Name: Szybka i wydajna ekspresja wielu białek w zarodkach ptaków za pomocą elektroporacji mRNA (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-06-07T14:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 40 s
Description: Poznaj szybką i wydajną metodę elektroporacji mRNA do ekspresji wielu białek w zarodkach przepiórczych. Technika umożliwia fluorescencyjne znakowanie komórek i śledzenie ich ruchów in vivo w biologii rozwojowej.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy Davidowi Hussowi za pomocne spostrzeżenia na temat tej pracy. Praca ta była częściowo wspierana przez Rose Hills Foundation Summer Research Fellowship (2016-2018) oraz stypendium USC Provost's Undergrad Research Fellowship dla MT, Saban Research Institute Intramural Training Pre-Doctoral Award dla MD oraz nagrodę University of Southern California Undergraduate Research Associates Program dla R.L.

<ol><li>Neumann, E., Schaefer-Ridder, M., Wang, Y., Hofschneider, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+transfer+into+mouse+lyoma+cells+by+electroporation+in+high+electric+fields%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Journal%22%5BJournal%5D)">Gene transfer into mouse lyoma cells by electroporation in high electric fields.</a> EMBO Journal. 1 (7), 841-845 (1982).</li>
<li>Potter, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electroporation+in+biology%3A+methods%2C+applications%2C+and+instrumentation%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Electroporation in biology: methods, applications, and instrumentation.</a> Analytical Biochemistry. 174 (2), 361-373 (1988).</li>
<li>Shillito, R. D., Saul, M. W., Paszkowski, J., Muller, M., Potrykus, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-Efficiency+Direct+Gene-Transfer+to+Plants%5BTitle%5D)+AND+%22Bio-Technology%22%5BJournal%5D)">High-Efficiency Direct Gene-Transfer to Plants.</a> Bio-Technology. 3 (12), 1099-1103 (1985).</li>
<li>Cui, C., Rongish, B., Little, C., Lansford, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ex+Ovo+Electroporation+of+DNA+Vectors+into+Pre-gastrulation+Avian+Embryos%5BTitle%5D)+AND+%22CSH+Protocol%22%5BJournal%5D)">Ex Ovo Electroporation of DNA Vectors into Pre-gastrulation Avian Embryos.</a> CSH Protocol. 2007 (24), 4894(2007).</li>
<li>Voiculescu, O., Papanayotou, C., Stern, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatially+and+temporally+controlled+electroporation+of+early+chick+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocol%22%5BJournal%5D)">Spatially and temporally controlled electroporation of early chick embryos.</a> Nature Protocol. 3 (3), 419-426 (2008).</li>
<li>Voiculescu, O., Stern, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Manipulating+Gene+Expression+in+the+Chick+Embryo%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Manipulating Gene Expression in the Chick Embryo.</a> Methods Molecular Biology. , 105-114 (2017).</li>
<li>Chuai, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+movement+during+chick+primitive+streak+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Bioliogy%22%5BJournal%5D)">Cell movement during chick primitive streak formation.</a> Developmental Bioliogy. 296 (1), 137-149 (2006).</li>
<li>Krull, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+primer+on+using+in+ovo+electroporation+to+analyze+gene+function%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Dynamics%22%5BJournal%5D)">A primer on using in ovo electroporation to analyze gene function.</a> Developmental Dynamics. 229 (3), 433-439 (2004).</li>
<li>Momose, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+targeting+of+gene+expression+in+chick+embryos+by+microelectroporation%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental%2C+Growth+and+Differentiation%22%5BJournal%5D)">Efficient targeting of gene expression in chick embryos by microelectroporation.</a> Developmental, Growth and Differentiation. 41 (3), 335-344 (1999).</li>
<li>Nakamura, H., Watanabe, Y., Funahashi, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Misexpression+of+genes+in+brain+vesicles+by+in+ovo+electroporation%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental%2C+Growth+and+Differentiation%22%5BJournal%5D)">Misexpression of genes in brain vesicles by in ovo electroporation.</a> Developmental, Growth and Differentiation. 42 (3), 199-201 (2000).</li>
<li>Teddy, J. M., Lansford, R., Kulesa, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Four-color%2C+4-D+time-lapse+confocal+imaging+of+chick+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">Four-color, 4-D time-lapse confocal imaging of chick embryos.</a> Biotechniques. 39 (5), 703-710 (2005).</li>
<li>Green, M. R., Maniatis, T., Melton, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+beta-globin+pre-mRNA+synthesized+in+vitro+is+accurately+spliced+in+Xenopus+oocyte+nuclei%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Human beta-globin pre-mRNA synthesized in vitro is accurately spliced in Xenopus oocyte nuclei.</a> Cell. 32 (3), 681-694 (1983).</li>
