Name: Oparta na sieci neuronowej identyfikacja w pełni rozwiniętych oocytów myszy kompetentnych lub niekompetentnych rozwojowo (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-03-03T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 4 s
Description: Poznaj nieinwazyjną metodę oceny kompetencji rozwojowej oocytów myszy wykorzystującą obrazowanie time-lapse i sieci neuronowe. Technika ta pozwala na real-time predykcję potencjału rozwojowego gamet żeńskich.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była możliwa dzięki wsparciu przez: Uniwersytet w Pawii FRG 2016; Uniwersytet w Parmie FIL 2014, 2016; i Kinesis w celu dostarczenia wyrobów z tworzyw sztucznych niezbędnych do przeprowadzenia tego badania. Dziękujemy dr Shane'owi Windsorowi (Wydział Inżynierii, Uniwersytet w Bristolu, Wielka Brytania) za dostarczenie Cell_PIV oprogramowania.

Wszystkie procedury dotyczące zwierząt zostały zatwierdzone przez Instytucjonalne Komisje ds. Opieki nad Zwierzętami i Ich Użytkowania oraz Etyki na Uniwersytecie w Pawii. Zwierzęta utrzymywano w warunkach 22 °C, wilgotności powietrza 60% i cyklu światło/ciemność trwającego 12:12 godziny.
1.Izolacja jajników
<ol>
	<li>Wstrzyknąć dootrzewnowo 2 samicom myszy CD1 w wieku od czterech do jedenastu tygodni z 10 j. hormonu folikulotropowego za pomocą sterylnej strzykawki insulinowej o pojemności 1 ml.</li>
	<li>Czekaj 46-48 godzin.</li>
	<li>Zważyć mysz i znieczulić ją wstrzyknięciem domięśniowym 50 mg/kg leku Zoletil (kloridian Tiletamina i Zolazepan). Eutanazja przez zwichnięcie szyjki macicy.</li>
	<li>Chwyć skórę pokrywającą ścianę brzucha za pomocą kleszczy preparacyjnych. Przetnij skórę i ścianę ciała nożyczkami i rozciągnij nacięcie kleszczami.</li>
	<li>Za pomocą pęsety odsuń wnętrzności na bok, wskaż rogi macicy i zlokalizuj jajniki na ich końcu.</li>
	<li>Delikatnie przytrzymaj jajnik za pomocą kleszczy zegarmistrzowskich i nożyczkami przetnij jego więzadło do macicy. Powtórz z drugim jajnikiem.</li>
	<li>Przenieść pobrane jajniki na 35-milimetrową płytkę Petriego z hodowlą komórkową zawierającą 1 ml pożywki izolacyjnej M2 podgrzanej w temperaturze 37 °C, 5% CO2 w powietrzu.</li>
	<li>Usuń tłuszcz i jajowód za pomocą cienkich nożyczek pod mikroskopem stereoskopowym.</li>
</ol>
2. Izolacja kompleksów oocytów cumulusa
<ol>
	<li>Nakłuj powierzchnię jajnika za pomocą sterylnej pęsety i sterylnej igły insulinowej 1G, aż do biernego uwolnienia kompleksów oocytów antralnych wzgórków jajowych (COC).</li>
	<li>Zebrać COC z więcej niż trzema warstwami komórek wzgórka za pomocą sterowanej ustami, ręcznie ciągniętej mikropipety Pasteura (o średnicy 200 μm) i przenieść je do 300 μl kropli świeżej pożywki M2.</li>
	<li>Usunąć wzgórki otaczające oocyty za pomocą ręcznie wyciągniętej mikropipety Pasteura (o średnicy 80 μm), delikatnie pipetując przez kilka sekund,</li>
	<li>Wielokrotnie przenoś oocyty z 20 μl kropli pożywki M2 do innej, aż komórki wzgórka zostaną całkowicie wyeliminowane.</li>
</ol>
3. Klasyfikacja oocytów na podstawie organizacji chromatyny
<ol>
	<li>Przygotować roztwór barwiący Hoechst 33342 o końcowym stężeniu 0,05 μg/ml w pożywce M2, zaczynając od roztworu macierzystego o stężeniu 5 mg/ml rozcieńczonego w 1x PBS.</li>
	<li>Umieść 3,5 μl mikrokropelek roztworu barwiącego Hoechst na dnie pokrywki szalki Petriego o średnicy 35 mm.</li>
	<li>Przenieś każdy pojedynczy oocyt do kropli barwiącej Hoechst, umieść naczynie na wstępnie podgrzanej (37 °C) płycie grzewczej i przykryj ją ciemną pokrywką, aby uniknąć ekspozycji na światło.</li>
	<li>Po 10 minutach inkubacji w temperaturze pokojowej obserwuj oocyty pod mikroskopem fluorescencyjnym przy 10-krotnym powiększeniu w świetle UV (330-385 nm), nie dłużej niż 1-2 s.</li>
	<li>Klasyfikuj oocyty jako otoczone jąderko (SN) (<silna klasa="xfig">Figura 1A), jeśli prezentują pierścień chromatyny Hoechst-dodatniej otaczający jąderko.</li>
	<li>Klasyfikuj oocyty jako jąderko nieotoczone (NSN), jeśli ich jąderko nie jest otoczone chromatyną Hoechst-dodatnią i wykazuje rozproszone plamki heterochromatyczne w jądrze (<silna klasa = "xfig">Figura 1B).</li>
</ol>
4. Klasyfikacja oocytów na podstawie sieci neuronowych
