Oparta na sieci neuronowej identyfikacja w pełni rozwiniętych oocytów myszy kompetentnych lub niekompetentnych rozwojowo

Ogólnym celem tej procedury jest identyfikacja occytów ze zdolnością rozwojową tylnej strony za pomocą nieinwazyjnego narzędzia. Główną zaletą tej metody jest to, że obserwując ruchy oocytów zachodzące podczas dojrzewania in vitro, można ocenić potencjał rozwojowy gamet żeńskich. Technika ta opiera się na obrazowaniu poklatkowym sprzężonym z prędkością obrazu cząstek, analizą opartą na sieciach neuronowych.

W tym miejscu opiszemy kroki podjęte w celu wykazania, że oocyty myszy podczas przejścia z etapu pęcherza rozrodczego do etapu metafazy drugiej wykazują inny profil wspomnianych ruchów plazmatycznych istotnie skorelowany z ich kompetencjami rozwojowymi lub niekompetencją. Według Światowej Organizacji Zdrowia niepłodność jest patologią, która dotyka około 20 procent par, a ponadto jedna trzecia kobiet poddawanych leczeniu onkologicznemu jest zagrożona przedwczesną niewydolnością jajników. Odpowiada to około 300 000 lub 30 000 kobiet w krajach takich jak USA czy Włochy.

Opracowanie nieinwazyjnych procedur identyfikacji kompetencji rozwojowych oocytów przyczyniłoby się do poprawy ogólnego powodzenia wyników ciąży. W tym miejscu podajemy szczegółowe informacje na temat najważniejszych etapów procedury opracowanej dla myszy, aby była ona łatwo dostępna do przetestowania i zastosowania u innych gatunków ssaków, takich jak bydło lub ludzie. Jajniki są przenoszone na szalkę Petriego zawierającą pożywkę M2 wstępnie podgrzaną i zrównoważoną o temperaturze 37 stopni Celsjusza i pięciu procentach CO2.

Jeśli jajowód i trochę tłuszczu są nadal obecne wokół jajnika, należy je usunąć. Następnie, przytrzymując jajnik pęsetą, nakłuwa się jego powierzchnię za pomocą sterylnej igły 1G. Nakłute jajniki są usuwane z pożywki M2 i za pomocą ręcznie ciągniętej mikropipety przekierowujemy nasz pierwszy ruch do nowej, czystej pożywki M2, a następnie pipetuje się i pipetuje przez kilka sekund, aż komórki wzgórka otaczające oocyt zostaną całkowicie usunięte.

Następnie oocyty są przenoszone w 20 mikrolitrowych kroplach pożywki M2 i jeśli niektóre komórki wzgórka utrzymują się, są one dokładnie usuwane przez kilka przejść od kropli do kropli, aż komórki wzgórka zostaną całkowicie wyeliminowane. W celu przygotowania Hoechst 33342 o końcowym stężeniu 0,05 mikrograma na promil, zaczynamy od łagodnego roztworu Hoechst o stężeniu pięciu miligramów na promil, przygotowanego w jednorazowym pbs i dalej rozcieńczamy, aż do uzyskania wymaganego stężenia. 3,5 mikrolitra mikrokropli roztworu Hoechsta umieszcza się na dnie pokrywki szalki Petriego, a następnie każdy rozcieńczony oocyt przenosi się w jednej kropli Hoechsta, uważając, aby zmniejszyć ekspozycję światła podczas procesu barwienia Hoechsta, przykrywając naczynie ciemną pokrywką.