<li>Mimoto, M. S., Christian, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Manipulation+of+gene+function+in+Xenopus+laevis%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Manipulation of gene function in Xenopus laevis.</a> Methods in Molecular Biology. 770, 55-75 (2011).</li>
<li>Luni, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-efficiency+cellular+reprogramming+with+microfluidics%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">High-efficiency cellular reprogramming with microfluidics.</a> Nature Methods. 13 (5), 446-452 (2016).</li>
<li>Bugeon, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+and+efficient+transfection+of+mouse+neural+stem+cells+and+mature+neurons+by+in+vivo+mRNA+electroporation%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Direct and efficient transfection of mouse neural stem cells and mature neurons by in vivo mRNA electroporation.</a> Development. 144 (21), 3968-3977 (2017).</li>
<li>Riedl, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lifeact%3A+a+versatile+marker+to+visualize+F-actin%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Lifeact: a versatile marker to visualize F-actin.</a> Nature Methods. 5 (7), 605-607 (2008).</li>
<li>Turner, D. L., Weintraub, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+achaete-scute+homolog+3+in+Xenopus+embryos+converts+ectodermal+cells+to+a+neural+fate%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+and+Development%22%5BJournal%5D)">Expression of achaete-scute homolog 3 in Xenopus embryos converts ectodermal cells to a neural fate.</a> Genes and Development. 8 (12), 1434-1447 (1994).</li>
<li>Krieg, P. A., Melton, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+messenger+RNAs+are+produced+by+SP6+in+vitro+transcription+of+cloned+cDNAs%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Functional messenger RNAs are produced by SP6 in vitro transcription of cloned cDNAs.</a> Nucleic Acids Research. 12 (18), 7057-7070 (1984).</li>
<li>Hamburger, V., Hamilton, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+series+of+normal+stages+in+the+development+of+the+chick+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Morphology%22%5BJournal%5D)">A series of normal stages in the development of the chick embryo.</a> Journal of Morphology. 88 (1), 49-92 (1951).</li>
<li>Eyal-Giladi, H., Kochav, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((From+cleavage+to+primitive+streak+formation%3A+a+complementary+normal+table+and+a+new+look+at+the+first+stage+of+the+development+of+the+chick.+I.+General+morphology%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">From cleavage to primitive streak formation: a complementary normal table and a new look at the first stage of the development of the chick. I. General morphology.</a> Developmental Biology. 49, 321-337 (1976).</li>
<li>Ainsworth, S. J., Stanley, R. L., Evans, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Developmental+stages+of+the+Japanese+quail%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Anatomy%22%5BJournal%5D)">Developmental stages of the Japanese quail.</a> Journal of Anatomy. 216 (1), 3-15 (2010).</li>
<li>Chapman, S. C., Collignon, J., Schoenwolf, G. C., Lumsden, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+method+for+chick+whole-embryo+culture+using+a+filter+paper+carrier%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Dynamics%22%5BJournal%5D)">Improved method for chick whole-embryo culture using a filter paper carrier.</a> Developmental Dynamics. 220 (3), 284-289 (2001).</li>
<li>Hama, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Scale%3A+a+chemical+approach+for+fluorescence+imaging+and+reconstruction+of+transparent+mouse+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neurosciences%22%5BJournal%5D)">Scale: a chemical approach for fluorescence imaging and reconstruction of transparent mouse brain.</a> Nature Neurosciences. 14 (11), 1481-1488 (2011).</li>
<li>New, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+technique+for+the+cultivation+of+the+chick+embryo+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Embryology+and+Experimental+Morphology%22%5BJournal%5D)">A new technique for the cultivation of the chick embryo in vitro.</a> Journal of Embryology and Experimental Morphology. 3, 320-331 (1955).</li>
<li>Drake, C. J., Davis, L. A., Hungerford, J. E., Little, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Perturbation+of+beta+1+integrin-mediated+adhesions+results+in+altered+somite+cell+shape+and+behavior%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Perturbation of beta 1 integrin-mediated adhesions results in altered somite cell shape and behavior.</a> Developmental Biology. 149 (2), 327-338 (1992).</li>
<li>Sato, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+analysis+of+vascular+morphogenesis+using+transgenic+quail+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Dynamic analysis of vascular morphogenesis using transgenic quail embryos.</a> PLoS ONE. 5 (9), e12674(2010).</li>
