Mikroskopia fluorescencyjna oparta na arkuszach świetlnych żywych lub utrwalonych i barwionych zarodków Tribolium castaneum
28 kwietnia 2017
Obrazowanie morfogenezy zarodków owadów za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej opartej na arkuszach świetlnych stało się najnowocześniejszym rozwiązaniem. Protokół ten nakreśla i porównuje trzy techniki montażu odpowiednie dla zarodków Tribolium castaneum, wprowadza dwie nowatorskie, wykonane na zamówienie linie transgeniczne, dobrze nadające się do obrazowania na żywo, omawia podstawowe kontrole jakości i wskazuje obecne ograniczenia eksperymentalne.
Ogólnym celem tego protokołu jest nieinwazyjna obserwacja rozwoju zarodków Tribolium castaneum przez bardzo długi okres czasu. Mikroskopia fluorescencyjna oparta na arkuszach świetlnych pomaga odpowiedzieć na pytania związane z morfogenezą w powstającym organizmie modelowym owadów Tribolium castaneum, odnosząc się do wzorców migracji i proliferacji komórek od wczesnej blastodermy do początku ruchu mięśni. Główną zaletą tej metody jest to, że krytyczne czynniki, takie jak fotowybielanie i fototoksyczność, są ograniczone do minimum, nawet jeśli zarodki są obserwowane przez kilka dni.
Aby zamontować zarodek w komorze na próbkę za pomocą kolumny agarozowej, najpierw napełnij strzykawkę o długości jednego milimetra wodą destylowaną i użyj małego gumowego węża, aby przymocować strzykawkę do szklanej kapilary. Napełnij kapilatę do połowy wodą destylowaną, a następnie za pomocą pędzla przenieś zarodek na wewnętrzną stronę szklanego otworu kapilary i wbij kapilarnę do płynnej agarozy, powoli wciągając kilka mikrolitrów agarozy wraz z zarodkiem do naczynia włosowatego. Gdy zarodek jest na miejscu, powinno znajdować się kilka mikrolitrów agarozy zarówno nad, jak i poniżej zarodka.
Gdy agaroza zastygnie, skróć kapilatę do długości około pięciu milimetrów. Pozostały fragment powinien być całkowicie wypełniony agarozą, a zarodek powinien znajdować się w drugim kwartylu. Następnie włóż stalowy cylinder ze szpilką do komory na próbkę i przyklej fragment kapilary na górze szpilki, Kolumna agarozy powinna wystawać kilka milimetrów z obszaru fragmentu kapilary, który zawiera zarodek.
Aby zamontować zarodek w komorze na próbkę za pomocą półkuli agarozy, najpierw wciągnij 200 mikrolitrów płynnej agarozy do jednomilimetrowej strzykawki i użyj strzykawki do napełnienia stalowej rurki z komorą na próbkę agarozą od góry rury, aż w dolnym otworze utworzy się półkula. Kiedy agaroza zastygnie, podnieś zarodek czubkiem pędzla i przestaw zarodek tak, aby przedni koniec stał się dostępny. Zanurz półkulę agarozy w płynnej agarozie, aby pokryć półkulę cienką warstwą i umieść zarodek z przednim końcem pionowo na biegunie półkuli agarozy.
Obróć stalową rurę i użyj szczoteczki, aby w razie potrzeby skorygować pozycję zarodka. Idealnie byłoby, gdyby mniej niż połowa powierzchni zarodka była pokryta agarozą, a boki były jak najbardziej strome. Zbyt duża ilość agarozy na powierzchni zarodka prowadzi do mechanicznego zwężenia i zmniejszonej wymiany gazowej i jonowej, co ma dramatyczny wpływ na przeżywalność zarodka.
Następnie powoli włóż stalową rurkę do komory na próbkę. Aby zamontować zarodek w komorze na próbkę za pomocą uchwytu na pajęczynę, najpierw wybierz zarodek pędzlem i odłóż pędzel na bok. Następnie przykryj szczelinowy otwór uchwytu pajęczyny pięcioma do ośmiu mikrolitrami płynnej agarozy, a następnie usuń większość agarozy, aż pozostanie tylko cienka warstwa agarozy.
Umieść zarodek na folii agarozowej i ostrożnie dostosuj jego położenie, przesuwając zarodek do środka osi x otworu szczelinowego i wyrównując jego wydłużoną przednią tylną oś z wydłużoną osią otworu szczelinowego. Upewnij się, że umieściłeś zarodek na folii agarozowej w ciągu 10-15 sekund po jego aplikacji, czyli gdy agaroza jest jeszcze płynna, w przeciwnym razie nie przyczepi się prawidłowo. Następnie powoli włóż uchwyt pajęczyny do komory na próbkę, ustawiając uchwyt tak, aby nie zakłócał światła wzbudzenia i emisji.