<ol>
	<li>Przygotuj cztery kropelki pożywki α-MEM o pojemności 2 μl uzupełnione 5% inaktywowaną termicznie płodową surowicą bydlęcą, 2 mM L-glutaminy, 5 mM tauryny, 100 μg/ml penicyliny, 75 μg/ml streptomycyny i 23,5 μg/μl pirogronianu sodu na płytce Petriego o średnicy 35 mm i przykryj je wstępnie podgrzanym (37 °C) i wstępnie zrównoważonym olejem mineralnym, aby uniknąć parowania pożywki. 
UWAGA: Jeśli korzystasz z systemu przesiewania komórek na żywo, utrzymuj krople w określonej odległości, używając narysowanej siatki o wymiarach 7 mm x 7 mm jako wskazówki.</li>
	<li>Przenieś 3-4 oocyty do każdej kropli.</li>
	<li>Umieść szalkę Petriego ze szklanym dnem w systemie przesiewowym komórek na żywo, wyposażonym w oprogramowanie do nagrywania poklatkowego (patrz tabela materiałów), które umożliwia obserwację dojrzewania oocytów w środowisku o stabilnej temperaturze (37 °C) i stężeniu CO2 (5%).</li>
	<li>Otwórz oprogramowanie do nagrywania poklatkowego. Na ekranie pojawia się okno z ujęciem na żywo oocytu po lewej stronie i wszystkimi przyciskami ustawień po prawej stronie.</li>
	<li>Wybierz środek oocytu, aby ustawić go na środku ekranu. W razie potrzeby wyreguluj ostrość.</li>
	<li>Wybierz przycisk Ph i ustaw lampę DIA na 192, czas ekspozycji na 1/125 s, wzmocnienie na 1,99, a rozdzielczość na 1600 x 1200.</li>
	<li>Wybierz FL2 i ustaw lampę DIA na 5, czas ekspozycji na 3 s, wzmocnienie na 2,37, a rozdzielczość na 1600 x 1200.</li>
	<li>Wybierz przycisk Nowy punkt, aby zarejestrować pozycję oocytu w kropli hodowli. Powtórz tę samą procedurę dla każdego oocytu w kropli hodowlanej.</li>
	<li>Wybierz Czas i ustaw Cykl akwizycji na 8 minut, a Całkowity czas na 15 godzin.</li>
	<li>Wybierz opcję Rozpocznij film poklatkowy, aby rozpocząć cykl nagrywania.</li>
	<li>Otwórz oprogramowanie MATLAB i napisz >>cell_piv; a następnie wybierz narzędzie PIV Tool.</li>
	<li>Wybierz folder zawierający nagrany film i wybierz dowolny z .jpeg plików, aby załadować całą sekwencję obrazów. Dla każdej komórki jajowej wybierz obszar zainteresowania (ROI), klikając narzędzie Wybierz obszar.</li>
	<li>Wybierz opcję Process PIV (Przetwarzaj PIV) w menu File (Plik). Wybierz przycisk narzędzia przeglądarki. 
	UWAGA: Program obliczy wektory prędkości w ROI i automatycznie utworzy plik danych, zapisany jako plik .mat.</li>
	<li>Wybierz plik .mat do otwarcia. Wybierz przycisk Wybierz narzędzie ROI i narysuj okrąg wokół konturu oocytu. Kliknij Zapisz w menu Plik. 
	UWAGA: Wektory w tym regionie są teraz wyświetlane, a dane średniej wielkości w oknie wykresu są aktualizowane dla tego nowego zwrotu z inwestycji.</li>
	<li>Otwórz zebrane dane dotyczące średniej wielkości wszystkich klatek poklatkowych zarejestrowanych w arkuszu kalkulacyjnym, z sekwencją klatek w wierszach, a w kolumnach każdą analizowaną pojedynczą oocytą.</li>
	<li>Uporządkuj dane oocytów NSN i SN w 10 podgrupach.</li>
	<li>Użyj 9 podgrup, aby iteracyjnie trenować sztuczną sieć neuronową typu feed-forward (FANN) i 1 podgrupy do testowania ślepego.
	<ol>
		<li>Powtórz kolejne 9 razy, zmieniając ślepą próbkę testową (10-krotna walidacja krzyżowa).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Otwórz MATLAB, uruchom niestandardowy skrypt główny i na żądanie wstaw nazwę pliku z danymi treningowymi (train.txt), liczbą oocytów NSN i SN używanych do treningu oraz interwałem poklatkowym do analizy (zazwyczaj od klatki # 1-2 do klatki # 112-113).</li>
	<li>Naciśnij Enter, aby przeprowadzić szkolenie.</li>
	<li>Wstaw nazwę pliku z danymi testowymi (test.txt).</li>
	<li>Otwórz test_outputs_cyt wektorowe w programie MATLAB workspace. 
	UWAGA: Na ekranie pojawi się okno pokazujące, w pierwszym wierszu, prawdopodobieństwo uzyskania wyników prawdziwie dodatnich (TP lub True NSN) i fałszywie dodatnich (FP lub False NSN) odpowiednio dla oocytów NSN i SN; zamiast tego w drugim wierszu prawdopodobieństwo uzyskania wyników fałszywie ujemnych (FN lub fałszywy SN) i prawdziwie ujemnych (TN lub True SN) odpowiednio dla oocytów NSN i SN.</li>
	<li>Użyj wzoru: (TP+TN)/(TP+FP+FN+TN), aby obliczyć dokładność FANN, wyrażoną w procentach.</li>
</ol>

