Name: Izolacja i charakterystyka mysich oocytów antralnych na podstawie organizacji chromatyny jąderkowej (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-01-07T12:00:01.000+00:00
Duration: 7 min 16 s
Description: Poznaj metodę izolacji i charakterystyki mysich oocytów antralnych na podstawie organizacji chromatyny jąderkowej. Protokół umożliwia rozróżnienie typów SN i NSN oraz ocenę ich potencjału rozwojowego w badaniach biologii rozrodu.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

M.M. i C.A.R. dziękują za wsparcie finansowe Ministero della Salute, Ricerca Finalizzata/giovani ricercatori anno 2009 Fondazione IRCCS Ospedale San Matteo, Pavia (I). M.M i C.A.R. pragną podziękować Mariannie Longo za pomoc w przygotowaniu zdjęć.

Protokół ten jest sporządzany zgodnie z zasadami przewodnimi europejskich (UE 63/2010) i włoskich (26/2014) przepisów chroniących zwierzęta wykorzystywane do badań naukowych. Eutanazja zwichnięcia szyjki macicy służy do izolacji jajników i jest wykonywana przez ekspertów i przeszkolone osoby wymienione w zatwierdzonym protokole obejmującym to badanie. 
1. Zwierzęta
<ol>
	<li>Dorosłe samice myszy w wieku od 3 do 6 tygodni należy utrzymywać w pomieszczeniu o kontrolowanej temperaturze i wilgotności (z fazami 12L:12D i karmione ad libitum).</li>
	<li>Wstrzyknąć myszom dootrzewnowo 2,5 j.m. gonadotropiny surowicy ciężarnej klaczy (PMSG) w celu stymulowania wzrostu pęcherzyków poprzez naśladowanie działania hormonu folikulotropowego (FSH). Odizoluj jajniki do pobrania antralnych oocytów 48 godzin później. Poddaj eutanazji samicę myszy, której wcześniej wstrzyknięto PMSG, zgodnie z wytycznymi instytucjonalnymi.</li>
	<li>Szybko usunąć jajniki z jamy ciała i umieścić je na szalce Petriego zawierającej pożywkę M2 w celu późniejszej izolacji oocytów (patrz punkt 3).
	<ol>
		<li>Wykonaj nacięcie na skórze pokrywającej ścianę brzucha, a następnie nacięcie w otrzewnej za pomocą sterylnych nożyczek preparacyjnych. Otwórz nacięcie, aby odsłonić brzuch, przesuń wnętrzności na jedną stronę za pomocą sterylnej pęsety i zlokalizuj jajowody, tworząc kształt litery V, zaczynając od pęcherza.</li>
		<li>Obserwuj jajniki znajdujące się poniżej nerek. Przytrzymaj każdą rurkę sterylną pęsetą i wykonaj małe nacięcie na dnie jajników, aby je uwolnić. Przenieść oba jajniki na dno szalki Petriego zawierającej wstępnie zrównoważoną pożywkę.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Przygotowanie hormonów
<ol>
	<li>Rozcieńczyć PMSG (dostępny w różnych stężeniach podstawowych) sterylnym izotonicznym roztworem soli fizjologicznej, aby uzyskać stężenie robocze 2,5 hormonu I.U. na 0,1 ml dla odpowiedniej objętości iniekcji. 
	UWAGA: Roztwory hormonów muszą być porcjowane w probówkach o pojemności 0,5 ml i przechowywane w temperaturze -20 °C do dnia użycia. Nie przechowywać rozcieńczonych podwielokrotności dłużej niż trzy miesiące w temperaturze -20 °C. Po rozmrożeniu, jeśli wykonywane są seryjne wstrzyknięcia, porcje roztworów hormonów należy przechowywać w temperaturze +4 °C i zużyć je w ciągu 4 dni.</li>
</ol>
3. Izolacja oocytów antralnych
Dla prawidłowej izolacji komórek jajowych:
<ol>
	<li>Zrównoważyć pożywkę M213 (M2) przy 5% CO2 i temperaturze 37 °C przez co najmniej 1 godzinę przed rozpoczęciem procedury izolacji oocytów. Przygotować dwie szalki Petriego (35 mm x 10 mm), jedną z 1 ml M2 do nakłucia jajników, a drugą z małymi kroplami (20 μl) M2 pokrytymi olejem mineralnym (~1,5 ml) do transferu oocytów po wyizolowaniu z jajnika (patrz 3.4-3.6). Obie szalki Petriego należy przechowywać w inkubatorze w temperaturze 5% CO2 i temperaturze 37 °C do momentu, gdy będą gotowe do użycia.</li>
