Name: Ekspresja transgenu za pośrednictwem HSV konstruktów chimerycznych w celu zbadania funkcji behawioralnej heteromerów GPCR u myszy (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-07-09T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 30 s
Description: Poznaj metodę transferu genów za pomocą wirusa HSV w celu badania funkcji behawioralnej heteromerów GPCR u myszy. Technika ta pozwala analizować interakcje receptorów 5-HT2A-mGlu2 w kontekście zaburzeń psychicznych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

NIH R01MH084894 uczestniczył w finansowaniu tego badania. Chcielibyśmy podziękować doktorom Yasmin Hurd i Scottowi Russo z Mount Sinai School of Medicine za przekazanie myszy i wykorzystanie ich urządzeń chirurgicznych i behawioralnych podczas kręcenia tej pracy.

UWAGA: Wszystkie procedury związane z hodowlą i opieką nad zwierzętami zostały przeprowadzone zgodnie z rozporządzeniem Instytucjonalnego Komitetu ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt (IACUC) Icahn School of Medicine w Mount Sinai. Pamiętaj, aby używać sterylnych rękawiczek przez cały czas trwania zabiegu. 
1. Przygotowanie leków i wirusów
<ol>
	<li>Przygotowanie leku
	<ol>
		<li>Przygotować 15,0 ml środka znieczulającego ketamina/ksylazyna, rozpuszczając 1,35 ml 100 mg/ml ketaminy i 0,75 ml 20 mg/ml ksylazyny w 12,9 ml 0,9% roztworu soli fizjologicznej. Dokładnie wymieszaj roztwór.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotowanie wirusa
	<ol>
		<li>Sklonuj konstrukty mGlu2 i mGlu2ΔTM4N do wektora wirusa opryszczki pospolitej (HSV) zgodnie ze standardowymi protokołami opisanymi wcześniej6. Upakuj cząsteczki wirusa zgodnie z wcześniejszym opisem6,13,14. Substytucja reszt Ala-6774,40, Ala-6814,44 i Ala6854,48 w mGlu2 dla Ser6864,40, Phe6904,44 i Gly-6944,48 w mGlu3 (HA-mGlu2ΔTM4N) została opisana wcześniej6, 
		UWAGA: Wcześniej wykazano, że chimeryczny konstrukt HA-mGlu2ΔTM4N ulega ekspresji w błonie plazmatycznej z nienaruszoną sygnalizacją zależną od białka G6.</li>
		<li>Wektory wirusowe należy przechowywać w temperaturze -80 °C, gdy nie są używane. Rozmrozić wektor wirusowy na lodzie, a następnie podzielić na 10 μl podwielokrotności. Przed zabiegiem chirurgicznym przechowywać na lodzie.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Chirurgia
<ol>
	<li>Przygotowanie do zabiegu
	<ol>
		<li>Zważyć mysz i wstrzyknąć jej odpowiednią dawkę koktajlu ketamina/ksylazyna (szczegółowe informacje, patrz 1.1.1).</li>
		<li>Sprawdź mysz, aby zobaczyć, czy jest odpowiednio znieczulona, ściśnij stopę i ogon, aby uzyskać reakcję bólu, jeśli nie jest w stanie wywołać odpowiedzi, mysz jest odpowiednio znieczulona.</li>
		<li>Ogol głowę myszy od podstawy czaszki do czubka nosa za pomocą maszynki do strzyżenia. Następnie nałóż żel okulistyczny na mysz, aby zapobiec ślepocie myszy.</li>
		<li>Załadować każdą strzykawkę na ramkę stereotaktyczną. Następnie przechyl prostopadłą część każdego ramienia ramy stereotaktycznej tak, aby były oddalone o 10 stopni od normalnej. Upewnij się, że ramiona są przechylone, tak aby igły były skierowane do siebie.</li>
		<li>Oczyścić każdą strzykawkę, wypełniając igłę 70% etanolem. Napełnić igłę co najmniej trzy razy, aby upewnić się, że strzykawka jest czysta.</li>
		<li>Po oczyszczeniu igły przepłukać igłę, napełniając igłę podwójnie destylowanymH2O. Po przepłukaniu napełnić każdą igłę 1,3 μl podwójnie destylowanegoH2O. Przekręcić tłok strzykawki, aby uwolnić 0,3 μl podwójnie destylowanegoH2O. Jeśli woda skrapla się na końcu igły, ostrożnie wytrzyj wodę. Jeśli nic nie wydostaje się ze strzykawki, należy całkowicie wcisnąć tłok w dół, a następnie powtórzyć czyszczenie strzykawki.</li>
		<li>Po napełnieniu wodą należy wyciągnąć strzykawkę, napełniając strzykawkę 0,5 μl powietrza.</li>
		<li>Gdy powietrze i woda znajdą się w strzykawce, ostrożnie napełnij strzykawkę 1,3 μl roztworu wirusa. W tym momencie należy upewnić się, że całkowita objętość w strzykawce wynosi 2,8 μl. Ponownie przekręcić końcówkę strzykawki, aby uwolnić 0,3 μl wirusa. Jeśli płyn skrapla się na końcu igły, ostrożnie zetrzyj płyn. Jeśli nic nie wydostaje się ze strzykawki, należy całkowicie wcisnąć tłok w dół, a następnie powtórzyć czyszczenie strzykawki.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>chirurgia
	<ol>
		<li>Przymocuj mysz do ramki stereotaktycznej, upewniając się, że ramka stereotaktyczna jest wyregulowana tak, aby czaszka była wypoziomowana i płaska. Nałóż povodine-jod na odsłoniętą skórę głowy. Za pomocą skalpela wykonaj strzałkowe nacięcie wzdłuż linii środkowej czaszki w odsłoniętym ogolonym obszarze. Następnie przymocuj zaciski biurety do skóry w miejscu nacięcia, aby upewnić się, że czaszka pozostaje odsłonięta.</li>
		<li>UżyjH2O2, aby rozpuścić okostną, aby odsłonić szwy czaszki. Teraz, gdy bregma i szwy są widoczne, pamiętaj o wyregulowaniu ramy stereotaktycznej, aby upewnić się, że czaszka jest wypoziomowana.</li>
		<li>Wyrównać końcówki igieł strzykawek z bregmą i zanotować współrzędne bregmy. Oblicz współrzędne miejsca, w którym zostaną wkłute igły.
		<ol>
			<li>Dla płaszczyzny Rostral-Cauldal (R-C) dodać 1,6 mm do zarejestrowanych współrzędnych R-C bregma (+1,6 z Bregmy). Dla płaszczyzny grzbietowo-brzusznej (D-V) odejmij 2,4 mm od zarejestrowanych współrzędnych D-V bregma (-2,4 od Bregmy).</li>
			<li>Na koniec, dla płaszczyzny przyśrodkowej bocznej (M-L), dodaj 2,6 mm do zarejestrowanych współrzędnych M-L bregma (+2,6 od Bregma). Dla wszystkich współrzędnych należy zapisać zarówno lewą, jak i prawą współrzędną, ponieważ jest to wstrzyknięcie dwustronne.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Doprowadź igły do żądanych współrzędnych. Zaznacz miejsca, w które mają zostać wbite igły i za pomocą wiertła wywierć zaznaczone obszary.</li>
		<li>Za pomocą aplikatora z bawełnianą końcówką zetrzyj nadmiar krwi lub fragment kości.</li>
		<li>Przyłóż igły do czaszki, gdzie końcówki igieł dotykają powierzchni mózgu. Następnie opuść igły do żądanych współrzędnych, powoli je obniżając.</li>
		<li>Gdy igły znajdą się w żądanych współrzędnych, powoli wstrzykiwać zawartość strzykawki, przekręcając tłok igły o 0,1 μl na minutę w ciągu 5 minut (łącznie 0,5 μl).</li>
		<li>Po wykonaniu wstrzyknięcia należy pozostawić strzykawkę w korze mózgowej na kolejne 5 minut.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Zamykanie/Pielęgnacja
	<ol>
		<li>Usuwaj igły z kory myszy równomiernie i powoli. Następnie wyjmij mysz z ramki stereotaktycznej.</li>
		<li>Nałóż cyjanoakrylan (klej skórny) na podstawowe płaty skóry z nacięcia, a następnie za pomocą kleszczy chwyć płaty skóry i umieść je razem.</li>
		<li>Pozostaw cyjanoakrylan do wyschnięcia. Umieść mysz w klatce nad poduszką grzewczą (poduszka grzewcza jest opcjonalna, jeśli sala operacyjna jest utrzymywana w temperaturze pokojowej 37 °C - w przeciwnym razie nie jest to konieczne). Pamiętaj, aby umieścić mysz na ręczniku papierowym, aby upewnić się, że pościel nie przylega do miejsca operacji.</li>
