Ocena integralności punktu kontrolnego zespołu wrzeciona w oocytach myszy

Aneuploidia jest główną genetyczną przyczyną wczesnego poronienia u ludzi. Większość błędów w segregacji chromosomów występuje podczas mejozy w oocytach. Dlatego ocena punktu kontrolnego montażu wrzeciona w oocytach ma kluczowe znaczenie dla zrozumienia, dlaczego oocyty są podatne na błędy.

W tym miejscu opisujemy trzy techniki kompleksowej oceny integralności SAC w oocytach myszy poprzez badanie różnych krytycznych etapów w punkcie kontrolnym przy użyciu kombinacji obrazowania na żywo i immunofluorescencji. Procedurę zademonstruje dr Cecilia Blengini, pracownik naukowy z mojego laboratorium. Na początek należy przygotować jeden mililitr pożywki hodowlanej zawierającej nokodazol i rewersynę z DMSO jako kontrolą, jak opisano w manuskrypcie.

Do dojrzewania oocytów i obrazowania na żywo należy użyć wstępnie podgrzanej 96-dołkowej płytki w inkubatorze. I załaduj pierwszą, drugą i trzecią studzienkę odpowiednio 150 mikrolitrami kontrolnego DMSO, nokodazolu i nokodazolu oraz leczenia rewersyną. Podczas przetrzymywania płytki w inkubatorze w warunkach opisanych w manuskrypcie.

Aby rozpocząć dojrzewanie miotyczne, usuń milrinon, sekwencyjnie przenosząc oocyty przez 6 kropli po 100 mikrolitrów pożywki hodowlanej wolnej od milrinonu zawierającej DMSO. I umieść je w odpowiednim dołku 96-dołkowej płytki. Używanie pipety ręcznej lub obsługiwanej ustnie podczas oglądania oocytów pod mikroskopem stereoskopowym.

Zobrazuj oocyty za pomocą mikroskopu jasnego pola wyposażonego w komorę inkubatora z kontrolowanym środowiskiem o temperaturze 37 stopni Celsjusza, 5% dwutlenku węgla i wilgotności 80%. Rób obrazy w środkowej płaszczyźnie oocytów w odstępach 20 minut przez 24 godziny. Po ilościowym określeniu liczby oocytów, które wytłaczają ciało polarne, poprzez identyfikację komórek, które przechodzą przez asymetryczne cytokiny z małą komórką obok komórki jajowej i we wspólnej osłonie przejrzystej.

Przeglądaj obrazy za pomocą oprogramowania do obrazowania. Mikroiniekcję pro-fazowych zatrzymanych oocytów pierwszej po 100 nanogramów na mikrolitr wcześniej przygotowanego cRNA sekuryny-gfp. Po mikroiniekcji pozwól oocytom na regenerację i translację RNA w inkubatorze dwutlenku węgla przez co najmniej trzy godziny.

Następnie załaduj 150 mikrolitrów pożywki hodowlanej z pięcioma mikromolami nokodazolu lub bez nich. I 150 mikrolitrów pożywki hodowlanej z 0,5 mikromola rewersyny w trzech różnych dołkach 96-dołkowej płytki. Przemyj mikrowstrzyknięte oocyty przez sześć kropli pożywki hodowlanej wolnej od milrinonu i przenieś jedną trzecią oocytów do każdego zabiegu.

Trzymaj płytkę w inkubatorze w temperaturze 37 stopni Celsjusza z 5% dwutlenkiem węgla i wilgotnością 80%, aż oocyty wznowią mejozę, około trzech godzin po umyciu milrinonem. Rejestruj obrazy dojrzewania oocytów za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego wyposażonego w komorę inkubatora. Użyj oprogramowania do analizy obrazu, aby określić ilościowo zniszczenie securin-gfp i otworzyć obrazy kanału GFP, zaczynając od czasu 0,1.

W preferowanym oprogramowaniu do analizy użyj narzędzia do zaznaczania lub kształtowania, aby oznaczyć każdy oocyt i wygenerować interesujący obszar dla każdej komórki. Użyj tego samego obszaru zainteresowania, aby wybrać obszar tła do odjęcia później i zmierz intensywność pikseli GFP w każdym obszarze zainteresowania we wszystkich punktach czasowych. Na koniec do każdej wartości GFP odejmij pomiar obszaru zainteresowania w tle.