Po dziesięciu minutach barwienia oocyty obserwuje się pod mikroskopem fluorescencyjnym ze światłem UV. Na podstawie konformacji chromatyny klasyfikuje się je jako jąderko otoczone, SN, jeśli prezentują pierścień chromatyny x-dodatniej wokół jąderka lub jako jąderko nieotoczone, NSN, jeśli jąderko nie ma pierścienia chromatyny x-dodatniej, a ogólna chromatyna wydaje się rozproszona w jąderku. Cztery dwumikrolitrowe krople pożywki alpha mem umieszcza się na szalce Petriego ze szklanym dnem, uważając, aby utrzymać krople w określonej odległości, krople nakłada się wstępnie podgrzanym i zrównoważonym olejem mineralnym, a do każdej kropli przenosi się w sumie trzy do czterech oocytów.

Szalka Petriego jest przenoszona do komory inkubacyjnej mikroskopu poklatkowego, co pozwala na długotrwałe utrzymanie temperatury 37 stopni Celsjusza i pięciu procent CO2 oraz oświetlenie czerwonym światłem LED. Przed analizą poklatkową, za pomocą oprogramowania BioStation, ustawiane są współrzędne każdej kropli, aby zautomatyzować przejście od jednej kropli do drugiej podczas rutynowej symulacji poklatkowej. Klatki poklatkowe są wykonywane w odstępach ośmiominutowych, co daje łącznie 15 godzin.

Nagrane filmy są następnie analizowane za pomocą oprogramowania CellPave, które pozwala na detekcję ruchów cytoplazmatycznych wyrażonych w postaci wektorów prędkości. Po pierwsze, za pomocą narzędzia CellPave, obwód każdego oocytu jest ręcznie wyznaczany. Następnie oprogramowanie oblicza prędkość ruchu cytoplazmatycznego występującą w porównaniu dwóch kolejnych klatek poklatkowych i wyraża ją poprzez umieszczenie kolorowej strzałki, której intensywność i długość koloru określa prędkość i kierunek ruchów.

Widoczny tutaj histogram pod oocytem opisuje ogólną prędkość ruchu cytoplazmatycznego w ciągu 15-godzinnego okresu rejestracji oocytu SN. Ten sam rodzaj analizy przeprowadza się na oocycie NSN. Zwróć uwagę na opóźniony szczyt ekstruzji ciała biegunowego o jeden pik ekstruzji wykazywany przez oocyt NSN w porównaniu z oocytem SN.

Dolna część ekranu pokazuje czasowy wzorzec cytoplazmatycznej prędkości ruchu oocytu. Prędkość oblicza się, porównując dwie kolejne klatki. Surowe dane dotyczące prędkości ruchu cytoplazmy są następnie eksportowane do arkusza Excel, w którym w wierszach podawana jest sekwencja Frensa i w kolumnach analizowany pojedynczy oocyt

Po lewej stronie znajdują się dane oocytu SN, a po prawej oocyty NSN. Dane oocytów SN lub NSN są następnie dzielone na 10 podgrup. Dziewięć służy do treningu, kolor zielony.

I jeden do testów na ślepo, kolor czerwony. Ta procedura jest powtarzana w sumie 10 razy. Za każdym razem zmieniając ślepą próbkę testową.

Dane są następnie analizowane za pomocą sztucznej sieci neuronowej typu feed-forward (FANN). FANN jest zbudowany do analizy wszystkich klatek poklatkowych, tutaj nazwanych neuronami wejściowymi"Te ostatnie są połączone z trzema ukrytymi neuronami, które z kolei są połączone z dwoma neuronami wyjściowymi. Jeden wynik daje prawdopodobieństwo, że dane wejściowe są kompetentną komórką jajową.

Drugi, wręcz przeciwnie, że dane wejściowe są niekompetentną komórką jajową. Porównanie tych dwóch wyników przewiduje kompetencję umysłową oocytu dula z dokładnością 91,03 procent. Technika została opracowana dla oocytów myszy, jak pokazano tutaj.

Jednak w przyszłości wycofanie ma na celu przetestowanie go na ludzkich oocytach. W rzeczywistości nieinwazyjne procedury związane z analizą jakości oocytów są szczególnie potrzebne w dziedzinie technologii sztucznego rozrodu.