		<li>W zależności od długości zabiegu chirurgicznego należy upewnić się, że myszy są poza narkozą w ciągu 30 - 60 minut po zabiegu. Po operacji zwierzę umieszcza się je we własnej klatce i monitoruje do momentu utraty przytomności, zanim wróci do swojego pokoju, aby dojść do siebie. Nie stosuje się żadnych leków przeciwbólowych po operacji, ponieważ mogą one zmienić wyniki naszych eksperymentów poprzez modyfikację niektórych szlaków biochemicznych w mózgu. Jednak zwierzęta są monitorowane do czasu wyzdrowienia ze znieczulenia w dniu operacji i codziennie po operacji pod kątem objawów infekcji i oceny bólu/dystresu.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Eksperyment z reakcją głowy na Twitchu
<ol>
	<li>Konfiguracji
	<ol>
		<li>Przeprowadź wszystkie testy behawioralne między 10:00 a 14:00, 2 - 3 dni po stereotaktycznym wstrzyknięciu cząstek wirusa.</li>
		<li>Rozpuścić (±)-1-(2,5-dimetoksy-4-jodofenylo)-2-aminopropan chlorowodorek (DOI) w 0,9% roztworze soli do 2,0 mg/kg. Przygotuj również 0,9% roztwór soli fizjologicznej.</li>
		<li>Przygotuj klatkę domową (28 x 18 x 15 cm) bez pościeli i za pomocą statywu wyreguluj kamerę tak, aby view kamery wideo znajdował się bezpośrednio nad klatką domową.</li>
		<li>Przyzwyczaj myszy do pokoju na co najmniej 4 godziny przed rozpoczęciem eksperymentu.</li>
		<li>Skonfiguruj kamerę, aby nagrywać drganie głowy.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>eksperyment
	<ol>
		<li>Ustaw kamerę tak, aby znajdowała się bezpośrednio nad klatką domową. Skalibruj kamerę tak, aby cała klatka domowa znajdowała się w polu view.</li>
		<li>Zważyć mysz i wstrzyknąć jej dootrzewnowo odpowiednią dawkę 0,9% soli fizjologicznej lub DOI (0,01 ml/g). UWAGA: Jeśli mysz waży 25 gramów, należy podać dawkę do całkowitej objętości 0,25 ml.</li>
		<li>Umieść każdą mysz z powrotem w klatce domowej na 10 minut. Po 10 minutach umieść mysz na środku pustej klatki domowej i sprawdź, czy w polu widzenia kamery nie ma martwych punktów. Naciśnij przycisk nagrywania na kamerze. Opuść pokój. 
		UWAGA: Ruchy myszy i różne reakcje behawioralne w nich (drganie głowy, drapanie w uchu itp. Proszę zapoznać się z tabelą danych uzupełniających 1 Gonzalez-Maeso i wsp. 2007 dla pełnej listy reakcji behawioralnych wywołanych przez DOI.)3, będzie nagrywany przez 30 minut. Dlatego ważne jest, aby w rejestrowanym polu widzenia nie było martwych punktów.</li>
		<li>Po 30 minutach zatrzymaj nagrywanie na kamerze i umieść mysz z powrotem w oryginalnej klatce domowej. Powtórz ten proces dla każdej myszy.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>recenzja
	<ol>
		<li>Niech każdy sędzia przejrzy taśmy bez względu na warunki eksperymentalne u myszy (np. leki używane podczas eksperymentu z drganiem głowy lub wirusa używanego podczas wstrzyknięcia wewnątrzczaszkowego)). Ręcznie nagrywaj każde drgnięcie głowy w całym filmie. 
		UWAGA: Drganie głowy definiuje się jako szybki ruch potrząsania głową wykonywany przez mysz (dodatkowe wideo).</li>
		<li>Dla każdej myszy uśrednij końcową odpowiedź HTR z trzech sum sędziów niewidomych. Następnie pogrupuj te wartości według warunków eksperymentalnych i przeprowadź analizę statystyczną (tj. test t lub ANOVA).</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Fribourg, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Decoding+the+Signaling+of+a+GPCR+Heteromeric+Complex+Reveals+a+Unifying+Mechanism+of+Action+of+Antipsychotic+Drugs%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Decoding the Signaling of a GPCR Heteromeric Complex Reveals a Unifying Mechanism of Action of Antipsychotic Drugs.</a> Cell. 147 (5), 1011-1023 (2011).</li>
<li>Gonzalez-Maeso, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+a+serotonin%2Fglutamate+receptor+complex+implicated+in+psychosis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Identification of a serotonin/glutamate receptor complex implicated in psychosis.</a> Nature. 452 (7183), 93-97 (2008).</li>
<li>Gonzalez-Maeso, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hallucinogens+Recruit+Specific+Cortical+5-HT%282A%29+Receptor-Mediated+Signaling+Pathways+to+Affect+Behavior%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Hallucinogens Recruit Specific Cortical 5-HT(2A) Receptor-Mediated Signaling Pathways to Affect Behavior.</a> Neuron. 53 (3), 439-452 (2007).</li>
<li>Gonzalez-Maeso, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptome+fingerprints+distinguish+hallucinogenic+and+nonhallucinogenic+5-hydroxytryptamine+2A+receptor+agonist+effects+in+mouse+somatosensory+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Transcriptome fingerprints distinguish hallucinogenic and nonhallucinogenic 5-hydroxytryptamine 2A receptor agonist effects in mouse somatosensory cortex.</a> J Neurosci. 23 (26), 8836-8843 (2003).</li>
<li>Moreno, J. L., Holloway, T., Albizu, L., Sealfon, S. C., Gonzalez-Maeso, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabotropic+glutamate+mGlu2+receptor+is+necessary+for+the+pharmacological+and+behavioral+effects+induced+by+hallucinogenic+5-HT2A+receptor+agonists%5BTitle%5D)+AND+%22Neurosci+Lett%22%5BJournal%5D)">Metabotropic glutamate mGlu2 receptor is necessary for the pharmacological and behavioral effects induced by hallucinogenic 5-HT2A receptor agonists.</a> Neurosci Lett. 493 (3), 76-79 (2011).</li>
<li>Moreno, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+Three+Residues+Essential+for+5-HT2A-mGlu2+Receptor+Heteromerization+and+its+Psychoactive+Behavioral+Function%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Identification of Three Residues Essential for 5-HT2A-mGlu2 Receptor Heteromerization and its Psychoactive Behavioral Function.</a> J Biol Chem. 287, 44301-44319 (2012).</li>
<li>Geyer, M. A., Vollenweider, F. X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Serotonin+research%3A+contributions+to+understanding+psychoses%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Pharmacol+Sci%22%5BJournal%5D)">Serotonin research: contributions to understanding psychoses.</a> Trends Pharmacol Sci. 29 (9), 445-453 (2008).</li>
<li>Nichols, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hallucinogens%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmacol+Ther%22%5BJournal%5D)">Hallucinogens.</a> Pharmacol Ther. 101 (2), 131-181 (2004).</li>
<li>Hanks, J. B., Gonzalez-Maeso, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Animal+models+of+serotonergic+psychedelics%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Chem+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Animal models of serotonergic psychedelics.</a> ACS Chem Neurosci. 4 (1), 33-42 (2013).</li>
<li>Fiorella, D., Rabin, R. A., Winter, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+5-HT2A+and+5-HT2C+receptors+in+the+stimulus+effects+of+hallucinogenic+drugs.+II%3A+Reassessment+of+LSD+false+positives%5BTitle%5D)+AND+%22Psychopharmacology+%28Berl%29%22%5BJournal%5D)">Role of 5-HT2A and 5-HT2C receptors in the stimulus effects of hallucinogenic drugs. II: Reassessment of LSD false positives.</a> Psychopharmacology (Berl). 121 (3), 357-363 (1995).</li>
