Name: Analiza immunofluorescencyjna endogennych i egzogennych białek centromer-kinetochoru (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-03-03T14:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 35 s
Description: Poznaj technikę immunofluorescencyjną do lokalizacji i ilościowego oznaczania endogennych oraz egzogennych białek centromer-kinetochoru w ludzkich komórkach. Metoda umożliwia badanie dynamiki białek podczas podziału komórkowego.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez GM68418 grantu NIH.

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

W ostatnich latach w wielu badaniach opracowano różne ilościowe testy mikroskopowe dla komórek stałych. 42 Postęp w biologii centromerów i kinetochorów często wymaga zrozumienia specyficznej dla centromeru lub kinetochoru funkcji białek, których subkomórkowa regulacja przestrzenno-czasowa odzwierciedla zmieniające się funkcje tych białek podczas cyklu komórkowego. Dlatego opracowaliśmy tutaj metody barwienia IIF i ilościowy test IIF w celu specyficznej analizy względnych poziomów endogennych i egzogennych biał...

"Centromery" zostały klasycznie zdefiniowane jako regiony stłumionej rekombinacji mejotycznej w genetyce, a później uznane za główne zwężenie chromosomów mitotycznych, co odgrywa istotną rolę w dokładnej segregacji chromosomów podczas mitozy. "Kinetochory" zostały opisane jako wielowarstwowe struktury, które wiążą się z mikrotubulami na powierzchni centromerów, jak ujawniła mikroskopia elektronowa; "kinetochory" zostały później zdefiniowane jako kompleks makromolekularny, który lokalizuje się w centromerze chromosomów mitotycznych. Pomimo dramatycznej rozbieżności w centromerowych sekwencjach DNA u kręgowców, struktura i skład kinetochoru są wysoce konserwatywne. Dynamiczna interakcja między mikrotubulami wrzeciona a kinetochorem jest wymagana do wiernej segregacji chromosomów podczas mitozy, a defekty funkcji centromeru-kinetochoru prowadzą do aneuploidii, a tym samym raka.
Centromer u większości eukariontów nie ma zdefiniowanej sekwencji DNA, ale składa się z dużych tablic (0,3-5 Mb) powtarzalnego alfoidalnego DNA składającego się z 171-bp α-satelitarnego DNA. Z wyjątkiem drożdży pączkujących, tożsamość centromerów osiąga się nie przez sekwencję DNA, ale przez obecność specjalnego nukleosomu, który zawiera wariant histonu H3 CenH3 (białko CENtromeru A [CENP-A] u ludzi). 5 Nukleosomów CENP-A lokalizuje się w wewnętrznej płytce kinetochorówssaków 7 i wiąże się z 171-pz α-satelitarnym DNA. Aktywne centromery wymagają nukleosomów zawierających CENP-A do kierowania rekrutacją konstytutywnej sieci związanej z centromerem (CCAN) i białek kinetochoru, które razem regulują przyłączanie chromosomów do wrzeciona mitotycznego i późniejszą progresję cyklu przez punkt kontrolny wrzeciona.
W świetle powyższych dowodów, CENP-A został zaproponowany jako epigenetyczny znak centromeru8; jednak proces, w którym CENP-A jest włączany do centromerowego DNA i czynniki odpowiedzialne za tę inkorporację nie zostały jeszcze dobrze scharakteryzowane. Krótka domena ukierunkowana na centromery (CATD) znajduje się w regionie fałdu histonowego CENP-A, a zastąpienie odpowiedniego regionu H3 CATD jest wystarczające do skierowania H3 do centromeru. 9 Kilka badań sugerowało funkcjonalne role modyfikacji potranslacyjnej (PTM) CENP-A12-16; jednak mechanizmy molekularne tych PTM CENP-A w rekrutacji do centromerów nie zostały jeszcze wyjaśnione. Wcześniej informowaliśmy, że aktywność ligazy E3 CUL4A-RBX1-COPS8 jest wymagana do ubikwitylacji CENP-A K124 i lokalizacji CENP-A do centromerów. 17
Odkrycie i charakterystyka białek kinetochoru doprowadziły do nowego wglądu w segregację chromosomów. 18 Za pomocą różnych metod zidentyfikowano ponad 100 składników kinetochoru w komórkach kręgowców. 19,20 Zrozumienie, w jaki sposób kinetochory składają się i funkcjonują, wynika również z charakterystyki funkcji komórkowych każdego białka centromer-kinetochoru i sieci białko-białko w komórkach. 19 Bezpośrednia wizualizacja i zaawansowane metody obrazowania w mikroskopii fluorescencyjnej zapewniają niezwykłą rozdzielczość składowych centromeru-kinetochoru i umożliwiają bezpośrednią obserwację określonych składników molekularnych centromerów i kinetochorów. Ponadto kluczowe znaczenie dla tych obserwacji mają metody pośredniego barwienia immunofluorescencyjnego (IIF) przy użyciu swoistych przeciwciał. Jednak pomimo licznych doniesień na temat protokołów IIF, niewiele z nich szczegółowo omawiało problemy specyficznych białek centromer-kinetochoru. 1-4 Dlatego niezwykle ważne jest opracowanie i raportowanie metod barwienia IIF oraz ilościowego testu IIF w celu specyficznej analizy każdego białka centromeru-kinetochoru. W barwieniu IIF należy postępować zgodnie z protokołem barwienia, aby uniknąć utraty interesującego białka lub reszty komórki. Jednak fiksacja czasami niszczy miejsca antygenowe, a różne kombinacje przeciwciało-antygen działają słabo z jednym utrwalaczem, ale bardzo dobrze z innym,21 a wybór utrwalacza zależy w dużej mierze od białka (białek) będących przedmiotem zainteresowania. Dlatego różne metody utrwalania mają kluczowe znaczenie w barwieniu IIF białek centromeru-kinetochoru.
Tutaj zoptymalizowano metody pośredniego barwienia immunofluorescencyjnego (IIF) oraz test do lokalizacji endogennych białek centromerowo-kinetochorowych, w tym CENP-A i egzogennych białek CENP-A znakowanych flagą, oraz opracowano ilościowe określanie tych białek w komórkach ludzkich. Metody te mogą być stosowane do analizy białek centromeru-kinetochoru u innych gatunków.

