Obrazowanie potencjału błony za pomocą dwóch typów genetycznie kodowanych fluorescencyjnych czujników napięcia
4 lutego 2016
Opisano metodę obrazowania zmian potencjału błonowego za pomocą genetycznie kodowanych wskaźników napięcia.
Ogólnym celem niniejszej procedury jest optyczne raportowanie zmian potencjału błonowego przy użyciu genetycznie kodowanego wskaźnika napięcia. Metoda ta opisze mocne i słabe strony obrazowania z zastosowaniem różnych genetycznie kodowanych fluorescencyjnych sond napięciowych. Na przykład sondy oparte na FRET zapewnią zaletę obrazowania ratiometrycznego, ale dadzą słabszy sygnał.
Główną zaletą tej techniki jest możliwość wizualizacji aktywności neuronalnej w czasie rzeczywistym. Zazwyczaj osoby rozpoczynające pracę z tą metodą napotykają trudności, ponieważ stosunek sygnału do szumu nie jest zbyt wysoki, istnieje kilka źródeł zakłóceń, a proces składa się z wielu etapów, na których mogą wystąpić błędy. Nowi użytkownicy są często zmyleni i biorą interferencje za rzeczywiste sygnały.
Wizualna demonstracja tej metody jest kluczowa dla potwierdzenia poprawności stosowanych sond oraz tego, co one faktycznie wskazują. W celu przygotowania układu, między wolną a szybką kamerą CCD instaluje się dzielnik obrazu do obrazowania GEVI opartych na FRET. Przed rozpoczęciem eksperymentu należy włożyć do dzielnika obrazu kostkę filtra z lustrem dichroicznym i dwoma filtrami emisyjnymi.
Usuń ten drugi kostkę filtra podczas obrazowania GEVI z pojedynczym białkiem fluorescencyjnym. Aby rozpocząć eksperyment, zlokalizuj zdrową komórkę HEK293, która wykazuje silną, zlokalizowaną fluorescencję błony w porównaniu z fluorescencją wewnątrzkomórkową; unikaj patchowania komórek okrągłych, ponieważ są one w trakcie podziału lub obumierają. Następnie zastosuj impuls testowy, aby sprawdzić odpowiedź prądową.
Następnie należy opuścić pipetę do patch-clampu bezpośrednio nad powierzchnię komórki. Potem powoli opuszczaj pipetę, aż delikatnie dotknie ona błony komórkowej. Rezystancja błony powinna wzrosnąć do poziomu od jednego do dwóch megaohm.
Następnie należy utworzyć uszczelnienie gigaohmowe, delikatnie przykładając podciśnienie za pomocą pipety. Po uzyskaniu uszczelnienia gigaohmowego ustaw potencjał pipety na pożądany potencjał podtrzymujący. Następnie należy ustawić ostrość wysokiej prędkości kamery CCD na ciele komórki.
W przypadku rejestracji GEVI opartej na FRET, należy dostosować rozmiar podzielonych obrazów za pomocą pokręteł rozdzielacza obrazu, aby uzyskać równomierny widok dla każdej długości fali emisji. Następnie należy przerwać błonę komórkową poprzez przyłożenie ciśnienia ujemnego w celu utworzenia konfiguracji całej komórki (whole cell). Teraz otwórz oprogramowanie do obrazowania.
Następnie kliknij acquire w menu kamery SciMeasure, aby otworzyć stronę akwizycji CCD. W kolejnym kroku utwórz nowy plik danych, aby zapisać nagranie. Kliknij analog output, a następnie read an ASCII, aby otworzyć plik protokołu impulsów w celu przeprowadzenia obrazowania.
Następnie kliknij „average the internal repetitions”, aby uśrednić liczbę prób. Następnie zamknij stronę wyjścia analogowego. Ustaw odpowiednie parametry akwizycji na stronie „CCD acquire”.
Następnie wprowadź konkretne wartości dla liczby klatek do akwizycji oraz liczby prób. Po tym kliknij przycisk „take data optics plus BNC”, aby rozpocząć rejestrację. Podczas obrazowania napięcia monitoruj oscyloskop, aby upewnić się, że konfiguracja whole-cell pozostaje stabilna przez cały czas trwania pomiaru.
