybkimi kamerami CCD w celu obrazowania GEVI opartego na FRET. Przed eksperymentem należy włożyć kostkę filtrującą z lustrem dichroicznym i dwoma filtrami emisyjnymi do rozdzielacza obrazu.

Usuń tę drugą kostkę filtra podczas obrazowania GEVI z pojedynczym białkiem fluorescencyjnym. Aby rozpocząć eksperyment, zlokalizuj zdrową komórkę HEK293, która wykazuje silną, zlokalizowaną fluorescencję błony w porównaniu z fluorescencją wewnętrzną i unikaj łatania okrągłych komórek, gdy się dzielą lub umierają. Następnie zastosuj impuls testowy, aby sprawdzić aktualną odpowiedź.

Następnie opuść pipetę z zaciskiem krosowym na prawo nad powierzchnią komórki. Następnie powoli opuść pipetę, aż delikatnie dotknie błony komórkowej. Rezystancja membrany powinna wzrosnąć do jednego do dwóch megaomów.

Następnie ułóż uszczelkę gigaomową, delikatnie stosując podciśnienie przez pipetę. Po uzyskaniu gigaomowego uszczelnienia należy ustawić potencjał pipety na żądany potencjał utrzymywania. Następnie ustaw ostrość szybką kamerę CCD na korpusie komórki.

W przypadku nagrywania GEVI opartego na FRET, dostosuj rozmiar podzielonych obrazów, aby uzyskać równomiernie rozmieszczony widok dla każdej długości fali emisji za pomocą pokręteł na rozdzielaczu obrazu. Następnie rozerwij błonę komórkową, stosując podciśnienie, aby utworzyć całą konfigurację komórki. Teraz otwórz oprogramowanie do obrazowania.

Następnie kliknij menu pobierania kamery SciMeasure, aby otworzyć stronę pobierania CCD. Następnie utwórz nowy plik danych, aby zapisać nagranie. Kliknij wyjście analogowe, a następnie odczytaj ASCII, aby otworzyć plik protokołu impulsowego w celu przeprowadzenia obrazowania.

Następnie kliknij uśrednij liczbę powtórzeń wewnętrznych, aby uśrednić liczbę prób. Następnie zamknij stronę wyjścia analogowego. Ustaw określone parametry akwizycji na stronie pobierania CCD.

Następnie wprowadź określone wartości liczby klatek do akwizycji i liczby prób. Następnie kliknij przycisk take data optics plus BNC, aby rozpocząć nagrywanie. Podczas obrazowania napięcia monitoruj oscyloskop, aby zapewnić stabilną konfigurację całej komórki podczas całego nagrania.

Aby obliczyć fluorescencję ułamkową, kliknij plik, a następnie przeczytaj plik danych, aby otworzyć plik danych, który został zarejestrowany w poprzednim kroku. Obraz komórki w natężeniu światła spoczynkowego powinien być widoczny po prawej stronie. Następnie kliknij pokaż BNC, aby wyświetlić aktualne wartości napięcia końcowego.

Zmień tryb strony z krlatki RLI na odejmowanie klatki, aby wykorzystać funkcję odejmowania ramki do identyfikacji pikseli za pomocą reagujących sygnałów optycznych. Następnie wybierz dwa punkty czasowe do odjęcia i zidentyfikuj obszar komórki, który pokazuje sygnały w odpowiedzi na zmianę potencjału błony. Następnie wyznacz piksele, które należy przeanalizować, przeciągając lub klikając każdy piksel.

Graficzne przedstawienie średniej intensywności fluorescencji z wybranych pikseli powinno pojawić się po lewej stronie okna oprogramowania. Podziel odjęte piksele natężeniem światła spoczynkowego, klikając przycisk podziel przez RLI, aby uzyskać wartości ułamkowej zmiany fluorescencji. Aby wyeksportować dane, usuń wykresy aktualnego napięcia końcowego, odznaczając menu pokaż BNC.

Przejdź do danych wyjściowych, zapisz ślady tak, jak są wyświetlane w formacie ASCII, aby wyeksportować ślad fluorescencji w formacie pliku ASCII do analizy dopasowania krzywej. W tej procedurze narysuj wykres zmiany fluorescencji w funkcji napięcia, wykreślając ułamkowe zmiany fluorescencji w odpowiedzi na napięcie w programie do analizy danych. Następnie dopasuj krzywą do funkcji Boltzmanna, aby określić zakres napięcia sygnału optycznego, klikając analizę, dopasowanie, dopasowanie sigmoidalne, a następnie otwórz okno dialogowe.

Odtwórz znormalizowane zmiany fluorescencji frakcyjnej w odpowiedzi na napięcie za pomocą programu do analizy danych. Aby obliczyć szybkość odpowiedzi optycznej, otwórz plik ASCII i wykreśl ślad zmiany fluorescencji ułamkowej w funkcji czasu. Następnie kliknij selektor danych w oprogramowaniu do analizy danych i wybierz jeden punkt czasowy odpowiadający początkowi krokowego impulsu napięcia i drugi punkt czasowy, w którym sygnał optyczny osiągnął stan ustalony.

Dopasuj ten zakres zarówno do pojedynczej, jak i podwójnej funkcji rozkładu wykładniczego, klikając analizę, dopasowanie, dopasowanie wykładnicze, a następnie otwórz okno dialogowe i zgłoś lepsze dopasowanie. Ten rysunek pokazuje zmianę fluorescencji komórki HEK wyrażającej pojedynczy GEVI Bongwoori na bazie FP. Jest to typowa zmiana fluorescencji w odpowiedzi na stopniowane impulsy napięcia.

W tym przypadku komórka HEK293 została sfotografowana za pomocą szybkiej kamery CCD. To zdjęcie pokazuje natężenie światła spoczynkowego komórki wyrażającej Bongwoori. A to jest obraz odejmowania klatek wskazujący piksele, w których zaobserwowano zmianę fluorescencji.

Pokazany tutaj jest optyczny zapis indukowanych potencjałów czynnościowych z pierwotnych neuronów hipokampa myszy wyrażających Bongwoori. Potencjały czynnościowe zostały wywołane w trybie cęgowym prądów całego ogniwa. Ślad frakcyjnej zmiany fluorescencji został wybrany z pikseli skorelowanych z somą.

Na tym rysunku zmiana fluorescencji komórki HEK eksprymującej GEVI na bazie FRET pokazuje odpowiedzi na schodkowane impulsy napięciowe na dwóch długościach fali. Nagrane z częstotliwością jednego kiloherca za pomocą szybkiej kamery CCD. Podczas próby wykonania tej procedury należy pamiętać o przetestowaniu zmiennych poziomów fluorescencji, ponieważ nadekspresja fluorescencji może wpływać na zdrowie komórki.

Zgodnie z tą procedurą można zastosować inne metody, takie jak kodowanie fragmentatora, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania dotyczące aktywności neuronów w różnych obwodach. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak obrazować potencjał błony za pomocą różnych typów sond.