Name: Ocena integralności punktu kontrolnego zespołu wrzeciona w oocytach myszy (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-09-13T14:50:00.000+00:00
Duration: 10 min 9 s
Description: Poznaj trzy techniki oceny integralności punktu kontrolnego zespołu wrzeciona w oocytach myszy. Wykorzystaj obrazowanie na żywo i immunofluorescencję, aby zrozumieć błędy segregacji chromosomów prowadzące do aneuploidii.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Finansowanie tego projektu zostało zapewnione przez National Institutes of Health (R35GM136340 do KS).

Wszystkie myszy użyte w tych protokołach były trzymane i hodowane zgodnie z wytycznymi Rutgers University Institutional Animal Use and Care Committee (Protokół 201702497) oraz National Institutes of Health. Te organy regulacyjne zatwierdziły wszystkie procedury eksperymentalne obejmujące badania na zwierzętach. Wszystkie myszy użyte w niniejszym badaniu były 6-8-tygodniowymi samicami CF-1.
1. Przygotowanie eksperymentalne
<ol>
	<li>Przed rozpoczęciem oceny SAC należy pobrać oocyty myszy zgodnie z wcześniej opublikowanym raportem12. Podziel pobrane oocyty na trzy grupy o równej wielkości i trzymaj je w pożywkach hodowlanych Chatot, Ziomek i Bavister (CZB) zawierających 2,5 μM milrinonu (patrz Tabela Materiałów), aby uniknąć wznowienia mejotycznego13. 
	UWAGA: Skład CZB: 81,6 mM NaCL; 4,8 mM KCl; 1,2 mM KH2PO4; 1,2 mM MgSO 4-7H2 O; 0,27 mM pirogronian; 1,7 mM CaCl2; 30,8 mM kwas DL-mlekowy; 7 mM Tauryna; 0,1 mM EDTA; 25 mM NaHCO3; Gentamycyna; i 0,3% BSA.</li>
	<li>Przygotuj cRNA do mikroiniekcji zgodnie z wcześniejszym opisem12,14. Amplifikacja mysiego genu Securin z cDNA sklonowanego z oocytów pęcherzyków rozrodczych myszy , a następnie subklonowanie do wektora pMDL2 zawierającego sekwencję Gfp15,16.
	<ol>
		<li>Aby przygotować cRNA Securin-Gfp, należy zlinearyzować plazmid za pomocą trawienia Nde I. Wykonaj transkrypcję in vitro przy użyciu polimerazy RNA T3 i oczyszczając cRNA16. 
		UWAGA: Przechowywać cRNA w porcjach po 2-3 μl w temperaturze -80 °C do momentu użycia.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Leczenie nokodazolem i obrazowanie na żywo
<ol>
	<li>Przygotować 1 ml pożywki hodowlanej (CZB) zawierającej 5 μM nokodazolu (NOC), 1 ml pożywki hodowlanej z 5 μM NOC plus 0,5 μM rewersyny (NOC + REV) i 1 ml pożywki hodowlanej z dimetylosulfotlenkiem (DMSO) (1:2000) jako kontrolę (patrz tabela materiałów).</li>
	<li>Do dojrzewania oocytów i obrazowania na żywo należy użyć 96-dołkowej płytki wstępnie podgrzanej w inkubatorze w temperaturze 37 °C, 5% CO2 i wilgotności 80%. W pierwszym dołku załadować 150 μl kontrolnego traktowania DMSO; w drugiej studzience załadować 150 μl obróbki NOC; a w trzeciej studzience załadować 150 μL obróbki NOC + REV. Przechowywać płytkę w inkubatorze w tych samych warunkach, co powyżej, aż będzie potrzebna. 
	UWAGA: Na płytce 96-dołkowej unikaj używania pierwszego rzędu i pierwszej kolumny, ponieważ cień obramowania wpływa na jakość obrazów.</li>
	<li>Aby rozpocząć dojrzewanie mejotyczne, usuń milrinon. Podczas oglądania oocytów pod mikroskopem stereoskopowym przy użyciu powiększenia od 30x do 64x, wypłucz milrinon z pożywki, sekwencyjnie przenosząc oocyty przez sześć kropli po 100 μl pożywki hodowlanej bez milrinonu zawierającej DMSO i umieść je w odpowiednim dołku płytki 96-dołkowej za pomocą pipety obsługiwanej ręcznie lub doustnie.
	<ol>
		<li>Policz oocyty, podnosząc je za pomocą pipety obsługiwanej ręcznie lub doustnie i dostarczając do następnej kropli, aby uniknąć ich utraty. Oocyty są pojedynczymi, dużymi (~80 μm średnicy) i okrągłymi komórkami. Jądro pojawi się jak guzik w środku komórki, a błona i osłonka przejrzysta otaczają oocyt. 
		UWAGA: Przenoś oocyty między kroplami, przenosząc jak najmniejszą ilość płynu. Pozwala to na optymalne usunięcie milrinonu z pożywki hodowlanej. Jeśli oocyty nie wznowią mejozy, prawdopodobnie milrinon nie został skutecznie usunięty.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Powtórz ten sam proces (krok 2.3) dla zabiegu NOC i NOC + REV.</li>
	<li>Zobrazuj oocyty za pomocą mikroskopu jasnego pola wyposażonego w komorę inkubatora z kontrolowanym środowiskiem w następujących warunkach: 37 °C, 5% CO2 i 80% wilgotności. Rób obrazy w środkowej płaszczyźnie oocytów w odstępach 20 minut przez 24 godziny.</li>
	<li>Określ ilościowo liczbę oocytów, które wytłaczają ciało polarne (PB), identyfikując komórki, które przechodzą przez asymetryczną cytokinezę. Rezultatem będzie mała komórka (PB) obok jaja i we wspólnej osłonce przejrzystej. Przeglądaj obrazy za pomocą oprogramowania do obrazowania (ImageJ, patrz tabela materiałów).</li>