<li>Vollenweider, F. X., Vollenweider-Scherpenhuyzen, M. F., Babler, A., Vogel, H., Hell, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Psilocybin+induces+schizophrenia-like+psychosis+in+humans+via+a+serotonin-2+agonist+action%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroreport%22%5BJournal%5D)">Psilocybin induces schizophrenia-like psychosis in humans via a serotonin-2 agonist action.</a> Neuroreport. 9 (17), 3897-3902 (1998).</li>
<li>Moreno, J. L., Sealfon, S. C., Gonzalez-Maeso, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Group+II+metabotropic+glutamate+receptors+and+schizophrenia%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Mol+Life+Sci%22%5BJournal%5D)">Group II metabotropic glutamate receptors and schizophrenia.</a> Cell Mol Life Sci. 66 (23), 3777-3785 (2009).</li>
<li>Kurita, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HDAC2+regulates+atypical+antipsychotic+responses+through+the+modulation+of+mGlu2+promoter+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">HDAC2 regulates atypical antipsychotic responses through the modulation of mGlu2 promoter activity.</a> Nat Neurosci. 15 (9), 1245-1254 (2012).</li>
<li>Kurita, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Repressive+Epigenetic+Changes+at+the+mGlu2+Promoter+in+Frontal+Cortex+of+5-HT2A+Knockout+Mice%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Repressive Epigenetic Changes at the mGlu2 Promoter in Frontal Cortex of 5-HT2A Knockout Mice.</a> Mol Pharmacol. 83 (6), 1166-1175 (2013).</li>
<li>Rives, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crosstalk+between+GABAB+and+mGlu1a+receptors+reveals+new+insight+into+GPCR+signal+integration%5BTitle%5D)+AND+%22Embo+J%22%5BJournal%5D)">Crosstalk between GABAB and mGlu1a receptors reveals new insight into GPCR signal integration.</a> Embo J. 28 (15), 2195-2208 (2009).</li>
<li>Milligan, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Prevalence%2C+Maintenance+and+Relevance+of+GPCR+Oligomerization%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">The Prevalence, Maintenance and Relevance of GPCR Oligomerization.</a> Mol Pharmacol. (84), Epub ahead of print 158-169 (2013).</li>
<li>Ferre, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((G+protein-coupled+receptor+oligomerization+revisited%3A+functional+and+pharmacological+perspectives%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmacol+Rev%22%5BJournal%5D)">G protein-coupled receptor oligomerization revisited: functional and pharmacological perspectives.</a> Pharmacol Rev. 66 (2), 413-434 (2014).</li>
<li>Gonzalez-Maeso, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GPCR+oligomers+in+pharmacology+and+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Brain%22%5BJournal%5D)">GPCR oligomers in pharmacology and signaling.</a> Mol Brain. 4 (1), 20(2011).</li>
<li>Gonzalez-Maeso, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Family+a+GPCR+heteromers+in+animal+models%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Family a GPCR heteromers in animal models.</a> Front Pharmacol. 5, 226(2014).</li>
<li>Dragulescu-Andrasi, A., Chan, C. T., De, A., Massoud, T. F., Gambhir, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bioluminescence+resonance+energy+transfer+%28BRET%29+imaging+of+protein-protein+interactions+within+deep+tissues+of+living+subjects%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Bioluminescence resonance energy transfer (BRET) imaging of protein-protein interactions within deep tissues of living subjects.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (29), 12060-12065 (2011).</li>
<li>Calebiro, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-molecule+analysis+of+fluorescently+labeled+G-protein-coupled+receptors+reveals+complexes+with+distinct+dynamics+and+organization%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Single-molecule analysis of fluorescently labeled G-protein-coupled receptors reveals complexes with distinct dynamics and organization.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (2), 743-748 (2013).</li>
<li>Fonseca, J. M., Lambert, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Instability+of+a+class+a+G+protein-coupled+receptor+oligomer+interface%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Instability of a class a G protein-coupled receptor oligomer interface.</a> Mol Pharmacol. 75 (6), 1296-1299 (2009).</li>
<li>Hern, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Formation+and+dissociation+of+M1+muscarinic+receptor+dimers+seen+by+total+internal+reflection+fluorescence+imaging+of+single+molecules%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Formation and dissociation of M1 muscarinic receptor dimers seen by total internal reflection fluorescence imaging of single molecules.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (6), 2693-2698 (2010).</li>
<li>Hlavackova, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sequential+inter-+and+intrasubunit+rearrangements+during+activation+of+dimeric+metabotropic+glutamate+receptor+1%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Signal%22%5BJournal%5D)">Sequential inter- and intrasubunit rearrangements during activation of dimeric metabotropic glutamate receptor 1.</a> Sci Signal. 5 (237), 59(2012).</li>
<li>Irannejad, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conformational+biosensors+reveal+GPCR+signalling+from+endosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Conformational biosensors reveal GPCR signalling from endosomes.</a> Nature. 495 (7442), 534-538 (2013).</li>
<li>Calebiro, D., Nikolaev, V. O., Persani, L., Lohse, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Signaling+by+internalized+G-protein-coupled+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Pharmacol+Sci%22%5BJournal%5D)">Signaling by internalized G-protein-coupled receptors.</a> Trends Pharmacol Sci. 31 (5), 221-228 (2010).</li>
<li>Celada, P., Puig, M. V., Diaz-Mataix, L., Artigas, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+hallucinogen+DOI+reduces+low-frequency+oscillations+in+rat+prefrontal+cortex%3A+reversal+by+antipsychotic+drugs%5BTitle%5D)+AND+%22Biol+Psychiatry%22%5BJournal%5D)">The hallucinogen DOI reduces low-frequency oscillations in rat prefrontal cortex: reversal by antipsychotic drugs.</a> Biol Psychiatry. 64 (5), 392-400 (2008).</li>
<li>Béïque, J. -C., Imad, M., Mladenovic, L., Gingrich, J. A., Andrade, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanism+of+the+5-hydroxytryptamine+2A+receptor-mediated+facilitation+of+synaptic+activity+in+prefrontal+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Mechanism of the 5-hydroxytryptamine 2A receptor-mediated facilitation of synaptic activity in prefrontal cortex.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (23), 9870-9875 (2007).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Wraz z wcześniejszymi odkryciami na myszach mGlu2-KO5, wyniki z chimerycznymi konstruktami mGlu2 i mGlu2/mGlu3, które nie tworzą kompleksu receptora 5-HT2A-mGlu2 w hodowanych komórkach, sugerują, że kompleks receptora heteromerycznego 5-HT2A-mGlu2 w korze czołowej myszy jest potrzebny do wywołania drgań głowy przez halucynogenny 5-HT2A podobny do LSD agonistów receptorów. Ograniczeniem tej metody jest to, że nie mierzy ona bliskiej bliskości molekularnej na poziomie subkomórkow...