Po podzieleniu mejozy na trzy grupy, przenieś każdą grupę mejozy do 100 mikrolitrowych kropli pożywki hodowlanej wolnej od milrinonu. Przykryj krople olejem mineralnym i umieść je w inkubatorze na trzy, pięć i siedem godzin, aby osiągnąć odpowiednio wczesny etap pierwszej prometafazy, późny etap pierwszej prometafazy i etap pierwszej metafazy. W wyznaczonych punktach czasowych utrwal oocyty, przenosząc je do 500 mikrolitrowych kropli 2% paraformaldehydu w buforze PME przez 20 minut w temperaturze pokojowej za pomocą szklanego naczynia z dziewięcioma dołkami.

Następnie przenieś komórki do czystej studzienki zawierającej 500 mikrolitrów kropli roztworu blokującego. Aby kontynuować wykrywanie MAD2, przenieś oocyty do czystej studzienki zawierającej 500 mikrolitrów kropli roztworu przepuszczalnego. Po inkubacji przez 20 minut w temperaturze pokojowej przenieś komórki do nowego dołka z roztworem blokującym i inkubuj przez 10 minut.

Przenieś oocyty do 30-mikrolitrowej kropli roztworu blokującego z przeciwciałem anty-MAD2 i przeciwciałem anty-centromerowym i inkubuj przez dwie godziny w temperaturze pokojowej. Aby przepłukać nadmiar przeciwciał pierwszorzędowych po przeniesieniu komórek do 30 mikrolitrów kropli buforu PME uzupełnionego 0,5% Tritonem, inkubować przez 10 minut w wilgotnej komorze. Przenieś komórki do 30 mikrolitrowej kropli roztworu blokującego zawierającego przeciwciała drugorzędowe, takie jak przeciwciała anty-ludzkie 633 i anty-królicze 568.

I inkubować przez godzinę w temperaturze pokojowej. Aby zamontować komórki na szkiełku mikroskopowym, przenieś komórki do 10 mikrolitrowej kropli pożywki montażowej zawierającej DAPI. Dodaj małe kropki wazeliny do każdego rogu szkiełka nakrywkowego.

Ostrożnie umieść je na upuszczeniu nośnika montażowego i powoli dociskaj, aby rozprowadzić. Przymocuj szkiełko korekcyjne do szkiełka za pomocą przezroczystego lakieru do paznokci. Obrazowanie kinetochorów za pomocą mikroskopu konfokalnego wyposażonego w obiektyw 40 lub 63 X.

Za pomocą sygnału przeciwciała antycentromerowego należy określić zakres Z, który umożliwia obrazowanie całego obszaru chromosomu. Oocyty kontrolne leczone DMSO wytłaczały ciało polarne około 14 godzin po uwolnieniu z milrinonu. Po aktywacji SAC, oocyty leczone nokodazolem zostały zatrzymane w pierwszej fazie i nie wytłaczały ciała polarnego.

Jednak przy braku aktywacji SAC, oocyty wytłaczały ciało polarne, mimo że nie miały przyłączeń do mikrotubul kinetochorowych. Oceniono szybkość degradacji sekuryny-gfp podczas dojrzewania mięśniowego. W którym w grupie kontrolnej oocytów traktowanych DMSO intensywność securin-gfp zaczyna spadać po około 10 godzinach od wypłukania milrinonu.

Gdy oocyty dojrzewały w obecności czynnika aktywującego SAC, nokodazolu, poziomy sekuryny-gfp były stabilne przez cały okres dojrzewania mięśniowego. W przeciwieństwie do tego, gdy zapobiegano aktywacji SAC za pomocą leczenia reversine, wzorzec securin-gfp przyspieszył, a degradacja rozpoczęła się po około czterech godzinach od wypłukania milrinonu, co było zgodne z hamowaniem SAC. Obrazowanie konfokalne zastosowano do wykrycia centromerów i MAD2 oocytów, które dojrzały do wczesnej prometafazy pierwszej, późnej prometafazy pierwszej i metafazy pierwszej.

Aby ocenić siłę sygnału SAC, określono ilościowo intensywność pikseli MAD2 zlokalizowaną w kinetochorze. Znaczące poziomy rekrutacji MAD2 do kinetochorów występują we wczesnej pierwszej prometafazie, kiedy większość kinetochorów nie była przyłączona do mikrotubul. Poziomy MAD2 zmniejszyły się w późniejszej prometafazie i były prawie nieobecne w pierwszej fazie, gdy wszystkie kinetochory były stabilnie przyłączone do mikrotubul.

Ważne jest, aby podkreślić, że każda z tych technik ma swoje ograniczenia i swoją interpretację. Sugerujemy wykonanie kombinacji tych metod w celu oceny integralności SAC. Te trzy eseje pozwalają naukowcom ocenić surowość worka w oocytach, dając wgląd w potencjalną przyczynę aneuploidii w ludzkich komórkach jajowych.