	<li>Zaimportuj sekwencję obrazów do oprogramowania do analizy obrazu i przesuwaj klatki, aż jedna lub więcej komórek przejdzie przez asymetryczną cytokinezę. Oblicz procent oocytów, które wytłaczają PB, w całkowitej liczbie oocytów17.</li>
</ol>
3. Monitorowanie wzorca degradacji Securin-gfp podczas dojrzewania mejotycznego
<ol>
	<li>Odwirować 3 μl cRNA Securin-Gfp (krok 1.2) przy 19 283 x g przez 30 minut w 4 °C18. 
	UWAGA: Użyć supernatantu, aby uniknąć ładowania zanieczyszczeń, które mogłyby spowodować zablokowanie igły podczas mikroiniekcji.</li>
	<li>Postępuj zgodnie z mikroiniekcją oocytów krok po kroku, szczegółowo opisaną w reference12. Mikroiniekcja oocytów zatrzymanych w profazie I za pomocą 100 ng/μL cRNA Securin-gfp przygotowanego w kroku 1.2.</li>
	<li>Po mikroiniekcji należy pozwolić oocytom na regenerację i translację RNA w inkubatorze CO2 przez co najmniej 3 godziny. Sprawdź ekspresję, obserwując oocyty w automatycznym wielokanałowym systemie obrazowania fluorescencyjnego (patrz tabela materiałów), aby wyświetlić sygnał GFP.</li>
	<li>Jak opisano w kroku 2.2, załadować 150 μl pożywki hodowlanej z lub bez 5 μM nokodazolu i 150 μl pożywki hodowlanej z 0,5 μM rewersyny do trzech różnych dołków na 96-dołkowej płytce.</li>
	<li>Przemyj mikrowstrzyknięte oocyty przez sześć kropli pożywki hodowlanej bez milrinonu i przenieś 1/3 oocytów do każdego zabiegu.</li>
	<li>Przechowywać płytkę w inkubatorze w temperaturze 37 °C, przy 5% CO2 i wilgotności 80%, aż oocyty wznowią mejozę, około 3 godziny po umyciu milrinonem. 
	UWAGA: Użyj mikroskopu stereoskopowego o powiększeniu od 30x-64x, aby ocenić rozpad otoczki jądrowej jako cechę charakterystyczną wznowienia mejotyki.</li>
	<li>Rejestrować obrazy dojrzewania oocytów za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego wyposażonego w komorę inkubatora, jak opisano w kroku 2.6. Użyj ustawień jasnego pola, aby znaleźć oocyty w studni. Użyj filtra 488, aby wykryć sygnał Securin-gfp i dostosuj intensywność fluorescencji, aby uniknąć nadmiernego naświetlania komórek.
	<ol>
		<li>Jeśli system obrazowania jest zautomatyzowany, zapisz pozycje oocytów w każdym dołku. Ponieważ Securin-gfp jest równomiernie rozprowadzany w cytoplazmie, wykonuj obrazy w środkowej płaszczyźnie oocytów w odstępach 20 minut przez 24 godziny. Aby uchwycić grupy oocytów na jednym zdjęciu, użyj soczewki obiektywowej o mniejszym powiększeniu, takiej jak 10x.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Użyj oprogramowania do analizy obrazu, aby określić ilościowo zniszczenie Securin-gfp. Otwórz obrazy kanału GFP. Zacznij od punktu czasowego 1. W preferowanym oprogramowaniu do analizy użyj narzędzia do zaznaczania lub kształtowania, aby oznaczyć każdy oocyt i wygenerować obszar zainteresowania (ROI) dla każdej komórki.
	<ol>
		<li>Użyj tego samego zwrotu z inwestycji, aby wybrać obszar tła, który ma zostać później odjęty. Zmierz intensywność pikseli GFP w każdym ROI.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Korzystając z ROI dla każdego oocytu wygenerowanego w kroku 3.8, zmierz intensywność GFP we wszystkich punktach czasowych. 
	UWAGA: W niektórych programach zakładka "Analizuj" umożliwia wybór funkcji Zmierz.
	<ol>
		<li>Następnie przejdź do następnego przedziału czasowego i powtórz ten proces, aby zmierzyć intensywność GFP w każdym przedziale czasowym. Na koniec do każdej wartości GFP odejmij pomiar zwrotu z inwestycji w tle wybrany w kroku 3.8. Analiza ta da wartość intensywności Securin-gfp dla każdego oocytu w każdym punkcie czasowym.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wyodrębnij różne parametry ze wzorca niszczenia Sekuryny: (a) czas, w którym rozpoczęła się degradacja Securin-gfp. Informuje to o tym, kiedy rozpoczęło się wyciszanie SAC; b) czas minimalnego sygnału Securin-gfp. Informuje to o tym, kiedy wyciszenie SAC spadło poniżej poziomu progowego, aby umożliwić wysoką aktywację APC/C i pełną degradację Securin-GFP; (c) szybkość niszczenia Securin-gfp19. Informuje to o tym, jak szybko aktywność SAC spada poniżej poziomu progowego aktywacji APC/C i degradacji Securin-GFP.</li>
</ol>
4. Rekrutacja MAD2 w kinetochorach metodą immunofluorescencji podczas dojrzewania mejotycznego
UWAGA: Aby uzyskać informacje na temat pobierania i dojrzewania oocytów, zapoznaj się z poprzednio opublikowanym raportem12.
<ol>