<table><tbody><tr><td>Lipofectamin 2000</td><td>Life Technologies/Invitrogen</td><td>11668</td><td>odczynnik do transfekcji I</td></tr><tr><td>Lipofektamin RNAiMAX</td><td>Life Technologies/Invitrogen</td><td>13778</td><td>odczynnik do transfekcji II</td></tr><tr><td>Opti-MEM I</td><td>Life Technologies/Invitrogen</td><td>31985</td><td>Zredukowane podłoże surowicy, ciepłe w 37 stopniach; C kąpiel wodna przed użyciem</td></tr><tr><td>DMEM o wysokiej zawartości glukozy (Dulbecco' s zmodyfikowany Orzeł" s medium)</td><td>Life Technologies/BioWhittaker</td><td>12-604</td><td>DMEM o wysokiej zawartości glukozy, ciepły w 37 stopniach; C Kąpiel wodna przed użyciem</td></tr><tr><td>Płodowa surowica bydlęca, certyfikowana, inaktywowana termicznie, pochodzenie z USA</td><td>Life Technologies/Gibco</td><td>10082</td><td>FBS (płodowa surowica bydlęca)</td></tr><tr><td>Poli-L-lizyna ROZTWÓR</td><td>SIGMA-SLDRICH</td><td>P 8920</td><td>Poli-L-lizyna, 0,1% w/v, w wodzie</td></tr><tr><td>UltraPure Distilled Water</td><td>Life Technologies/Invitrogen/Gibco</td><td>10977</td><td>Sterylna woda klasy do hodowli tkankowych&nbsp;</td></tr><tr><td>Szkło z mikro pokrywą (22 mm x 22 mm)&nbsp;</td><td>Surgipath</td><td>105</td><td>Szkło nakrywkowe (22 mm x 22 mm)&nbsp;</td></tr><tr><td>6-dołkowy klaster do hodowli komórkowych</td><td>Fisher/Corning Incorporated</td><td>07-200-83</td><td>6-dołkowa płyta polistyrenowa&nbsp;</td></tr><tr><td>Penicylina, Streptomycyna; Liquid</td><td>Fisher/Gibco</td><td>15-140</td><td>Penicylina-streptomycyna</td></tr><tr><td>PAP PEN&nbsp;</td><td>Miejsce wiązania</td><td>AD100.1</td><td>Hydrofobowy długopis barierowy (do hydrofobowej bariery w barwieniu immunofluorescencyjnym)</td></tr><tr><td>Paklitaksel (Taxol)</td><td>SIGMA-SLDRICH</td><td>T7402</td><td>Taxol do analizy komórek mitotycznych</td></tr><tr><td>TN-16, inhibitor mikrotubul (TN16)</td><td>Enzo Life Sciences</td><td>BML-T120</td><td>TN16 do analizy komórek mitotycznych</td></tr><tr><td>BSA (albumina surowicy bydlęcej)</td><td>SIGMA-SLDRICH</td><td>A7906</td><td>Odczynnik blokujący</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>SIGMA-SLDRICH</td><td>T8787</td><td>Detergent do przepuszczalności</td></tr><tr><td>Paraformaldehyd</td><td>SIGMA-SLDRICH</td><td>P6148</td><td>Reagant utrwalający</td></tr><tr><td>DAPI</td><td>SIGMA-SLDRICH</td><td>D9542</td><td>Do barwienia jądrowego</td></tr><tr><td>p-fenylenodiaminy</td><td>SIGMA-SLDRICH</td><td>P6001</td><td>Do montażu medium</td></tr><tr><td>Mikroprowadnice VWR, matowe</td><td>VWR International</td><td>48312-013</td><td>Mikroprowadnice&nbsp;</td></tr><tr><td>Przeciwciało anty-CENP-A</td><td>Stressgen/Enzo Life Sciences</td><td>KAM-CC006</td><td>Mysie przeciwciało monoklonalne; stosunek rozcieńczenia 1:100 (IIF), 1:5000 (WB)</td></tr><tr><td>Przeciwciało anty-CENP-B</td><td>Novus Biologicals</td><td>H00001059-B01P</td><td>Mysie przeciwciało monoklonalne; stosunek rozcieńczenia 1:200 (IIF, wiązanie metanol/aceton)-1:400 (IIF, wiązanie paraformaldehydu)Przeciwciało</td></tr> <tr><td>anty-CENP-B&nbsp;</td><td>abcam</td><td>ab25734</td><td>Przeciwciało poliklonalne królika; stosunek rozcieńczenia 1:200 (IIF, wiązanie metanol/aceton)-1:400 (IIF, wiązanie paraformaldehydu)Przeciwciało</td></tr> <tr><td>anty-centromerowe (ACA)</td><td>Fitzgerald Industries International, Inc.