Halucynogeny, takie jak LSD, psylocybina i meskalina powodują znaczące zmiany w ludzkiej świadomości, poznaniu i emocjach7-9. Inaktywacja sygnalizacji receptora serotoniny 5-HT2A za pomocą metod genetycznych lub farmakologicznych powoduje znacznie osłabione reakcje behawioralne na halucynogeny zarówno u gryzoni3,10, jak i u ludzi11. Chociaż halucynogeny wiążą inne podtypy receptorów8, receptor5-HT 2A jest uważany za niezbędny dla unikalnej aktywności behawioralnej tych substancji chemicznych.
Metabotropowe receptory glutaminianu grupy II (tj. mGlu2 i mGlu3) były przedmiotem znacznego zainteresowania w związku z molekularnym mechanizmem halucynogenów i ich integralną rolą leżącą u podstaw psychozy12. Wcześniej wykazano, że myszy bez ekspresji białka mGlu2 (myszy mGlu2-KO) są niewrażliwe na komórkowe i behawioralne działanie halucynogenów5. Zasugerowano również, że receptory 5-HT2A i mGlu2 tworzą specyficzny kompleks heteromeryczny, za pomocą którego ligandy serotoniny i glutaminianu modulują wzór sprzężenia białka G w żywych komórkach 1,2.
Strukturalnie, domeny transbłonowe (TM) 4 i 5 mGlu2 odgrywają fundamentalną rolę w tworzeniu heteromerycznym z receptorem 5-HT2A 5. Ponadto dalsze badania wykazały, że trzy reszty znajdujące się na wewnątrzkomórkowym końcu TM4 mGlu2 są niezbędne do utworzenia heterokompleksu receptora 5-HT2A-mGlu2 w żywych komórkach6.
Na podstawie tych wyników zaobserwowanych w heterologicznych systemach ekspresji, tutaj opisujemy użycie za pośrednictwem HSV ekspresji chimerycznych konstruktów mGlu2 i mGlu2/mGlu3 typu dzikiego w korze czołowej myszy mGlu2-KO, aby sprawdzić, czy heteromeryczne tworzenie się między 5-HT2A i mGlu2 jest konieczne dla zachowania drgań głowy wywołanego przez halucynogennych agonistów receptora 5-HT2A.