	<li>Podziel oocyty na trzy grupy. Przenieś każdą grupę oocytów do 100 μl kropli pożywki hodowlanej bez milrynonu. Przykryj krople olejem mineralnym i umieść je w inkubatorze (37 °C, 5% CO2 i 80% wilgotności) na 3 godziny, 5 godzin i 7 godzin, aby osiągnąć odpowiednio wczesną fazę prometafazy I, późną prometafazę I i fazę metafazy I. 
	UWAGA: Umieść każdy punkt czasowy w innym naczyniu, aby uniknąć kilkukrotnego wyjmowania tego samego naczynia z inkubatora, co wpływa na regularny czas dojrzewania mejotycznego.</li>
	<li>W wyznaczonych punktach czasowych utrwal oocyty, przenosząc je do 500 μl kropli 2% PFA w 1x buforze PHEM przez 20 minut w temperaturze pokojowej, używając 9-dołkowego szklanego naczynia, jak opisano wcześniej20. Następnie przenieś komórki do czystej studzienki zawierającej 500 μl kropli roztworu blokującego (PBS + 0,3% BSA + 0,01% Tween-20 + 0,02% NaN3). 
	UWAGA: Skład PHEM: 60 mM RURY; 25 mM HEPES; 10 mM EGTA; oraz 2 mM MgCl2, 
	UWAGA: W tym momencie można się zatrzymać i przechowywać oocyty w roztworze blokującym na 9-dołkowej płytce w temperaturze 4 °C do dogodnego czasu na zakończenie immunofluorescencji.</li>
	<li>Aby kontynuować wykrywanie MAD2, przenieś oocyty do czystej studzienki zawierającej 500 μl kropli roztworu przepuszczalnego (PBS + 0,3% BSA + 0,1% TritonX-100 + 0,02% NaN3). Inkubować przez 20 minut w temperaturze pokojowej, a następnie przenieść komórki do nowego dołka z roztworem blokującym i inkubować przez 10 minut.</li>
	<li>Do pozostałych etapów immunofluorescencji użyj 96-dołkowej pokrywki naczynia z wgłębieniami, jak opisano wcześniej20. Użyj wilgotnej ciemnej komory, aby uniknąć ekspozycji na światło i parowania. Przenieść oocyty do 30 μl kropli roztworu blokującego z przeciwciałem anty-MAD2 (1:1000, królik) i przeciwciałem anty-centromerowym (ACA) (1:30, człowiek) (patrz tabela materiałów) i inkubować przez 2 godziny w temperaturze pokojowej. 
	UWAGA: Pokrywka naczynia z 96 dołkami zapewnia miejsce na przetwarzanie kilku białek i grup w tym samym czasie.</li>
	<li>Aby wypłukać nadmiar przeciwciał pierwotnych, przenieś komórki do 30 μl kropli 1x buforu PHEM uzupełnionego 0,5% Tritonem i inkubuj przez 10 minut w wilgotnej komorze. Powtórz ten krok jeszcze dwa razy.</li>
	<li>Wykonaj czwarte płukanie, przenosząc komórki do 30 μl kropli 1x buforu PHEM bez 0,5% 1x Triton i inkubuj przez 10 minut.</li>
	<li>Przenieść komórki do 30 μl kropli roztworu blokującego zawierającego przeciwciała drugorzędowe, takie jak przeciwciała anty-ludzkie-633 (1:200) i anty-królicze-568 (1:200) (patrz tabela materiałów) i inkubować przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej><.
	UWAGA: Wybierz kombinację fluoroforów w oparciu o lasery lub filtry mikroskopowe.</li>
	<li>Aby przepłukać nadmiar przeciwciał drugorzędowych, powtórz kroki 4.5-4.6.</li>
	<li>Aby zamontować komórki na szkiełku mikroskopowym, przenieś komórki do kropli 10 μl pożywki montażowej zawierającej DAPI (0,1 mg/ml) (patrz tabela materiałów). Dodaj małe kropki wazeliny do każdego rogu szkiełka nakrywkowego, ostrożnie umieść je na kropli nośnika montażowego i powoli dociskaj, aby rozprowadzić. Użyj przezroczystego lakieru do paznokci, aby uszczelnić szkiełko nakrywkowe do szkiełka. Bardziej szczegółowy opis procesu montażu można znaleźć w pliku reference20.</li>
	<li>Obrazowanie kinetochorów za pomocą mikroskopu konfokalnego (patrz tabela materiałów) wyposażonego w obiektyw 40x lub 63x. Korzystając z sygnału ACA, określ zakres z, który umożliwia obrazowanie całego obszaru chromosomu. 
	UWAGA: W niektórych systemach obrazowania można używać zoomu optycznego 4,0 i kroku z 0,5 μm. Parametry te mogą się różnić w zależności od systemu i konieczna będzie optymalizacja.</li>
	<li>Analizuj intensywność MAD2 w kinetochorach za pomocą oprogramowania do analizy obrazu. Wykonaj maksymalną projekcję stosu z, a następnie podziel kanały.</li>
	<li>Najpierw utwórz maskę przy użyciu kanału ACA, wybierając kanał ACA, aby ustalić próg identyfikujący wszystkie sygnały kinetochorowe. Przejdź do zakładki edycji i utwórz wybór. Następnie utwórz ROI z tym wyborem.</li>
	<li>Wybierz kanał MAD2 i wprowadź zaznaczenie utworzone w kroku 4.12. Wybierz metodę progową, która lepiej dostosowuje się do sygnału MAD2. Zmierz intensywność. 
	UWAGA: Wybierz metodę progową w leczeniu kontrolnym i utrzymuj ją stałą podczas analizy różnych zabiegów.</li>
	<li>Aby wykonać obliczenia względnej intensywności pikseli, podziel intensywność każdej komórki przez średnią intensywność oocytów WT w eksperymencie.</li>
</ol>