<li>Kanda, T., Sullivan, K. F., Wahl, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histone-GFP+fusion+protein+enables+sensitive+analysis+of+chromosome+dynamics+in+living+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%22%5BJournal%5D)">Histone-GFP fusion protein enables sensitive analysis of chromosome dynamics in living mammalian cells.</a> Current Biology. 8 (7), 377-385 (1998).</li>
<li>Uetrecht, A. C., Bear, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Golgi+polarity+does+not+correlate+with+speed+or+persistence+of+freely+migrating+fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Golgi polarity does not correlate with speed or persistence of freely migrating fibroblasts.</a> European Journal of Cell Biology. 88 (12), 711-717 (2009).</li>
<li>Alberts, B., et al. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aAlberts%2C+B+%22Molecular+Biology+of+the+Cell%22">Molecular Biology of the Cell</a>. , 5th edition, Garland Science. (2007).</li>
<li>Arndt-Jovin, D. J., Jovin, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence+labeling+and+microscopy+of+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Fluorescence labeling and microscopy of DNA.</a> Methods Cell Biol. 30, 417-448 (1989).</li>
<li>Jovin, T. M., Arndt-Jovin, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Luminescence+digital+imaging+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Biophysics+and+Biophysical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Luminescence digital imaging microscopy.</a> Annu Rev Biophysics and Biophysical Chemistry. 18, 271-308 (1989).</li>
<li>Heikal, A. A., Hess, S. T., Baird, G. S., Tsien, R. Y., Webb, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+spectroscopy+and+dynamics+of+intrinsically+fluorescent+proteins%3A+coral+red+%28dsRed%29+and+yellow+%28Citrine%29%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Science+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Molecular spectroscopy and dynamics of intrinsically fluorescent proteins: coral red (dsRed) and yellow (Citrine).</a> Proceedings of the National Academy of Science U S A. 97 (22), 11996-12001 (2000).</li>
<li>Iizuka, R., Yamagishi-Shirasaki, M., Funatsu, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kinetic+study+of+de+novo+chromophore+maturation+of+fluorescent+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Kinetic study of de novo chromophore maturation of fluorescent proteins.</a> Analytical Biochemistry. 414 (2), 173-178 (2011).</li>
<li>Nakamura, H., Katahira, T., Sato, T., Watanabe, Y., Funahashi, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gain-+and+loss-of-function+in+chick+embryos+by+electroporation%5BTitle%5D)+AND+%22Mechanism+of+Development%22%5BJournal%5D)">Gain- and loss-of-function in chick embryos by electroporation.</a> Mechanism of Development. 121 (9), 1137-1143 (2004).</li>
<li>Swartz, M., Eberhart, J., Mastick, G. S., Krull, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sparking+new+frontiers%3A+using+in+vivo+electroporation+for+genetic+manipulations%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Sparking new frontiers: using in vivo electroporation for genetic manipulations.</a> Developmental Biology. 233 (1), 13-21 (2001).</li>
<li>Meyer, S., Temme, C., Wahle, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Messenger+RNA+turnover+in+eukaryotes%3A+pathways+and+enzymes%5BTitle%5D)+AND+%22Critical+Reviews+in+Biochemistry+and+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Messenger RNA turnover in eukaryotes: pathways and enzymes.</a> Critical Reviews in Biochemistry and Molecular Biology. 39 (4), 197-216 (2004).</li>
<li>Bevilacqua, P. C., Ritchey, L. E., Su, Z., Assmann, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-Wide+Analysis+of+RNA+Secondary+Structure%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+in+Genetics%22%5BJournal%5D)">Genome-Wide Analysis of RNA Secondary Structure.</a> Annual Review in Genetics. 50, 235-266 (2016).</li>
<li>Harland, R., Misher, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stability+of+RNA+in+developing+Xenopus+embryos+and+identification+of+a+destabilizing+sequence+in+TFIIIA+messenger+RNA%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Stability of RNA in developing Xenopus embryos and identification of a destabilizing sequence in TFIIIA messenger RNA.</a> Development. 102 (4), 837-852 (1988).</li>
<li>Lippincott-Schwartz, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+long+road%3A+peering+into+live+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">The long road: peering into live cells.</a> Nature Cell Biology. 12 (10), 918(2010).</li>
<li>Sato, Y., Lansford, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transgenesis+and+imaging+in+birds%2C+and+available+transgenic+reporter+lines%5BTitle%5D)+AND+%22Development+Growth+%26+Differentiation%22%5BJournal%5D)">Transgenesis and imaging in birds, and available transgenic reporter lines.</a> Development Growth & Differentiation. 55 (4), 406-421 (2013).</li>
<li>Goldman, R. D., Spector, D. L. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aGoldman%2C+RD+%22Live+Cell+Imaging%3A+A+Laboratory+Manual%22">Live Cell Imaging: A Laboratory Manual</a>. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. (2005).</li>
</ol>