	<li>Podczas zabiegów izolacji oocytów należy używać mikroskopu stereoskopowego.</li>
	<li>Przygotuj cienkie szklane pipety do ust w celu pobrania oocytów, rozciągając szklane pipety Pasteura trzymane poziomo (trzymając końce pipety obiema rękami), nad pionowym płomieniem pochodzącym z palnika Bunsena (ryc. 1).
	<ol>
		<li>Gdy szkło zacznie się topić, wyjmij pipetę z płomienia i wykonaj szybki ruch ciągnący, aby uzyskać żądaną pipetę. Mocno odetnij nadmiar szkła w pobliżu wąskiego punktu pipety paznokciami, aby wyregulować długość i średnicę wewnętrznej kapilary. Upewnij się, że cienka kapila ma średnicę wewnętrzną ~100 μm, nieco większą niż średnica oocytu (~80 μm).</li>
		<li>Aby dodać pipetę do ust, podłącz jeden koniec rurki aspiratora do wyciągniętej pipety za pomocą odpowiedniej końcówki, a drugi koniec umieść w jamie ustnej, zabezpieczając go zębami.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Zbierz jajniki za pomocą sterylnej pęsety i umieść je na dnie szalki Petriego do hodowli komórkowych (35 mm x 10 mm). Przykryć je 1 ml M2 uprzednio zrównoważonego w temperaturze 37 °C i 5% CO2 (rysunek 2).</li>
	<li>Delikatnie nakłuć pęcherzyki antralne jajników sterylną igłą strzykawki insulinowej, aby uwolnić antralne oocyty w M2 (ryc. 3).</li>
	<li>Delikatnie przetrzeć oocyty przez wąską pipetę Pasteura w celu usunięcia komórek pęcherzykowych i wszelkich innych możliwych resztek tkanek (ryc. 4A), a następnie umieścić je na dnie małych kropelek (20 μl) M2 pokrytych olejem mineralnym odpowiednim do hodowli zarodków (wcześniej przygotowanym; Rysunek 4B). 
	UWAGA: Ważne jest, aby usunąć wszystkie komórki wzgórka przyczepione do osłonki przejrzystej oocytów poprzez ciągłe pipetowanie przez kilka różnych kropli M2. Wykonaj ten krok tak szybko, jak to możliwe, aby uniknąć zmian pH pożywki.</li>
</ol>
4. Barwienie oocytów antralnych za pomocą Hoechst33342
UWAGA: Oocyty antralne można rozróżnić w SN (Surrounded Nucleolus), NSN (Not Surrounded Nucleolus) lub w dowolnej innej formie pośredniej, na podstawie ich organizacji chromatyny po barwieniu supravitalnym stężeniem Hoechst33342 (lub dowolnymi innymi markerami specyficznymi dla zasad AT)14. W rzeczywistości oocyty SN wykazują pierścień Hoechst-dodatni wokół jąderka, podczas gdy NSN nie, stąd jego nazwa.
Dla prawidłowego barwienia oocytów:
<ol>
	<li>Przenieść oocyty za pomocą pipety doustnej do kropli Hoechst33342 (20 μl) rozcieńczonych w M2 w stężeniu supravital 50 ng/μl przez 10 minut w ciemności.</li>
	<li>Po inkubacji z Hoechst33342 przenieść każdy pojedynczy oocyt za pomocą pipety doustnej na dnie małych kropli (5 μl) M2 pokrytych olejem mineralnym, do sortowania na podstawie organizacji chromatyny (SN lub NSN). Użyj dowolnego mikroskopu fluorescencyjnego wyposażonego w filtr Hoechst33342 (długość fali emisji 486 nm), aby zobrazować konfigurację chromatyny oocytów. 
	UWAGA: W zależności od rodzaju używanego mikroskopu fluorescencyjnego może okazać się konieczne użycie płytki Petriego ze szklanym dnem do akwizycji obrazu. Mikroskopia konfokalna Olympus Fluoview Fv10i, wyposażona w uchwyt na próbkę 35 mm, wymaga jedynie szklanych naczyń dolnych do akwizycji obrazu, o standardowej grubości 0,17 mm i dopuszczalnym zakresie od 0,13 do 0,21 mm.</li>
	<li>Pobudzaj oocyty nie dłużej niż 5-10 sekund, prawdopodobnie wystarczająco długo, aby uwidocznić obecność lub brak pierścienia wokół jąderka (ryc. 5).</li>
	<li>Po sortowaniu hodować antralne oocyty SN i NSN w M2 w temperaturze 5% CO2 i temperaturze 37 °C w celu wywołania dojrzewania in vitro lub przechowywać je w odpowiednich do analiz molekularnych lub komórkowych.</li>
</ol>