W przypadku testów obrazowania na żywo najpierw skonfiguruj film poklatkowy, a następnie w trybie światła transmisyjnego ustaw zarodek wzdłuż osi X i Y do środka pola widzenia, nie narażając zarodka na działanie lasera. Obróć zarodek o 360 stopni w krokach co 90 stopni, aby zbadać tkankę pod kątem uszkodzeń, które mogły wystąpić podczas procesu montowania. W trybie kwitnienia zdefiniuj stos Z dla każdego kierunku, dodając bufor przestrzenny o wielkości od 25 do 50 mikrometrów przed i za zarodkiem oraz zdefiniuj odstępy Z.
W przypadku długotrwałego obrazowania należy upewnić się, że komora próbki jest wypełniona wystarczającym buforem obrazowania i zakryć otwór komory próbki. Następnie rozpocznij proces obrazowania, monitorując prawidłową akwizycję we wszystkich kierunkach we wszystkich kanałach dla wszystkich zarodków. Pod koniec okresu obrazowania wyjmij uchwyt próbki z komory na próbkę i przenieś zarodek na szkiełko podstawowe.
Jeśli użyto kolumny agarozowej, użyj ostrego ostrza, aby wydobyć zarodki z otaczającej agarozy. Jeśli użyto półkuli agarozy, przenieś półkulę płaską stroną na szkiełko przedmiotowe. W przypadku metody utrwalania pajęczyny użyj pędzla, aby delikatnie zdemontować zarodek z filmu agarozowego.
Następnie inkubować szkiełko z załadowanym zarodkiem w małym szklanym naczyniu w atmosferze nasyconej wilgoci w standardowych warunkach, aż do wyklucia się larw. Aby przetworzyć dane obserwowanego zarodka, otwórz interesujące Cię pliki w odpowiednim oprogramowaniu do analizy obrazowania i obróć stosy Z, aby w razie potrzeby wyrównać przednią tylną oś zarodka z osią Y. Przytnij stosy Z wzdłuż osi X i Y, tak aby pozostało tylko minimalne tło, a następnie oblicz maksymalny rzut Z dla każdego stosu Z.
Następnie, w zależności od linii transgenicznej i metod obrazowania, dokonaj odpowiednich dynamicznych korekt intensywności stosów czasowych, aby w razie potrzeby skorygować wszelkie fotowybielacze lub florę pod kątem wahań ekspresji. Korzystając z linii transgenicznej, która wyraża białko fuzyjne M-szmaragdu histonowego 2B pod kontrolą promotora alfa-tububliny, zarejestrowano 66 godzin rozwoju embrionalnego w temperaturze pokojowej od retrakcji prążka zarodkowego do zamknięcia grzbietowego. Ta wzmacniająca linia pułapek może być wykorzystana do wizualizacji klastrów neuronalnych w przydatkach głowy i dynamiki migracji cirrosa podczas zamknięcia grzbietowego.
Obrazowanie podobnej linii transgenicznej, która zawiera ten sam transgen, ale w innym miejscu genomu, optyczne odcinki przejścia od gastrulacji do wydłużenia prążka zarodkowego pokazują wewnętrzny układ komórek wyłaniającego się pasma zarodkowego. Wykorzystując linię transgeniczną glejowo-niebieską, pozyskiwanie Z-Stacks w wielu kierunkach poprzez rotację próbki pozwala na obserwację reorganizacji komórek glejowych wzdłuż i wokół brzusznego rdzenia nerwowego, a także dynamiki ich proliferacji grzbietowej strony płatów głowy w tym samym zarodku. Małe barwniki fluorescencyjne mogą być również stosowane do specyficznego znakowania struktur międzykomórkowych w celu podkreślenia pewnych cech embrionalnych, takich jak marskość wątroby, tylne brzuszne komórki marskości wątroby lub trójwarstwa tkanki pasma zarodkowego błony płodowej surowiczej, która pojawia się podczas zamykania okna surowiczego.
Dwukolorowe barwienie barwnikiem fluorescencyjnym pozwala na dalszą wizualizację dwóch struktur międzykomórkowych w tym samym zarodku. Na przykład cytoszkielet aktynowy i otoczka jądrowa. Po zakończeniu nagrywania ważne jest, aby kontrola jakości eksperymentu pobrała zarodki i wychowała je do zdrowych, płodnych dorosłych.
Procedura ta może być łączona z innymi technikami, takimi jak Rodzicielska Różnica RNA w celu analizy powalonych fenotypów.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Ten protokół opisuje zastosowanie fluorescencyjnej mikroskopi opartej na arkuszach świetlnych do obserwacji morfogenezy zarodków Tribolium castaneum. Porównuje trzy techniki montażu i wprowadza nowe linie transgeniczne do żywych obrazów.
Kluczowe komponenty badania
Obszar nauki
- Neuronauki
- Embriologia
- Techniki obrazowania
Tło
- Tribolium castaneum jest nowym organizmem modelowym owadów.