<table><tbody><tr><td>mGlu2 wektor bitronicznego wirusa opryszczki pospolitej (HSV)&nbsp;</td><td>MIT Core</td><td></td><td>mGlu2 i mGlu2DTM4N poddano subklonowaniu do bicystronicznego wektora wirusa HSV-GFP p1005 + HSV eksprymującego GFP pod kontrolą promotora CMV. Cząsteczki wirusa zostały wyprodukowane przez Viral Core Facility w Instytucie McGoverna (MIT). Aby uzyskać więcej informacji, prosimy o kontakt z dyrektorem, dr Rachael Neve (rneve@mit.edu)</td></tr><tr><td>mGlu2&Delta; Wektor wirusa opryszczki pospolitej (HSV) bicitronic TM4N&nbsp;</td><td>MIT Core</td><td></td><td>mGlu2 i mGlu2DTM4N poddano subklonowaniu do bicystronicznego wektora wirusa HSV-GFP p1005 + HSV eksprymującego GFP pod kontrolą promotora CMV. Cząsteczki wirusa zostały wyprodukowane przez Viral Core Facility w Instytucie McGoverna (MIT). Aby uzyskać więcej informacji, skontaktuj się z dyrektorem, dr Rachael Neve (rneve@mit.edu)</td></tr><tr><td>GFP wektor wirusa opryszczki pospolitej (HSV)&nbsp;</td><td>MIT Core</td><td></td><td>mGlu2 i mGlu2DTM4N poddano subklonowaniu do bicystronicznego wektora wirusa HSV-GFP p1005 + HSV eksprymującego GFP pod kontrolą promotora CMV. Cząsteczki wirusa zostały wyprodukowane przez Viral Core Facility w Instytucie McGoverna (MIT). Aby uzyskać więcej informacji, prosimy o kontakt z dyrektorem, dr Rachael Neve (rneve@mit.edu)</td></tr><tr><td>Xylazine&nbsp;</td><td>Nr Lloyd</td><td>List 4811-20ml, NADA #139-236, kod NDC: 61311-481-10</td><td>1,35 ml ketaminy (100 mg/ml) + 0,75 ml ksylazyny (20 mg/ml) rozcieńcza się w 12,0 ml 0,9% roztworu soli</td></tr><tr><td>fizjologicznej Ketamina&nbsp;</td><td>Vedco</td><td>KetaVed-10ml, NADA #200-029, NDC Kod(y): 50989-161-06</td><td>1,35 ml ketaminy (100 mg/ml) + 0,75 ml ksylazyny (20 mg/ml) rozcieńcza się w 12,0 ml 0,9% roztworu soli</td></tr> fizjologicznej <tr><td>Żel okulistyczny</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC0550805</td><td></td></tr><tr><td>Klipsy do burwet</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC9268369</td> Feather Ostrze chirurgiczne Fisher Scientific NC9032736 <td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Wodór Nadtlenek</td><td>Fisher Scientific</td><td>19-898-919&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Strzykawka Hamilton</td><td>Fisher Scientific</td><td>14815203</td><td></td></tr><tr><td>Hamilton&trade; Małe wyjmowane igły w piaście (33 Ga)</td><td>Fisher Scientific</td><td>14816206</td><td></td></tr><tr><td>akumulatorowa mikrowiertarka</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC9089241</td><td></td></tr><tr><td>Dermabond Klej skórny</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC0690470</td><td></td></tr><tr><td>(&plusmn;)-1-(2,5-dimetoksy-4-jodofenylo)-2-aminopropan chlorowodorek (DOI)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>42203-78-1</td><td>rozpuszczony w 0,9% roztworze soli do stężenia 2,0 mg/kg</td></tr></tbody></table>