<ol><li>Parfenov, V., Potchukalina, G., Dudina, L., Kostyuchek, D., Gruzova, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+antral+follicles%3A+oocyte+nucleus+and+the+karyosphere+formation+%28electron+microscopic+and+autoradiographic+data%29%5BTitle%5D)+AND+%22Gamete+Res%22%5BJournal%5D)">Human antral follicles: oocyte nucleus and the karyosphere formation (electron microscopic and autoradiographic data).</a> Gamete Res. 22 (2), 219-231 (1989).</li>
<li>Anderiesz, C., Ferraretti, A. P., Magli, C., Fiorentino, A., Fortini, D., Gianaroli, L., Jones, G. M., Trounson, A. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+recombinant+human+gonadotropins+on+human%2C+bovine+and+murine+oocyte+meiosis%2C+fertilization+and+embryonic+development+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Reprod%22%5BJournal%5D)">Effect of recombinant human gonadotropins on human, bovine and murine oocyte meiosis, fertilization and embryonic development in vitro.</a> Human Reprod. 15 (5), 1140-1148 (2000).</li>
<li>Mattson, B. A., Albertini, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oogenesis%3A+Chromatin+and+microtubule+dynamics+during+meiotic+prophase%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Reprod.+Dev%22%5BJournal%5D)">Oogenesis: Chromatin and microtubule dynamics during meiotic prophase.</a> Mol. Reprod. Dev. 25 (4), 374-383 (1990).</li>
<li>Debey, P., Szollosi, M. S., Szollosi, D., Vautier, D., Girousse, A., Besomber, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Competent+mouse+oocytes+isolated+from+antral+follicles+exhibit+different+chromatin+organization+and+follow+different+maturation+dynamics%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Reprod.+Dev%22%5BJournal%5D)">Competent mouse oocytes isolated from antral follicles exhibit different chromatin organization and follow different maturation dynamics.</a> Mol. Reprod. Dev. 36 (1), 59-74 (1993).</li>
<li>Zuccotti, M., Piccinelli, A., Giorgi Rossi, P., Garagna, S., Redi, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromatin+organisation+during+mouse+oocyte+growth%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Reprod.+Dev%22%5BJournal%5D)">Chromatin organisation during mouse oocyte growth.</a> Mol. Reprod. Dev. 41 (1-2), 479-485 (1995).</li>
<li>Wu, Y. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selection+of+oocytes+for+in+vitro+maturation+by+brilliant+cresyl+blue+staining%3A+a+study+using+the+mouse+model%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Res%22%5BJournal%5D)">Selection of oocytes for in vitro maturation by brilliant cresyl blue staining: a study using the mouse model.</a> Cell Res. 17, 722-731 (2007).</li>
<li>Opiela, Y., Kątska-Książkiewicz, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+utility+of+Brilliant+Cresyl+Blue+%28BCB%29+staining+of+mammalian+oocytes+used+for+in+vitro+embryo+production+%28IVP%29%5BTitle%5D)+AND+%22Reproductive+Biol%22%5BJournal%5D)">The utility of Brilliant Cresyl Blue (BCB) staining of mammalian oocytes used for in vitro embryo production (IVP).</a> Reproductive Biol. 13, 177-183 (2013).</li>
<li>Labrecque, R., Sirard, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+study+of+mammalian+oocyte+competence+by+transcriptome+analysis%3A+progress+and+challenges%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Human+Reprod%22%5BJournal%5D)">The study of mammalian oocyte competence by transcriptome analysis: progress and challenges.</a> Mol. Human Reprod. 20 (2), 103-116 (2014).</li>
<li>Monti, M., Zanoni, M., Calligaro, A., Ko, M. S., Mauri, P. L., Redi, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Developmental+arrest+and+mouse+antral+Not-Surrouded+Nucleolus+oocyte%5BTitle%5D)+AND+%22Biol.+Reprod%22%5BJournal%5D)">Developmental arrest and mouse antral Not-Surrouded Nucleolus oocyte.</a> Biol. Reprod. 88 (1), 1-7 (2013).</li>
<li>Yurttas, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+for+PADI6+and+the+cytoplasmic+lattices+in+ribosomal+storage+in+oocytes+and+translational+control+in+the+early+mouse+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Role for PADI6 and the cytoplasmic lattices in ribosomal storage in oocytes and translational control in the early mouse embryo.</a> Development. 135 (15), 2627-2636 (2008).</li>
<li>Li, L., Baibakov, B., Dean, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+subcortical+maternal+complex+essential+for+preimplantation+mouse+embryogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Cell%22%5BJournal%5D)">A subcortical maternal complex essential for preimplantation mouse embryogenesis.</a> Dev. Cell. 15 (3), 416-425 (2008).</li>
<li>Ami, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FT-IR+spectra+signatures+of+mouse+antral+oocytes%3A+molecular+markers+of+oocyte+maturation+and+developmental+competence%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim.+Biophys.+Acta%22%5BJournal%5D)">FT-IR spectra signatures of mouse antral oocytes: molecular markers of oocyte maturation and developmental competence.</a> Biochim. Biophys. Acta. 1813 (6), 1220-1222 (2011).</li>
<li>Fulton, B. P., Whittingam, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+of+mammalian+oocytes+by+intercellular+injection+of+calcium%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Activation of mammalian oocytes by intercellular injection of calcium.</a> Nature. 273 (5658), 149-151 (1978).</li>
<li>Luttmer, S. J., Longo, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Examination+of+living+and+fixed+gametes+and+early+embryos+stained+with+supravital+fluorochromes+%28Hoechst+33342+and+3%2C3%E2%80%B2-dihexyloxacarbocyanine+iodide%29%5BTitle%5D)+AND+%22Gamete+Res%22%5BJournal%5D)">Examination of living and fixed gametes and early embryos stained with supravital fluorochromes (Hoechst 33342 and 3,3′-dihexyloxacarbocyanine iodide).</a> Gamete Res. 15 (3), 267-283 (1986).</li>
<li>Monti, M., Redi, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+biopolitics+of+frozen+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">The biopolitics of frozen embryos.</a> Int. J. Dev. Biol. 55, 243-247 (2011).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia

Protokół ten opisuje metodę stosowaną do izolacji i klasyfikacji antralnych oocytów GV myszy. Nie ma żadnych szczególnych krytycznych kroków, które należy podkreślić, z kilkoma wyjątkami. Po pierwsze: zabieg ten należy wykonać tak szybko, jak to możliwe, aby: a) utrzymać witalność oocytów i b) uniknąć zmian pH w użytej pożywce. Po drugie: oocyty powinny być krótko wzbudzone (5-10 sekund) do Hoechst33342, aby uniknąć uszkodzenia chromatyny i późniejszej śmierci oocytów, zwłaszcza jeśli IVM i IVF są następującymi krokami. ...

W pełni rozwinięte oocyty antralne (GV, pęcherzyki rozrodcze) wyizolowane z przedziału antralnego jajnika są rutynowo wykorzystywane do różnych celów, takich jak na przykład badanie molekularnych i komórkowych mechanizmów stojących za dojrzewaniem in vitro do etapu Metafazy II.
Pomimo pięknego wyglądu, większość oocytów antralnych, ale nie wszystkie, są w stanie zakończyć mejozę i osiągnąć stadium blastocysty; w rzeczywistości, u wielu gatunków ssaków, w tym ludzi1,2, około 30% z nich zatrzymuje swój rozwój na etapie 2-komórkowym, jeśli zapłodnienie nastąpi3-5. Do tej pory stosuje się niewiele parametrów do odróżnienia oocytów zdolnych do podtrzymania rozwoju embrionalnego od tych, które nie są w stanie tego zrobić.
Na przykład, barwienie błękitem krezylu (BCB) jest prawidłową metodą sortowania oocytów na podstawie aktywności dehydrogenazy glukozo-6-fosforanowej, chociaż użyteczność tej metody sortowania związana z barwieniem BCB+ lub BCB- jest nadal zależna laboratoryjnie6-8.
Inna sprawdzona metoda tkwi w organizacji ich chromatyny: jeśli są barwione jakimikolwiek barwnikami interkalacyjnymi DNA (jak Hoechst33342), 70% oocytów antralnych wykazuje pierścień barwnikowo-dodatni wokół jąderka i nazywane są Otoczonymi Jąderkami (SN), podczas gdy pozostałe 30% wykazują bardziej zauważone pozytywne sygnały i nazywane są Nieotoczonymi Jąderkami (NSN)3-5. Niedawno wykazaliśmy, że brak sieci cytoplazmatycznych9 (CPL, ważne miejsca magazynowania mRNA i rybosomów pochodzących od matki zarówno w oocytach, jak i zarodkach ssaków)10 oraz regulacja w dół MATER (niezbędnej do tworzenia CPL11), wraz z obecnością kropelek lipidów w ich cytoplazmach9,12, mogą być innymi przyczynami związanymi z niezdolnością oocytów NSN do wyjścia poza stadium 2-komórkowe.
Niestety, niewiele technik można zastosować do sortowania antralnych oocytów SN i NSN i z tego powodu opracowanie mniej inwazyjnej metody (bez barwienia jądrowego, procedur fiksacji lub manipulacji za pomocą pipet doustnych) może stać się bardzo ważne dla zwiększenia tempa rozwoju zarówno ludzkich, jak i zwierzęcych embrionów.