<ol><li>Patrizio, P., Fragouli, E., Bianchi, V., Borini, A., Wells, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+methods+for+selection+of+the+ideal+oocyte%5BTitle%5D)+AND+%22Reprod.+Biomed.+Online%22%5BJournal%5D)">Molecular methods for selection of the ideal oocyte.</a> Reprod. Biomed. Online. 15 (3), 346-353 (2007).</li>
<li>Rienzi, L., Vajta, G., Ubaldi, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Predictive+value+of+oocyte+morphology+in+human+IVF%3A+a+systematic+review+of+the+literature%5BTitle%5D)+AND+%22Human.+Reprod.+Update%22%5BJournal%5D)">Predictive value of oocyte morphology in human IVF: a systematic review of the literature.</a> Human. Reprod. Update. 17 (1), 34-35 (2011).</li>
<li>Tan, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromatin+configurations+in+the+germinal+vesicle+of+mammalian+oocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Hum.+Reprod%22%5BJournal%5D)">Chromatin configurations in the germinal vesicle of mammalian oocytes.</a> Mol. Hum. Reprod. 15 (1), 1-9 (2009).</li>
<li>Vigone, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptome+based+identification+of+mouse+cumulus+cell+markers+that+predict+the+developmental+competence+of+their+enclosed+antral+oocytes%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Genomics%22%5BJournal%5D)">Transcriptome based identification of mouse cumulus cell markers that predict the developmental competence of their enclosed antral oocytes.</a> BMC Genomics. 14, 380(2013).</li>
<li>Bui, T. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytoplasmic+movement+profiles+of+mouse+surrounding+nucleolus+and+not-surrounding+nucleolus+antral+oocytes+during+meiotic+resumption%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Reprod.+Dev%22%5BJournal%5D)">Cytoplasmic movement profiles of mouse surrounding nucleolus and not-surrounding nucleolus antral oocytes during meiotic resumption.</a> Mol. Reprod. Dev. 84 (5), 356-362 (2017).</li>
<li>Zuccotti, M., Piccinelli, A., Giorgi Rossi, P., Garagna, S., Redi, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromatin+organization+during+mouse+oocyte+growth%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Reprod.+Dev%22%5BJournal%5D)">Chromatin organization during mouse oocyte growth.</a> Mol. Reprod. Dev. 41 (4), 479-485 (1995).</li>
<li>Zuccotti, M., Garagna, S., Merico, V., Monti, M., Redi, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromatin+organisation+and+nuclear+architecture+in+growing+mouse+oocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell.+Endocrinol%22%5BJournal%5D)">Chromatin organisation and nuclear architecture in growing mouse oocytes.</a> Mol. Cell. Endocrinol. 234 (1-2), 11-17 (2005).</li>
<li>Zuccotti, M., Merico, V., Cecconi, S., Redi, C. A., Garagna, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((What+does+it+take+to+make+a+developmentally+competent+mammalian+egg%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Hum.+Reprod.+Update%22%5BJournal%5D)">What does it take to make a developmentally competent mammalian egg?</a> Hum. Reprod. Update. 17 (4), 525-540 (2011).</li>
<li>Inoue, A., Nakajima, R., Nagata, M., Aoki, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Contribution+of+the+oocyte+nucleus+and+cytoplasm+to+the+determination+of+meiotic+and+developmental+competence+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Hum.+Reprod%22%5BJournal%5D)">Contribution of the oocyte nucleus and cytoplasm to the determination of meiotic and developmental competence in mice.</a> Hum. Reprod. 23 (6), 1377-1384 (2008).</li>
<li>Ajduk, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rhythmic+actomyosin-driven+contractions+induced+by+sperm+entry+predict+mammalian+embryo+viability%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Commun%22%5BJournal%5D)">Rhythmic actomyosin-driven contractions induced by sperm entry predict mammalian embryo viability.</a> Nat. Commun. 2, 417(2011).</li>
<li>Swann, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phospholipase+C-%CE%B6-induced+Ca2%2B+oscillations+cause+coincident+cytoplasmic+movements+in+human+oocytes+that+failed+to+fertilize+after+intracytoplasmic+sperm+injection%5BTitle%5D)+AND+%22Fertil.+Steril%22%5BJournal%5D)">Phospholipase C-ζ-induced Ca2+ oscillations cause coincident cytoplasmic movements in human oocytes that failed to fertilize after intracytoplasmic sperm injection.</a> Fertil. Steril. 97 (3), 742-747 (2012).</li>
<li>Thakur, A., Mishra, V., Jain, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Feed+forward+artificial+neural+network%3A+tool+for+early+detection+of+ovarian+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Sci.+Pharm%22%5BJournal%5D)">Feed forward artificial neural network: tool for early detection of ovarian cancer.</a> Sci. Pharm. 79 (3), 493-505 (2011).</li>
<li>Laudani, A., Lozito, G. M., Riganti Fulginei, F., Salvini, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((On+Training+Efficiency+and+Computational+Costs+of+a+Feed+Forward+Neural+Network%3A+A+Review%5BTitle%5D)+AND+%22Comput.+Intell.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">On Training Efficiency and Computational Costs of a Feed Forward Neural Network: A Review.</a> Comput. Intell. Neurosci. 2015, 818243(2015).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Istnieje kilka krytycznych kroków, o które należy zadbać podczas wykonywania tego protokołu z oocytami myszy, a także z oocytami innych gatunków. Po wyizolowaniu z pęcherzyków jajniki powinny zostać natychmiast przeniesione do kropli rejestrujących, ponieważ oddzielenie się od towarzyszących komórek wzgórka uruchamia początek przejścia GV do MII. Możliwą modyfikacją obecnego protokołu może być dodanie 3-izobutylo-1-metyloksantyny (IBMX) do pożywki M2 używanej do izolacji COC. IBMX zapobiega natychmiastowemu wyzwoleniu pr...