</td><td>90C-CS1058</td><td>Ludzka surowica centromerowa; stosunek rozcieńczenia 1:2000 (IIF)</td></tr><tr><td>Przeciwciało anty-CENP-H</td><td>Bethyl Laboratories</td><td>BL1112 (A400-007A)</td><td>Przeciwciało poliklonalne królika; stosunek rozcieńczenia 1:200 (IIF)</td></tr><tr><td>Przeciwciało anty-CENP-H</td><td>BD</td><td>612142</td><td>Mysie przeciwciało monoklonalne; stosunek rozcieńczenia 1:200 (IIF)</td></tr><tr><td>Przeciwciało anty-CENP-I</td><td>N/A, Dr. Katusmi Kitagawa N/A, Dr. Katusmi Kitagawa</td><td></td><td>Przeciwciało poliklonalne królika; stosunek rozcieńczenia 1:1000 (IIF); Niikura i in., Onkogen, 4133-4146 (2006)</td></tr><tr><td>Przeciwciało anty-KNL1</td><td>Novus Biologicals</td><td>NBP1-89223</td><td>Przeciwciało poliklonalne królika; stosunek rozcieńczenia 1:100 (IIF)Przeciwciało</td></tr> <tr><td>anty-Hec1</td><td>Novus Biologicals / GeneTex</td><td>NB 100-338 / GTX70268</td><td>Mysie przeciwciało monoklonalne; stosunek rozcieńczenia 1:100 (IIF)</td></tr><tr><td>Przeciwciało anty-Hec1</td><td>GeneTex</td><td>GTX110735</td><td>Przeciwciało poliklonalne królika; stosunek rozcieńczenia 1:100 (IIF)</td></tr><tr><td>Przeciwciało anty-Ska1</td><td>abcam</td><td>ab46826</td><td>Przeciwciało poliklonalne królika; stosunek rozcieńczenia 1:100 (IIF)</td></tr><tr><td>Przeciwciało Anti-Flag</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>F3165</td><td>Mysie przeciwciało monoklonalne; stosunek rozcieńczenia 1:1000 (IIF), 1:5000 (WB)</td></tr><tr><td>Przeciwciało Anti-Flag</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>F7425</td><td>Przeciwciało poliklonalne królika; stosunek rozcieńczenia 1:1000 (IIF), 1:5000 (WB)</td></tr><tr><td>Anty-CUL4A przeciwciało</td><td>N/A, Dr. Pradip Raychaudhuri</td><td>N/A, Dr. Pradip Raychaudhuri</td><td>Przeciwciało poliklonalne królika; stosunek rozcieńczenia 1:3000 (WB); Shiyanov i wsp., Dziennik chemii biologicznej, 35309-35312 (1999)</td></tr><tr><td>Przeciwciało anty-RBX1</td><td>Sygnalizacja komórkowa</td><td>4397</td><td>Przeciwciało poliklonalne królika; stosunek rozcieńczenia 1:2000 (WB)</td></tr><tr><td>Przeciwciało anty-GAPDH</td><td>Chemicon</td><td>MAB374</td><td>Mysie przeciwciało monoklonalne; stosunek rozcieńczenia 1:5000 (WB)</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 Goat Anti-Mouse</td><td>IgG Life Technologies/Invitrogen</td><td>A11001</td><td>przeciwciało drugorzędowe sprzężone z fluoroforem (przeciwciało drugorzędowe oczyszczone z powinowactwa)</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 594 Goat Anti-Mouse IgG</td><td>Life Technologies/Invitrogen</td><td>A11005</td> przeciwciało <td>drugorzędowe sprzężone