ekspresja transgenu za pośrednictwem hsv konstruktów chimerycznych w celu zbadania funkcji behawioralnej heteromerów gpcr u myszy

HSV-Mediated Transgene Expression of Chimeric Constructs to Study Behavioral Function of GPCR Heteromers in Mice

Heteromeryczny kompleks receptorowy pomiędzy 5-HT2A i mGlu2 został zamieszany w niektóre fenotypy behawioralne w mysich modelach psychozy1,2. W związku z tym badanie szczegółów strukturalnych interakcji między 5-HT2A i mGlu2 wpływających na zachowania związane ze schizofrenią stanowi potężne narzędzie translacyjne. Jak wykazano wcześniej, reakcja skurczu głowy (HTR) u myszy jest wywoływana przez leki halucynogenne i ta reakcja behawioralna jest nieobecna u myszy z nokautem 5-HT2A (KO)3,4. Dodatkowo, poprzez warunkową ekspresję receptora 5-HT2A tylko w korze, wykazano, że zależne od receptora 5-HT2A szlaki sygnałowe na korowych neuronach piramidowych są wystarczające do wywołania zachowania drgawek głowy w odpowiedzi na leki halucynogenne3. Wreszcie, wykazano, że reakcja behawioralna drgań głowy wywołana przez halucynogeny DOI i dietyloamid kwasu lizergowego (LSD) jest znacznie zmniejszona u myszy mGlu2-KO5. Odkrycia te sugerują, że mGlu2 jest przynajmniej częściowo niezbędny dla zależnych od receptora 5-HT2A efektów behawioralnych podobnych do psychozy, indukowanych przez leki podobne do LSD. Nie dostarcza to jednak dowodów na to, czy kompleks receptora5-HT 2A-mGlu2 jest niezbędny dla tego fenotypu behawioralnego. Aby odpowiedzieć na to pytanie, wykorzystano konstrukty wirusa opryszczki pospolitej (HSV) do ekspresji mGlu2 lub mGlu2ΔTM4N (chimeryczny konstrukt mGlu2 / mGlu3, który nie tworzy kompleksu receptora 5-HT2A-mGlu2) w korze czołowej myszy mGlu2-KO, aby zbadać, czy ten heteromeryczny kompleks GPCR jest potrzebny do efektów behawioralnych wywołanych przez leki podobne do LSD6.

Poprzednie doniesienia wykazują, że mysia reakcja behawioralna w postaci potrząsania głową jest wywoływana w sposób wiarygodny i silny przez halucynogeny, a występuje ona w stopniu zerowym u myszy 5-HT2A-KO3. Ponadto wykazano, że reakcja potrząsania głową wywołana przez halucynogenne agoniści 5-HT2A, takie jak DOI i LSD, była znacznie zmniejszona u myszy mGlu2-KO5. Jednakże, mimo że poprzednie wyniki przekonująco dowodzą, iż 5-HT2A i ...

Ten artykuł opisuje, jak wstrzyknąć wektory wirusowe do kory czołowej myszy w celu przetestowania testów behawioralnych, które wymagają tworzenia heteromerycznego GPCR.

Ekspresja transgenu za pośrednictwem HSV konstruktów chimerycznych w celu zbadania funkcji behawioralnej heteromerów GPCR u myszy

The heteromeric receptor complex between 5-HT2A and mGlu2 has been implicated in some of the behavioral phenotypes in mouse models of psychosis1,2.  ...

