Ekspresja transgenu za pośrednictwem HSV konstruktów chimerycznych w celu zbadania funkcji behawioralnej heteromerów GPCR u myszy

Ogólnym celem tej metody jest obserwacja, w jaki sposób transfer genów za pośrednictwem wirusa wpływa na fenotypy behawioralne wymagające heterodimeryzacji receptorów sprzężonych z białkiem G w modelach mysich. Metoda ta może pomóc w udzieleniu odpowiedzi na kluczowe pytania w dziedzinie neuro- i psychofarmakologii, a konkretnie w kwestii tego, jak receptory sprzężone z białkiem G oddziałują ze sobą na poziomie molekularnym.

Stosując tę metodę możemy zrozumieć, w jaki sposób ta interakcja wpływa na zachowanie w modelach zaburzeń psychiatrycznych, takich jak schizofrenia i depresja. Z wykorzystaniem tej metody przyjrzymy się w szczególności receptorowi serotoninowemu 2a oraz metabotropowemu receptorowi glutaminianowemu 2, z których oba wykazują zaangażowanie w mechanizm działania leków stosowanych w leczeniu pacjentów ze schizofrenią. Należy rozpocząć od prawidłowego znieczulenia myszy zgodnie z zatwierdzonymi metodami.

Upewnij się, że osiągnięto płaszczyznę znieczulenia chirurgicznego, wykonując ucisk palca u nogi i stwierdzając brak reakcji. Następnie nałóż żel oftalmiczny w celu ochrony oczu. Przymocuj mysz do ramion stereotyptycznych, dbając o odpowiednie ustawienie nachylenia głowy, aby czaszka była w pozycji poziomej i płaskiej.

Nanieś jodopowidon na odsłoniętą skórę głowy. Za pomocą skalpela wykonaj nacięcie strzałkowe wzdłuż linii środkowej czaszki w obrębie odsłoniętego, ogolonego obszaru. Następnie przymocuj klamry Pureit do skóry w miejscu nacięcia, aby zapewnić stały dostęp do czaszki.

Nanieś nadtlenek wodoru, aby rozpuścić okostną i odsłonić szwy czaszki. Po uwidocznieniu bregmy i szwów należy wyregulować ramę stereotaktyczną, aby upewnić się, że czaszka jest wypoziomowana. Zrównaj końcówki igieł strzykawek z bregmą i zapisz współrzędne bregmy.

Aby wykonać obustronne wstrzyknięcia do kory czołowej, należy dodać 1,6 mm do zapisanej współrzędnej rostralno-kaudalnej względem bregma oraz 2,6 mm do zapisanej współrzędnej przyśrodkowej względem bregma. Zaznacz miejsca wstrzyknięć na czaszce, a następnie wywierć w tych miejscach małe otwory. Za pomocą patyczka higienicznego usuń nadmiar krwi lub fragmenty kości.

Doprowadź igłę do powierzchni mózgu, a następnie obniż ją do głębokości określonej przez współrzędną grzbietowo-brzuszną. Następnie powoli wstrzyknij zawartość strzykawki, obracając tłok igły, aby podać 0,1 µL na minutę przez pięć minut, co da łącznie wstrzyknięcie 0,5 µL. Pozostaw strzykawkę w miejscu przez pięć minut.

Po upływie wyznaczonego czasu wyjmij zwierzę ze stereotyptaksji, zamknij nacięcie i umieść je na podkładce grzewczej. Podaj przeciwbólowe leki pooperacyjne zgodnie z zatwierdzonym protokołem dotyczącym zwierząt. Przeprowadź testy behawioralne od dwóch do trzech dni po stereotaktycznym wstrzyknięciu cząsteczek wirusa.

Adaptuj myszy do pomieszczenia przez co najmniej cztery godziny przed rozpoczęciem eksperymentu. Rozpocznij od rozpuszczenia DOI w 0,9% roztworze soli fizjologicznej do stężenia dwóch miligramów na kilogram. Przygotuj klatkę domową bez ściółki i za pomocą statywu ustaw kamerę tak, aby znajdowała się bezpośrednio nad klatką domową.

Skalibruj kamerę w taki sposób, aby cała klatka domowa znajdowała się w polu widzenia. Zważ mysz i wykonaj zastrzyk dosytroniczny z odpowiednią dawką 0,9% soli fizjologicznej lub DOI. Umieść mysz z powrotem w klatce domowej na dziesięć minut.

Po dziesięciu minutach umieść mysz w centrum pustej klatki domowej i upewnij się, że w polu widzenia kamery nie ma martwych punktów. Naciśnij przycisk nagrywania w kamerze i opuść pomieszczenie. Po 30 minutach przerwij nagrywanie i umieść mysz z powrotem w oryginalnej klatce domowej.

Powtórz test behawioralny na kolejnej myszy. Przekaż filmy do recenzji sędziemu, który nie zna warunków eksperymentalnych. Ręcznie zarejestruj każde drgnienie głowy podczas całego nagrania.

Drżenie głową definiuje się jako szybki ruch potrząsania głową wykonywany przez mysz. Przetworzyć dane zgodnie z opisem zawartym w pisemnej części protokołu. Przedstawiony tutaj obraz jest reprezentatywny dla ekspresji transgenu indukowanej przez HSV w korze czołowej.

HSV mGlu2 GFP wstrzyknięto do kory czołowej, a ekspresję GFP wykazano za pomocą immunocytochemii. Ten pasek skali odpowiada 200 mikronom. Ten obraz przedstawia western blot ekspresji transgenu pośredniczonej przez HSV oraz reaktywność anty-mGlu2 w korze czołowej myszy z nokautem genu mGlu2.

W niniejszym doświadczeniu zmierzono immunoreaktywność mGlu2 jako monomeru. Ten histogram pokazuje, że ekspresja mGlu2 za pośrednictwem wirusa, ale nie chimerycznego mGlu2 w korze przedczołowej myszy z knockoutem mGlu2, znacząco przywraca reakcję drżenia głowy wywołaną przez DOI, będący halucynogennym agonistą receptora serotoninowego 2a. Najbardziej krytycznymi krokami w tym eksperymencie są odstępy czasowe pomiędzy iniekcjami wirusowymi, wystąpieniem reakcji drżenia głowy a momentem uśmiercenia myszy.

Każde opóźnienie może zmienić wyniki eksperymentu lub wprowadzić niejednoznaczność do danych. Po opanowaniu techniki, operacja myszy w celu wstrzyknięcia wirusa potrwa około 30 minut. Eksperyment z drżeniem głowy powinien również zająć około 35 minut na mysz.

Zaleca się przeprowadzanie zabiegów w odstępach czasowych lub operowanie na więcej niż jednej myszy jednocześnie. W ten sposób można zachować harmonogram pozwalający na wykonanie eksperymentów z drganiami głowy w ciągu trzech do czterech dni po operacji, co stanowi okres szczytowej ekspresji konstruktu wirusowego. Dziękujemy za oglądanie i życzymy powodzenia w przeprowadzaniu eksperymentu.