Niepłodność kobieca to patologia, która dotyka coraz większą liczbę kobiet. Według Światowej Organizacji Zdrowia około 20% par jest bezpłodnych, z czego 40% z powodu niepłodności kobiet. Ponadto u jednej trzeciej kobiet poddawanych leczeniu onkologicznemu (odpowiednio 300 000 rocznie i 30 000 rocznie w USA lub we Włoszech) rozwija się przedwczesna niewydolność jajników.
Strategia zapobiegania niepłodności u pacjentów z rakiem polega na izolacji i kriokonserwacji pęcherzyków jajnikowych przed leczeniem onkologicznym, a następnie dojrzewaniu in vitro (IVM) oocytów GV do stadium MII (przejście GV-to-MII). Dostępność nieinwazyjnych markerów kompetencji rozwojowej oocytów poprawiłaby procesy zapłodnienia i rozwoju oraz ogólny sukces ciąży1,2.
Na podstawie konfiguracji chromatyny zaobserwowanej po barwieniu supravital fluorochromem Hoechst 33342, w pełni rozwinięte oocyty ssaków są klasyfikowane jako Otoczone Jąderko (SN) lub Nieotoczone Jąderko (NSN)3. Oprócz odmiennej organizacji chromatyny, te dwa typy oocytów wykazują wiele różnic morfologicznych i funkcjonalnych3,4,5,6,7,8,9, w tym ich kompetencje mejotyczne i rozwojowe. Po wyizolowaniu z jajnika i osiągnięciu dojrzałości in vitro, oba typy oocytów osiągają stadium MII, a po inseminacji plemników rozwijają się do stadium 2-komórkowego, ale tylko te z organizacją chromatyny SN mogą rozwinąć się do term9. Chociaż jest dobra jako metoda klasyfikacji do wyboru kompetentnych i niekompetentnych oocytów, główną wadą jest mutagenny efekt, jaki sam fluorochrom, a przede wszystkim światło UV używane do jego wykrywania może mieć na komórki.
Z tych wszystkich powodów szukaliśmy innych nieinwazyjnych markerów związanych z konformacją chromatyny SN lub NSN, które mogłyby zastąpić użycie Hoechst, zachowując przy tym tę samą wysoką dokładność klasyfikacji. Obserwacja poklatkowa prędkości ruchu cytoplazmatycznego (CMV) staje się cechą charakterystyczną dla stanu komórki. Na przykład ostatnie badania wykazały związek między CMV zarejestrowanymi w momencie zapłodnienia a zdolnością mysich i ludzkich zygot do ukończenia preimplantacji i pełnego rozwoju10,11.
Na podstawie tych wcześniejszych badań, opisujemy tutaj platformę do rozpoznawania w pełni rozwiniętych oocytów myszy kompetentnych lub niekompetentnych rozwojowo5,6,7,8. Platforma opiera się na trzech głównych etapach: 1) Oocyty wyizolowane z pęcherzyków antralnych są najpierw klasyfikowane na podstawie ich konfiguracji chromatyny jako jąderko otoczone (SN) lub jąderko nieotoczone (NSN); 2) Zdjęcia poklatkowe CMV występujące podczas przejścia GV do MII każdego pojedynczego oocytu są wykonywane i analizowane za pomocą prędkości obrazu cząstek (PIV); oraz 3) dane uzyskane za pomocą PIV są analizowane za pomocą sztucznej sieci neuronowej (FANN) do ślepej klasyfikacji12,13. Podajemy szczegółowe informacje na temat najbardziej krytycznych etapów procedury zaprojektowanej dla myszy, aby była gotowa do przetestowania i użycia u innych gatunków ssaków (np. bydła, małp i ludzi).