Autorzy nie mają do zadeklarowania konfliktu interesów.

W tym protokole przedstawiliśmy instrukcje krok po kroku, jak precyzyjnie mikrowstrzykiwać i elektrorazować mRNA do komórek zarodków przepiórek gastrulujących. Wykazaliśmy, że zsyntetyzowana in vitro elektroporacja mRNA umożliwia szybką i wydajną ekspresję białek fluorescencyjnych (FP) w gastrulujących zarodkach przepiórek (ryc. 2 i 3). Fluorescencja z białka H2B-cytrynu translowanego z elektroporowanych mRNA mogła być wykryta za pomocą mikroskopii konfokalnej w ciągu ~ 20 m...

Elektroporacja to metoda fizycznej transfekcji, która wykorzystuje impuls elektryczny do tworzenia przejściowych porów w błonie plazmatycznej, umożliwiając substancjom takim jak kwasy nukleinowe lub chemikalia przejście do cytozolu. Elektroporacja jest szeroko stosowana do dostarczania DNA do komórek bakterii, drożdży, roślin i ssaków1,2,3. Jest rutynowo stosowany do wprowadzania ładunków genetycznych do docelowych komórek i tkanek w rozwijającym się zarodku ptaka w celu zbadania genetycznej kontroli rozwoju lub oznaczania migrujących populacji komórek4,5,6,7. Istnieje jednak kilka ograniczeń eksperymentalnych związanych z elektroporacją DNA8. Na przykład elektroporacja DNA często wprowadza bardzo zmienną liczbę wektorów ekspresyjnych na komórkę, a następnie kodowane przez nie mRNA i białka. Ta zmienność może prowadzić do znacznej heterogeniczności między komórkami, co komplikuje zarówno analizę obrazu, jak i interpretację danych9,10. Dodatkowo, białka z elektroporacji DNA zaczynają wyrażać się dopiero ~3 godziny po elektroporacji i nie osiągają maksymalnej wydajności w liczbie komórek i intensywności fluorescencji do 12 godzin, prawdopodobnie ze względu na czas potrzebny do przeniesienia do jądra i zakończenia zarówno transkrypcji, jak i translacji in vivo11.
Dla kontrastu, transfekcja mRNA została skutecznie wykorzystana w różnych systemach modelowych, w tym oocyty Xenopus laevis metodą mikroiniekcji12,13, przeprogramowanie ludzkich komórek macierzystych przez transfekcję lipofektaminy mRNA14, oraz elektroportowanie opornych nerwowych komórek macierzystych u dorosłych myszy15. Przetestowaliśmy zdolność elektroporacji mRNA do skutecznego znakowania komórek podczas wczesnego rozwoju embrionalnego ptaków przy użyciu syntetyzowanych in vitro mRNA, które kodują odrębne białka fluorescencyjne (FP). W naszych badaniach wykorzystaliśmy wektor pCS2+, uniwersalny wektor ekspresyjny, który jest powszechnie stosowany do ekspresji białek w zarodkach Xenopus i zebry pręgowanego. Promotory polimerazy RNA SP6 i T7 w pCS2 + umożliwiają syntezę mRNA i białka z dowolnego sklonowanego genu, gdy są stosowane w systemie transkrypcji/translacji in vitro.
Tutaj pokazujemy, że elektroporacja mRNA umożliwia szybką i efektywną ekspresję białek fluorescencyjnych (FPs) w zarodkach przepiórczych gastrulatujących. Zaprojektowaliśmy i wygenerowaliśmy wiele wektorów ekspresyjnych wykorzystywanych w tych badaniach. Na przykład sklonowaliśmy gen LifeAct-eGFP 16 do wektora pCS2+17 w celu ekspresji z promotora CMV i promotora SP6. Wstawiony gen znajduje się poniżej promotora SP6 i powyżej SV40 poly(A) tail18. W zarodkach poddanych jednoczesnej elektroporacji z mRNA i DNA FP kodowane z transkrybowanych in vitro mRNA zostały po raz pierwszy wykryte w ciągu 20 minut od elektroporacji, podczas gdy FP z wektorów ekspresji DNA wykryto dopiero po 3 godzinach. Wiele mRNA kodujących białka jądrowe, Golgiego i błonowe mogą być jednocześnie elektroporowane do zarodka, co skutkuje szybką i wydajną ekspresją wielu białek w poszczególnych komórkach. Wreszcie, stosując test odzyskiwania fluorescencji in vivo po fotowybielaniu (FRAP), pokazujemy, że większość elektroporowanych mRNA rozpada się w ciągu 2 godzin. Tak więc szybka początkowa produkcja białek w połączeniu z ograniczoną translacją nowych białek sprawia, że elektroporacja mRNA jest cenną techniką, gdy konieczna jest czasowa kontrola ekspresji.