W tym artykule szczegółowo opisujemy prosty i szybki protokół używany do izolowania i sortowania oocytów antralnych SN i NSN od samic myszy i jest on skierowany do wszystkich naukowców zainteresowanych badaniem żeńskiej gametogenezy, dojrzewania oocytów i rozwoju zarodka.

<table><tbody><tr><td>PMSG</td><td>Sigma</td><td>G4527</td><td></td></tr><tr><td>EmbrioMax M2</td><td>Millipore</td><td>MR-015-PD</td><td></td></tr><tr><td>Hoechst33342</td><td>Thermo Scientific</td><td>62249</td><td></td></tr><tr><td>Olej mineralny</td><td>Sigma</td><td>M8410</td><td></td></tr><tr><td>Naczynie do hodowli komórkowych 35mmx10mm</td><td>Corning</td><td>430165</td><td></td></tr><tr><td>&micro;-Dish 35mm, wysokie szklane dno</td><td>Ibidi</td><td>81158</td><td></td></tr><tr><td>Pipeta Pasteur Borosilicate</td><td>Corning</td><td>7095D-9</td><td></td></tr><tr><td>Zespoły probówek aspiratora do kalibrowanych pipet mikropilarnych</td><td>Sigma</td><td>A5177</td><td></td></tr></tbody></table>

izolacja i charakterystyka mysich oocytów antralnych na podstawie organizacji chromatyny jąderkowej

Isolation and Characterization of Mouse Antral Oocytes Based on Nucleolar Chromatin Organization

Ten protokół opisuje prostą i szybką metodę izolowania i charakteryzowania mysich antralnych oocytów GV (Germinal Vesicle) jako zdolnych (SN, Surrounded Nucleolus) lub niezdolnych (NSN, Not Surrounded Nucleolus) do rozwinięcia się do stadium blastocysty po dojrzewaniu in vitro (IVM) i zapłodnieniu in vitro (IVF). Wykorzystuje Hoeschst33342 (lub dowolny inny barwnik interkalacyjny DNA) zdolny do wiązania się z heterochromatyną jąderka pokazującego pierścień w oocytach SN lub nie, jak w oocytach NSN. Jest to najłatwiejszy i najszybszy sposób sortowania obu oocytów antralnych, które mogą być ostatecznie wykorzystane do procedur IVM lub IVF. 
Krótko mówiąc, protokół składa się z następujących kroków: wstrzyknięcie hormonu w celu stymulacji wzrostu pęcherzyków; izolacja oocytów w stadium GV od przedziału antralnego poprzez nakłucie jajnika sterylną igłą; przygotowanie cienkich szklanych pipet do pipetowania oocytów do ust; sortowanie oocytów za pomocą Hoechst33342 przygotowanych w stężeniu supravitalnym; IVM, IVF lub jakakolwiek inna analiza molekularna/komórkowa.
Niestety, wciąż niewiele jest dowodów na sortowanie oocytów SN i NSN przy użyciu mniej inwazyjnych technik. Jeśli i kiedy zostaną zidentyfikowane, mogą być potencjalnie zastosowane w technologiach wspomaganego rozrodu u ludzi, chociaż z kilkoma aspektami, które powinny zostać zmodyfikowane. Do tej pory technika ta ma potencjalne implikacje dla znacznego zwiększenia liczby udanych procedur IVM i IVF zarówno u gatunków zagrożonych, jak i o znaczeniu ekonomicznym.