z fluoroforem (przeciwciało drugorzędowe oczyszczone z powinowactwa)</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 Goat Anti-Rabbit IgG</td><td>Life Technologies/Invitrogen</td><td>A11008</td> przeciwciało <td>drugorzędowe sprzężone z fluoroforem (przeciwciało drugorzędowe oczyszczone z powinowactwa)</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 594 Kozia Anty-Królicza IgG</td><td>Life Technologies/Invitrogen</td><td>A11012</td> przeciwciało <td>drugorzędowe sprzężone z fluoroforem (przeciwciało drugorzędowe oczyszczone z powinowactwa)</td></tr><tr><td>Beztłuszczowe mleko w proszku (zatwierdzony zamiennik mleka w proszku z goździka)</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC9255871 (nr zamówienia 190915; Lot# 90629)</td><td>Odtłuszczone mleko</td></tr><tr><td>Leica DM IRE2 zmotoryzowany mikroskop fluorescencyjny&nbsp;</td><td>Zmotoryzowany mikroskop fluorescencyjny</td> <td>Leica</td><td></td>&nbsp;</tr><tr><td>Obiektyw olejowy HCX PL APO 63x</td><td>Leica</td><td>LEICA HCX PL APO NA 1.40 OIL PH 3 CS</td><td>63X Soczewka zanurzeniowa</td></tr><tr><td>olejowa HCX PL APO 100x Obiektyw immersyjny Leica</td><td></td><td>LEICA HCX PL APO NA 1.40 OIL PHE</td><td>100X Obiektyw olejowy</td></tr><tr><td>Leica EL6000 Kompaktowe źródło światła</td><td>Leica</td><td></td><td>Zewnętrzne kompaktowe źródło światła do wzbudzenia fluorescencyjnego</td></tr><tr><td>Cyfrowa kamera CCD ORCA-R2&nbsp;</td><td>Cyfrowa kamera CCD</td> <td>Hamamatsu</td><td>C10600-10B</td>&nbsp;</tr><tr><td>Openlab wersja 5.5.2 Oprogramowanie do obrazowania naukowego&nbsp;</td><td>Perkin Elmer/Improvision</td><td></td><td>Do obserwacji, akwizycji, kwantyfikacji i analizy obrazu</td></tr><tr><td>Velocity wersja 6.1.1 Oprogramowanie do analizy obrazów 3D&nbsp;</td><td>Perkin Elmer/Improvision</td><td></td><td>Do obserwacji, akwizycji, kwantyfikacji i analizy obrazu</td></tr><tr><td>Kompletny koktajl inhibitorów proteaz bez EDTA</td><td>Roche</td><td>11873580001/11836170001</td><td>Inhibitor proteazy w tabletkach koktajlowych</td></tr><tr><td>PlusOne 2-D Quant Kit</td><td>Amersham Biosciences</td><td>80-6483-56</td><td>Komercyjny odczynnik do oznaczania białek I do pomiaru stężenia białka (kompatybilny z 2% SDS)</td></tr><tr><td>Bio-Rad Protein Assay</td><td>Bio-Rad</td><td>500-0006</td><td>Komercyjny odczynnik do oznaczania białek II do pomiaru stężenia białka (zgodny z 0,1% SDS)</td></tr><tr><td>Immobilon-FL</td><td>EMD Membrana miliporowa</td><td>IPFL00010</td><td>PVDF do przenoszenia</td></tr><tr><td>IRDye 800CW Goat Anti-Mouse IgG</td><td>LI-COR Biosciences</td><td>926-32210</td><td>IR fluorescencyjne przeciwciało drugorzędowe sprzężone z barwnikiem (przeciwciało drugorzędowe oczyszczone z powinowactwa); współczynnik rozcieńczenia 1:20000 (IIF)</td></tr><tr><td>IRDye 680 Kozia IgG ANTY-KRÓLICZA</td><td>LI-COR Biosciences</td><td>926-32221</td><td>IR fluorescencyjne przeciwciało drugorzędowe sprzężone z barwnikiem (przeciwciało drugorzędowe oczyszczone z powinowactwa); stosunek rozcieńczenia 1:20000 (IIF)</td></tr><tr><td>Kozioł anty-mysi IgG DyLight 549</td><td>Fisher Scientific</td><td>PI35507</td><td>DyLight Przeciwciało drugorzędowe sprzężone z barwnikiem IR fluorescencyjne przeciwciało drugorzędowe sprzężone z barwnikiem (przeciwciało drugorzędowe oczyszczone z powinowactwa); stosunek rozcieńczenia 1:20000 Panie przewodniczący, panie i panowie!