<table><tbody><tr><td>BamHI-HF</td><td>New England Biolabs</td><td>R3136L</td><td></td></tr><tr><td>BglII</td><td>New England Biolabs</td><td>R0144S</td><td></td></tr><tr><td>BsrG1-HF</td><td>New England Biolabs</td><td>R3575S</td><td></td></tr><tr><td>NotI-HF</td><td>New England Biolabs</td><td>R3189L</td><td></td></tr><tr><td>SalI-HF</td><td>New England Biolabs</td><td>R3138L</td><td></td></tr><tr><td>Fenol:Chloroform:Alkohol izoamylowy</td><td>Thermo Fisher</td><td></td><td></td>15593031</tr><tr><td>SP6 mMessage Machine zestaw do transkrypcji in vitro</td><td>Thermo Fisher</td><td>AM1340</td><td></td></tr><tr><td>Fast Green FCF</td><td>Sigma Aldrich</td><td>F7252</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma Aldrich</td><td>93443</td><td>Glikol 4-(1,1,3,3-Tetrametylobutylo)fenylo-polietylenowy, t-Octylphenoxyethoxyethanol, Eter glikolu polietylenowego tert-oktylofenylowy</td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D9542</td><td>Dichlorowodorek 2-(4-amidinofenylo)-6-indolokarbidyny, dichlorowodorek 4&prime;,6-diamidino-2-fenyloindolu, dichlorowodorek DAPI</td></tr><tr><td>Bibuła filtracyjna Whatman No.1</td><td>Sigma Aldrich</td><td>WHA1001125</td><td></td></tr><tr><td>glicerol</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G9012</td><td></td></tr><tr><td>Mocznik</td><td>Sigma Aldrich Aldrich</td><td>51457</td><td></td></tr><tr><td>pmTurkus2-Golgi</td><td>Addgene</td><td>36205</td><td>pmTurkus2-Golgi był prezentem od Dorusa Gadelli (plazmid Addgene # 36205 ; http://n2t.net/addgene:36205 ; RRID:Addgene_36205)</td></tr><tr><td>pmEGFP-N1-LifeAct</td><td></td><td></td><td>Nat. Methods 2008;5:605-7. Identyfikator PubMed: 18536722</td></tr><tr><td>pCS2.Lifeact-mGFP</td><td>Addgene</td><td></td><td>Ten artykuł</td></tr><tr><td>pCS.H2B-cytryn</td><td>Addgene</td><td>53752</td><td>pCS-H2B-cytryn był prezentem od Seana Megasona (plazmid Addgene # 53752 ; http://n2t.net/addgene:53752 ; RRID:Addgene_53752)</td></tr><tr><td>pCS.memb-mCherry</td><td>Addgene</td><td>#53750</td><td>pCS-memb-mCherry był prezentem od Seana Megasona (plazmid Addgene # 53750 ; http://n2t.net/addgene:53750 ; RRID:Addgene_53750)</td></tr><tr><td>Mikroskop odwrócony Zeiss LSM-780</td><td>Carl Zeiss Microscopy GmbH</td><td></td><td>LSM-780 to mikroskop konfokalny i wielofotonowy, który oferuje czułość wymaganą do ważnych prac obrazowych. Wyposażony w zmotoryzowany stolik, urządzenie do automatycznego ustawiania ostrości i inkubator z pełnym zaciemnieniem, model 780 jest doskonałym mikroskopem do wysokiej jakości obrazowania żywych komórek/zarodków. 32-kanałowy detektor Quasar o wysokiej czułości pozwala na obrazowanie spektralne, liniowe rozmieszanie i akwizycję obrazu o dużej liczbie kolorów (>4). Wzbudzenie może być realizowane za pomocą 6-liniowych laserów jednofotonowych (405, 458, 488, 514, 564 i 633 nm), lasera 2-fotonowego Chameleon (Coherent) (zakres od 690nm do 1000nm) oraz pracy z oprogramowaniem systemowym ZEN 2011 SP7 (Black).</td></tr><tr><td>CUY-21 EDIT Elektroporator in vivo</td><td>Bex Co., Ltd.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Płaska elektroda kwadratowa platynowa, długość boku 5 mm</td><td>Bex Co., Ltd.</td><td></td><td></td>LF701P5E</tr><tr><td>Mikroskop stereoskopowy Olympus MVX10 FL</td> Aparat monochromatyczny <td>Olympus LifeScience</td><td></td><td></td></tr><tr><td>XM10</td><td>Olympus LifeScience</td><td></td><td></td></tr><tr><td><silny>Sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS) do HCR (10&krotnie, pH 7,4) </td><td></td><td></td><td>Aby przygotować 1 l 10-krotnego roztworu podstawowego, połącz 80 g NaCl (Sigma-Aldrich S3014), 2 g KCl (Sigma-Aldrich P9541), 11,4 g Na2HPO4 (bezwodny; Sigma-Aldrich S3264) i 2,7 g KH2PO4 (bezwodny; Sigma-Aldrich P9791). Dostosuj pH do 7,4 za pomocą HCl i doprowadź końcową objętość do 1 l za pomocą ultraczystego H2O. Należy unikać stosowania CaCl2 i MgCl2 w PBS dla HCR. Ważne jest, aby PBS dla HCR był przygotowany jako roztwór wolny od RNaz (np. poprzez obróbkę ditylowęglanem [DEPC]).</td></tr><tr><td>1,37 M NaCl</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>27 mM KCl</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>80 mM Na2HPO4 20 mM KH2PO4</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>PBS/Triton</td><td></td><td></td>Dodaj <td>1 ml Triton X-100 (Sigma Aldrich 93443) i 100 ml 10&razy; PBS do 890 ml ultraczystego destylowanego H2O. Przefiltrować roztwór przez 0,2 &mu; m przefiltrować i przechowywać w temperaturze 4 ? C do momentu użycia.</td></tr><tr><td>1&krotnie; sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS) (poddawana działaniu DEPC; pH 7,4)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>0,1% Triton X-100</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

szybka i wydajna ekspresja wielu białek w zarodkach ptaków za pomocą elektroporacji mrna

Fast and Efficient Expression of Multiple Proteins in Avian Embryos Using mRNA Electroporation

Informujemy, że elektroporacja mRNA pozwala białkom fluorescencyjnym znakować komórki w żywych zarodkach przepiórczych szybciej i szerzej niż elektroporacja DNA. Wysoka wydajność transfekcji pozwala na kotransfekcję co najmniej 4 różnych mRNA z wydajnością ~87%. Większość wysterylizowanych elektroporacją mRNA ulega degradacji w ciągu pierwszych 2 godzin po elektroporacji, co pozwala na przeprowadzenie wrażliwych na czas eksperymentów w rozwijającym się zarodku. Na koniec opisujemy, jak dynamicznie obrazować żywe zarodki elektroporowane mRNA, które kodują różne subkomórkowe ukierunkowane białka fluorescencyjne.

Elektroporacja mRNA jest bardziej wydajna niż elektroporacja DNA
Do przygotowania mRNA transkrybowanego in vitro wykorzystaliśmy pCS2+.H2B-Citrine. Ponieważ elektroporacja DNA jest zazwyczaj przeprowadzana przy stężeniu 1-2 µg/µL, do elektroporacji mRNA zastosowaliśmy ekvimolarne stężenie mRNA (obliczone na około 0,25-0,5 µg/µL dla H2B-Citrine). W pierwszej kolejności przetestowaliśmy wydajność elektroporacji DN...