<table><tbody><tr><td>Folligon</td><td>Intervet</td><td>A201A02</td><td>Leczenie hormonalne</td></tr><tr><td>Hoechst 33342&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B2261</td><td>Do barwienia heterochromatyny oocytów</td></tr><tr><td>Hodowla komórkowa szalka Petriego 35 mm x 10 mm&nbsp;</td><td>Corning&nbsp;</td><td>430165</td><td>Do izolacji COC</td></tr><tr><td>EmbryoMax M2 Medium (1X), Płyn, z czerwienią fenolową</td><td>Merck-Millipore</td><td>MR-015-D</td><td>Do izolacji COC</td></tr><tr><td>MEM Alpha Medium (1X) + Glutamax&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M4526</td><td>Do dojrzewania oocytów in vitro</td></tr><tr><td>Hodowla komórkowa szalka Petriego 35 mm szklane dno&nbsp;</td><td>WillCo&nbsp;</td><td>GWSt-3522</td><td>Do eksperymentów obrazowych</td></tr><tr><td>BioStation IM-LM&nbsp;</td>System badań przesiewowych komórek na żywo firmy <td>Nikon</td><td>MFA91001</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Pipeta Pasteura</td><td>Delchimica Scientific Glassware</td><td>6709230</td><td>Do manipulacji mieszkami</td></tr><tr><td>włosowymi Olej mineralny</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M8410</td><td>Aby zapobiec zanieczyszczeniu i parowaniu pożywki</td></tr><tr><td>Penicylina / Streptomycyna</td><td>Life Technologies</td><td>15070063</td><td>Aby zapobiec zanieczyszczeniu podłoża&nbsp;</td></tr><tr><td>Płodowa surowica bydlęca (FBS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>ML16141079</td><td>Do makijażu &alfa; Nośnik MEM&nbsp;</td></tr><tr><td>L-glutamina&nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td>25030</td><td>Do makijażu &alpha; Nośnik MEM&nbsp;</td></tr><tr><td>Tauryna</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T0625</td><td>Do makijażu &alfa; Nośnik MEM&nbsp;</td></tr><tr><td>Albumina surowicy bydlęcej (BSA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A3310</td><td>Do makijażu &alfa; Pożywki MEM</td></tr><tr><td>Pirogronian sodu&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>&nbsp; P4562</td><td>Do makijażu i alfa; MEM media</td></tr><tr><td>Zoletil (kloridian Tiletamina i Zolazepan)</td><td>Virbac Srl</td><td>QN01AX9</td><td>Do znieczulenia myszy</td></tr><tr><td>Cell_PIV sofware&nbsp;</td><td>Dzięki uprzejmości dr Shane'a Windsora, University of Bristol, Wielka Brytania</td><td>&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp;-</td><td>&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp;-</td></tr><tr><td>MATLAB</td><td>MathWorks, Natick, MA&nbsp;</td><td>&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp;-</td><td>Do wieloparadygmatowych obliczeń numerycznych</td></tr></tbody></table>

oparta na sieci neuronowej identyfikacja w pełni rozwiniętych oocytów myszy kompetentnych lub niekompetentnych rozwojowo

A Neural Network-Based Identification of Developmentally Competent or Incompetent Mouse Fully-Grown Oocytes

