Analiza immunofluorescencyjna endogennych i egzogennych białek centromer-kinetochoru
3 marca 2016
Tutaj opisujemy protokoły wykrywania endogennych i egzogennych białek centromer-kinetochoru w komórkach ludzkich i ilościowego określania tych poziomów białek w centromerach-kinetochorach poprzez pośrednie barwienie immunofluorescencyjne za pomocą utrwalania (utrwalanie paraformaldehydu, acetonu lub metanolu).
Ogólnym celem tego pośredniego testu immunoflorescencyjnego jest optymalizacja lokalizacji i kwantyfikacji endogennych i egzogennych białek centromer-kinetochoru, w tym białka centromerowego A i znakowanych flagą egzogennych białek CENP-A w komórkach ludzkich. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania dotyczące identyfikacji i ilościowego oznaczania białek centromer-kinetochoru. Główną zaletą tej techniki jest to, że można ją stosować do porównywania różnych poziomów ekspresji centromeru-kinetochoru w zależności od wybranej anafazy, która jest przedmiotem zainteresowania.
18 godzin po wysianiu przemyć wyhodowane komórki jednorazowo PBS i dodać 500 mikrolitrów zredukowanej pożywki surowicy do każdego dołka z sześciodołkowej płytki hodowlanej polistyrenu. Następnie przetransfekuj komórki w każdym dołku świeżo przygotowanym roztworem mieszaniny A i B i inkubuj kultury w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla. Po czterech i pół godzinie zmień DMEM o wysokiej zawartości glukozy na wysoki uzupełniony FBS i antybiotykami i włóż płytkę z powrotem do inkubatora do hodowli komórkowych.
48 do 72 godzin później odessać pożywkę do hodowli komórkowej i przepłukać komórki jeden raz PBS, dodając sól fizjologiczną po bokach dołków hodowlanych, aby uniknąć naruszania komórek. Następnie utrwal komórki 4% paraformaldehydem przez 30 minut w temperaturze 4 stopni Celsjusza. Pod koniec okresu utrwalania przepłukać komórki dwukrotnie buforem Kb2 i przepuszczać próbki w buforze Kb1 przez 30 minut w temperaturze pokojowej.
Następnie przepłucz komórki jeden raz buforem Kb2 i zablokuj wszelkie niespecyficzne wiązania poprzez dodanie świeżego buforu Kb2. Po pięciu minutach w temperaturze pokojowej użyj kleszczy, aby usunąć zasiane szkła nakrywkowe z każdej ze studzienek i użyj hydrofobowego pisaka barierowego, aby narysować hydrofobowe bariery wokół każdej próbki szkła nakrywkowego. Przenieść szkła nakrywkowe na nową sześciodołkową płytkę polistyrenową i zanurzyć próbki w odpowiednim przeciwciałie pierwszorzędowym na jedną godzinę w temperaturze 37 stopni Celsjusza.
Następnie przepłukać komórki trzykrotnie buforem Kb2 i oznaczyć je odpowiednim przeciwciałem drugorzędowym przez kolejną godzinę w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Pod koniec inkubacji przepłukać próbki pięcioma 6-minutowymi płukaniami w buforze Kb2. Następnie oznacz jądra komórkowe buforem Kb3 zawierającym DapE przez pięć minut w temperaturze pokojowej, a następnie jednym do dwóch płukań w buforze Kb2 i ponownie napełnij studzienki buforem Kb2.
Teraz umieść kroplę podłoża montażowego na środku jednego szkiełka mikroskopowego dla każdej szklanki nakrywkowej komórek i usuń płyn z próbek komórek. Na koniec ostrożnie umieść każdą próbkę na środku jednego z przygotowanych szkiełek mikroskopowych i usuń nadmiar podłoża montażowego ręcznikiem papierowym. Jak zaobserwowano w tym reprezentatywnym eksperymencie, poziomy endogennej ekspresji białka CENP-A w całkowitych lizatach komórkowych komórek transfekowanych siRNA CUL4A były podobne do poziomów ekspresji CENP-A w komórkach transfekowanych lucyferazy siRNA.
