Analiza immunofluorescencyjna endogennych i egzogennych białek centromer-kinetochoru

Ogólnym celem tego pośredniego testu immunoflorescencyjnego jest optymalizacja lokalizacji i kwantyfikacji endogennych i egzogennych białek centromer-kinetochoru, w tym białka centromerowego A i znakowanych flagą egzogennych białek CENP-A w komórkach ludzkich. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania dotyczące identyfikacji i ilościowego oznaczania białek centromer-kinetochoru. Główną zaletą tej techniki jest to, że można ją stosować do porównywania różnych poziomów ekspresji centromeru-kinetochoru w zależności od wybranej anafazy, która jest przedmiotem zainteresowania.

18 godzin po wysianiu przemyć wyhodowane komórki jednorazowo PBS i dodać 500 mikrolitrów zredukowanej pożywki surowicy do każdego dołka z sześciodołkowej płytki hodowlanej polistyrenu. Następnie przetransfekuj komórki w każdym dołku świeżo przygotowanym roztworem mieszaniny A i B i inkubuj kultury w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla. Po czterech i pół godzinie zmień DMEM o wysokiej zawartości glukozy na wysoki uzupełniony FBS i antybiotykami i włóż płytkę z powrotem do inkubatora do hodowli komórkowych.