Opisujemy elektroporację informacyjnego RNA (mRNA) jako metodę, która pozwala na szybką i efektywną ekspresję wielu białek w systemie modelowym zarodka przepiórki. Metoda ta może być stosowana do fluorescencyjnego znakowania komórek i rejestrowania ich ruchów in vivo za pomocą mikroskopii poklatkowej wkrótce po elektroporacji.

Szybka i wydajna ekspresja wielu białek w zarodkach ptaków za pomocą elektroporacji mRNA

We report that mRNA electroporation permits fluorescent proteins to label cells in living quail embryos more quickly and broadly than DNA electroporation. ...

Elektroporacja mRNA zapewnia szybką, wydajną i kontrolowaną przestrzennie i czasowo ekspresję wielu białek w systemie modelu ptaka. Metoda ta pozwala na szerszą i szybszą ekspresję białek fluorescencyjnych niż znakowanie osiągane za pomocą standardowej elektroporacji DNA. Elektroporacja ułatwia przejściowe otwieranie porów w błonie plazmatycznej, które służą jako kanały do przenoszenia ładunków genetycznych, takich jak RNA i DNA, do komórek wielu organizmów modelowych.W początkowych eksperymentach należy pracować z embrionami starszymi niż jeden dzień, ponieważ są one bardziej wytrzymałe i bardziej odporne na zewnętrzne manipulacje, takie jak elektroporacja. W odpowiednim stadium rozwoju embrionalnego delikatnie rozbij i wlej zawartość jaj przepiórczych do 10-centymetrowej szalki Petriego. Użyj pipety transferowej, aby usunąć większość grubego białka.Użyj tkanki laboratoryjnej, aby delikatnie przetrzeć powierzchnię jarzma, aby usunąć pozostałe grube białko wokół zarodka, aby upewnić się, że zarodek będzie mocno przylegał do papierowego pierścienia. Połóż wstępnie przyciętą bibułę filtracyjną na zarodku i użyj nożyczek, aby płynnie przeciąć na obwodzie zarodka. Użyj pipety Pasteura, aby ułożyć PPS pod zarodkiem za pomocą delikatnych strumieni, aby usunąć wszelkie jarzmo przyklejające się do tkanki.Powoli pociągnij papierowy pierścień zarodka pod kątem do góry i zdejmij go z jarzma. Umieść papier na szalce Petriego wypełnionej PBS w celu dalszego czyszczenia. Po usunięciu większości jarzma umieść zarodek brzuszną stroną do góry na 35-milimetrowej szalce Petriego pokrytej półstałą mieszaniną agaru i białka.Przygotuj komorę elektroporacyjną, łącząc czarną elektrodę, wypełniając ją PBS i umieszczając w niej zarodek. Użyj szklanej mikrokapilary, aby wstrzyknąć bolus 200 nanolitrów mRNA do wnęki między epiblastem a błoną witelinową pokrywającą żądany obszar. A następnie użyj czerwonej elektrody do elektroporacji zarodka.Umieść elektropostowany zarodek z powrotem na mieszaninie agaru i białka i inkubuj w temperaturze 38 stopni Celsjusza do pożądanego stadium rozwojowego. W celu obrazowania białek fluorescencyjnych kodowanych elektroporacją obserwuj wszystkie elektroporowane zarodki pod fluorescencyjnym stereoskopem, aby wybrać najzdrowsze i najlepiej elektroporowane zarodki do eksperymentów z obrazowaniem dynamicznym. Kontynuować inkubację pozostałych zarodków pnionych galwanicznie i zarodków nieposadzonych galwanicznie w oddzielnym inkubatorze.Krótko przepłucz wybrany zarodek PBS, aby usunąć wszelkie pęcherzyki, które mogły powstać na grzbietowej stronie zarodka podczas elektroporacji. Oczyszczony zarodek należy umieścić bezpośrednio w naczyniu do obrazowania zawierającym cienką warstwę około 150 mikrolitrów agaru białkowego, uważając, aby nie wytworzyć żadnych pęcherzyków na grzbietowej powierzchni zarodka. Dodaj mały, wilgotny, zwinięty kawałek bibuły wzdłuż wewnętrznych krawędzi naczynia do obrazowania.Uszczelnij naczynie folią parafinową, aby zminimalizować parowanie podczas obrazowania i inkubacji. Szybko przenieś naczynie do wstępnie podgrzanego etapu mikroskopu konfokalnego i użyj kanału jasnego pola, aby zlokalizować kolorowy barwnik w zarodku. Ustaw oprogramowanie do obrazowania na żądany obiektyw, zwierciadło dichroiczne i widma emisyjne, a następnie włącz odpowiedni laser.Zadbaj o to, aby komórki pozostały w wizji obrazu przez cały film. Użyj wystarczająco wysokiej rozdzielczości obrazowania i upewnij się, że warunki obrazowania nie spowodują fototoksyczności. Kliknij opcję Live (Na żywo) w oprogramowaniu do obrazowania i dostosuj moc lasera do ustawienia odpowiedniego dla intensywności fluorescencji w zależności od mocy lasera każdego mikroskopu.Rozpocznij obrazowanie zarodka przy użyciu 1% mocy lasera i wzmocnienia 800, powoli zwiększając moc lasera o 1%, aż zobaczysz nasycone piksele. Gdy obserwuje się nasycone piksele, zmniejsz nieznacznie moc lasera, aż nie będzie można zobaczyć