<ol><li>Gruhn, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromosome+errors+in+human+eggs+shape+natural+fertility+over+reproductive+life+span%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Chromosome errors in human eggs shape natural fertility over reproductive life span.</a> Science. 365 (6460), 1466-1469 (2019).</li>
<li>Nagaoka, S. I., Hassold, T. J., Hunt, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+aneuploidy%3A+mechanisms+and+new+insights+into+an+age-old+problem%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews.+Genetics%22%5BJournal%5D)">Human aneuploidy: mechanisms and new insights into an age-old problem.</a> Nature Reviews. Genetics. 13 (7), 493-504 (2012).</li>
<li>Musacchio, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+molecular+biology+of+spindle+assembly+checkpoint+signaling+dynamics%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%22%5BJournal%5D)">The molecular biology of spindle assembly checkpoint signaling dynamics.</a> Current Biology. 25 (20), 1002-1018 (2015).</li>
<li>Lara-Gonzalez, P., Westhorpe, F. G., Taylor, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+spindle+assembly+checkpoint%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%22%5BJournal%5D)">The spindle assembly checkpoint.</a> Current Biology. 22 (22), 966-980 (2012).</li>
<li>London, N., Biggins, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Signalling+dynamics+in+the+spindle+checkpoint+response%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Signalling dynamics in the spindle checkpoint response.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 15 (11), 736-748 (2014).</li>
<li>Kuhn, J., Dumont, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mammalian+kinetochores+count+attached+microtubules+in+a+sensitive+and+switch-like+manner%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Mammalian kinetochores count attached microtubules in a sensitive and switch-like manner.</a> Journal of Cell Biology. 218 (11), 3583-3596 (2019).</li>
<li>Jones, K. T., Lane, S. I. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+causes+of+aneuploidy+in+mammalian+eggs%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Molecular causes of aneuploidy in mammalian eggs.</a> Development. 140 (18), 3719-3730 (2013).</li>
<li>Gui, L., Homer, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spindle+assembly+checkpoint+signalling+is+uncoupled+from+chromosomal+position+in+mouse+oocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Spindle assembly checkpoint signalling is uncoupled from chromosomal position in mouse oocytes.</a> Development. 139 (11), 1941-1946 (2012).</li>
<li>Nagaoka, S. I., Hodges, C. A., Albertini, D. F., Hunt, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oocyte-specific+differences+in+cell-cycle+control+create+an+innate+susceptibility+to+meiotic+errors%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%22%5BJournal%5D)">Oocyte-specific differences in cell-cycle control create an innate susceptibility to meiotic errors.</a> Current Biology. 21 (8), 651-657 (2011).</li>
<li>Sebestova, J., Danylevska, A., Novakova, L., Kubelka, M., Anger, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lack+of+response+to+unaligned+chromosomes+in+mammalian+female+gametes%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Cycle%22%5BJournal%5D)">Lack of response to unaligned chromosomes in mammalian female gametes.</a> Cell Cycle. 11 (16), 3011-3018 (2012).</li>
<li>Vasquez, R. J., Howell, B., Yvon, A. M., Wadsworth, P., Cassimeris, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanomolar+concentrations+of+nocodazole+alter+microtubule+dynamic+instability+in+vivo+and+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Biology+of+the+Cell%22%5BJournal%5D)">Nanomolar concentrations of nocodazole alter microtubule dynamic instability in vivo and in vitro.</a> Molecular Biology of the Cell. 8 (6), 973-985 (1997).</li>
<li>Stein, P., Schindler, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+oocyte+microinjection%2C+maturation+and+ploidy+assessment%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Mouse oocyte microinjection, maturation and ploidy assessment.</a> Journal of Visualized Experiments. (53), e2851(2011).</li>
<li>Thomas, R. E., Thompson, J. G., Armstrong, D. T., Gilchrist, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+specific+phosphodiesterase+isoenzyme+inhibitors+during+in+vitro+maturation+of+bovine+oocytes+on+meiotic+and+developmental+capacity%5BTitle%5D)+AND+%22Biology+of+Reproduction%22%5BJournal%5D)">Effect of specific phosphodiesterase isoenzyme inhibitors during in vitro maturation of bovine oocytes on meiotic and developmental capacity.</a> Biology of Reproduction. 71 (4), 1142-1149 (2004).</li>
<li>Marin, D., Nguyen, A. L., Scott, R. T., Schindler, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+mouse+oocytes+to+assess+human+gene+function+during+meiosis+I%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Using mouse oocytes to assess human gene function during meiosis I.</a> Journal of Visualized Experiments. (134), e57442(2018).</li>
<li>Herbert, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Homologue+disjunction+in+mouse+oocytes+requires+proteolysis+of+securin+and+cyclin+B1%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Homologue disjunction in mouse oocytes requires proteolysis of securin and cyclin B1.</a> Nature Cell Biology. 5 (11), 1023-1025 (2003).</li>
<li>Solc, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple+requirements+of+PLK1+during+Mouse+oocyte+maturation%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Multiple requirements of PLK1 during Mouse oocyte maturation.</a> PLoS One. 10 (2), 0116783(2015).</li>
<li>Blengini, C. S., Nguyen, A. L., Aboelenain, M., Schindler, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Age-dependent+integrity+of+the+meiotic+spindle+assembly+checkpoint+in+females+requires+Aurora+kinase+B%5BTitle%5D)+AND+%22Aging+Cell%22%5BJournal%5D)">Age-dependent integrity of the meiotic spindle assembly checkpoint in females requires Aurora kinase B.</a> Aging Cell. 20 (11), 13489(2021).</li>
<li>Balboula, A. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Haspin+kinase+regulates+microtubule-organizing+center+clustering+and+stability+through+Aurora+kinase+C+in+mouse+oocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Science%22%5BJournal%5D)">Haspin kinase regulates microtubule-organizing center clustering and stability through Aurora kinase C in mouse oocytes.</a> Journal of Cell Science. 129 (19), 3648-3660 (2016).</li>
<li>Nabti, I., Grimes, R., Sarna, H., Marangos, P., Carroll, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Maternal+age-dependent+APC%2FC-mediated+decrease+in+securin+causes+premature+sister+chromatid+separation+in+meiosis+II%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Maternal age-dependent APC/C-mediated decrease in securin causes premature sister chromatid separation in meiosis II.</a> Nature Communications. 8 (1), 15346(2017).</li>
<li>Blengini, C. S., Schindler, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunofluorescence+technique+to+detect+subcellular+structures+critical+to+oocyte+maturation%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Immunofluorescence technique to detect subcellular structures critical to oocyte maturation.</a> Methods in Molecular Biology. 1818, 67-76 (2018).</li>
<li>Santaguida, S., Tighe, A., D'Alise, A. M., Taylor, S. S., Musacchio, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dissecting+the+role+of+MPS1+in+chromosome+biorientation+and+the+spindle+checkpoint+through+the+small+molecule+inhibitor+reversine%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Dissecting the role of MPS1 in chromosome biorientation and the spindle checkpoint through the small molecule inhibitor reversine.</a> Journal of Cell Biology. 190 (1), 73-87 (2010).</li>
<li>Musacchio, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+molecular+biology+of+spindle+assembly+checkpoint+signaling+dynamics%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%22%5BJournal%5D)">The molecular biology of spindle assembly checkpoint signaling dynamics.</a> Current Biology. 25 (20), 1002-1018 (2015).</li>
<li>Wassmann, K., Niault, T., Maro, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metaphase+I+arrest+upon+activation+of+the+Mad2-dependent+spindle+checkpoint+in+mouse+oocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%22%5BJournal%5D)">Metaphase I arrest upon activation of the Mad2-dependent spindle checkpoint in mouse oocytes.</a> Current Biology. 13 (18), 1596-1608 (2003).</li>
<li>Hassold, T., Hall, H., Hunt, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+origin+of+human+aneuploidy%3A+where+we+have+been%2C+where+we+are+going%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Molecular+Genetics%22%5BJournal%5D)">The origin of human aneuploidy: where we have been, where we are going.</a> Human Molecular Genetics. 16, 203-208 (2007).</li>
<li>Gui, L., Homer, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spindle+assembly+checkpoint+signalling+is+uncoupled+from+chromosomal+position+in+mouse+oocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Spindle assembly checkpoint signalling is uncoupled from chromosomal position in mouse oocytes.</a> Development. 139 (11), 1941-1946 (2012).</li>
<li>Homer, H. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mad2+prevents+aneuploidy+and+premature+proteolysis+of+cyclin+B+and+securin+during+meiosis+I+in+mouse+oocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+and+Development%22%5BJournal%5D)">Mad2 prevents aneuploidy and premature proteolysis of cyclin B and securin during meiosis I in mouse oocytes.</a> Genes and Development. 19 (2), 202-207 (2005).</li>
<li>Blengini, C. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aurora+kinase+A+is+essential+for+meiosis+in+mouse+oocytes%5BTitle%5D)+AND+%22PLOS+Genetics%22%5BJournal%5D)">Aurora kinase A is essential for meiosis in mouse oocytes.</a> PLOS Genetics. 17 (4), 1009327(2021).</li>
<li>Hagting, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+securin+proteolysis+is+controlled+by+the+spindle+checkpoint+and+reveals+when+the+APC%2FC+switches+from+activation+by+Cdc20+to+Cdh1%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Human securin proteolysis is controlled by the spindle checkpoint and reveals when the APC/C switches from activation by Cdc20 to Cdh1.</a> Journal of Cell Biology. 157 (7), 1125-1137 (2002).</li>
<li>Rodriguez-Rodriguez, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+roles+of+RZZ+and+Bub1-KNL1+in+mitotic+checkpoint+signaling+and+kinetochore+expansion%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%22%5BJournal%5D)">Distinct roles of RZZ and Bub1-KNL1 in mitotic checkpoint signaling and kinetochore expansion.</a> Current Biology. 28 (21), 3422-3429 (2018).</li>
<li>Chambon, J. P., Hached, K., Wassmann, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromosome+spreads+with+centromere+staining+in+mouse+oocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Chromosome spreads with centromere staining in mouse oocytes.</a> Methods in Molecular Biology. 957, 203-212 (2013).</li>
</ol>

