Analiza immunofluorescencyjna endogennych i egzogennych białek centromer-kinetochoru
March 3rd, 2016
Tutaj opisujemy protokoły wykrywania endogennych i egzogennych białek centromer-kinetochoru w komórkach ludzkich i ilościowego określania tych poziomów białek w centromerach-kinetochorach poprzez pośrednie barwienie immunofluorescencyjne za pomocą utrwalania (utrwalanie paraformaldehydu, acetonu lub metanolu).
Ogólnym celem tego pośredniego testu immunoflorescencyjnego jest optymalizacja lokalizacji i kwantyfikacji endogennych i egzogennych białek centromer-kinetochoru, w tym białka centromerowego A i znakowanych flagą egzogennych białek CENP-A w komórkach ludzkich. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania dotyczące identyfikacji i ilościowego oznaczania białek centromer-kinetochoru. Główną zaletą tej techniki jest to, że można ją stosować do porównywania różnych poziomów ekspresji centromeru-kinetochoru w zależności od wybranej anafazy, która jest przedmiotem zainteresowania.
18 godzin po wysianiu przemyć wyhodowane komórki jednorazowo PBS i dodać 500 mikrolitrów zredukowanej pożywki surowicy do każdego dołka z sześciodołkowej płytki hodowlanej polistyrenu. Następnie przetransfekuj komórki w każdym dołku świeżo przygotowanym roztworem mieszaniny A i B i inkubuj kultury w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla. Po czterech i pół godzinie zmień DMEM o wysokiej zawartości glukozy na wysoki uzupełniony FBS i antybiotykami i włóż płytkę z powrotem do inkubatora do hodowli komórkowych.
48 do 72 godzin później odessać pożywkę do hodowli komórkowej i przepłukać komórki jeden raz PBS, dodając sól fizjologiczną po bokach dołków hodowlanych, aby uniknąć naruszania komórek. Następnie utrwal komórki 4% paraformaldehydem przez 30 minut w temperaturze 4 stopni Celsjusza. Pod koniec okresu utrwalania przepłukać komórki dwukrotnie buforem Kb2 i przepuszczać próbki w buforze Kb1 przez 30 minut w temperaturze pokojowej.
Następnie przepłucz komórki jeden raz buforem Kb2 i zablokuj wszelkie niespecyficzne wiązania poprzez dodanie świeżego buforu Kb2. Po pięciu minutach w temperaturze pokojowej użyj kleszczy, aby usunąć zasiane szkła nakrywkowe z każdej ze studzienek i użyj hydrofobowego pisaka barierowego, aby narysować hydrofobowe bariery wokół każdej próbki szkła nakrywkowego. Przenieść szkła nakrywkowe na nową sześciodołkową płytkę polistyrenową i zanurzyć próbki w odpowiednim przeciwciałie pierwszorzędowym na jedną godzinę w temperaturze 37 stopni Celsjusza.
Następnie przepłukać komórki trzykrotnie buforem Kb2 i oznaczyć je odpowiednim przeciwciałem drugorzędowym przez kolejną godzinę w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Pod koniec inkubacji przepłukać próbki pięcioma 6-minutowymi płukaniami w buforze Kb2. Następnie oznacz jądra komórkowe buforem Kb3 zawierającym DapE przez pięć minut w temperaturze pokojowej, a następnie jednym do dwóch płukań w buforze Kb2 i ponownie napełnij studzienki buforem Kb2.
Teraz umieść kroplę podłoża montażowego na środku jednego szkiełka mikroskopowego dla każdej szklanki nakrywkowej komórek i usuń płyn z próbek komórek. Na koniec ostrożnie umieść każdą próbkę na środku jednego z przygotowanych szkiełek mikroskopowych i usuń nadmiar podłoża montażowego ręcznikiem papierowym. Jak zaobserwowano w tym reprezentatywnym eksperymencie, poziomy endogennej ekspresji białka CENP-A w całkowitych lizatach komórkowych komórek transfekowanych siRNA CUL4A były podobne do poziomów ekspresji CENP-A w komórkach transfekowanych lucyferazy siRNA.
Co więcej, poziomy białka endogennego CENP-A w całkowitych lizatach komórkowych komórek transfekowanych siRNA RBX1 były podobne do endogennych poziomów CENP-A w komórkach transfekowanych siRNA lucyferazy, co sugeruje, że ligaza CUL4A RBX1 E3 jest wymagana do lokalizacji CENP-A w centromerach. Mutanty lizyny CENP-A tracą zdolność do lokalizacji w centromerach, co sugeruje, że ubikwitylacja CENP-A K124 jest niezbędna do lokalizacji CENP-A w centromerach. Co ważne, egzogenna fuzja monoubikwityny białka CENP-A uratowała delokalizację mutanta CENP-A K124R, przywracając białko do lokalizacji centromerowej.