nasyconych pikseli. Obrazuj zarodek co trzy do pięciu minut, aby sprawdzić migrację pojedynczych komórek przez różne punkty czasowe za pomocą pięciu mikrometrowych stosów Z na całym galwanizowanym obszarze z dodatkowym miejscem w kierunku dolnej części stosu Z na wypadek, gdyby zarodek zapadł się w łożu agarozy podczas sesji obrazowania.Aby zaobserwować, jak szybko poruszają się komórki, sprawdź kilka pierwszych punktów czasowych pierwszego filmu. Jeśli komórki poruszają się w szybkim tempie, rozważ zwiększenie powiększenia obrazowanego obszaru lub zobrazowanie innego obszaru. Po zobrazowaniu całego galwanicznego obszaru zarodka, należy wykonać obraz tego samego zarodka w niegalwanicznym obszarze, aby określić poziomy autofluorescencji.Aby określić, jak długo transfekowane mRNA może ulegać transfekcji na białka fluorescencyjne po potwierdzeniu elektroporacji genu będącego przedmiotem zainteresowania pod mikroskopem stereoskopowym, umieść zarodek na podgrzanym stoliku odwróconego mikroskopu konfokalnego i użyj lasera 405 nanometrów o 70% mocy lasera, 100 iteracjach i prędkości skanowania czterech, aby fotowybielić większość fluorescencji komórkowej z galwanizowanego genu w różnych punktach czasowych. Kontynuuj inkubację zarodków na etapie w temperaturze 36 stopni Celsjusza po fotowybielaniu, zwracając uwagę na aktywnie dzielące się komórki w obszarze fotobielenia, które są zwykle widoczne tylko u zdrowych zarodków, a tym samym wskazują, że elektroporacja nie uszkodziła komórek zarodkowych. Uzyskuj obrazy stosu Z po wybielaniu obszaru galwanicznego przez żądany okres czasu w regularnych odstępach czasu od trzech do pięciu minut.Aby upewnić się, że warunki obrazowania nie wpływają szkodliwie na przeżywalność zarodków, należy jednocześnie inkubować galwanicznie platerowane zarodki, które nie są wybielane fotoblaszem, aby służyły jako kontrola obrazowania. Aby określić ilościowo wyniki fotowybielania dla rozpadu mRNA po elektroporacji, użyj ImageJ do pomiaru intensywności fluorescencji okręgu o średnicy 7,5 mikrometra w środku galwanizowanego obszaru każdej komórki, aby śledzić fluorescencję komórki w każdym odstępie od trzech do pięciu minut. Po zmierzeniu wszystkich komórek w obszarze fotowybielania, które nie przechodzą mitozy i zostały całkowicie wybielone, należy wykreślić intensywność fluorescencji w czasie po wybielaniu w każdym z punktów czasowych, w których zarodek został wybielony.Chociaż elektroporacja DNA prowadzi do jaśniejszej fluorescencji w niektórych ogniwach galwanicznych, wydajność elektroporacji DNA jest wyraźnie niższa w porównaniu z szeroko eksprymowanymi białkami fluorescencyjnymi kodowanymi przez mRNA. Porównując koelektroporację DNA i mRNA w tym samym zarodku, wydajność DNA wyrażającego białko fluorescencyjne jest również znacznie i konsekwentnie mniej wydajna niż w przypadku białka fluorescencyjnego eksprymującego mRNA. Oznaczanie ilościowe wszystkich zarodków pokrytych galwanicznie tylko mRNA, DNA lub kombinacją tych dwóch, ujawnia, że mRNA transfekuje około 75% komórek w danym regionie, podczas gdy DNA transfekuje tylko około 25% komórek.Transfekowane mRNA powinno prowadzić do szybszej produkcji białek w porównaniu z transfekowanym DNA, ponieważ mRNA może być natychmiast rozpoznane przez cytozolową maszynerię translacyjną. Chociaż wcześniej wykazano, że koelektroporacja wielu DNA jest stosunkowo nieefektywna, koelektroporacja czterech mRNA w tym eksperymencie spowodowała 87% wydajność transfekcji wszystkich czterech mRNA we wszystkich galwanizowanych regionach. Chociaż fotowybielanie początkowo zmniejsza intensywność fluorescencji w fotowybielanych komórkach o około 95%niektóre komórki odzyskują zdolność do podziału i ekspresji białek fluorescencyjnych wkrótce po elektroporacji.Zdolność ta zmniejsza się jednak w ciągu pięciu godzin po elektroporacji. Nie spiesz się z optymalizacją najlepszych warunków obrazowania i kontynuuj majsterkowanie nawet po uruchomieniu filmu, będąc gotowym do wprowadzenia wszelkich korekt w razie potrzeby.

fast-efficient-expression-multiple-proteins-avian-embryos-using-mrna

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia rozwojowa

Elektroporacja in ovo zarodka kurczaka jest techniką pozwalającą na manipulacje genetyczne w embrionie ptaka. Typowe zastosowania tej metody obejmują analizę funkcjonalną genów oraz domniemanych elementów wzmacniających. Niniejszy film prezentuje elektroporację cewy nerwowej w embrionach kurczaka w stadium HH 10. Omówiono technikę iniekcji oraz prawidłową obsługę jaj.