Autorzy nie mają żadnych konfliktów do ujawnienia.

Punkt kontrolny montażu wrzeciona jest krytycznym mechanizmem kontrolnym podczas podziału komórki, zaprojektowanym w celu zapobiegania błędom segregacji chromosomów. Dzięki temu ogniwo ma wystarczająco dużo czasu na skorygowanie nieprawidłowych nasadek KT-MT. Mejoza w oocytach jest procesem podatnym na błędy, w którym większość nieprawidłowej segregacji chromosomów występuje podczas mejozy I, co prowadzi do powstania aneuploidalnych jaj, które są główną przyczyną wczesnych poronień i niepłodności u ludzi<sup class="xref"...

Aneuploidia, która wynika z błędów w segregacji chromosomów, jest główną przyczyną wczesnych poronień i jest silnie związana z błędami w mejozie1. Mejoza różni się od mitozy, ponieważ składa się z dwóch rund podziału komórki bez etapu replikacji DNA. W mejozie I chromosomy homologiczne rozdzielają się, podczas gdy chromatydy siostrzane pozostają razem. W oocytach ten etap jest podatny na błędy, co prowadzi do produkcji aneuploidalnych komórek jajowych2.
Aby zapobiec błędom segregacji chromosomów, większość typów komórek aktywuje mechanizm nadzoru, który wstrzymuje cykl komórkowy, zwany punktem kontrolnym montażu wrzeciona (SAC). Mechanizm ten wykrywa przyłączenia kinetochoru (KT)-mikrotubul (MT), a napięcie jest generowane, gdy chromosomy są zorientowane w sposób dwubiegunowy3. Nieprzyłączone kinetochory wywołują reakcję SAC, która rozpoczyna się od rekrutacji MPS1, głównego regulatora SAC, do kinetochorów3,4. MPS1 inicjuje rekrutację innych komponentów SAC, działając jako platforma do tworzenia kompleksu mitotycznych punktów kontrolnych (MCC). MCC, składający się z MAD1, MAD2, BUB3 i BUBR1, dyfunduje do cytoplazmy i hamuje aktywację APC/C poprzez sekwestrację jego aktywatora CDC20. Gdy wszystkie kinetochory są stabilnie przyłączone do MT, a chromosomy są wyrównane na płytce metafazowej, SAC zostaje wyciszony, a MCC rozkłada i uwalnia CDC20, umożliwiając w ten sposób aktywację APC/C. Aktywny APC/C degraduje sekurynę i cyklinę B, dwa kluczowe kroki w wyzwalaniu początku anafazy5,6. W komórkach somatycznych SAC jest rygorystyczny, ponieważ jest aktywowany przez pojedynczy nieprzyłączony kinetochor i jest wystarczający do wywołania zatrzymania cyklu komórkowego6. Jednak podczas mejozy oocytów SAC jest bardziej pobłażliwy, a oocyty mogą wejść w anafazę I z jednym lub kilkoma nieprzyłączonymi kinetochorami6,7,8,9,10. Zrozumienie, dlaczego SAC jest bardziej permisywny w oocytach, jest ciągłym obszarem zainteresowania w tej dziedzinie. Mechanizmy, które powodują defekty aktywacji SAC lub wyciszanie SAC, mogą prowadzić do błędów w segregacji chromosomów lub przedłużonego zatrzymania cyklu komórkowego i śmierci komórki. Dlatego ocena mechanizmów, które utrzymują integralność SAC w oocytach, jest ważna dla zrozumienia procesu tworzenia zdrowych, euploidalnych jaj.
Ten protokół opisuje techniki kompleksowej oceny integralności SAC w mejozie oocytów myszy poprzez badanie różnych krytycznych etapów punktu kontrolnego. Po pierwsze, opisano ocenę odpowiedzi SAC po indukcji aktywacji SAC. Aktywacja ta jest osiągana poprzez generowanie nieprzyłączonych kinetochorów za pomocą nokodazolu, leku, który depolimeryzuje MTs11. Po drugie, opisano metodę monitorowania wyciszania SAC poprzez śledzenie dynamiki degradacji sekuryny podczas dojrzewania oocytów. Wreszcie, test oparty na immunofluorescencji jest stosowany do pomiaru rekrutacji MAD2, jednego ze składników MCC, do kinetochorów. Razem testy te kompleksowo oceniają integralność SAC podczas dojrzewania mejotycznego oocytów.