Po opanowaniu, procedury utrwalania komórek i barwienia immunofluorescencyjnego można zakończyć w ciągu pięciu do sześciu godzin, jeśli są wykonywane prawidłowo. Pamiętaj, aby delikatnie nałożyć wszystkie roztwory na boki studzienek, aby komórki nie zostały wyjęte ze szkieł nakrywkowych podczas płukania lub zanurzania próbek. Nie zapominaj, że praca z podgrzanym paraformaldehydem poza wentylowanym pomieszczeniem lub że materiały łatwopalne w pobliżu ognia mogą być bardzo niebezpieczne i że podczas wykonywania tej procedury należy zawsze podjąć odpowiednie środki ostrożności.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Przegląd
Niniejsza publikacja prezentuje protokoły dotyczące wykrywania i ilościowego oznaczania białek centromer-kinetochor w komórkach ludzkich przy użyciu pośredniego barwienia immunofluorescencyjnego. Metody te obejmują różne techniki utrwalania w celu optymalizacji lokalizacji tych białek.
Kluczowe elementy badania
Obszar nauki
- Biologia komórkowa
- Neurobiologia
- Analiza białek
Wprowadzenie
- Białka centromer-kinetochor odgrywają kluczową rolę w podziałach komórkowych.
- Zrozumienie ich lokalizacji i poziomów ekspresji jest niezbędne dla badań z zakresu biologii komórkowej.
- Pośrednie barwienie immunofluorescencyjne jest powszechną techniką badania tych białek.
- Różne metody utrwalania mogą wpływać na wykrywanie tych białek.
Cel badania
- Optymalizacja lokalizacji endogennych i egzogennych białek centromer-kinetochor.
- Ilościowe oznaczenie poziomów białka w centromerach-kinetochorach w komórkach ludzkich.
- Dostarczenie niezawodnego protokołu dla naukowców z tej dziedziny.
Wykorzystane metody
- Techniki pośredniego barwienia immunofluorescencyjnego.
- Wykorzystanie utrwalania formaldehydem, acetonem lub metanolem.
- Transfekcja hodowanych komórek określonymi konstruktami białkowymi.
- Inkubacja i wymiana pożywki w celu optymalizacji ekspresji białka.
Główne wyniki
- Powodzenie lokalizacji białka centromer A oraz białka CENP-A oznaczonych flagą.
- Ilościowe oznaczenie poziomów białka na różnych etapach anafazy.
- Wykazano skuteczność różnych metod utrwalania.
- Dostarczono protokół, który można dostosować do różnych potrzeb eksperymentalnych.
Wnioski
- Badanie oferuje solidną metodę badania białek centromer-kinetochor.
- Odkrycia mogą wzbogacić zrozumienie dynamiki białek podczas podziału komórkowego.
- Protokóły mogą być wykorzystywane w przyszłych badaniach z zakresu biologii komórkowej.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
Quantitative immunofluorescence analysis of centromere-kinetochore proteins enables precise interrogation of chromosome segregation mechanisms, a critical inflection point in cell division research. This capability supports predictive confidence in target validation and mechanistic de-risking for discovery-stage programs focused on mitotic regulation. Robust localization and quantification workflows for endogenous and exogenous proteins facilitate portfolio decisions in early discovery and translational research.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables direct visualization and quantification of centromere-kinetochore protein localization in human cells.
- Supports mechanistic de-risking by distinguishing effects of genetic or chemical perturbations on protein targeting.
- Facilitates functional validation of candidate targets involved in chromosome segregation fidelity.
- Provides quantitative benchmarks for pathway interrogation and hypothesis testing.
Screening & Assay Development
- Delivers validated immunofluorescence protocols adaptable for high-content screening of mitotic regulators.
- Ensures reproducible detection of both endogenous and exogenous protein variants across experimental conditions.
- Enables quantitative readouts suitable for comparative analysis in compound or genetic screens.
- Supports assay standardization for cross-laboratory and cross-platform studies.
Translational & Preclinical Research
- Aligns with disease-relevant models by enabling detection of protein mislocalization linked to chromosomal instability.
- Provides continuity from discovery through preclinical validation by supporting biomarker quantification in engineered cell systems.
- Facilitates risk-adjusted advancement decisions based on quantitative protein localization data.
Pipeline & Workflow Integration
This immunofluorescence protocol integrates into the discovery-to-preclinical continuum, supporting both early mechanistic studies and downstream assay development for lead identification.
- Discovery Biology: Enables hypothesis-driven testing of centromere-kinetochore protein function and localization.
- Screening: Provides quantitative, reproducible immunofluorescence readouts for screening campaigns targeting mitotic pathways.
- Analytics: Supports statistical comparison of protein localization and expression across experimental groups.
- Translational Research: Bridges discovery findings to preclinical models by quantifying protein mislocalization relevant to chromosomal instability syndromes.
- Enterprise Reuse: Offers a standardized, adaptable workflow for diverse protein targets and cell systems.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation and reduces mechanistic ambiguity in mitotic pathway studies.
- Operational Value: Delivers standardized, scalable protocols for reproducible immunofluorescence analysis.
- Strategic Value: Improves go/no-go decision-making and capital efficiency by providing robust quantitative data.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of targets and programs based on mechanistic insights.
Implementation Considerations
- Requires expertise in immunofluorescence microscopy and quantitative image analysis.
- Demands access to validated antibodies and high-quality imaging instrumentation.
- Necessitates cross-team standardization of fixation and staining protocols for reproducibility.
- Adaptable to various cell models but may require optimization for specific protein tags or fixation chemistries.
- Careful handling of hazardous reagents and adherence to safety protocols are essential.