Co więcej, poziomy białka endogennego CENP-A w całkowitych lizatach komórkowych komórek transfekowanych siRNA RBX1 były podobne do endogennych poziomów CENP-A w komórkach transfekowanych siRNA lucyferazy, co sugeruje, że ligaza CUL4A RBX1 E3 jest wymagana do lokalizacji CENP-A w centromerach. Mutanty lizyny CENP-A tracą zdolność do lokalizacji w centromerach, co sugeruje, że ubikwitylacja CENP-A K124 jest niezbędna do lokalizacji CENP-A w centromerach. Co ważne, egzogenna fuzja monoubikwityny białka CENP-A uratowała delokalizację mutanta CENP-A K124R, przywracając białko do lokalizacji centromerowej.
Po opanowaniu, procedury utrwalania komórek i barwienia immunofluorescencyjnego można zakończyć w ciągu pięciu do sześciu godzin, jeśli są wykonywane prawidłowo. Pamiętaj, aby delikatnie nałożyć wszystkie roztwory na boki studzienek, aby komórki nie zostały wyjęte ze szkieł nakrywkowych podczas płukania lub zanurzania próbek. Nie zapominaj, że praca z podgrzanym paraformaldehydem poza wentylowanym pomieszczeniem lub że materiały łatwopalne w pobliżu ognia mogą być bardzo niebezpieczne i że podczas wykonywania tej procedury należy zawsze podjąć odpowiednie środki ostrożności.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejsze opracowanie przedstawia protokoły wykrywania i ilościowego określania białek centromerowo-kinetochorowych w komórkach ludzkich z wykorzystaniem pośredniego barwienia immunofluorescencyjnego. Metody obejmują różne techniki fiksacji w celu optymalizacji lokalizacji tych białek.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Biologia komórki
- Neuronauka
- Analiza białek
Wprowadzenie
- Białka centromerowo-kinetochorowe odgrywają kluczową rolę w podziale komórki.
- Zrozumienie ich lokalizacji oraz poziomów ekspresji jest niezbędne dla badań z zakresu biologii komórki.
- Pośrednie barwienie immunofluorescencyjne jest powszechnie stosowaną techniką badania tych białek.
- Różne metody fiksacji mogą wpływać na detekcję tych białek.
Cel badania
- W celu optymalizacji lokalizacji endogennych i egzogennych białek centromerowo-kinetochorowych.
- W celu ilościowego oznaczenia poziomu białek w centromerach i kinetochorach w komórkach ludzkich.
- W celu dostarczenia wiarygodnego protokołu dla badaczy w tej dziedzinie.
Zastosowane metody
- Techniki pośredniego barwienia immunofluorescencyjnego.
- Zastosowanie metod fiksacji z użyciem paraformaldehydu, acetonu lub metanolu.
- Transfekcja hodowlanych komórek specyficznymi konstruktami białkowymi.
- Inkubacja i wymiana pożywki w celu optymalizacji ekspresji białek.
Główne wyniki
- Pomyślna lokalizacja białka centromerycznego A oraz białek CENP-A znakowanych flagą.
- Ilościowe oznaczenie poziomów białek w różnych etapach anafazy.
- Wykazanie skuteczności różnych metod fiksacji.
- Opracowanie protokołu, który można dostosować do różnych potrzeb eksperymentalnych.
Wnioski
- Badanie oferuje solidną metodę analizy białek centromerowo-kinetochorowych.
- Wyniki mogą zwiększyć zrozumienie dynamiki białek podczas podziału komórki.
- Protokoły te mogą zostać wykorzystane w przyszłych badaniach z zakresu biologii komórki.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla Przemysłu
Ilościowa analiza immunofluorescence białek centromerowo-kinetochorowych umożliwia precyzyjne badanie mechanizmów segregacji chromosomów, co stanowi kluczowy punkt zwrotny w badaniach nad podziałem komórki. Możliwość ta zwiększa pewność prognostyczną przy walidacji celów oraz minimalizacji ryzyka mechanistycznego w programach na etapie odkrywania leków, skupionych na regulacji mitozy. Solidne schematy lokalizacji i kwantyfikacji białek endogennych i egzogennych ułatwiają podejmowanie decyzji portfelowych we wczesnej fazie odkryć oraz w badaniach translacyjnych.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne etapy odkrywania i walidacja celu
- Umożliwia bezpośrednią wizualizację i ilościowe określenie lokalizacji białek centromerowo-kinetochorowych w ludzkich komórkach.