<table><tbody><tr><td>Albumina surowicy bydlęcej (BSA)</td><td>Sigma</td><td>A4503</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Life Technologies</td><td>D1306</td><td></td></tr><tr><td>Dimetylosulfotlenek (DMSO)</td><td>Sigma</td><td>D5879</td><td></td></tr><tr><td>Osioł-anty-królik-Alexa-568</td><td>Life Technologies</td><td>A10042</td><td></td></tr><tr><td>EVOS FL System automatycznego obrazowania</td><td>Life Technologies</td><td></td><td>Mikroskop</td></tr> <tr><td>fluorescencyjnyInkubator EVOS Onstage</td><td>Life Technologies</td><td></td><td>Komora inkubatora</td></tr><tr><td>Szklane dno 96-dołkowe płytki N 1.5 niepowlekane</td><td>MatTek Corporation</td><td>P96G-1.5-5-F</td><td></td></tr><tr><td>kozio-anty-ludzkie-Alexa-633</td><td>Life Technologies</td><td>A21091</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma</td><td>H3537</td><td></td></tr><tr>Ludzkie przeciwciała<td>anty-ACA</td><td>Włączone</td><td>15-234</td><td>Rozcieńczenie 1/30</td></tr><tr><td>ImageJ</td><td>NIH</td><td></td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma</td><td>P5405</td><td></td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>Sigma</td><td>P5655</td><td></td></tr><tr><td>Leica SP8 wyposażona w obiektyw zanurzeniowy 63&times;, 1.40 NA</td> oil immersion <td>Leica</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MgSO4&middot; 7H20</td><td>Sigma</td><td>M7774</td><td></td></tr><tr><td>Milrinone</td><td>Sigma</td><td>M4659</td><td></td></tr><tr><td>Na2HPO4</td><td>Sigma</td><td>S2429</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma</td><td>S5886</td><td></td></tr><tr><td>NaN3</td><td>Sigma</td><td>S2002</td><td></td></tr><tr><td>Nocodazole</td><td>Sigma</td><td>M1404</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldhyde (PFA)</td><td>Sigma</td><td>P6148</td><td></td></tr><tr><td>RURY</td><td>Sigma</td><td>P6757</td><td></td></tr><tr><td>Królik anty-MAD2</td><td>Biolegend</td><td>924601</td><td>Rozcieńczenie 1/1000; poprzednio Covance #PRB-452C</td></tr><tr><td>Reversine</td><td>Cayman Chemical</td><td>10004412</td><td></td></tr><tr><td>Triton-X</td><td>Sigma</td><td>274348</td><td></td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Sigma</td><td>X100</td><td></td></tr><tr><td>Vectashield</td><td>Vector laboratoria</td><td>H-1000</td><td></td></tr></tbody></table>

ocena integralności punktu kontrolnego zespołu wrzeciona w oocytach myszy

Evaluation of the Spindle Assembly Checkpoint Integrity in Mouse Oocytes

Aneuploidia jest główną nieprawidłowością genetyczną powodującą wczesne poronienia i niepowodzenia ciąży u ludzi. Większość błędów w segregacji chromosomów, które powodują aneuploidię, występuje podczas mejozy w oocytach, ale dlaczego mejoza oocytów jest podatna na błędy, nadal nie jest w pełni zrozumiałe. Podczas podziału komórki zapobiegają błędom w segregacji chromosomów poprzez aktywację punktu kontrolnego montażu wrzeciona (SAC). Ten mechanizm sterowania opiera się na wykrywaniu przyczepów kinetochoru (KT) i mikrotubul (MT) i wykrywaniu napięcia generowanego przez włókna wrzeciona. Gdy KT są odczepione, SAC jest aktywowany i zapobiega progresji cyklu komórkowego. SAC jest najpierw aktywowany przez kinazę MPS1, która wyzwala rekrutację i tworzenie kompleksu mitotycznych punktów kontrolnych (MCC), składającego się z MAD1, MAD2, BUB3 i BUBR1. Następnie MCC dyfunduje do cytoplazmy i sekwestruje CDC20, aktywator kompleksu/cyklosomu promujący anafazę (APC/C). Gdy KT zostaną przyłączone do mikrotubul, a chromosomy zostaną wyrównane na płytce metafazowej, SAC jest wyciszany, CDC20 jest uwalniany, a APC/C jest aktywowany, wywołując degradację cykliny B i sekuryny, umożliwiając w ten sposób początek anafazy. W porównaniu z komórkami somatycznymi, SAC w oocytach nie jest tak skuteczny, ponieważ komórki mogą ulegać anafazie pomimo nieprzyłączonych KT. Zrozumienie, dlaczego SAC jest bardziej pobłażliwy i czy ta permisywność jest jedną z przyczyn błędów segregacji chromosomów w oocytach, nadal wymaga dalszych badań. Niniejszy protokół opisuje trzy techniki kompleksowej oceny integralności SAC w oocytach myszy. Techniki te obejmują stosowanie nokodazolu do depolimeryzacji MT w celu oceny odpowiedzi SAC, śledzenie wyciszania SAC poprzez śledzenie kinetyki niszczenia sekuryny oraz ocenę rekrutacji MAD2 do KT za pomocą immunofluorescencji. Łącznie techniki te badają mechanizmy potrzebne do produkcji zdrowych komórek jajowych, zapewniając pełną ocenę integralności SAC.

Ocena responsywności SAC poprzez traktowanie nocodazolem 
Celem tego eksperymentu jest ocena aktywacji i siły SAC. Poprzez zastosowanie nocodazolu do depolimeryzacji mikrotubul wrzeciona, wszystkie kinetochory pozostaną nieprzyłączone, co spowoduje zatrzymanie cyklu komórkowego za pośrednictwem SAC. W zastosowanym systemie obrazowania oocyty kontrolne traktowane DMSO wydaliły ciało polarne około 14 h po uwolnieniu z milrinonu (Rysunek 1, górne panele). Zgodnie z aktywacją...

Błąd w segregacji chromosomów jest powszechną cechą oocytów. Dlatego badanie punktu kontrolnego montażu wrzeciona daje ważne wskazówki na temat mechanizmów potrzebnych do produkcji zdrowych jaj. Niniejszy protokół opisuje trzy uzupełniające się testy do oceny integralności punktu kontrolnego montażu wrzeciona w oocytach myszy.

Ocena integralności punktu kontrolnego zespołu wrzeciona w oocytach myszy

Aneuploidy is the leading genetic abnormality causing early miscarriage and pregnancy failure in humans. Most errors in chromosome segregation that give ...

