Izolacja i charakterystyka mysich oocytów antralnych na podstawie organizacji chromatyny jąderkowej
7 stycznia 2016
Tutaj prezentujemy protokół charakterystyki oocytów antralnych myszy na podstawie organizacji jąder.
Ogólnym celem tej procedury jest wyszczególnienie wszystkich kroków niezbędnych do scharakteryzowania oocytów antralnych myszy na podstawie ich organizacji chromatyny, zgodnie z ich zdolnością do pełnego podtrzymania przyszłego rozwoju embrionalnego. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania z dziedziny biologii rozwoju, takie jak sposób rozróżnienia i wyizolowania dwóch różnych rodzajów ooyctes antralnych, SN, jąderka otoczonego i NSN, jąderka nieotoczonego, znajdującego się w przedziale antralnym jajnika ssaków. Aby pobrać jajniki, zacznij od wstrzyknięcia trzy- do sześciotygodniowych samic myszy IP 2,5 jednostki międzynarodowej gonadotropiny surowicy ciężarnej klaczy.
Dwa dni później, około godziny przed zbiorami, napełnij jedną sterylną szalkę Petriego pożywką M2 i dodaj kilka 20 kropli pożywki M2 do drugiej szalki Petriego, pokrywając każdą kroplę 1,5 mililitra oleju mineralnego. Następnie przenieś wszystkie szalki Petriego do inkubatora z 5% dwutlenkiem węgla o temperaturze 37 stopni Celsjusza, aby umożliwić zrównoważenie pożywki. Następnie za pomocą sterylnych nożyczek preparacyjnych wykonaj nacięcie w skórze pokrywającej ścianę brzucha, a następnie nacięcie w otrzewnej pierwszej myszy, której wstrzyknięto hormon
.Użyj sterylnej pęsety, aby odsunąć jelita na bok, aby zlokalizować jajowody, które tworzą kształt litery V, zaczynając od pęcherza. Po zlokalizowaniu jajników poniżej nerek chwyć jeden jajowód macicy i uwolnij odpowiedni jajnik z małym nacięciem w dolnej części tkanki. Powtórz proces, aby zebrać drugi jajnik, a następnie umieść oba jajniki na szalce Petriego wypełnionej wstępnie zrównoważoną pożywką M2.
Przed wyizolowaniem oocytu antralnego należy wykonać szklane pipety doustne, chwytając oba końce szklanej pipety Pasteura i trzymając pipetę poziomo nad płomieniem palnika Bunsena. Gdy szkło zacznie się topić, wyjmij pipetę z płomienia i szybko rozsuń instrument. Za pomocą paznokcia mocno odetnij nadmiar szkła w pobliżu wąskiego punktu pipety, aby skrócić końcówkę i uzyskać wewnętrzną średnicę kapilary około 100 mikronów.
Ważne jest, aby pipeta miała odpowiednią średnicę. Jeśli jest zbyt wąski, ooyctes utkną, rozpadną się i umrą. Następnie podłącz niezmodyfikowaną końcówkę pipety do rurki aspiratora.
Następnie przenieś jajniki na szalkę Petriego zawierającą jeden mililitr wstępnie zbalansowanej pożywki M2 i użyj sterylnej igły do strzykawki insulinowej, aby delikatnie nakłuć pęcherzyki antralne jajników. Po uwolnieniu oocytów delikatnie zbierz je pipetą doustną, uważając, aby nie zassać żadnych komórek pęcherzykowych ani innych resztek tkanki. Następnie szybko pipetuj każdy oocyt przez wiele wstępnie zrównoważonych kropli pożywki M2, aby usunąć wszystkie komórki wzgórka przyczepione do osłonki przejrzystej oocytów.
Po ogołoceniu oocytów ostrożnie umieść oocyty na dnie pojedynczych kropli świeżej zbalansowanej pożywki M2. Aby wybarwić oocyty, użyj pipety doustnej, aby przenieść komórki do 20 mikrolitrowych kropli Hoechst 33342, rozcieńczonych w pożywce M2. Następnie przenieś oocyty na nową szalkę Petriego zawierającą pięć mikrolitrowych kropli pożywki M2 pokrytej olejem mineralnym, uważając, aby oocyty były umieszczone indywidualnie na dnie każdej kropli.
Kiedy wszystkie oocyty zostaną przeniesione, umieść szalkę pod mikroskopem fluorescencyjnym i pobudzaj komórki na tyle długo, aby uwidocznić obecność lub brak pierścienia wokół jąderka. Uważaj, aby nie prześwietlić oocytów, ponieważ chromatyna może zostać uszkodzona, a oocyty mogą umrzeć, jeśli są wystawione zbyt długo. Po zidentyfikowaniu oocytów SN i NSN należy posortować komórki na odpowiednią szalkę Petriego w odpowiednim odczynniku do pożądanej dalszej analizy, zgodnie z ich organizacją chromatyny.
Barwienie Hoechst 33342 w celu organizacji chromatyny jest prawdopodobnie najbardziej krytycznym etapem procedury. Pięć do 10 sekund wzbudzenia powinno wystarczyć do posortowania oocytów na podstawie obecności lub braku chromatyny otaczającej jąderko każdego oocytu. Po opanowaniu tej techniki można ją wykonać w mniej niż trzy godziny, jeśli zostanie wykonana prawidłowo.
