Ekspresja transgenu za pośrednictwem HSV konstruktów chimerycznych w celu zbadania funkcji behawioralnej heteromerów GPCR u myszy
July 9th, 2016
Ten artykuł opisuje, jak wstrzyknąć wektory wirusowe do kory czołowej myszy w celu przetestowania testów behawioralnych, które wymagają tworzenia heteromerycznego GPCR.
Ogólnym celem tej metody jest obserwacja, w jaki sposób transfer genów za pośrednictwem wirusa wpływa na fenotypy behawioralne, które wymagają heterodimeryzacji receptorów sprzężonych z białkiem G w modelach mysich. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania z zakresu neurofarmakologii i psychofarmakologii. W szczególności, w jaki sposób receptory sprzężone z białkiem g oddziałują ze sobą na poziomie molekularnym.
Stosując tę metodę możemy zrozumieć, jak ta interakcja wpływa na zachowanie w modelach zaburzeń psychicznych, takich jak schizofrenia i depresja. Korzystając z tej metody, przyjrzymy się w szczególności seratoninie 2a i metabotropowemu receptorowi glutaminianu 2, które, jak wykazano, są zaangażowane w mechanizm działania leków stosowanych w leczeniu pacjentów ze schizofrenią. Zacznij od odpowiedniego znieczulenia myszy zgodnie z zatwierdzonymi metodami.
Upewnij się, że uzyskano chirurgiczną płaszczyznę znieczulenia, wykonując uszczypnięcie palca u nogi i odnotowując brak odpowiedzi. Następnie nałóż żel okulistyczny, aby chronić oczy. Przymocuj mysz do ramki stereotaktycznej, upewniając się, że wyregulowałeś nachylenie głowy tak, aby czaszka była wypoziomowana i płaska.
Nałóż jod powidonu na odsłoniętą skórę głowy. Za pomocą skalpela wykonaj strzałkowe nacięcie wzdłuż linii środkowej czaszki w odsłoniętym ogolonym obszarze. Następnie przymocuj klamry pureit do skóry w miejscu nacięcia, aby upewnić się, że czaszka pozostaje odsłonięta.
Zastosuj nadtlenek wodoru, aby rozpuścić okostną i odsłonić szwy czaszki. Teraz, gdy bregma i szwy są widoczne, pamiętaj o wyregulowaniu ramy stereotaktycznej, aby upewnić się, że czaszka jest wypoziomowana. Wyrównać końcówki igieł strzykawek z bregma i zanotować współrzędne bregmy.
Aby obustronnie wstrzyknąć korę czołową, dodaj 1,6 mm do zarejestrowanej współrzędnej bregmy ogonowej rostralnej i 2,6 mm do zarejestrowanej współrzędnej bregmy bocznej przyśrodkowej. Zaznacz miejsca wstrzyknięć na czaszce, a następnie wywierć małe otwory w miejscach wstrzyknięcia. Za pomocą aplikatora z bawełnianą końcówką zetrzyj nadmiar krwi lub fragmenty kości.
Przyłóż igłę do powierzchni mózgu i obniż na głębokość grzbietowej współrzędnej brzusznej. Następnie powoli wstrzyknąć zawartość strzykawki, przekręcając tłok igły, aby podawać 0,1 mikrolitra na minutę przez pięć minut, do wstrzyknięcia 0,5 mikrolitra. Pozostawić strzykawkę na miejscu przez pięć minut.
Po wyznaczonym czasie wyjmij zwierzę ze stereotaksji, zamknij nacięcie i umieść na podkładce rozgrzewającej. Podaj analgezję pooperacyjną zgodnie z zatwierdzonym protokołem dla zwierząt. Wykonaj testy behawioralne dwa do trzech dni po stereotaktycznym wstrzyknięciu cząstek wirusa.