- Wspiera ograniczanie ryzyka mechanistycznego poprzez rozróżnienie efektów zaburzeń genetycznych lub chemicznych w kierowaniu białek.
- Ułatwia walidację funkcjonalną potencjalnych celów zaangażowanych w wierność segregacji chromosomów.
- Zapewnia ilościowe punkty odniesienia do badania szlaków sygnałowych i weryfikacji hipotez.
Przesiewanie i opracowanie testu
- Zapewnia zwalidowane protokoły immunofluorescencji, które można dostosować do wysokoprzepustowego przesiewu (high-content screening) regulatorów mitozy.
- Gwarantuje powtarzalną detekcję wariantów białek endogennych i egzogennych w różnych warunkach doświadczalnych.
- Umożliwia uzyskanie ilościowych wyników odpowiednich do analizy porównawczej w przesiewach związków chemicznych lub genetycznych.
- Wspiera standaryzację testów na potrzeby badań międzylaboratoryjnych i międzyplatformowych.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Jest zgodne z modelami istotnymi dla przebiegu choroby, umożliwiając wykrywanie błędnej lokalizacji białek powiązanej z niestabilnością chromosomową.
- Zapewnia ciągłość od etapu odkrycia po walidację przedkliniczną poprzez wspieranie kwantyfikacji biomarkerów w inżynieryjnych systemach komórkowych.
- Ułatwia podejmowanie decyzji o dalszym rozwoju projektu w oparciu o analizę ryzyka i ilościowe dane dotyczące lokalizacji białek.
Integracja rurociągu i przepływu pracy
Niniejszy protokół immunofluorescencji wpisuje się w proces przejścia od etapu odkrywania do badań przedklinicznych, wspierając zarówno wczesne badania mechanistyczne, jak i późniejszą opracowanie testów służących do identyfikacji wiodących związków.
- Biologia odkrywcza: Umożliwia weryfikację hipotez dotyczących funkcji i lokalizacji białek centromerowo-kinetochorowych.
- Screening: Zapewnia ilościowe, powtarzalne odczyty immunofluorescencyjne dla kampanii screeningowych celujących w szlaki mitotyczne.
- Analityka: Wspiera statystyczne porównywanie lokalizacji i ekspresji białek w grupach eksperymentalnych.
- Badania translacyjne: Łączy odkrycia z modelami przedklinicznymi poprzez ilościowe określanie błędnej lokalizacji białek istotnej dla syndromów niestabilności chromosomowej.
- Zastosowania przedsiębiorstw: Oferuje zestandaryzowany, adaptowalny schemat pracy dla różnych białek docelowych i systemów komórkowych.
Wpływ operacyjny i organizacyjny
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność prognostyczną w walidacji celów i redukuje niejednoznaczność mechanistyczną w badaniach nad szlakami mitotycznymi.
- Wartość operacyjna: Dostarcza zestandaryzowanych, skalowalnych protokołów dla powtarzalnej analizy immunofluorescencji.
- Wartość strategiczna: Poprawia proces podejmowania decyzji go/no-go oraz efektywność kapitałową poprzez dostarczenie solidnych danych ilościowych.
- Wpływ na portfolio: Umożliwia priorytetyzację celów i programów z uwzględnieniem ryzyka w oparciu o wglądy mechanistyczne.
Uwagi dotyczące wdrożenia
- Wymagana jest biegłość w zakresie mikroskopii immunofluorescencyjnej oraz ilościowej analizy obrazu.
- Konieczny jest dostęp do zwalidowanych przeciwciał i wysokiej jakości aparatury obrazującej.
- W celu zapewnienia powtarzalności niezbędna jest standaryzacja protokołów fiksacji i barwienia pomiędzy zespołami.
- Metoda jest możliwa do dostosowania do różnych modeli komórkowych, lecz może wymagać optymalizacji dla konkretnych znaczników białkowych lub odczynników do fiksacji.
- Niezbędna jest ostrożna obsługa niebezpiecznych odczynników oraz przestrzeganie protokołów bezpieczeństwa.