Podczas wykonywania tej procedury ważne jest, aby pracować w temperaturze pokojowej i pamiętać o delikatnym traktowaniu zarówno jajników, jak i oocytów. Po tej procedurze oocyty można następnie wykorzystać do dojrzewania in vitro i zapłodnienia in vitro. Po jej opracowaniu, technika ta utorowała drogę naukowcom w dziedzinie biologii rozwojowej, aby odpowiedzieć na wciąż otwarte pytanie, jak rozpoznać i rozróżnić dwa rodzaje oocytów antralnych znajdujących się w jajnikach ssaków.
Po obejrzeniu tego filmu będziesz dobrze wiedział, jak zrobić i używać własnej pipety do jamy ustnej, jak izolować i sortować oocyty antralne za pomocą barwienia Hoechst 33342. Nie zapominaj, że praca ze zwierzętami i komórkami wymaga specjalnych środków ostrożności, takich jak noszenie środków ochrony osobistej i używanie wysterylizowanych narzędzi.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Ten protokół opisuje charakterystykę ludzkich oocytów antralnych opartych na organizacji nukleolusów. Ma na celu rozróżnienie między oocytami z nukleolusem otoczonym (SN) i oocytami z nukleolusem nieotoczonym (NSN).
Kluczowe elementy badania
Obszar nauki
- Biologia rozwojowa
- Biologia rozrodcza
- Biologia komórki
Tło
- Ludzkie oocyty antralne są kluczowe dla zrozumienia rozwoju embrionalnego.
- Organizacja nukleolusów jest kluczowym czynnikiem w ocenie jakości oocytów.
- Rozróżnienie między oocytami SN i NSN może wpłynąć na badania nad płodnością.
- Ta metoda zapewnia systematyczne podejście do charakteryzacji oocytów.
Cel badania
- Charakterystyka ludzkich oocytów antralnych na podstawie organizacji chromatyny.
- Ułatwienie izolacji różnych typów oocytów antralnych.
- Zwiększenie zrozumienia rozwoju i jakości oocytów.
Stosowane metody
- Wstrzyknięcie surowicy klaczy w ciąży z gonadotropiną do samic myszy.
- Pobrane jajniki po określonym okresie inkubacji.
- Przygotowanie pożywki M2 do pobierania oocytów.
- Sterylne techniki sekcji do pobierania jajników.
Główne wyniki
- Udana charakterystyka oocytów SN i NSN.
- Ustanowienie wiarygodnego protokołu izolacji oocytów.
- Wgląd w potencjał rozwojowy różnych typów oocytów.
- Wkład w dziedzinę biologii rozrodczej.
Wnioski
- Protokół skutecznie rozróżnia między typami oocytów.
- Zapewnia podstawę dla dalszych badań nad rozwojem oocytów.
- Przyszłe badania mogą opierać się na tych znaleziskach w celu eksploracji płodności.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
Reliable isolation and characterization of mouse antral oocytes based on nucleolar chromatin organization directly addresses early-stage challenges in reproductive and developmental biology pipelines. This method enables precise identification of oocyte subtypes with distinct developmental potential, supporting predictive confidence in downstream in vitro maturation (IVM) and fertilization (IVF) workflows. The approach enhances portfolio decision-making by enabling functional target validation and biological de-risking at the earliest inflection point.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables functional discrimination between SN and NSN oocytes for mechanistic de-risking.
- Supports hypothesis-driven interrogation of oocyte developmental competence.
- Facilitates biological target validation for reproductive and developmental studies.
- Improves predictive confidence in selecting oocytes for downstream applications.
Screening & Assay Development
- Provides a standardized workflow for sorting oocytes based on chromatin organization.
- Delivers reproducible, quantitative readouts using Hoechst 33342 staining.
- Prepares validated oocyte populations for IVM, IVF, or molecular analyses.
- Enables reliable assay development for evaluating oocyte quality and function.
Translational & Preclinical Research
- Aligns oocyte selection with translational models for reproductive biology.
- Supports continuity from discovery through preclinical validation of oocyte competence.
- Reduces risk in advancing oocyte-based interventions or fertility studies.
- Provides a mechanistic foundation for future biomarker development.
Pipeline & Workflow Integration
This method integrates at the interface of early discovery and preclinical research, enabling robust selection and characterization of oocytes for downstream functional studies and translational applications.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and mechanistic clarification of oocyte developmental potential.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative sorting of oocytes for assay readiness.
- Analytics: Provides clear chromatin-based readouts to compare oocyte subtypes.
- Translational Research: Facilitates alignment of oocyte selection with preclinical fertility models.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable protocol for oocyte isolation and characterization across studies.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in oocyte selection.
- Operational Value: Standardizes and streamlines oocyte sorting for reproducibility and scalability.
- Strategic Value: Enables informed go/no-go decisions and reduces late-stage biological risk in reproductive pipelines.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization of oocyte-based research and development programs.
Implementation Considerations
- Requires expertise in oocyte handling, chromatin staining, and fluorescence microscopy.
- Demands access to sterile dissection tools, mouth pipettes, and fluorescence imaging infrastructure.
- Necessitates cross-team standardization of sorting criteria and staining protocols.
- Adaptation may be needed for different species or model systems.
- Careful handling is essential to avoid chromatin damage and ensure oocyte viability.