Przyzwyczaj myszy do pokoju na co najmniej cztery godziny przed rozpoczęciem eksperymentu. Zacznij od rozpuszczenia DOI w 0,9-procentowym roztworze soli fizjologicznej do dwóch miligramów na kilogram. Przygotuj klatkę domową bez pościeli i za pomocą statywu wyreguluj kamerę tak, aby znajdowała się bezpośrednio nad klatką domową.
Skalibruj kamerę tak, aby cała klatka domowa znajdowała się w polu view. Zważyć mysz i wstrzyknąć dootrzewnowo odpowiednią dawkę 0,9 procent soli fizjologicznej lub DOI. Umieść mysz z powrotem w klatce domowej na dziesięć minut.
Po dziesięciu minutach umieść mysz na środku pustej klatki domowej i upewnij się, że w polu widzenia kamery nie ma martwych punktów. Naciśnij przycisk nagrywania na kamerze i opuść pomieszczenie. Po 30 minutach zatrzymaj nagrywanie i umieść mysz z powrotem w oryginalnej klatce domowej.
Powtórz test behawioralny na następnej myszy. Niech sędzia przejrzy filmy bez względu na warunki eksperymentalne. Ręcznie nagrywaj każde drgnięcie głowy w całym filmie.
Drganie głowy definiuje się jako szybki ruch potrząsania głową wykonywany przez mysz. Przetwarzaj dane zgodnie z opisem w pisemnej części protokołu. Pokazany tutaj jest reprezentatywny obraz ekspresji transgenu za pośrednictwem HSV w korze czołowej.
HSV mGlu2 GFP wstrzyknięto do kory czołowej, a ekspresję GFP ujawniono za pomocą immunocytochemii. Ta podziałka reprezentuje 200 mikronów. Ten obraz pokazuje western blot ekspresji transgenu za pośrednictwem HSV i reaktywności anty-mGlu2 w korze czołowej myszy z nokautem mGlu2.
Tutaj zmierzyliśmy immunoreaktywność mGlu2 jako monomeru. Ten histogram pokazuje, że ekspresja mGlu2 za pośrednictwem wirusa, ale nie chimerycznego mGlu2 w korze czołowej myszy z nokautem mGlu2, znacząco ratuje reakcję skurczu głowy wywołaną przez halucynogennego agonistę receptora seratoniny 2a DOI. Najbardziej krytycznymi krokami w tym eksperymencie są czas między zastrzykami wirusa, reakcja drgania głowy i kiedy myszy są składane w ofierze.
Każde opóźnienie może zmienić wyniki eksperymentu lub wprowadzić niejednoznaczność do danych. Po opanowaniu, operacja na myszach zajmie około 30 minut, aby wstrzyknąć wirusa. Eksperyment z drganiem głowy powinien również trwać około 35 minut na mysz.
Zaleca się przeprowadzanie operacji rozłożonych w czasie lub operowanie na więcej niż jednej myszy na raz. W ten sposób można utrzymać oś czasu, która pozwala na przeprowadzenie eksperymentów z drganiem głowy w ciągu trzech do czterech dni po operacji, co jest szczytowym czasem ekspresji konstruktu wirusowego. Dziękujemy za oglądanie i życzymy powodzenia w eksperymencie.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Przegląd
Ten artykuł opisuje metodę wstrzykiwania wektorów wirusowych do przedniego kory mózgu myszy w celu badania testów behawioralnych związanych z heteromeryzacją GPCR. Podejście ma na celu wyjaśnienie interakcji molekularnych receptorów sprzężonych z białkami G i ich wpływ na zachowanie w modelach psychiatrycznych.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neuronauki
- Farmakologia
- Nauki behawioralne
Tło
- Receptory sprzężone z białkami G (GPCR) odgrywają kluczową rolę w neurotransmisji.
- Zrozumienie interakcji GPCR może zapewnić wgląd w zaburzenia psychiczne.
- Heterodimeryzacja GPCR może wpływać na wyniki behawioralne.
- Ta metoda wykorzystuje wektory wirusowe do transferu genów w modelach mysich.
