Szybka i wydajna ekspresja wielu białek w zarodkach ptaków za pomocą elektroporacji mRNA

Elektroporacja mRNA zapewnia szybką, wydajną i kontrolowaną przestrzennie i czasowo ekspresję wielu białek w systemie modelu ptaka. Metoda ta pozwala na szerszą i szybszą ekspresję białek fluorescencyjnych niż znakowanie osiągane za pomocą standardowej elektroporacji DNA. Elektroporacja ułatwia przejściowe otwieranie porów w błonie plazmatycznej, które służą jako kanały do przenoszenia ładunków genetycznych, takich jak RNA i DNA, do komórek wielu organizmów modelowych.

W początkowych eksperymentach należy pracować z embrionami starszymi niż jeden dzień, ponieważ są one bardziej wytrzymałe i bardziej odporne na zewnętrzne manipulacje, takie jak elektroporacja. W odpowiednim stadium rozwoju embrionalnego delikatnie rozbij i wlej zawartość jaj przepiórczych do 10-centymetrowej szalki Petriego. Użyj pipety transferowej, aby usunąć większość grubego białka.

Użyj tkanki laboratoryjnej, aby delikatnie przetrzeć powierzchnię jarzma, aby usunąć pozostałe grube białko wokół zarodka, aby upewnić się, że zarodek będzie mocno przylegał do papierowego pierścienia. Połóż wstępnie przyciętą bibułę filtracyjną na zarodku i użyj nożyczek, aby płynnie przeciąć na obwodzie zarodka. Użyj pipety Pasteura, aby ułożyć PPS pod zarodkiem za pomocą delikatnych strumieni, aby usunąć wszelkie jarzmo przyklejające się do tkanki.

Powoli pociągnij papierowy pierścień zarodka pod kątem do góry i zdejmij go z jarzma. Umieść papier na szalce Petriego wypełnionej PBS w celu dalszego czyszczenia. Po usunięciu większości jarzma umieść zarodek brzuszną stroną do góry na 35-milimetrowej szalce Petriego pokrytej półstałą mieszaniną agaru i białka.

Przygotuj komorę elektroporacyjną, łącząc czarną elektrodę, wypełniając ją PBS i umieszczając w niej zarodek. Użyj szklanej mikrokapilary, aby wstrzyknąć bolus 200 nanolitrów mRNA do wnęki między epiblastem a błoną witelinową pokrywającą żądany obszar. A następnie użyj czerwonej elektrody do elektroporacji zarodka.

Umieść elektropostowany zarodek z powrotem na mieszaninie agaru i białka i inkubuj w temperaturze 38 stopni Celsjusza do pożądanego stadium rozwojowego. W celu obrazowania białek fluorescencyjnych kodowanych elektroporacją obserwuj wszystkie elektroporowane zarodki pod fluorescencyjnym stereoskopem, aby wybrać najzdrowsze i najlepiej elektroporowane zarodki do eksperymentów z obrazowaniem dynamicznym. Kontynuować inkubację pozostałych zarodków pnionych galwanicznie i zarodków nieposadzonych galwanicznie w oddzielnym inkubatorze.

Krótko przepłucz wybrany zarodek PBS, aby usunąć wszelkie pęcherzyki, które mogły powstać na grzbietowej stronie zarodka podczas elektroporacji. Oczyszczony zarodek należy umieścić bezpośrednio w naczyniu do obrazowania zawierającym cienką warstwę około 150 mikrolitrów agaru białkowego, uważając, aby nie wytworzyć żadnych pęcherzyków na grzbietowej powierzchni zarodka. Dodaj mały, wilgotny, zwinięty kawałek bibuły wzdłuż wewnętrznych krawędzi naczynia do obrazowania.

Uszczelnij naczynie folią parafinową, aby zminimalizować parowanie podczas obrazowania i inkubacji. Szybko przenieś naczynie do wstępnie podgrzanego etapu mikroskopu konfokalnego i użyj kanału jasnego pola, aby zlokalizować kolorowy barwnik w zarodku. Ustaw oprogramowanie do obrazowania na żądany obiektyw, zwierciadło dichroiczne i widma emisyjne, a następnie włącz odpowiedni laser.

Zadbaj o to, aby komórki pozostały w wizji obrazu przez cały film. Użyj wystarczająco wysokiej rozdzielczości obrazowania i upewnij się, że warunki obrazowania nie spowodują fototoksyczności. Kliknij opcję Live (Na żywo) w oprogramowaniu do obrazowania i dostosuj moc lasera do ustawienia odpowiedniego dla intensywności fluorescencji w zależności od mocy lasera każdego mikroskopu.