Aby obliczyć ułamkową zmianę fluorescencji, kliknij plik, a następnie odczytaj plik danych, aby otworzyć plik danych zarejestrowany w poprzednim kroku. Po prawej stronie powinien pojawić się obraz komórki o spoczynkowym natężeniu światła. Następnie kliknij pokaż BNC, aby wyświetlić bieżące wartości napięcia końcowego.
Zmień tryb strony z ramki RLI na odejmowanie ramek, aby wykorzystać funkcję odejmowania ramek do zidentyfikowania pikseli z responsywnymi sygnałami optycznymi. Następnie wybierz dwa punkty czasowe do odejmowania i zidentyfikuj obszar komórki, który wykazuje sygnały w odpowiedzi na zmianę potencjału błony. W kolejnym kroku wyznacz piksele wymagające analizy, przeciągając kursor lub klikając w każdy piksel.
Graficzna reprezentacja średniej intensywności fluorescencji z wybranych pikseli powinna pojawić się po lewej stronie okna oprogramowania. Podziel wartości pikseli po odjęciu przez spoczynkową intensywność światła, klikając przycisk divide by RLI, aby uzyskać wartości ułamkowej zmiany fluorescencji. Aby wyeksportować dane, usuń bieżące wykresy napięcia końcowego, odznaczając opcję show BNC w menu.
Przejdź do wyjścia (output), zapisz ślady jako wyświetlany format ASCII, aby wyeksportować ślad fluorescencji do pliku ASCII w celu przeprowadzenia analizy dopasowania krzywej. W tej procedurze narysuj wykres zmiany fluorescencji w funkcji napięcia, nanosząc frakcjonowane zmiany fluorescencji w odpowiedzi na napięcie w programie do analizy danych. Następnie dopasuj krzywą do funkcji Boltzmanna, aby określić zakres napięcia sygnału optycznego, klikając analiza (analysis), dopasowanie (fitting), dopasowanie sigmoidalne (sigmoidal fit), a następnie otwórz okno dialogowe (open dialog).
Należy ponownie wykreślić znormalizowane ułamkowe zmiany fluorescencji w odpowiedzi na napięcie, korzystając z programu do analizy danych. Aby obliczyć prędkość odpowiedzi optycznej, otwórz plik ASCII i wykreśl przebieg ułamkowej zmiany fluorescencji w funkcji czasu. Następnie kliknij selektor danych w oprogramowaniu do analizy danych i wybierz jeden punkt czasowy odpowiadający początkowi skokowego impulsu napięcia oraz drugi punkt czasowy, w którym sygnał optyczny osiągnął stan stacjonarny.
Dopasuj ten zakres zarówno do funkcji pojedynczego, jak i podwójnego zaniku wykładniczego, klikając analysis, fitting, exponential fit, a następnie open dialog i wskaż lepsze dopasowanie. Rysunek przedstawia zmianę fluorescencji komórki HEK wykazującej ekspresję pojedynczego GEVI Bongwoori opartego na białku FP. Jest to typowa zmiana fluorescencji w odpowiedzi na skokowe impulsy napięcia.
Tutaj komórka HEK293 została obrazowana za pomocą szybkiej kamery CCD. Obraz ten przedstawia spoczynkową intensywność światła komórki ekspresjonującej Bongwoori. A to jest obraz po odjęciu klatek, wskazujący piksele, w których zaobserwowano zmianę fluorescencji.
Przedstawiono tutaj optyczny zapis wywołanych potencjałów czynnościowych z pierwotnych neuronów hipokampa myszy wykazujących ekspresję Bongwoori. Potencjały czynnościowe wywołano w trybie clamp prądowym w konfiguracji whole-cell. Ślad frakcyjnej zmiany fluorescencji został wybrany z pikseli skorelowanych z somą.
Na tym rysunku zmiana fluorescencji komórki HEK wykazującej ekspresję GEVI opartego na FRET przedstawia odpowiedzi na skokowe impulsy napięcia w dwóch długościach fal. Rejestracja została przeprowadzona z częstotliwością 1 kHz przy użyciu szybkiej kamery CCD. Podczas wykonywania tej procedury należy pamiętać o testowaniu różnych poziomów fluorescencji, ponieważ nadekspresja białek fluorescencyjnych może wpływać na kondycję komórki.