Aneuploidia jest główną genetyczną przyczyną wczesnego poronienia u ludzi. Większość błędów w segregacji chromosomów występuje podczas mejozy w oocytach. Dlatego ocena punktu kontrolnego montażu wrzeciona w oocytach ma kluczowe znaczenie dla zrozumienia, dlaczego oocyty są podatne na błędy.W tym miejscu opisujemy trzy techniki kompleksowej oceny integralności SAC w oocytach myszy poprzez badanie różnych krytycznych etapów w punkcie kontrolnym przy użyciu kombinacji obrazowania na żywo i immunofluorescencji. Procedurę zademonstruje dr Cecilia Blengini, pracownik naukowy z mojego laboratorium. Na początek należy przygotować jeden mililitr pożywki hodowlanej zawierającej nokodazol i rewersynę z DMSO jako kontrolą, jak opisano w manuskrypcie.Do dojrzewania oocytów i obrazowania na żywo należy użyć wstępnie podgrzanej 96-dołkowej płytki w inkubatorze. I załaduj pierwszą, drugą i trzecią studzienkę odpowiednio 150 mikrolitrami kontrolnego DMSO, nokodazolu i nokodazolu oraz leczenia rewersyną. Podczas przetrzymywania płytki w inkubatorze w warunkach opisanych w manuskrypcie.Aby rozpocząć dojrzewanie miotyczne, usuń milrinon, sekwencyjnie przenosząc oocyty przez 6 kropli po 100 mikrolitrów pożywki hodowlanej wolnej od milrinonu zawierającej DMSO. I umieść je w odpowiednim dołku 96-dołkowej płytki. Używanie pipety ręcznej lub obsługiwanej ustnie podczas oglądania oocytów pod mikroskopem stereoskopowym.Zobrazuj oocyty za pomocą mikroskopu jasnego pola wyposażonego w komorę inkubatora z kontrolowanym środowiskiem o temperaturze 37 stopni Celsjusza, 5% dwutlenku węgla i wilgotności 80%. Rób obrazy w środkowej płaszczyźnie oocytów w odstępach 20 minut przez 24 godziny. Po ilościowym określeniu liczby oocytów, które wytłaczają ciało polarne, poprzez identyfikację komórek, które przechodzą przez asymetryczne cytokiny z małą komórką obok komórki jajowej i we wspólnej osłonie przejrzystej.Przeglądaj obrazy za pomocą oprogramowania do obrazowania. Mikroiniekcję pro-fazowych zatrzymanych oocytów pierwszej po 100 nanogramów na mikrolitr wcześniej przygotowanego cRNA sekuryny-gfp. Po mikroiniekcji pozwól oocytom na regenerację i translację RNA w inkubatorze dwutlenku węgla przez co najmniej trzy godziny.Następnie załaduj 150 mikrolitrów pożywki hodowlanej z pięcioma mikromolami nokodazolu lub bez nich. I 150 mikrolitrów pożywki hodowlanej z 0,5 mikromola rewersyny w trzech różnych dołkach 96-dołkowej płytki. Przemyj mikrowstrzyknięte oocyty przez sześć kropli pożywki hodowlanej wolnej od milrinonu i przenieś jedną trzecią oocytów do każdego zabiegu.Trzymaj płytkę w inkubatorze w temperaturze 37 stopni Celsjusza z 5% dwutlenkiem węgla i wilgotnością 80%, aż oocyty wznowią mejozę, około trzech godzin po umyciu milrinonem. Rejestruj obrazy dojrzewania oocytów za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego wyposażonego w komorę inkubatora. Użyj oprogramowania do analizy obrazu, aby określić ilościowo zniszczenie securin-gfp i otworzyć obrazy kanału GFP, zaczynając od czasu 0,1.W preferowanym oprogramowaniu do analizy użyj narzędzia do zaznaczania lub kształtowania, aby oznaczyć każdy oocyt i wygenerować interesujący obszar dla każdej komórki. Użyj tego samego obszaru zainteresowania, aby wybrać obszar tła do odjęcia później i zmierz intensywność pikseli GFP w każdym obszarze zainteresowania we wszystkich punktach czasowych. Na koniec do każdej wartości GFP odejmij pomiar obszaru zainteresowania w tle.Po podzieleniu mejozy na trzy grupy, przenieś każdą grupę mejozy do 100 mikrolitrowych kropli pożywki hodowlanej wolnej od milrinonu. Przykryj krople olejem mineralnym i umieść je w inkubatorze na trzy, pięć i siedem godzin, aby osiągnąć odpowiednio wczesny etap pierwszej prometafazy, późny etap pierwszej prometafazy i etap pierwszej metafazy. W wyznaczonych punktach czasowych utrwal oocyty, przenosząc je do 500 mikrolitrowych kropli 2% paraformaldehydu w buforze PME przez 20 minut w temperaturze pokojowej za pomocą szklanego naczynia z dziewięcioma dołkami.Następnie przenieś komórki do czystej studzienki zawierającej 500 mikrolitrów kropli roztworu blokującego. Aby kontynuować wykrywanie MAD2, przenieś oocyty do czystej studzienki zawierającej 500 mikrolitrów kropli roztworu przepuszczalnego. Po inkubacji przez 20 minut w temperaturze pokojowej przenieś komórki do nowego dołka z roztworem blokującym i inkubuj przez 10 minut.Przenieś oocyty do 30-mikrolitrowej kropli roztworu blokującego z przeciwciałem anty-MAD2 i przeciwciałem anty-centromerowym i inkubuj przez dwie godziny w temperaturze pokojowej. Aby przepłukać nadmiar przeciwciał pierwszorzędowych po przeniesieniu komórek do 30 mikrolitrów kropli buforu PME uzupełnionego 0,5% Tritonem, inkubować przez 10 minut w wilgotnej komorze. Przenieś komórki do 30 mikrolitrowej kropli roztworu blokującego zawierającego przeciwciała drugorzędowe, takie jak przeciwciała anty-ludzkie 633 i anty-królicze 568.I inkubować przez godzinę w temperaturze pokojowej. Aby zamontować komórki na szkiełku mikroskopowym, przenieś komórki do 10 mikrolitrowej kropli pożywki montażowej zawierającej DAPI. Dodaj małe kropki wazeliny do każdego rogu szkiełka nakrywkowego.Ostrożnie umieść je na upuszczeniu nośnika montażowego i powoli dociskaj, aby rozprowadzić. Przymocuj szkiełko korekcyjne do szkiełka za pomocą przezroczystego lakieru do paznokci. Obrazowanie kinetochorów za pomocą mikroskopu konfokalnego wyposażonego w obiektyw 40 lub 63 X.Za pomocą sygnału przeciwciała antycentromerowego należy określić zakres Z, który umożliwia obrazowanie całego obszaru chromosomu. Oocyty kontrolne leczone DMSO wytłaczały ciało polarne około 14 godzin po uwolnieniu z milrinonu. Po aktywacji SAC, oocyty leczone nokodazolem zostały zatrzymane w pierwszej fazie i nie wytłaczały ciała polarnego.Jednak przy braku aktywacji SAC, oocyty wytłaczały ciało polarne, mimo że nie miały przyłączeń do mikrotubul kinetochorowych. Oceniono szybkość degradacji sekuryny-gfp podczas dojrzewania mięśniowego. W którym w grupie kontrolnej oocytów traktowanych DMSO intensywność securin-gfp zaczyna spadać po około 10 godzinach od wypłukania milrinonu.Gdy oocyty dojrzewały w obecności czynnika aktywującego SAC, nokodazolu, poziomy sekuryny-gfp były stabilne przez cały okres dojrzewania mięśniowego. W przeciwieństwie do tego, gdy zapobiegano aktywacji SAC za pomocą leczenia reversine, wzorzec securin-gfp przyspieszył, a degradacja rozpoczęła się po około czterech godzinach od wypłukania milrinonu, co było zgodne z hamowaniem SAC. Obrazowanie konfokalne zastosowano do wykrycia centromerów i MAD2 oocytów, które dojrzały do wczesnej prometafazy pierwszej, późnej prometafazy pierwszej i metafazy pierwszej.Aby ocenić siłę sygnału SAC, określono ilościowo intensywność pikseli MAD2 zlokalizowaną w kinetochorze. Znaczące poziomy rekrutacji MAD2 do kinetochorów występują we wczesnej pierwszej prometafazie, kiedy większość kinetochorów nie była przyłączona do mikrotubul. Poziomy MAD2 zmniejszyły się w późniejszej prometafazie i były prawie nieobecne w pierwszej fazie, gdy wszystkie kinetochory były stabilnie przyłączone do mikrotubul.Ważne jest, aby podkreślić, że każda z tych technik ma swoje ograniczenia i swoją interpretację. Sugerujemy wykonanie kombinacji tych metod w celu oceny integralności SAC. Te trzy eseje pozwalają naukowcom ocenić surowość worka w oocytach, dając wgląd w potencjalną przyczynę aneuploidii w ludzkich komórkach jajowych.