Kliniki leczenia niepłodności skorzystałyby z możliwości wyboru komórek jajowych kompetentnych rozwojowo i niekompetentnych za pomocą nieinwazyjnych procedur, poprawiając w ten sposób ogólny wynik ciąży. Niedawno opracowaliśmy metodę klasyfikacji opartą na mikroskopowych obserwacjach na żywo oocytów myszy podczas ich dojrzewania in vitro od pęcherzyka rozrodczego (GV) do etapu metafazy II, a następnie analizie ruchów cytoplazmatycznych występujących w tym okresie poklatkowym. Poniżej przedstawiamy szczegółowe protokoły tej procedury. Oocyty izoluje się z w pełni rozwiniętych pęcherzyków antralnych i hoduje przez 15 godzin w mikroskopie wyposażonym do analizy poklatkowej w temperaturze 37 °C i 5% CO2 . Zdjęcia wykonywane są w odstępach 8-minutowych. Obrazy są analizowane przy użyciu metody prędkości obrazu cząstek (PIV), która oblicza dla każdego oocytu profil prędkości ruchu cytoplazmatycznego (CMV) występujących w całym okresie hodowli. Wreszcie, CMV każdego pojedynczego oocytu są karmione przez narzędzie klasyfikacji matematycznej (Feed-forward Artificial Neural Network, FANN), które przewiduje prawdopodobieństwo, że gameta będzie kompetentna lub niekompetentna rozwojowo z dokładnością 91,03%. Protokół ten, opracowany dla myszy, może być teraz testowany na oocytach innych gatunków, w tym ludzi.

Rysunek 2 przedstawia reprezentatywny oocyt rozwojowo kompetentny i niekompetentny, odpowiednio na początku (GV) i na końcu (MII) procedury IVM. IVM w pełni wyrośniętych oocytów mysich odbywa się podczas 15 h hodowli. Obserwacja Time-Lapse rejestruje przebieg mejozy i wykrywa główne zdarzenia mejotyczne, w tym GVBD oraz ekstruzję pierwszego ciałka polarnego.
Analiza i porównanie ponad dwustu oocytów...

Tutaj prezentujemy protokół do nieinwazyjnej oceny kompetencji rozwojowych oocytów przeprowadzanej podczas ich dojrzewania in vitro od pęcherzyka rozrodczego do etapu metafazy II. Metoda ta łączy obrazowanie poklatkowe z prędkością obrazu cząstek (PIV) i analizami sieci neuronowych.

Oparta na sieci neuronowej identyfikacja w pełni rozwiniętych oocytów myszy kompetentnych lub niekompetentnych rozwojowo

Infertility clinics would benefit from the ability to select developmentally competent vs. incompetent oocytes using non-invasive procedures, thus ...