Ogólnym celem tej metody jest obserwacja, w jaki sposób transfer genów za pośrednictwem wirusa wpływa na fenotypy behawioralne wymagające heterodimeryzacji receptorów sprzężonych z białkiem G w modelach mysich. Metoda ta może pomóc w udzieleniu odpowiedzi na kluczowe pytania w dziedzinie neuro- i psychofarmakologii, a konkretnie w kwestii tego, jak receptory sprzężone z białkiem G oddziałują ze sobą na poziomie molekularnym.Stosując tę metodę możemy zrozumieć, w jaki sposób ta interakcja wpływa na zachowanie w modelach zaburzeń psychiatrycznych, takich jak schizofrenia i depresja. Z wykorzystaniem tej metody przyjrzymy się w szczególności receptorowi serotoninowemu 2a oraz metabotropowemu receptorowi glutaminianowemu 2, z których oba wykazują zaangażowanie w mechanizm działania leków stosowanych w leczeniu pacjentów ze schizofrenią. Należy rozpocząć od prawidłowego znieczulenia myszy zgodnie z zatwierdzonymi metodami.Upewnij się, że osiągnięto płaszczyznę znieczulenia chirurgicznego, wykonując ucisk palca u nogi i stwierdzając brak reakcji. Następnie nałóż żel oftalmiczny w celu ochrony oczu. Przymocuj mysz do ramion stereotyptycznych, dbając o odpowiednie ustawienie nachylenia głowy, aby czaszka była w pozycji poziomej i płaskiej.Nanieś jodopowidon na odsłoniętą skórę głowy. Za pomocą skalpela wykonaj nacięcie strzałkowe wzdłuż linii środkowej czaszki w obrębie odsłoniętego, ogolonego obszaru. Następnie przymocuj klamry Pureit do skóry w miejscu nacięcia, aby zapewnić stały dostęp do czaszki.Nanieś nadtlenek wodoru, aby rozpuścić okostną i odsłonić szwy czaszki. Po uwidocznieniu bregmy i szwów należy wyregulować ramę stereotaktyczną, aby upewnić się, że czaszka jest wypoziomowana. Zrównaj końcówki igieł strzykawek z bregmą i zapisz współrzędne bregmy.Aby wykonać obustronne wstrzyknięcia do kory czołowej, należy dodać 1,6 mm do zapisanej współrzędnej rostralno-kaudalnej względem bregma oraz 2,6 mm do zapisanej współrzędnej przyśrodkowej względem bregma. Zaznacz miejsca wstrzyknięć na czaszce, a następnie wywierć w tych miejscach małe otwory. Za pomocą patyczka higienicznego usuń nadmiar krwi lub fragmenty kości.Doprowadź igłę do powierzchni mózgu, a następnie obniż ją do głębokości określonej przez współrzędną grzbietowo-brzuszną. Następnie powoli wstrzyknij zawartość strzykawki, obracając tłok igły, aby podać 0,1 µL na minutę przez pięć minut, co da łącznie wstrzyknięcie 0,5 µL. Pozostaw strzykawkę w miejscu przez pięć minut.Po upływie wyznaczonego czasu wyjmij zwierzę ze stereotyptaksji, zamknij nacięcie i umieść je na podkładce grzewczej. Podaj przeciwbólowe leki pooperacyjne zgodnie z zatwierdzonym protokołem dotyczącym zwierząt. Przeprowadź testy behawioralne od dwóch do trzech dni po stereotaktycznym wstrzyknięciu cząsteczek wirusa.Adaptuj myszy do pomieszczenia przez co najmniej cztery godziny przed rozpoczęciem eksperymentu. Rozpocznij od rozpuszczenia DOI w 0,9% roztworze soli fizjologicznej do stężenia dwóch miligramów na kilogram. Przygotuj klatkę domową bez ściółki i za pomocą statywu ustaw kamerę tak, aby znajdowała się bezpośrednio nad klatką domową.Skalibruj kamerę w taki sposób, aby cała klatka domowa znajdowała się w polu widzenia. Zważ mysz i wykonaj zastrzyk dosytroniczny z odpowiednią dawką 0,9% soli fizjologicznej lub DOI. Umieść mysz z powrotem w klatce domowej na dziesięć minut.Po dziesięciu minutach umieść mysz w centrum pustej klatki domowej i upewnij się, że w polu widzenia kamery nie ma martwych punktów. Naciśnij przycisk nagrywania w kamerze i opuść pomieszczenie. Po 30 minutach przerwij nagrywanie i umieść mysz z powrotem w oryginalnej klatce domowej.Powtórz test behawioralny na kolejnej myszy. Przekaż filmy do recenzji sędziemu, który nie zna warunków eksperymentalnych. Ręcznie zarejestruj każde drgnienie głowy podczas całego nagrania.Drżenie głową definiuje się jako szybki ruch potrząsania głową wykonywany przez mysz. Przetworzyć dane zgodnie z opisem zawartym w pisemnej części protokołu. Przedstawiony tutaj obraz jest reprezentatywny dla ekspresji transgenu indukowanej przez HSV w korze czołowej.HSV mGlu2 GFP wstrzyknięto do kory czołowej, a ekspresję GFP wykazano za pomocą immunocytochemii. Ten pasek skali odpowiada 200 mikronom. Ten obraz przedstawia western blot ekspresji transgenu pośredniczonej przez HSV oraz reaktywność anty-mGlu2 w korze czołowej myszy z nokautem genu mGlu2.W niniejszym doświadczeniu zmierzono immunoreaktywność mGlu2 jako monomeru. Ten histogram pokazuje, że ekspresja mGlu2 za pośrednictwem wirusa, ale nie chimerycznego mGlu2 w korze przedczołowej myszy z knockoutem mGlu2, znacząco przywraca reakcję drżenia głowy wywołaną przez DOI, będący halucynogennym agonistą receptora serotoninowego 2a. Najbardziej krytycznymi krokami w tym eksperymencie są odstępy czasowe pomiędzy iniekcjami wirusowymi, wystąpieniem reakcji drżenia głowy a momentem uśmiercenia myszy.Każde opóźnienie może zmienić wyniki eksperymentu lub wprowadzić niejednoznaczność do danych. Po opanowaniu techniki, operacja myszy w celu wstrzyknięcia wirusa potrwa około 30 minut. Eksperyment z drżeniem głowy powinien również zająć około 35 minut na mysz.Zaleca się przeprowadzanie zabiegów w odstępach czasowych lub operowanie na więcej niż jednej myszy jednocześnie. W ten sposób można zachować harmonogram pozwalający na wykonanie eksperymentów z drganiami głowy w ciągu trzech do czterech dni po operacji, co stanowi okres szczytowej ekspresji konstruktu wirusowego. Dziękujemy za oglądanie i życzymy powodzenia w przeprowadzaniu eksperymentu.

hsv-mediated-transgene-expression-chimeric-constructs-to-study

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Przedstawiamy protokół otrzymywania swoistych dla antygenu limfocytów T myszy z wykorzystaniem transdukcji...

Retrowirusowa transdukcja receptorów limfocytów T w limfocytach T myszy

Wektory wirusowe pozwalają na celową manipulację genami. Demonstrujemy metodę warunkowej ekspresji genów lub ablacji w rdzeniu kręgowym myszy, wykorzystując stereotaktyczne wstrzyknięcie wektora wirusowego do rogu grzbietowego, widocznego miejsca kontaktu synaptycznego między pierwotnymi aferentami somatosensorycznymi a neuronami ośrodkowego układu nerwowego.