evaluation-spindle-assembly-checkpoint-integrity-mouse

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia rozwojowa

Oocyty są podatne na aneuploidię z powodu błędów w segregacji chromosomów podczas dojrzewania meiotycznego. Aneuploidne komórki jajowe mogą prowadzić do niepłodności, poronień lub zaburzeń rozwojowych, takich jak zespół Downa. W niniejszej pracy opisujemy metody wprowadzania wybranych materiałów do oocytów oraz metody badania dojrzewania meiotycznego i oceny ploidii.

Mikroiniekcja, dojrzewanie i ocena ploidii oocytów mysich

Tutaj prezentujemy protokół specyficznego zubożenia mRNA za pośrednictwem siRNA, a następnie analizę immunofluorescencyjną w celu oceny montażu i organizacji wrzeciona mejotycznego w oocytach myszy. Protokół ten jest odpowiedni do in vitro zubożenia transkryptów i oceny funkcjonalnej różnych czynników wrzecionowych i/lub MTOC w oocytach.

Ocena wrzeciona mejotycznego w oocytach myszy za pomocą wyciszania za pośrednictwem siRNA

Tutaj prezentujemy protokół charakterystyki oocytów antralnych myszy na podstawie organizacji jąder.

Izolacja i charakterystyka mysich oocytów antralnych na podstawie organizacji chromatyny jąderkowej

Wiadomo, że oogeneza u ssaków jest podatna na błędy, szczególnie z powodu błędnej segregacji chromosomów. W tym manuskrypcie opisano metody przygotowania rozprzestrzeniania się chromatyny dla mysich oocytów z profazą, metafazą I i II stopnia. Te podstawowe techniki pozwalają na badanie białek związanych z chromatyną i morfologii chromosomów w trakcie oogenezy ssaków.

Preparaty do rozprzestrzeniania chromatyny do analizy progresji oocytów myszy od profazy do metafazy II

W miarę jak warianty genetyczne związane z chorobami ludzkimi zaczynają być odkrywane, coraz ważniejsze staje się opracowanie systemów, za pomocą których można szybko ocenić biologiczne znaczenie tych zidentyfikowanych wariantów. Protokół ten opisuje metody oceny funkcji ludzkich genów podczas mejozy żeńskiej I przy użyciu mysich oocytów.

Wykorzystanie oocytów myszy do oceny funkcji ludzkich genów podczas mejozy I

Przedstawiamy zarys protokołu klinicznego do nieinwazyjnej oceny dojrzałości ludzkiego jaja za pomocą mikroskopii światła spolaryzowanego.

Ocena dojrzałości ludzkich komórek jajowych i jej zastosowanie kliniczne

Przedstawiono zoptymalizowany protokół, który umożliwia wyczerpanie cytoplazmatycznych centrów organizowania mikrotubul w oocytach myszy podczas metafazy I za pomocą lasera femtosekundowego bliskiej podczerwieni.

Wielofotonowa ablacja laserowa cytoplazmatycznych centrów organizowania mikrotubul w oocytach myszy

Utrzymanie integralności genomu oocytu jest niezbędne do zapewnienia genetycznej wierności powstałego zarodka. W tym miejscu przedstawiamy dokładny protokół wykrywania pęknięć dwuniciowych DNA w żeńskich komórkach rozrodczych ssaków.

Wykrywanie dwuniciowych pęknięć DNA w oocytach myszy

Rysunek 1: Ramy end-to-end. Rysunek ilustruje kompleksowe ramy wiedzy multimodalnej Graf VISHAM-KG. Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tej figurki.

Przygotowanie rozprzestrzeniania chromosomów mejotycznych z oocytów myszy do oceny synapsy i rekombinacji

W tym badaniu opisujemy prostą metodę przeprowadzania analizy Evans Blue Dye (EBD) na larwach danio pręgowanego.  Technika ta jest potężnym narzędziem do charakteryzowania integralności mięśni szkieletowych i wyznaczania modeli dystrofii mięśniowej danio pręgowanego, a także jest cenną metodą opracowywania nowych metod terapeutycznych.

Analiza integralności mięśni szkieletowych larw danio pręgowanego za pomocą niebieskiego barwnika Evansa

Poznaj trzy techniki oceny integralności punktu kontrolnego zespołu wrzeciona w oocytach myszy. Wykorzystaj obrazowanie na żywo i immunofluorescencję, aby zrozumieć błędy segregacji chromosomów prowadzące do aneuploidii.

Ocena integralności punktu kontrolnego zespołu wrzeciona w oocytach myszy

Przeglądaj więcej filmów