Oparty na fluorescencji test potencjału błonowego do wysokoprzepustowego badania funkcjonalnego dwóch endogennych kanałów jonowych w dwóch nabłonkowych liniach komórkowych

Testy potencjału błonowego oparte na fluorescencji zapewniają solidne metody badania wpływu modulatorów na kanały jonowe, które ulegają endogennej ekspresji w komórkach nabłonkowych. Jako dowód słuszności koncepcji, mierzymy funkcję dwóch kanałów jonowych w dobrze znanych liniach komórek nabłonkowych. Ten test jest wszechstronny, ponieważ wykorzystuje egzogenną sondę chemiczną do pomiaru funkcji kanału jonowego, omijając w ten sposób potrzebę stosowania sond kodowanych genetycznie.

Te wysokoprzepustowe testy mogą zidentyfikować i scharakteryzować wpływ modulatorów małocząsteczkowych na kanały jonowe, które mogą przyczynić się do postępu w leczeniu mukowiscydozy. Na początek hoduj komórki Calu-3 i Caco-2 w kolbie T75 zawierającej EMEM z 20% płodową surowicą bydlęcą i 1% streptomycyną penicyliny. Odessać pożywkę z kolby T75 po osiągnięciu przez komórki zbiegu od 80 do 100%.

Delikatnie umyj komórki 10 mililitrami soli fizjologicznej buforowanej fosforanami. Następnie dodaj 2 mililitry wstępnie podgrzanej 0,25% trypsyny z 0,1% EDTA do monowarstwy komórki. Umieścić kolbę w temperaturze 37 stopni Celsjusza na około pięć minut.

Na tym etapie należy upewnić się, że komórki unoszą się z powierzchni kolby i dysocjują do zawiesiny pojedynczej komórki. Dodaj 8 mililitrów pożywki hodowlanej, aby zneutralizować reakcję. Gdy komórki osiągną zbieżność od 30 do 40%, dodaj 1,5 mililitra zawiesiny komórkowej do 18,5 mililitra pożywki hodowlanej w stożkowej probówce i wymieszaj.

Dodaj 200 mikrolitrów tej zawiesiny komórek do każdego dołka 96-dołkowej płytki, aby uzyskać około 140 000 komórek na studzienkę. Aby pokryć jedną pełną 384-dołkową płytkę, dodaj 1 mililitr zawiesiny komórkowej do 17 mililitrów pożywki hodowlanej w stożkowej probówce, aby uzyskać około 50 000 komórek na studzienkę. Po wymieszaniu dodać 50 mikrolitrów zawiesiny komórkowej do każdej studzienki.

Zmieniaj pożywkę co dwa dni i upewnij się, że komórki osiągną 100% zbieżność w ciągu trzech do pięciu dni we wszystkich studzienkach jednocześnie. Zmienić pożywkę na 24 godziny przed badaniami funkcjonalnymi. Najpierw przygotuj bezsodowy, bezchlorkowy roztwór buforowy z odczynnikami wymienionymi w protokole tekstowym.

Dodaj odczynniki do podwójnie destylowanej wody klasy kultur tkankowych. Pozwól odczynnikom się rozpuścić, mieszając przez noc w temperaturze pokojowej. Po ustabilizowaniu się roztworu dostosuj pH do 7,4, dodając kroplami 1 molowy roztwór NMDG.

Mieszaj przez 30 minut i dostosuj osmolarność roztworu do zakresu 300 plus minus 5 milimoli na kilogram. Przefiltrować i przechowywać roztwór buforowy w sterylnych butelkach. Następnie rozpuść 0,5 miligrama barwnika potencjału błonowego w 1 mililitrze bezsodowego, bezchlorkowego buforu i podgrzej roztwór do 37 stopni Celsjusza.

Usunąć pożywkę hodowlaną z monowarstw komórek Calu-3 i Caco-2. Dodać 195 mikrolitrów roztworu barwnika na dołek dla płytki 96-dołkowej i 95 mikrolitrów na dołek dla płytki 384-dołkowej. Pozwól komórkom załadować barwnik przez 35 minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla.

Następnie wykonaj pomiary fluorescencji ze wzbudzeniem na 530 nanometrach i emisją na 560 nanometrach. Początkowo wykonuj ciągłe odczyty linii bazowej przez pięć minut w odstępach 30-sekundowych. Następnie dodaj 5 mikrolitrów 400 mikromolowego roztworu Forskoliny do każdego dołka 96-dołkowej płytki, aby uzyskać końcowe stężenie Forskoliny wynoszące jeden mikromol

Do płytki 384-dołkowej dodaj pięć mikrolitrów 20 mikromolowego roztworu Forskoliny. Oceń stymulację przez 20 minut z pomiarami w 15-sekundowych odstępach. Następnie dodaj 5 mikrolitrów 400 mikromolowego roztworu inhibitora CFTR do 96-dołkowej płytki, aby uzyskać końcowe stężenie 10 mikromolowych.

Do płytki 384-dołkowej dodaj 5 mikrolitrów 200-mikromolowego inhibitora CFTR. Wykonaj odczyt hamowania przez 15 minut z pomiarami w odstępach 30-sekundowych. Określ ilościowo pomiary intensywności fluorescencji każdego dołka i wyeksportuj wartości jako arkusz kalkulacyjny.

w formacie kolumnowym, zawierającym poszczególne studzienki. Aby obliczyć zmiany wywołane przez forskolinę, podziel względne pomiary jednostek fluorescencji z każdej studzienki 96-dołkowej płytki przez ostatni pomiar intensywności fluorescencji z odczytu linii podstawowej i wykreśl je. Zmierz szczytowe odpowiedzi jako maksymalną intensywność fluorescencji mierzoną od wartości wyjściowej podczas stymulacji forskoliny.

Użyj tego pomiaru lub obszaru pod krzywą, aby określić ilościowo odpowiedź CFTR. Funkcję CFTR wykryto jako depolaryzację błony po stymulacji forskoliną w komórkach Caco-2. Wypływ fluoru wykryto jako gwałtowny wzrost fluorescencji w porównaniu z DMSO jako kontrolą nośnika.

Po stymulacji forskoliny sygnał fluorescencyjny utrzymywał się aż do dodania inhibitora CFTR, po czym nastąpił gwałtowny spadek intensywności fluorescencji. Zjawisko to było powtarzalne zarówno w komórkach Caco-2, jak i Calu-3. Aktywność CFTR obliczono jako różnicę w maksymalnej zmianie fluorescencji po stymulacji Forskoliną lub DMSO.

Poszczególne punkty mieściły się w przedziale plus minus 3 odchylenia standardowe od średniej w przypadku stymulacji forskoliną i kontroli DMSO, co wskazuje na odtwarzalność testu. Aby potwierdzić specyficzność reakcji funkcjonalnych, te testy potencjału błonowego mogą być dalej walidowane przy użyciu konwencjonalnych metod elektrofizjologicznych, takich jak komora usinga. Platforma ta jest w stanie wypełnić lukę między wysokoprzepustowymi ekranami modulatorów a heterologicznymi systemami ekspresji a czasochłonnymi pomiarami bioelektrycznymi w trudno dostępnych tkankach pierwotnych.