</td></tr><tr><td>Kozia anty-królik DyLight 649</td><td>Fisher Scientific</td><td>PI35565</td><td>DyLight Przeciwciało drugorzędowe sprzężone z barwnikiem DyLightPrzeciwciało drugorzędowe sprzężone z barwnikiem fluorescencyjnym IR (przeciwciało drugorzędowe oczyszczone z powinowactwa); stosunek rozcieńczenia 1:20000 (IIF)</td></tr><tr><td>Kozioł anty-mysie IgG-HRP</td><td>Santa Cruz</td><td>SC-2005</td><td>Przeciwciało drugorzędowe sprzężone z HRPPrzeciwciało drugorzędowe sprzężone z DyLightPrzeciwciało drugorzędowe sprzężone z barwnikiem IR (powinowactwo oczyszczone wtórnie przeciwciało); stosunek rozcieńczenia 1:10000 (IIF)</td></tr><tr><td>Kozioł anty-króliczy IgG-HRP</td><td>Santa Cruz</td><td>SC-2004</td><td>Przeciwciało drugorzędowe sprzężone z HRPPprzeciwciało drugorzędowe sprzężone z barwnikiem DyLightPrzeciwciało drugorzędowe sprzężone z barwnikiem IR (przeciwciało drugorzędowe oczyszczone z powinowactwa); stosunek rozcieńczenia 1:10000 (IIF)</td></tr><tr><td>Openlab wersja 5.5.2. Oprogramowanie do obrazowania naukowego&nbsp;</td><td>Improvision/PerkinElmer</td><td></td><td>Software A</td></tr><tr><td>Volocity wersja 6.3 Oprogramowanie do analizy obrazu 3D (akwizycja Volocity)</td><td>PerkinElmer</td><td></td><td>Software B1</td></tr><tr><td>Volocity wersja 6.3 Oprogramowanie do analizy obrazu 3D (kwantyfikacja objętości)</td><td>PerkinElmer</td><td></td><td>Software B2</td></tr><tr><td>Branson SONIFIER 450</td><td></td><td></td><td>Sonicator</td></tr><tr><td>Branson Ultrasonics Sonicator Microtip Step, Solidny, Gwint 9,5 mm</td><td>VWR Scientific Products Inc.</td><td>&nbsp; 33995-325</td><td>Klakson zakłócający do sonikacji</td></tr><tr><td>Branson Ultrasonics sonikator Mikrokońcówka stożkowa 6,5 mm</td><td>VWR Scientific Products Inc.</td><td>&nbsp; 33996-185</td><td>Mikrokońcówka do sonikacji</td></tr><tr><td>Odyssey CLx System obrazowania w podczerwieni&nbsp;</td><td>LI-COR Biosciences</td><td></td><td>System obrazowania w podczerwieni do wykrywania plam immunologicznych</td></tr><tr><td>Oprogramowanie do analizy Image Studio Ver 4.0&nbsp;</td><td>Oprogramowanie LI-COR Biosciences</td><td></td><td>C</td></tr><tr><td>Obrazowanie molekularne System Versadoc MP4000&nbsp;</td><td>Obrazowanie chemiluminescencyjne</td> <td>Bio-Rad</td><td></td> do wykrywania immunoblot</tr><tr><td>Ilość Jedno oprogramowanie do analizy 1D&nbsp;</td><td>Bio-Rad</td><td></td><td>Software D</td></tr><tr><td>SuperSignal West Femto Maximum Sensitivity Substrate</td><td>Thermo</td><td>34095</td><td>Ultraczułe wzmocnione podłoże chemiluminescencyjne (ECL)</td></tr></tbody></table>