Elektroporacja in ovo embrionów kurzych w stadium 10 według HH

Za pomocą mikropipet z cienkimi końcówkami wstrzykujemy plazmidowe DNA do poddomen somitów lub cewek nerwowych kurczaka. Stężenie plazmidu jest tak dostosowane, aby uzyskać pojedyncze transfekowane komórki. Następnie pozwalamy komórkom przekształcić się w populacje klonalne.

Transfekcja pojedynczych komórek w zarodkach kurczęt

Ogólnym celem tego filmu jest pokazanie, jak przeprowadzić celowaną iniekcję do siatkówki oraz elektroporację konstruktów DNA/RNA in ovo do siatkówki zarodka kurczaka w stadium 22-23 według skali Hamburgera i Hamiltona, co odpowiada około 4. dniu inkubacji (E4). Technika ta jest bardzo użyteczna w badaniu ekspresji genów, regulacji genów oraz zmian morfologicznych w rozwijającej się siatkówce kurczaka.

Elektroporacja in ovo siatkówki zarodka kurczaka

Opisano metodę transferu genów do embrionów kurcz uklutych na późniejszych etapach inkubacji (starszych niż stadium Hamburgera i Hamiltona (HH) 22). Metoda ta eliminuje wady elektroporacji in ovo stosowanej u starszych embrionów kurczych i stanowi przydatną technikę badania funkcji i regulacji genów na późniejszych etapach rozwoju.

Transfer genów do starszych zarodków kur w metodzie elektroporacji ex ovo

Ekspresja ektopowa to jedna z technik wyjaśniających rolę mikroRNA w rozwoju mózgu. Jednak celowanie w określone obszary za pomocą elektroporacji in ovo jest trudne. Tutaj pokazujemy skuteczny sposób selektywnego elektroportowania brzusznych i grzbietowych obszarów śródmózgowia.

In ovo Ekspresja mikroRNA w brzusznym śródmózgowiu piskląt

Narząd słuchowy pośredniczy w słyszeniu. W niniejszej pracy przedstawiono zmodyfikowaną metodę mikroelektroporacji in ovo zoptymalizowaną do badania proliferacji i różnicowania słuchowych komórek progenitorowych w rozwijającym się narządzie słuchowym kurcząt.

Transfer genów do narządu słuchowego kurczaka za pomocą mikroelektroporacji in ovo

Opracowaliśmy nowatorskie podejście do utraty funkcji, które polega na wprowadzeniu i genomowej integracji sztucznych sekwencji mikro-RNA w zarodkach piskląt za pomocą elektroporacji in ovo i systemu transpozonów Tol2. Technika ta zapewnia solidną i stabilną metodologię knockdownu genów do badań funkcji genów podczas rozwoju.

Podejście do utraty funkcji w embrionalnej siatkówce pisklęcia przy użyciu transgenicznej ekspresji sztucznych mikroRNA za pośrednictwem transpozonu Tol2

Ogólnym celem tego artykułu jest opisanie, jak przeprowadzić wewnątrzkomórkową iniekcję in ovo materiałów egzogennych do zarodków kurcząt. Takie podejście jest bardzo przydatne do badania biologii rozwoju zarodków kurczaków.

In Ovo Iniekcja donaczyniowa w zarodkach kurczaka

Pisklę jest opłacalnym, dostępnym i szeroko dostępnym organizmem modelowym do różnych badań. W tym miejscu szczegółowo opisano szereg protokołów, aby zrozumieć mechanizmy molekularne leżące u podstaw rozwoju i regeneracji ucha wewnętrznego ptaków.

Metody in ovo i ex ovo do badania rozwoju ucha wewnętrznego ptaków

Hodowle embrionalnych komórek siatkówki kurcząt stanowią cenne narzędzia do badania biologii fotoreceptorów. Opracowaliśmy skuteczną technikę transferu genów opartą na elektroporacji plazmidowej siatkówki ex ovo przed hodowlą. Technika ta znacznie zwiększa wydajność transfekcji w porównaniu z obecnie dostępnymi protokołami, dzięki czemu manipulacja genetyczna jest możliwa dla tego systemu.

Efektywny transfer genów w siatkówkach piskląt w badaniach pierwotnych hodowli komórkowych: podejście do elektroporacji ex-ovo

Poznaj szybką i wydajną metodę elektroporacji mRNA do ekspresji wielu białek w zarodkach przepiórczych. Technika umożliwia fluorescencyjne znakowanie komórek i śledzenie ich ruchów in vivo w biologii rozwojowej.

Szybka i wydajna ekspresja wielu białek w zarodkach ptaków za pomocą elektroporacji mRNA

Przeglądaj więcej filmów