Stereotaktyczne wstrzyknięcie wektora wirusowego w celu warunkowej manipulacji genami w rdzeniu kręgowym myszy

Wykorzystując binarną strategię genetyczną, dostarczamy szczegółowy protokół śledzenia obwodów neuronalnych u myszy, które wyrażają komplementarne znaczniki transsynaptyczne po rekombinacji za pośrednictwem Cre. Ponieważ specyficzna dla komórki produkcja znaczników jest zakodowana genetycznie, nasze eksperymentalne podejście jest odpowiednie do badania tworzenia i dojrzewania obwodów nerwowych podczas rozwoju mysiego embrionalnego mózgu w rozdzielczości pojedynczej komórki.

Warunkowe genetyczne śledzenie transsynaptyczne w embrionalnym mózgu myszy

Jelitowy układ nerwowy tworzą komórki grzebienia nerwowego, które namnażają się, migrują i kolonizują jelita. Komórki grzebienia nerwowego różnicują się w neurony z markerami specyficznymi dla ich fenotypu neuroprzekaźnika. Protokół ten opisuje technikę preparowania, utrwalania i barwienia immunologicznego mysiego embrionalnego przewodu pokarmowego w celu wizualizacji ekspresji neuroprzekaźników jelitowego układu nerwowego.

Barwienie immunologiczne w celu wizualizacji rozwoju mysiego jelitowego układu nerwowego

Ten film pokazuje procedurę kraniotomii, która umożliwia przewlekłe obrazowanie neuronów w korze zaśledziony myszy za pomocą mikroskopii dwufotonowej in vivo w linii transgenicznej Thy1-GFP. Podejście to łączy się z wstrzyknięciem do grzbietowego hipokampa wirusa związanego z ekspresją mCherry. Techniki te pozwalają na długoterminowe monitorowanie plastyczności strukturalnej zależnej od doświadczenia w RSC.

Jednoczesne dwufotonowe obrazowanie in vivo wejść synaptycznych i celów postsynaptycznych w korze zaśledzinowej myszy

Obecny protokół łączy sekwencjonowanie łańcucha alfa i beta TCR w parach pojedynczych komórek z usprawnionym generowaniem wektorów retrowirusowych kompatybilnych z ekspresją TCR in vitro i in vivo.

Usprawniona izolacja TCR z pojedynczych komórek i generowanie wektorów retrowirusowych do ekspresji TCR u ludzi in vitro i in vivo

Wstrzyknięcie dordzeniowe rekombinowanego rekombinowanego wirusa związanego z adenowirusem (rAAV) może być użyte do manipulowania dowolnym genetycznie znakowanym typem komórki w rdzeniu kręgowym. Tutaj opisujemy, jak transdukować neurony w rogu grzbietowym lędźwiowego rdzenia kręgowego. Technika ta umożliwia funkcjonalne badanie zmanipulowanego podtypu neuronu.

Ekspresja transgenu za pośrednictwem wirusa związanego z adenowirusem w genetycznie zdefiniowanych neuronach rdzenia kręgowego

Tutaj prezentujemy protokół promujący integrację transgenów i produkcję założycielskich myszy transgenicznych z wysoką skutecznością poprzez proste wstrzyknięcie wektora lentiwirusowego w przestrzeń okołobrewą zapłodnionego oocytu.

Produkcja transgenicznych myszy za pośrednictwem lentiwirusa: prosta i wysoce skuteczna metoda bezpośredniego badania założycieli

Prezentowana tutaj jest wielofotonowa mikroskopijna platforma do obrazowania powierzchni oka myszy na żywo. Fluorescencyjna mysz transgeniczna umożliwia wizualizację jąder komórkowych, błon komórkowych, włókien nerwowych i naczyń włosowatych na powierzchni oka. Nieliniowe sygnały generujące drugą harmoniczną pochodzące ze struktur kolagenowych zapewniają obrazowanie bez znaczników dla architektur zrębowych.

Niestandardowa platforma mikroskopii wielofotonowej do obrazowania na żywo rogówki i spojówki myszy

Przedstawiamy protokół retrowirusowej transdukcji przewodnikowego RNA do pierwotnych limfocytów T od transgenicznych myszy Cas9, zapewniając efektywną alternatywę dla edycji genów w badaniu różnicowania Th17.

Retrowirusowe celowanie genów za pośrednictwem CRISPR/Cas9 w badaniu różnicowania Th17 in vitro

Przedstawiamy ulepszone protokoły transdukcji retrowirusowej receptorów transportowych i konkurencyjnego naprowadzania w celu zbadania lokalizacji limfocytów specyficznych dla narządów i mikrośrodowisk za pośrednictwem receptorów. Metoda ta dostarcza cennych informacji na temat mechanizmów transportu komórek odpornościowych i ma potencjalne zastosowania w przyszłych badaniach podstawowych i terapeutycznych.

Wydajna transdukcja retrowirusowa i konkurencyjne naprowadzanie do badania lokalizacji limfocytów T za pośrednictwem GPCR w różnych mikrośrodowiskach tkankowych

Poznaj metodę transferu genów za pomocą wirusa HSV w celu badania funkcji behawioralnej heteromerów GPCR u myszy. Technika ta pozwala analizować interakcje receptorów 5-HT2A-mGlu2 w kontekście zaburzeń psychicznych.

Ekspresja transgenu za pośrednictwem HSV konstruktów chimerycznych w celu zbadania funkcji behawioralnej heteromerów GPCR u myszy (Wideo) | JoVE Journal

Ekspresja transgenu za pośrednictwem HSV konstruktów chimerycznych w celu zbadania funkcji behawioralnej heteromerów GPCR u myszy

Przeglądaj więcej filmów