Poniższe zdjęcia przedstawiają metodę izolacji oocytów antralnych z jajników myszych, począwszy od przygotowania pipet, aż po sortowanie oocytów za pomocą Hoechst33342. Metoda ta jest dość prosta i może być wykonana w każdym laboratorium wyposażonym w inkubator CO2, stereomikroskop oraz mikroskop fluorescencyjny z odpowiednim filtrem do obserwacji Hoechst33342. Rycina 1 pokazuje wstępny etap przygotowania pipety: w momencie gdy szkło zaczyna się topić i mięknąć...

Tutaj prezentujemy protokół charakterystyki oocytów antralnych myszy na podstawie organizacji jąder.

Izolacja i charakterystyka mysich oocytów antralnych na podstawie organizacji chromatyny jąderkowej

This protocol describes a simple and quick method to isolate and characterize mouse antral GV (Germinal Vesicle) oocytes as able (SN, Surrounded ...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest szczegółowe opisanie wszystkich kroków niezbędnych do charakterystyki oocytów antralnych myszy na podstawie organizacji ich chromatyny, w zależności od ich zdolności do pełnego podtrzymania przyszłego rozwoju embrionalnego. Metoda ta może pomóc w odpowiedzi na kluczowe pytania z zakresu biologii rozwoju, takie jak sposób rozróżniania i izolowania dwóch różnych rodzajów oocytów antralnych: SN (z otoczonym jąderkiem) oraz NSN (z nieotoczonym jąderkiem), znajdujących się w części antralnej jajnika ssaków. Aby pobrać jajniki, należy rozpocząć od wstrzyknięcia samicom myszy w wieku od trzech do sześciu tygodni drogą IP 2,5 jednostek międzynarodowych gonadotropiny z surowicy ciężkiej klaczy.Dwa dni później, na około godzinę przed zbiorem, napełnij jedną sterylną szalkę Petriego pożywką M2, a do drugiej szalki Petriego dodaj kilka kropel pożywki M2 o objętości 20 µL, przykrywając każdą kroplę 1,5 ml oleju mineralnego. Następnie przenieś wszystkie szalki Petriego do inkubatora w temperaturze 37 °C i przy 5% CO2, aby umożliwić wyrównanie parametrów pożywki. Następnie za pomocą sterylnych nożyczek chirurgicznych wykonaj nacięcie skóry pokrywającej ścianę brzuszną, a następnie nacięcie otrzewnej u pierwszej myszy po wstrzyknięciu hormonów.Za pomocą sterylnej pęsety odsunąć jelita, aby zlokalizować jajowody, które tworzą kształt litery V zaczynając od pęcherza. Po zlokalizowaniu jajników pod nerkami, chwycić jeden jajowód i uwolnić odpowiadający mu jajnik, wykonując niewielkie nacięcie u podstawy tkanki. Powtórzyć proces w celu pobrania drugiego jajnika, a następnie umieścić oba jajniki w szalce Petriego wypełnionej uprzednio zrównoważonym medium M2.Przed izolacją oocytu antralnego należy przygotować szklane pipety ustne, chwytając oba końce szklanej pipety Pasteura i trzymając ją poziomo nad płomieniem palnika Bunsena. Gdy szkło zacznie się topić, należy wyjąć pipetę z ognia i szybko ją rozciągnąć. Za pomocą paznokcia należy mocno odłamać nadmiar szkła blisko wąskiego punktu pipety, aby skrócić końcówkę i uzyskać wewnętrzną średnicę kapilary wynoszącą około 100 mikronów.Ważne jest, aby dobrać odpowiednią średnicę pipety. Jeśli będzie ona zbyt wąska, oocyty zostaną zablokowane, ulegną fragmentacji i obumrą. Następnie należy połączyć niemodyfikowany koniec pipety z rurką aspiratora.Następnie przenieś jajniki do szalki