analiza immunofluorescencyjna endogennych i egzogennych białek centromerowo-kinetochorowych

 Immunofluorescence Analysis of Endogenous and Exogenous Centromere-kinetochore Proteins

"Centromery" i "kinetochory" odnoszą się do miejsca, w którym chromosomy łączą się z wrzecionem podczas podziału komórki. Bezpośrednia wizualizacja białek centromer-kinetochoru podczas cyklu komórkowego pozostaje podstawowym narzędziem w badaniu mechanizmów działania tych białek. Zaawansowane metody obrazowania w mikroskopii fluorescencyjnej zapewniają niezwykłą rozdzielczość składowych centromer-kinetochor i umożliwiają bezpośrednią obserwację określonych składników molekularnych centromerów i kinetochorów. Ponadto kluczowe znaczenie dla tych obserwacji mają metody pośredniego barwienia immunofluorescencyjnego (IIF) przy użyciu swoistych przeciwciał. Jednak pomimo licznych doniesień na temat protokołów IIF, niewiele z nich szczegółowo omawiało problemy specyficznych białek centromer-kinetochoru. 1-4 W tym miejscu przedstawiamy zoptymalizowane protokoły barwienia endogennych białek centromer-kinetochoru w komórkach ludzkich za pomocą wiązania paraformaldehydu i barwienia IIF. Ponadto opisujemy protokoły wykrywania egzogennych białek CENP-A znakowanych flagą w komórkach ludzkich poddanych utrwalaniu acetonem lub metanolem. Metody te są przydatne w wykrywaniu i ilościowym określaniu endogennych białek centromer-kinetochoru i białek CENP-A znakowanych flagą, w tym białek w komórkach ludzkich.