Ogólnym celem tej procedury jest identyfikacja occytów ze zdolnością rozwojową tylnej strony za pomocą nieinwazyjnego narzędzia. Główną zaletą tej metody jest to, że obserwując ruchy oocytów zachodzące podczas dojrzewania in vitro, można ocenić potencjał rozwojowy gamet żeńskich. Technika ta opiera się na obrazowaniu poklatkowym sprzężonym z prędkością obrazu cząstek, analizą opartą na sieciach neuronowych.W tym miejscu opiszemy kroki podjęte w celu wykazania, że oocyty myszy podczas przejścia z etapu pęcherza rozrodczego do etapu metafazy drugiej wykazują inny profil wspomnianych ruchów plazmatycznych istotnie skorelowany z ich kompetencjami rozwojowymi lub niekompetencją. Według Światowej Organizacji Zdrowia niepłodność jest patologią, która dotyka około 20 procent par, a ponadto jedna trzecia kobiet poddawanych leczeniu onkologicznemu jest zagrożona przedwczesną niewydolnością jajników. Odpowiada to około 300 000 lub 30 000 kobiet w krajach takich jak USA czy Włochy.Opracowanie nieinwazyjnych procedur identyfikacji kompetencji rozwojowych oocytów przyczyniłoby się do poprawy ogólnego powodzenia wyników ciąży. W tym miejscu podajemy szczegółowe informacje na temat najważniejszych etapów procedury opracowanej dla myszy, aby była ona łatwo dostępna do przetestowania i zastosowania u innych gatunków ssaków, takich jak bydło lub ludzie. Jajniki są przenoszone na szalkę Petriego zawierającą pożywkę M2 wstępnie podgrzaną i zrównoważoną o temperaturze 37 stopni Celsjusza i pięciu procentach CO2.Jeśli jajowód i trochę tłuszczu są nadal obecne wokół jajnika, należy je usunąć. Następnie, przytrzymując jajnik pęsetą, nakłuwa się jego powierzchnię za pomocą sterylnej igły 1G. Nakłute jajniki są usuwane z pożywki M2 i za pomocą ręcznie ciągniętej mikropipety przekierowujemy nasz pierwszy ruch do nowej, czystej pożywki M2, a następnie pipetuje się i pipetuje przez kilka sekund, aż komórki wzgórka otaczające oocyt zostaną całkowicie usunięte.Następnie oocyty są przenoszone w 20 mikrolitrowych kroplach pożywki M2 i jeśli niektóre komórki wzgórka utrzymują się, są one dokładnie usuwane przez kilka przejść od kropli do kropli, aż komórki wzgórka zostaną całkowicie wyeliminowane. W celu przygotowania Hoechst 33342 o końcowym stężeniu 0,05 mikrograma na promil, zaczynamy od łagodnego roztworu Hoechst o stężeniu pięciu miligramów na promil, przygotowanego w jednorazowym pbs i dalej rozcieńczamy, aż do uzyskania wymaganego stężenia. 3,5 mikrolitra mikrokropli roztworu Hoechsta umieszcza się na dnie pokrywki szalki Petriego, a następnie każdy rozcieńczony oocyt przenosi się w jednej kropli Hoechsta, uważając, aby zmniejszyć ekspozycję światła podczas procesu barwienia Hoechsta, przykrywając naczynie ciemną pokrywką.Po dziesięciu minutach barwienia oocyty obserwuje się pod mikroskopem fluorescencyjnym ze światłem UV. Na podstawie konformacji chromatyny klasyfikuje się je jako jąderko otoczone, SN, jeśli prezentują pierścień chromatyny x-dodatniej wokół jąderka lub jako jąderko nieotoczone, NSN, jeśli jąderko nie ma pierścienia chromatyny x-dodatniej, a ogólna chromatyna wydaje się rozproszona w jąderku. Cztery dwumikrolitrowe krople pożywki alpha mem umieszcza się na szalce Petriego ze szklanym dnem, uważając, aby utrzymać krople w określonej odległości, krople nakłada się wstępnie podgrzanym i zrównoważonym olejem mineralnym, a do każdej kropli przenosi się w sumie trzy do czterech oocytów.Szalka Petriego jest przenoszona do komory inkubacyjnej mikroskopu poklatkowego, co pozwala na długotrwałe utrzymanie temperatury 37 stopni Celsjusza i pięciu procent CO2 oraz oświetlenie czerwonym światłem LED. Przed analizą poklatkową, za pomocą oprogramowania BioStation, ustawiane są współrzędne każdej kropli, aby zautomatyzować przejście od jednej kropli do drugiej podczas rutynowej symulacji poklatkowej. Klatki poklatkowe są wykonywane w odstępach ośmiominutowych, co daje łącznie 15 godzin.Nagrane filmy są następnie analizowane za pomocą oprogramowania CellPave, które pozwala na detekcję ruchów cytoplazmatycznych wyrażonych w postaci wektorów prędkości. Po pierwsze, za pomocą narzędzia CellPave, obwód każdego oocytu jest ręcznie wyznaczany. Następnie oprogramowanie oblicza prędkość ruchu cytoplazmatycznego występującą w porównaniu dwóch kolejnych klatek poklatkowych i wyraża ją poprzez umieszczenie kolorowej strzałki, której intensywność i długość koloru określa prędkość i kierunek ruchów.Widoczny tutaj histogram pod oocytem opisuje ogólną prędkość ruchu cytoplazmatycznego w ciągu 15-godzinnego okresu rejestracji oocytu SN. Ten sam rodzaj analizy przeprowadza się na oocycie NSN. Zwróć uwagę na opóźniony szczyt ekstruzji ciała biegunowego o jeden pik ekstruzji wykazywany przez oocyt NSN w porównaniu z oocytem SN.Dolna część ekranu pokazuje czasowy wzorzec cytoplazmatycznej prędkości ruchu oocytu. Prędkość oblicza się, porównując dwie kolejne klatki. Surowe dane dotyczące prędkości ruchu cytoplazmy są następnie eksportowane do arkusza Excel, w którym w wierszach podawana jest sekwencja Frensa i w kolumnach analizowany pojedynczy oocyt.Po lewej stronie znajdują się dane oocytu SN, a po prawej oocyty NSN. Dane oocytów SN lub NSN są następnie dzielone na 10 podgrup. Dziewięć służy do treningu, kolor zielony.I jeden do testów na ślepo, kolor czerwony. Ta procedura jest powtarzana w sumie 10 razy. Za każdym razem zmieniając ślepą próbkę testową.Dane są następnie analizowane za pomocą sztucznej sieci neuronowej typu feed-forward (FANN). FANN jest zbudowany do analizy wszystkich klatek poklatkowych, tutaj nazwanych neuronami wejściowymi"Te ostatnie są połączone z trzema ukrytymi neuronami, które z kolei są połączone z dwoma neuronami wyjściowymi. Jeden wynik daje prawdopodobieństwo, że dane wejściowe są kompetentną komórką jajową.Drugi, wręcz przeciwnie, że dane wejściowe są niekompetentną komórką jajową. Porównanie tych dwóch wyników przewiduje kompetencję umysłową oocytu dula z dokładnością 91,03 procent. Technika została opracowana dla oocytów myszy, jak pokazano tutaj.Jednak w przyszłości wycofanie ma na celu przetestowanie go na ludzkich oocytach. W rzeczywistości nieinwazyjne procedury związane z analizą jakości oocytów są szczególnie potrzebne w dziedzinie technologii sztucznego rozrodu.