Petriego zawierającej 1 ml uprzednio wyrównanego medium M2 i za pomocą sterylnej igły strzykawki insulinowej delikatnie nakłuj pęcherzyki antralne jajników. W miarę uwalniania oocytów, delikatnie zbierz je za pomocą pipety ustnej, dbając o to, aby nie zasysać komórek pęcherzykowych ani innych fragmentów tkanek. Następnie szybko przepłucz każdy oocyt przez wiele kropli uprzednio wyrównanego medium M2, aby usunąć wszystkie komórki cumulus przytwierdzone do błony przejrzystej oocytów.Po odkomórkowaniu oocytów, ostrożnie osadź je na dnie poszczególnych kropli świeżego, zrównoważonego medium M2. W celu zabarwienia oocytów, za pomocą pipety ustnej przenieś komórki do kropli 20 µL Hoechst 33342 rozcieńczonego w medium M2. Następnie przenieś oocyty do nowej szalki Petriego zawierającej krople 5 µL medium M2 przykryte olejem mineralnym, dbając o to, aby każdy oocyt osiadł pojedynczo na dnie każdej kropli.Po przeniesieniu wszystkich oocytów, umieść szalkę pod mikroskopem fluorescencyjnym i naświetlaj komórki tylko przez czas niezbędny do zwizualizowania obecności lub braku pierścienia wokół jąderka. Należy uważać, aby nie doprowadzić do nadmiernej ekspozycji oocytów, ponieważ zbyt długie naświetlanie może uszkodzić chromatynę i doprowadzić do śmierci oocytów. Po zidentyfikowaniu oocytów SN i NSN, posortuj komórki do odpowiednich szalek Petri z właściwym odczynnikiem do planowanej analizy końcowej, zgodnie z organizacją ich chromatyny.Barwienie Hoechst 33342 w celu analizy organizacji chromatyny jest prawdopodobnie najważniejszym etapem procedury. Wzbudzanie trwające od 5 do 10 sekund powinno być wystarczające, aby posegregować oocyty na podstawie obecności lub braku chromatyny otaczającej jąderko w każdym oocycie. Po opanowaniu techniki, przy jej prawidłowym wykonaniu, cały proces można ukończyć w czasie krótszym niż trzy godziny.Podczas wykonywania tej procedury ważne jest, aby pracować w temperaturze pokojowej oraz pamiętać o delikatnym obchodzeniu się zarówno z jajnikami, jak i oocytami. Po zakończeniu tej procedury oocyty mogą zostać wykorzystane do dojrzewania in vitro oraz zapłodnienia in vitro. Po opracowaniu ta technika utorowała drogę badaczom z dziedziny biologii rozwoju do odpowiedzi na wciąż otwarte pytanie: jak rozpoznać i odróżnić dwa rodzaje oocytów antralnych znajdujących się w jajnikach ssaków.Po obejrzeniu tego filmu zdobędą Państwo wiedzę na temat tego, jak wykonać i używać własnej pipety ustnej oraz jak izolować i sortować oocyty antralne za pomocą barwienia Hoechst 33342. Należy pamiętać, że praca ze zwierzętami i komórkami wymaga zachowania szczególnych środków ostrożności, takich jak noszenie osobistego sprzętu ochronnego i używanie wysterylizowanych narzędzi.

isolation-characterization-mouse-antral-oocytes-based-on-nucleolar

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia rozwojowa

Oocyty są podatne na aneuploidię z powodu błędów w segregacji chromosomów podczas dojrzewania meiotycznego. Aneuploidne komórki jajowe mogą prowadzić do niepłodności, poronień lub zaburzeń rozwojowych, takich jak zespół Downa. W niniejszej pracy opisujemy metody wprowadzania wybranych materiałów do oocytów oraz metody badania dojrzewania meiotycznego i oceny ploidii.