- Mikroskopia arkuszami świetlnymi minimalizuje fotobielnienie i fototoksyczność.
- Badanie koncentruje się na migracji i proliferacji komórek podczas rozwoju zarodkowego.
- Długotrwała bezinwazyjna obserwacja jest kluczowa dla biologii rozwoju.
Cel badania
- Obserwacja rozwoju zarodków owadów przez dłuższy okres.
- Zadresaowanie pytań związanych z morfogenezą w T. castaneum.
- Poprawa technik obrazowania dla lepszej kontroli jakości.
Zastosowane metody
- Fluorescencyjna mikroskopia oparta na arkuszach świetlnych.
- Trzy techniki montażu zarodków.
- Niestandardowe linie transgeniczne dla ulepszonych obrazów.
- Środki kontroli jakości do oceny efektywności obrazowania.
Główne wyniki
- Skuteczna długotrwała fluorescencyjna mikroskopia zarodków T. castaneum.
- Porównanie technik montażu wykazało różną efektywność.
- Nowe linie transgeniczne poprawiły zdolności żywych obrazów.
- Zidentyfikowano ograniczenia obecnych podejść eksperymentalnych.
Wnioski
- Mikroskopia arkuszami świetlnymi jest skuteczna w badaniu embriogenezy owadów.
- Techniki montażu znacząco wpływają na jakość obrazowania.
- Przyszłe prace powinny zwrócić uwagę na obecne ograniczenia protokołu.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
Light sheet-based fluorescence microscopy enables long-term, noninvasive observation of insect embryogenesis with reduced phototoxicity and photobleaching, supporting mechanistic de-risking in target validation studies. This approach provides quantitative, reproducible imaging data that enhances predictive confidence in developmental biology models relevant to translational research. The protocol establishes standardized mounting techniques and transgenic tools that improve assay reproducibility and scalability for cross-functional R&D workflows.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses through visualization of cell migration and proliferation patterns in developing embryos.
- Operational Value: Supports biological de-risking by providing high signal-to-noise ratio imaging over extended periods to clarify functional target roles.
- Predictive Value: Facilitates portfolio triage by generating reliable phenotypic data from disease-relevant systems for lead identification.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Prepares validated biological systems for downstream workflows through standardized embryo mounting and imaging conditions.
- Operational Value: Addresses assay standardization and reproducibility via defined mounting techniques and quality control measures for live imaging assays.
- Scalability: Highlights screening readiness and platform reuse through compatibility with multiple fluorescent dyes and transgenic lines for intracellular structure labeling.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Discusses disease relevance and translational biomarker alignment through observation of glial cell reorganization and neuronal cluster dynamics in embryos.
- Operational Value: Describes continuity from discovery through preclinical validation by enabling long-term imaging of developmental processes critical to morphogenesis.
- Risk-Adjusted Advancement: Addresses risk-adjusted advancement decisions by providing quantitative data on embryonic development stages for mechanistic de-risking.
Pipeline & Workflow Integration
The method supports the discovery continuum from hypothesis testing in early discovery to preclinical validation by enabling quantitative, reproducible imaging of developmental processes in a disease-relevant system.
- Discovery Biology: Explains how the method supports hypothesis testing, pathway clarification, and biological de-risking through visualization of cell migration and proliferation patterns.
- Screening: Describes assay readiness, reproducibility, and quantitative outputs via standardized mounting techniques and Z-stack acquisition for time-lapse imaging.
- Analytics: Highlights measurements, readouts, and statistical outputs such as Z-maximum projections and dynamic intensity adjustments that help teams compare conditions across time and directions.
- Translational Research: Connects the method to preclinical continuity through observation of glial proliferation dynamics and neuronal cluster formation relevant to neurodevelopmental pathways.
- Enterprise Reuse: Frames the method as a reusable capability rather than a single-use technique through standardized operating procedures and downloadable datasets for community-wide adoption.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence, target validation, reduction of mechanistic ambiguity in developmental processes.
- Operational Value: Standardization, reproducibility, and scalability of imaging workflows across multiple mounting techniques and fluorescent labels.
- Strategic Value: Better go/no-go decisions, capital efficiency, and reduced late-stage biological risk through early phenotypic assessment in embryo models.
- Portfolio Impact: Risk-adjusted prioritization and advancement decisions based on quantitative imaging data from long-term live imaging assays.
Implementation Considerations
- Required scientific expertise in developmental biology, microscopy, and transgenic line handling.
- Instrumentation and analytical infrastructure needs including light sheet microscope, imaging buffer, and analysis software for Z-stack processing.
- Cross-team standardization requirements for mounting techniques, embryo handling, and quality control protocols.
- Adaptation considerations across model systems including applicability to other insect species beyond Tribolium castaneum.
- Practical limitations supported by source material including challenges in embryo mounting stability and gas/ion exchange when agarose coverage is excessive.