Analiza immunofluorescencyjna endogennego CENP-A potwierdza hipotezę, że ligaza E3 CUL4A jest niezbędna do lokalizacji CENP-A w centromerach 
Nasze niedawne badania wykazały, że aktywność ligazy E3 CUL4A-RBX1-COPS8 jest wymagana do ubikwitynacji lizyny 124 (K124) w CENP-A oraz lokalizacji CENP-A w centromerach.17 Początkowo kompleks centromeru w interfazie (ICEN) został wyizolowany za pomocą natywnej immunoprecypitacji chromatyny z przeciwciałami anty-CENP-A...

Tutaj opisujemy protokoły wykrywania endogennych i egzogennych białek centromer-kinetochoru w komórkach ludzkich i ilościowego określania tych poziomów białek w centromerach-kinetochorach poprzez pośrednie barwienie immunofluorescencyjne za pomocą utrwalania (utrwalanie paraformaldehydu, acetonu lub metanolu).

Analiza immunofluorescencyjna endogennych i egzogennych białek centromerowo-kinetochorowych

"Centromeres" and "kinetochores" refer to the site where chromosomes associate with the spindle during cell division. Direct visualization of ...

Ogólnym celem tego pośredniego testu immunofluorescencyjnego jest optymalizacja lokalizacji i kwantyfikacji endogennych i egzogennych białek centromerowo-kinetochorowych, w tym białka centromerycznego A oraz egzogennych białek CENP-A z tagiem flag, w komórkach ludzkich. Metoda ta może pomóc w odpowiedzi na kluczowe pytania dotyczące sposobów identyfikacji i kwantyfikacji białek centromerowo-kinetochorowych. Główną zaletą tej techniki jest możliwość kwantyfikacji różnych poziomów ekspresji białek centromerowo-kinetochorowych w zależności od wybranej fazy anafazy.18 godzin po wysianiu, wypłucz hodowlane komórki jeden raz za pomocą PBS i dodaj 500 µL medium z obniżoną zawartością surowicy do każdej studni sześciostudzienkowej polistyrenowej płytki hodowlanej. Następnie przeprowadź transfekcję komórek w każdej studni za pomocą świeżo przygotowanego roztworu mieszaniny A i B i inkubuj hodowle w temperaturze 37 °C i 5% CO2. Po czterech i pół godzinach wymień medium na DMEM z wysoką zawartością glukozy uzupełniony o FBS i antybiotyki, a następnie umieść płytkę z powrotem w inkubatorze do hodowli komórkowych.Po 48 do 72 godzin odaspirować pożywkę hodowlaną i jednokrotnie wypłukać komórki roztworem PBS, dodając sól fizjologiczną po ściankach studzienek hodowlanych, aby uniknąć naruszenia warstwy komórek. Następnie utrwalić komórki w 4% paraformaldehydzie przez 30 minut w temperaturze 4 stopni Celsjusza. Po zakończeniu utrwalania dwukrotnie wypłukać komórki buforem Kb2, a następnie przeprowadzić permeabilizację próbek w buforze Kb1 przez 30 minut w temperaturze pokojowej.Następnie wypłucz komórki raz buforem Kb2 i zablokuj wiązania niespecyficzne, dodając świeży bufor Kb2. Po pięciu minutach w temperaturze pokojowej wyjmij pęsetą posiane szkiełka nakrywkowe z każdego z dołków, a następnie za pomocą hydrofobowego pisaka narysuj bariery hydrofobowe wokół każdej próbki na szkiełku. Przenieś szkiełka nakrywkowe do nowej polistyrenowej płytki sześciodołkowej i zanurz próbki w odpowiednim przeciwciele pierwszorzędowym na jedną godzinę w temperaturze 37 °C.Następnie komórki należy wypłukać trzykrotnie buforem Kb2 i znakować odpowiednim przeciwciałem wtórnym przez kolejną godzinę w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Po zakończeniu inkubacji próbki należy wypłukać w buforze Kb2, wykonując pięć 6-minutowych przemyć. Następnie jądra komórkowe należy znakować buforem Kb3 zawierającym DapE przez pięć minut w temperaturze pokojowej, po czym przeprowadzić od jednego do dwóch przemyć w buforze Kb2 i ponownie napełnić studzienki buforem Kb2.Następnie nanieś kroplę medium montażowego na środek każdego szkiełka przedmiotowego przeznaczonego dla poszczególnych szkiełek zakrywkowych z komórkami i usuń nadmiar cieczy z próbek komórek. Na koniec ostrożnie umieść każdą próbkę na środku jednego z przygotowanych szkiełek przedmiotowych i usuń nadmiar medium montażowego za pomocą ręcznika papierowego. Jak zaobserwowano w tym reprezentatywnym eksperymencie, poziomy endogennej ekspresji białka CENP-A w całkowitych lizatach komórkowych komórek transfekowanych siRNA przeciwko CUL4A były podobne do poziomów ekspresji CENP-A w komórkach transfekowanych siRNA przeciwko lucyferazie.Ponadto poziomy białka endogennego CENP-A w całkowitych lizatach komórkowych komórek przetransfekowanych siRNA przeciwko RBX1 były podobne do poziomów endogennego CENP-A w komórkach przetransfekowanych siRNA przeciwko Lucyferazie, co sugeruje, że ligaza E3 CUL4A RBX1 jest niezbędna do lokalizacji CENP-A w centromerach. Mutanty lizyny CENP-A tracą zdolność do lokalizacji w obrębie centromerów, co wskazuje, że ubikwitynacja CENP-A K124 jest kluczowa dla lokalizacji CENP-A w centromerach. Co istotne, egzogenna fuzja białka CENP-A z monoubikwityną przywróciła lokalizację mutanta delokalizowanego CENP-A K124R, przywracając białko do jego centromerycznego położenia.Po opanowaniu techniki, procedury fiksacji komórek i barwienia immunofluoroscencyjnego można przeprowadzić w ciągu pięciu do sześciu godzin, jeśli są one wykonywane prawidłowo. Należy pamiętać, aby wszystkie roztwory delikatnie nanosić na ścianki studzienek, tak aby komórki nie odkleiły się od szkiełek podstawowych podczas płukania lub zanurzania próbek. Należy pamiętać, że praca z podgrzanym paraformaldehydem poza pomieszczeniem wentylowanym oraz przebywanie z materiałami łatwopalnymi w pobliżu ognia mogą być niezwykle niebezpieczne, dlatego podczas wykonywania tej procedury należy zawsze przestrzegać odpowiednich środków ostrożności.

immunofluorescence-analysis-endogenous-exogenous-centromere

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Tutaj opisujemy protokół jednoczesnego wykrywania modyfikacji histonów przez immunofluorescencję i sekwencje DNA przez DNA FISH, a następnie mikroskopię 3D i analizy (3D immuno-DNA FISH).

Połączona immunofluorescencja i DNA FISH na zakonserwowanych w 3D jądrach interfazowych w celu zbadania zmian w organizacji jądrowej 3D

Obrazowanie białek centrosomalnych podczas spermatogenezy Drosophila jest skuteczną metodą identyfikacji nowych białek krytycznych dla biologii centrosomów, a także wyjaśnienia szczególnej funkcji znanych graczy w tym procesie.