a-neural-network-based-identification-developmentally-competent-or

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia rozwojowa

Oocyty są podatne na aneuploidię z powodu błędów w segregacji chromosomów podczas dojrzewania meiotycznego. Aneuploidne komórki jajowe mogą prowadzić do niepłodności, poronień lub zaburzeń rozwojowych, takich jak zespół Downa. W niniejszej pracy opisujemy metody wprowadzania wybranych materiałów do oocytów oraz metody badania dojrzewania meiotycznego i oceny ploidii.

Mikroiniekcja, dojrzewanie i ocena ploidii oocytów mysich

Tutaj prezentujemy protokół charakterystyki oocytów antralnych myszy na podstawie organizacji jąder.

Izolacja i charakterystyka mysich oocytów antralnych na podstawie organizacji chromatyny jąderkowej

W miarę jak warianty genetyczne związane z chorobami ludzkimi zaczynają być odkrywane, coraz ważniejsze staje się opracowanie systemów, za pomocą których można szybko ocenić biologiczne znaczenie tych zidentyfikowanych wariantów. Protokół ten opisuje metody oceny funkcji ludzkich genów podczas mejozy żeńskiej I przy użyciu mysich oocytów.

Wykorzystanie oocytów myszy do oceny funkcji ludzkich genów podczas mejozy I

Hodowle tkanek jajnikowych mogą być używane jako modele rozwoju pęcherzyków, owulacji i atrezji pęcherzyków oraz wskazują mechanizmy regulacyjne dynamicznych procesów jajnikowych.

Posiew tkanki jajnikowej w celu wizualizacji zjawisk w jajniku myszy

Tutaj opisujemy, porównujemy i kontrastujemy dwie różne techniki dokładnego liczenia pęcherzyków w stałych tkankach jajnika myszy.

Dokładne liczenie pęcherzyków w jajnikach dorosłych myszy

Tutaj prezentujemy zoptymalizowany protokół obrazowania całych jajników do analiz ilościowych i jakościowych przy użyciu barwienia immunologicznego z całą mocą, mikroskopii wielofotonowej oraz wizualizacji i analizy 3D. Protokół ten umożliwia wysokowydajne, niezawodne i powtarzalne przetwarzanie, które ma zastosowanie w toksykologii, diagnostyce klinicznej i testach genomowych funkcji jajników.

Immunofluorescencja, oczyszczanie i mikroskopia wielofotonowa całego jajnika do ilościowej analizy 3D rozwijającej się rezerwy jajnikowej u myszy

Błąd w segregacji chromosomów jest powszechną cechą oocytów. Dlatego badanie punktu kontrolnego montażu wrzeciona daje ważne wskazówki na temat mechanizmów potrzebnych do produkcji zdrowych jaj. Niniejszy protokół opisuje trzy uzupełniające się testy do oceny integralności punktu kontrolnego montażu wrzeciona w oocytach myszy.

Ocena integralności punktu kontrolnego zespołu wrzeciona w oocytach myszy

Rysunek 1: Ramy end-to-end. Rysunek ilustruje kompleksowe ramy wiedzy multimodalnej Graf VISHAM-KG. Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tej figurki.

Przygotowanie rozprzestrzeniania chromosomów mejotycznych z oocytów myszy do oceny synapsy i rekombinacji

Ten protokół opisuje procedury dotyczące in vitro dojrzewania oocytów mysich, in vitro zapłodnienia i późniejszej kultury embrionów do etapu blastocysty.

Dojrzewanie in vitro komórek jajowych myszy, zapłodnienie i hodowlą zarodków przedimplantacyjnych

Ten protokół szczegółowo opisuje metodę generowania neuronalnych komórek progenitorowych z embrionalnych komórek macierzystych przy użyciu metody monowarstwowej bez surowicy. Te progenitory mogą być wykorzystywane do uzyskiwania dojrzałych typów komórek nerwowych lub do badania procesu specyfikacji neuronalnej i są podatne na skalowanie w formacie wielodołkowym w celu przeprowadzenia badań przesiewowych związków.

Różnicowanie neuronalne embrionalnych komórek macierzystych myszy w hodowli jednowarstwowej bez surowicy

Poznaj nieinwazyjną metodę oceny kompetencji rozwojowej oocytów myszy wykorzystującą obrazowanie time-lapse i sieci neuronowe. Technika ta pozwala na real-time predykcję potencjału rozwojowego gamet żeńskich.

Oparta na sieci neuronowej identyfikacja w pełni rozwiniętych oocytów myszy kompetentnych lub niekompetentnych rozwojowo

Przeglądaj więcej filmów