Po zastosowaniu tej procedury można przeprowadzić inne metody, takie jak kodowanie warstwowe (slicer codings), w celu udzielenia odpowiedzi na dodatkowe pytania dotyczące aktywności neuronów w różnych obwodach. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać dobrą wiedzę na temat obrazowania potencjału błonowego przy użyciu różnych typów sond.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejszy artykuł opisuje metodę obrazowania zmian potencjału błonowego przy użyciu genetycznie kodowanych wskaźników napięcia. Technika ta umożliwia wizualizację aktywności neuronalnej w czasie rzeczywistym, choć ze względu na szumy oraz problemy z interpretacją sygnału stanowi ona wyzwanie dla nowych użytkowników.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neuronauka
- Elektrofizjologia
- Techniki obrazowania
Wstęp
- Genetycznie kodowane wskaźniki napięcia są wykorzystywane do monitorowania zmian potencjału błonowego.
- Różne sondy fluorescencyjne charakteryzują się odmiennymi zaletami i wadami.
- Sondy oparte na FRET umożliwiają obrazowanie ratiometryczne, lecz mogą generować słabsze sygnały.
- Zrozumienie stosunku sygnału do szumu jest kluczowe dla dokładnej interpretacji danych.
Cel badania
- W celu optycznego raportowania zmian potencjału błonowego.
- W celu oceny skuteczności różnych genetycznie kodowanych sond fluorescencyjnych.
- W celu uzyskania wglądu w wizualizację aktywności neuronalnej w czasie rzeczywistym.
Zastosowane metody
- Wykorzystanie genetycznie kodowanych wskaźników napięcia.
- Porównanie różnych technik obrazowania.
- Analiza stosunku sygnału do szumu.
- Ocena trudności użytkowników w interpretacji sygnałów.
Główne wyniki
- Możliwa jest wizualizacja aktywności neuronalnej w czasie rzeczywistym.
- Sondy oparte na FRET oferują pewne zalety pomimo słabszych sygnałów.
- Nowi użytkownicy napotykają trudności ze względu na zakłócenia szumem.
- Odpowiednie przeszkolenie jest niezbędne, aby odróżnić rzeczywiste sygnały od szumu.
Wnioski
- Genetycznie kodowane wskaźniki napięcia są cenne w badaniach z zakresu neuronauki.
- Zrozumienie ograniczeń różnych sond jest krytyczne.
- Szkolenie i doświadczenie mogą poprawić interpretację sygnału.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Obrazowanie potencjału błonowego przy użyciu genetycznie kodowanych wskaźników napięcia (GEVIs) umożliwia wizualizację elektrofizjologii komórkowej w czasie rzeczywistym, co wspiera wczesną walidację punktów uchwytu w procesie poszukiwania leków w neurobiologii. Metoda ta zapewnia ilościowe, dynamiczne odczyty aktywności neuronalnej, pomagając w ograniczaniu ryzyka mechanistycznego poprzez powiązanie efektów działania związków z funkcjonalnymi zmianami potencjału błonowego. Możliwość ta zwiększa pewność prognostyczną w identyfikacji związków wiodących, oferując bezpośrednie, optyczne raportowanie angażowania celu w żywych komórkach.
Zastosowania strategiczne w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Wartość naukowa: Umożliwia weryfikację hipotez terapeutycznych poprzez optyczne raportowanie dynamiki potencjału błonowego w odpowiedzi na modulację farmakologiczną.
- Wartość operacyjna: Wspiera funkcjonalną walidację celu poprzez bezpośredni pomiar zmian napięcia w czasie rzeczywistym w żywych komórkach wykazujących ekspresję GEVIs.
- Wartość prognostyczna: Zwiększa pewność co do zaangażowania celu poprzez dostarczenie ratiometrycznych lub opartych na intensywności odczytów fluorescencji skorelowanych ze zmianami napięcia.
Przesiewanie i opracowywanie testów
- Gotowość do analizy: Ułatwia przygotowanie zwalidowanych systemów komórkowych (np. HEK293) do późniejszego screeningu związków poprzez stabilną ekspresję GEVI i integrację z metodą patch-clamp w całej komórce.
- Wynik ilościowy: Umożliwia obrazowanie ratiometryczne z wykorzystaniem GEVI opartych na FRET, co poprawia wiarygodność sygnału i redukuje artefakty wynikające ze zmienności ekspresji lub fotoblaknięcia.