Cel badania
- Zbadanie efektów transferu genów pośredniczonego przez wirusa na fenotypy behawioralne.
- Zbadanie interakcji między serotoniną 2A a metabotropowym receptorem glutaminianowym 2.
- Rozważenie pytań w dziedzinie neuro- i psychofarmakologii.
Zastosowane metody
- Właściwe znieczulenie myszy zgodnie z zatwierdzonymi metodami.
- Wstrzyknięcie wektorów wirusowych do kory przedniej.
- Testy behawioralne w celu oceny wpływu interakcji GPCR.
- Analiza fenotypów behawioralnych związanych z zaburzeniami psychicznymi.
Główne wyniki
- Wgląd w heteromeryzację GPCR i jej implikacje behawioralne.
- Zrozumienie roli serotoniny 2A i metabotropowego receptora glutamianowego 2.
- Potencjalne powiązania między interakcjami GPCR a stanami psychicznymi.
- Wkład w dziedzinę neurofarmakologii poprzez eksperymentalne odkrycia.
Wnioski
- Metoda zapewnia ramy do badania interakcji GPCR in vivo.
- Wyniki mogą wpłynąć na strategie terapeutyczne dla zaburzeń psychicznych.
- Wymagana jest dalsza badania nad implikacjami tych interakcji.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
Dissecting the behavioral function of GPCR heteromers using HSV-mediated transgene expression in mice addresses a critical challenge in neuropsychiatric drug discovery: establishing mechanistic links between receptor complexes and disease-relevant phenotypes. This approach enables predictive confidence in target validation for psychiatric disorders by isolating the functional necessity of specific receptor interactions. The method supports risk-adjusted portfolio decisions at the interface of early discovery and translational research.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables direct interrogation of GPCR heteromer function in vivo for mechanistic de-risking.
- Clarifies the necessity of specific receptor complexes for disease-relevant behavioral phenotypes.
- Supports predictive confidence in target selection for neuropsychiatric indications.
Screening & Assay Development
- Establishes validated behavioral assays linked to molecular interventions for downstream screening.
- Provides quantitative behavioral outputs (head-twitch response) for assay standardization.
- Facilitates reproducible evaluation of genetic and pharmacological manipulations in vivo.
Translational & Preclinical Research
- Aligns preclinical behavioral models with human disease mechanisms via receptor complex interrogation.
- Enables continuity from molecular discovery to behavioral validation in animal models.
- Supports translational biomarker development by linking molecular interventions to quantifiable phenotypes.
Pipeline & Workflow Integration
This method bridges early discovery and preclinical validation by enabling hypothesis-driven testing of receptor complex function in disease-relevant behavioral systems.
- Discovery Biology: Supports null hypothesis testing for GPCR heteromer involvement in psychiatric phenotypes.
- Screening: Provides a platform for quantitative behavioral readouts following genetic or pharmacological perturbation.
- Analytics: Delivers measurable endpoints (head-twitch counts) for statistical comparison across experimental groups.
- Translational Research: Connects molecular interventions to behavioral outcomes relevant to psychiatric disorders.
- Enterprise Reuse: Offers a reusable workflow for interrogating other receptor complexes in vivo.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation and reduces mechanistic ambiguity for neuropsychiatric drug programs.
- Operational Value: Standardizes behavioral phenotyping linked to molecular interventions for reproducibility and scalability.
- Strategic Value: Informs go/no-go decisions by clarifying the necessity of receptor complexes for disease-relevant behaviors.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of targets and mechanisms for advancement in CNS pipelines.
Implementation Considerations
- Requires expertise in stereotactic surgery and behavioral phenotyping in rodents.
- Demands access to viral vector production and molecular validation infrastructure (immunocytochemistry, western blotting).
- Necessitates rigorous cross-team standardization of injection timing, behavioral testing, and data analysis.
- Adaptation to other receptor complexes or behavioral assays may require protocol optimization.
- Precise timing between viral delivery, behavioral assessment, and tissue collection is critical for data integrity.