Rozpocznij obrazowanie zarodka przy użyciu 1% mocy lasera i wzmocnienia 800, powoli zwiększając moc lasera o 1%, aż zobaczysz nasycone piksele. Gdy obserwuje się nasycone piksele, zmniejsz nieznacznie moc lasera, aż nie będzie można zobaczyć nasyconych pikseli. Obrazuj zarodek co trzy do pięciu minut, aby sprawdzić migrację pojedynczych komórek przez różne punkty czasowe za pomocą pięciu mikrometrowych stosów Z na całym galwanizowanym obszarze z dodatkowym miejscem w kierunku dolnej części stosu Z na wypadek, gdyby zarodek zapadł się w łożu agarozy podczas sesji obrazowania.

Aby zaobserwować, jak szybko poruszają się komórki, sprawdź kilka pierwszych punktów czasowych pierwszego filmu. Jeśli komórki poruszają się w szybkim tempie, rozważ zwiększenie powiększenia obrazowanego obszaru lub zobrazowanie innego obszaru. Po zobrazowaniu całego galwanicznego obszaru zarodka, należy wykonać obraz tego samego zarodka w niegalwanicznym obszarze, aby określić poziomy autofluorescencji.

Aby określić, jak długo transfekowane mRNA może ulegać transfekcji na białka fluorescencyjne po potwierdzeniu elektroporacji genu będącego przedmiotem zainteresowania pod mikroskopem stereoskopowym, umieść zarodek na podgrzanym stoliku odwróconego mikroskopu konfokalnego i użyj lasera 405 nanometrów o 70% mocy lasera, 100 iteracjach i prędkości skanowania czterech, aby fotowybielić większość fluorescencji komórkowej z galwanizowanego genu w różnych punktach czasowych. Kontynuuj inkubację zarodków na etapie w temperaturze 36 stopni Celsjusza po fotowybielaniu, zwracając uwagę na aktywnie dzielące się komórki w obszarze fotobielenia, które są zwykle widoczne tylko u zdrowych zarodków, a tym samym wskazują, że elektroporacja nie uszkodziła komórek zarodkowych. Uzyskuj obrazy stosu Z po wybielaniu obszaru galwanicznego przez żądany okres czasu w regularnych odstępach czasu od trzech do pięciu minut.

Aby upewnić się, że warunki obrazowania nie wpływają szkodliwie na przeżywalność zarodków, należy jednocześnie inkubować galwanicznie platerowane zarodki, które nie są wybielane fotoblaszem, aby służyły jako kontrola obrazowania. Aby określić ilościowo wyniki fotowybielania dla rozpadu mRNA po elektroporacji, użyj ImageJ do pomiaru intensywności fluorescencji okręgu o średnicy 7,5 mikrometra w środku galwanizowanego obszaru każdej komórki, aby śledzić fluorescencję komórki w każdym odstępie od trzech do pięciu minut. Po zmierzeniu wszystkich komórek w obszarze fotowybielania, które nie przechodzą mitozy i zostały całkowicie wybielone, należy wykreślić intensywność fluorescencji w czasie po wybielaniu w każdym z punktów czasowych, w których zarodek został wybielony.

Chociaż elektroporacja DNA prowadzi do jaśniejszej fluorescencji w niektórych ogniwach galwanicznych, wydajność elektroporacji DNA jest wyraźnie niższa w porównaniu z szeroko eksprymowanymi białkami fluorescencyjnymi kodowanymi przez mRNA. Porównując koelektroporację DNA i mRNA w tym samym zarodku, wydajność DNA wyrażającego białko fluorescencyjne jest również znacznie i konsekwentnie mniej wydajna niż w przypadku białka fluorescencyjnego eksprymującego mRNA. Oznaczanie ilościowe wszystkich zarodków pokrytych galwanicznie tylko mRNA, DNA lub kombinacją tych dwóch, ujawnia, że mRNA transfekuje około 75% komórek w danym regionie, podczas gdy DNA transfekuje tylko około 25% komórek.

Transfekowane mRNA powinno prowadzić do szybszej produkcji białek w porównaniu z transfekowanym DNA, ponieważ mRNA może być natychmiast rozpoznane przez cytozolową maszynerię translacyjną. Chociaż wcześniej wykazano, że koelektroporacja wielu DNA jest stosunkowo nieefektywna, koelektroporacja czterech mRNA w tym eksperymencie spowodowała 87% wydajność transfekcji wszystkich czterech mRNA we wszystkich galwanizowanych regionach. Chociaż fotowybielanie początkowo zmniejsza intensywność fluorescencji w fotowybielanych komórkach o około 95%niektóre komórki odzyskują zdolność do podziału i ekspresji białek fluorescencyjnych wkrótce po elektroporacji.

Zdolność ta zmniejsza się jednak w ciągu pięciu godzin po elektroporacji. Nie spiesz się z optymalizacją najlepszych warunków obrazowania i kontynuuj majsterkowanie nawet po uruchomieniu filmu, będąc gotowym do wprowadzenia wszelkich korekt w razie potrzeby.