- Skalowalność: Kompatybilność z szybką akwizycją CCD i zautomatyzowanymi protokołami impulsów wspiera powtarzanie prób oraz analizę zależności dawka-odpowiedź.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Znaczenie chorobowe: Możliwość zastosowania w modelach neuronalnych (np. pierwotnych neuronach hipokampa) w celu oceny wpływu związków w kontekstach elektrofizjologicznych istotnych dla danej choroby.
- Ciągłość translacyjna: Łączy wyniki uzyskane in vitro z potencjałem in vivo poprzez ustanowienie kompetencji w obrazowaniu pojedynczych komórek jako warunku wstępnego do badań nad złożonymi tkankami.
- Minimalizacja ryzyka mechanistycznego: Pozwala na odróżnienie specyficznych dla związku efektów napięciowych od niespecyficznego szumu dzięki odejmowaniu klatek i normalizacji linii bazowej.
Integracja potoku i przepływu pracy
Metoda ta wpisuje się w kontinuum procesu odkrywania leków, od wczesnej analizy celu po optymalizację związku wiodącego, w którym funkcjonalne odczyty napięcia stanowią podstawę do wyboru związków przed badaniami nad skutecznością przedkliniczną.
- Biologia odkrywcza: Wspiera weryfikację hipotez poprzez korelację sygnałów optycznych ze stymulacją metodą clampowania napięcia w celu walidacji odpowiedzi sondy oraz stanu zdrowotnego komórek.
- Przesiewanie: Dostarcza gotowych do analizy, powtarzalnych pomiarów dzięki standaryzowanej konfiguracji whole-cell oraz normalizacji fluorescencji bazowej.
- Analityka: Umożliwia określenie ułamkowej zmiany fluorescencji oraz analizę kinetyczną (dopasowanie wykładnicze) w celu ilościowego oznaczenia amplitudy sygnału i szybkości odpowiedzi.
- Badania translacyjne: Umożliwia przejście z modeli jednokomórkowych HEK293 do pierwotnych neuronów, wspierając ocenę istotności translacyjnej.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Tworzy wielokrotnego użytku platformę obrazowania do badań nad modulacją kanałów jonowych w wielu klasach celów i kampaniach przesiewowych.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorczy
- Wartość naukowa: Redukuje niejednoznaczność mechanistyczną, zapewniając bezpośrednie, w czasie rzeczywistym, optyczne raportowanie zmian potencjału błonowego jako funkcjonalnego biomarkera aktywności neuronalnej.
- Wartość operacyjna: Sprzyja standaryzacji poprzez zdefiniowane protokoły patch clamp, kalibrację dzielnika obrazu oraz zestandaryzowane kroki analizy (odejmowanie klatek, normalizacja RLI).
- Wartość strategiczna: Poprawia proces podejmowania decyzji go/no-go, umożliwiając wczesne wykrycie pozatarczasowych efektów elektrofizjologicznych, co zmniejsza ryzyko odrzucenia projektu na późnym etapie.
- Wpływ na portfolio: Wspiera priorytetyzację skorygowaną o ryzyko poprzez kwantyfikację indukowanych przez związki przesunięć napięcia z określonymi progami dla dalszego rozwoju.
Wskazówki dotyczące wdrożenia
- Wymaga doświadczenia w zakresie elektrofizjologii (metoda whole-cell patch clamp), mikroskopii fluorescencyjnej oraz pracy z GEVI.
- Zależność od szybkich kamer CCD, rozdzielaczy obrazu i kostek filtrujących w celu detekcji FRET przy dwóch długościach fal.
- Konieczność standaryzacji międzyzespołowej pomiędzy zespołami zajmującymi się obrazowaniem a elektrofizjologią w celu zapewnienia spójności pozyskiwanych danych.
- Kwestie adaptacyjne obejmują typ GEVI (pojedyncze FP vs. oparte na FRET), poziomy ekspresji oraz odpowiedniość linii komórkowej (np. unikanie dzielących się lub obumierających komórek HEK293).
- Ograniczenia praktyczne obejmują niski stosunek sygnału do szumu, podatność na artefakty wynikające z nadekspresji oraz zależną od użytkownika interpretację sygnałów optycznych w stosunku do szumu.