Obrazowanie centrosomów w jądrach much

Tutaj opracowano nowatorski ilościowy test fluorescencyjny do pomiaru zmian poziomu białka szczególnie w centrosomach poprzez normalizację intensywności fluorescencji tego białka do odpowiedniego wzorca wewnętrznego.

Ilościowy test immunofluorescencyjny do pomiaru zmienności poziomów białek w centrosomach

Kinaza zależna od cykliny 1 (Cdk1) jest aktywowana w fazie G2 cyklu komórkowego i reguluje wiele szlaków komórkowych. W tym miejscu przedstawiamy protokół testu kinazy in vitro z Cdk1, który umożliwia identyfikację miejsc fosforylacji specyficznych dla Cdk1 w celu ustalenia celów komórkowych tej ważnej kinazy.

Identyfikacja miejsc fosforylacji specyficznych dla kinazy 1 zależnej od cykliny za pomocą testu kinazy in vitro

Opracowaliśmy strategię oczyszczania i obrazowania dużej liczby centrioli w różnych orientacjach, które można poddać mikroskopii superrozdzielczej i uśrednianiu pojedynczych cząstek.

Izolacja i obrazowanie fluorescencyjne do rekonstrukcji pojedynczych cząstek Chlamydomonas Centrioles

Ubikwitylacja CENP-A jest ważnym wymogiem dla depozycji CENP-A w centromerze, dziedziczonym przez dimeryzację między podziałami komórkowymi i nieodzownym dla żywotności komórki. Tutaj opisujemy analizę spektrometrii mas w celu identyfikacji ubikwitylacji białka CENP-A (EYFP-CENP-A) znakowanego EYFP.

Analiza spektrometrii mas w celu identyfikacji ubikwitylacji CENP-A znakowanego EYFP (EYFP-CENP-A)

Po uszkodzeniu DNA, ludzkie komórki aktywują niezbędne szlaki naprawcze, aby przywrócić integralność swojego genomu. W tym miejscu opisujemy metodę immunofluorescencji pośredniej jako sposób na wykrycie białek naprawy DNA, analizę ich przestrzennej i czasowej rekrutacji oraz pomoc w badaniu interakcji białko-białko w miejscach uszkodzenia DNA.

Wizualizacja oddziaływania białek naprawy DNA za pomocą immunofluorescencji

Prezentowany tutaj jest protokół do obrazowania żywych komórek w nienaruszonej tkance w superrozdzielczości. Ustandaryzowaliśmy warunki obrazowania bardzo wrażliwej populacji dorosłych komórek macierzystych w ich natywnym środowisku tkankowym. Technika ta polega na zrównoważeniu rozdzielczości czasowej i przestrzennej, aby umożliwić bezpośrednią obserwację zjawisk biologicznych w żywej tkance.

Obrazowanie żywych komórek w superrozdzielczości struktur subkomórkowych

Błąd w segregacji chromosomów jest powszechną cechą oocytów. Dlatego badanie punktu kontrolnego montażu wrzeciona daje ważne wskazówki na temat mechanizmów potrzebnych do produkcji zdrowych jaj. Niniejszy protokół opisuje trzy uzupełniające się testy do oceny integralności punktu kontrolnego montażu wrzeciona w oocytach myszy.

Ocena integralności punktu kontrolnego zespołu wrzeciona w oocytach myszy

Mikroskopia poklatkowa jest cennym narzędziem do badania mejozy u pączkujących drożdży. Protokół ten opisuje metodę, która łączy synchronizację cyklu komórkowego, mikroskopię poklatkową i warunkowe wyczerpanie białka docelowego, aby zademonstrować, jak badać funkcję określonego białka podczas segregacji chromosomów mejotycznych.

Zastosowanie mikroskopii poklatkowej i specyficznego dla etapu zubożenia komórek białek do badania mejozy u S. cerevisiae

Ruch chromosomów podczas profazy mejotycznej to słabo poznane zjawisko, które jest fundamentalne dla powstawania zarodników. Protokół ten opisuje metodę pozyskiwania, analizy i ilościowego określania ruchów centromerów podczas profazy mejotycznej w męskich meiocytach Arabidopsis thaliana .

Charakterystyka obrazowania na żywo ruchów centromerów podczas męskiej profazy mejotycznej u Arabidopsis thaliana

Poznaj technikę immunofluorescencyjną do lokalizacji i ilościowego oznaczania endogennych oraz egzogennych białek centromer-kinetochoru w ludzkich komórkach. Metoda umożliwia badanie dynamiki białek podczas podziału komórkowego.

Analiza immunofluorescencyjna endogennych i egzogennych białek centromerowo-kinetochorowych

Przeglądaj więcej filmów