Mikroiniekcja, dojrzewanie i ocena ploidii oocytów mysich

Ten film opisuje izolację oocytów antralnych ze świeżo pobranych jajników myszy. Te antralne oocyty mogą być wykorzystane do dalszej charakterystyki i badań rozwojowych.

Izolacja oocytów antralnych myszy: metoda izolowania oocytów antralnych ze świeżo pobranych jajników myszy

Tutaj prezentujemy protokół specyficznego zubożenia mRNA za pośrednictwem siRNA, a następnie analizę immunofluorescencyjną w celu oceny montażu i organizacji wrzeciona mejotycznego w oocytach myszy. Protokół ten jest odpowiedni do in vitro zubożenia transkryptów i oceny funkcjonalnej różnych czynników wrzecionowych i/lub MTOC w oocytach.

Ocena wrzeciona mejotycznego w oocytach myszy za pomocą wyciszania za pośrednictwem siRNA

Tutaj prezentujemy protokół do nieinwazyjnej oceny kompetencji rozwojowych oocytów przeprowadzanej podczas ich dojrzewania in vitro od pęcherzyka rozrodczego do etapu metafazy II. Metoda ta łączy obrazowanie poklatkowe z prędkością obrazu cząstek (PIV) i analizami sieci neuronowych.

Oparta na sieci neuronowej identyfikacja w pełni rozwiniętych oocytów myszy kompetentnych lub niekompetentnych rozwojowo

Wiadomo, że oogeneza u ssaków jest podatna na błędy, szczególnie z powodu błędnej segregacji chromosomów. W tym manuskrypcie opisano metody przygotowania rozprzestrzeniania się chromatyny dla mysich oocytów z profazą, metafazą I i II stopnia. Te podstawowe techniki pozwalają na badanie białek związanych z chromatyną i morfologii chromosomów w trakcie oogenezy ssaków.

Preparaty do rozprzestrzeniania chromatyny do analizy progresji oocytów myszy od profazy do metafazy II

W miarę jak warianty genetyczne związane z chorobami ludzkimi zaczynają być odkrywane, coraz ważniejsze staje się opracowanie systemów, za pomocą których można szybko ocenić biologiczne znaczenie tych zidentyfikowanych wariantów. Protokół ten opisuje metody oceny funkcji ludzkich genów podczas mejozy żeńskiej I przy użyciu mysich oocytów.

Wykorzystanie oocytów myszy do oceny funkcji ludzkich genów podczas mejozy I

Hodowle tkanek jajnikowych mogą być używane jako modele rozwoju pęcherzyków, owulacji i atrezji pęcherzyków oraz wskazują mechanizmy regulacyjne dynamicznych procesów jajnikowych.

Posiew tkanki jajnikowej w celu wizualizacji zjawisk w jajniku myszy

Przedstawiono zoptymalizowany protokół, który umożliwia wyczerpanie cytoplazmatycznych centrów organizowania mikrotubul w oocytach myszy podczas metafazy I za pomocą lasera femtosekundowego bliskiej podczerwieni.

Wielofotonowa ablacja laserowa cytoplazmatycznych centrów organizowania mikrotubul w oocytach myszy

Ten protokół dostarcza eksperymentalnych ram do dokumentowania fizycznego wpływu cytoszkieletu na kształt jądra i wewnętrzne organelle pozbawione błony w układzie oocytów myszy. Struktura może być dostosowana do użycia w innych typach komórek i kontekstach.

Uchwycenie mieszania jądra oocytu myszy na podstawie cytoszkieletu w różnych skalach przestrzennych

Rysunek 1: Ramy end-to-end. Rysunek ilustruje kompleksowe ramy wiedzy multimodalnej Graf VISHAM-KG. Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tej figurki.

Przygotowanie rozprzestrzeniania chromosomów mejotycznych z oocytów myszy do oceny synapsy i rekombinacji

Poznaj metodę izolacji i charakterystyki mysich oocytów antralnych na podstawie organizacji chromatyny jąderkowej. Protokół umożliwia rozróżnienie typów SN i NSN oraz ocenę ich potencjału rozwojowego w badaniach biologii rozrodu.

Izolacja i charakterystyka mysich oocytów antralnych na podstawie organizacji chromatyny jąderkowej

Przeglądaj więcej filmów