Mikroskopia fluorescencyjna oparta na arkuszach świetlnych żywych lub utrwalonych i barwionych zarodków Tribolium castaneum

Ogólnym celem niniejszego protokołu jest nieinwazyjna obserwacja rozwoju embrionów Tribolium castaneum przez bardzo długi czas. Mikroskopia fluorescencyjna oparta na arkuszu światła pomaga odpowiedzieć na pytania dotyczące morfogenezy w wyłaniającym się owadzim organizmie modelowym Tribolium castaneum, odnosząc się do wzorców migracji i proliferacji komórek od wczesnego blastodermu aż do rozpoczęcia ruchów mięśniowych. Główną zaletą tej metody jest sprowadzenie do minimum czynników krytycznych, takich jak fotoblaknięcie i fototoksyczność, nawet podczas obserwacji embrionów przez kilka dni.

Aby umieścić zarodek w komorze próbki przy użyciu kolumny agarozowej, najpierw należy napełnić strzykawkę o średnicy jednego milimetra wodą destylowaną i za pomocą małego gumowego wężyka podłączyć strzykawkę do szklanej kapilary. Napełnij kapilarę w połowie wodą destylowaną, a następnie za pomocą pędzla przenieś zarodek na wewnętrzną stronę otworu szklanej kapilary i powoli wprowadź kapilarę do ciekłej agarozy, zasysając kilka mikrolitrów agarozy wraz z zarodkiem do wnętrza kapilary. Gdy zarodek znajdzie się na miejscu, nad nim i pod nim powinno znajdować się po kilka mikrolitrów agarozy.

Po zestaleniu się agarozy należy skrócić kapilarę do długości około pięciu milimetrów. Pozostały fragment powinien być całkowicie wypełniony agarozą, a embrion powinien znajdować się w drugim kwartyle. Następnie należy włożyć stalowy cylinder z pinem do komory z próbką i przytwierdzić fragment kapilary na szczycie pinu; kolumna agarozy powinna wystawać o kilka milimetrów poza obszar fragmentu kapilary zawierający embrion.

Aby zamocować embrion w komorze z próbką za pomocą półkuli agarozowej, należy najpierw pobrać 200 µL ciekłej agarozy do strzykawki o średnicy 1 mm, a następnie za pomocą strzykawki wypełnić stalową rurkę z komorą z próbką agarozą od góry, aż do momentu utworzenia się półkuli w dolnym otworze. Po zastygnięciu agarozy należy pobrać embrion końcem pędzla i ułożyć go tak, aby koniec przedni był dostępny. Zanurz półkulę agarozową w ciekłej agarozie, aby pokryć ją cienką warstwą, a następnie umieść embrion końcem przednim skierowanym do góry na biegunie półkuli agarozowej.

Obróć stalową rurkę i za pomocą pędzla skoryguj w razie potrzeby pozycję zarodka. Idealnie mniej niż połowa powierzchni zarodka powinna być pokryta agarozą, a boki powinny być jak najstromo dostępne. Zbyt duża ilość agarozy na powierzchni zarodka prowadzi do ucisku mechanicznego oraz ograniczenia wymiany gazowej i jonowej, co ma dramatyczny wpływ na przeżywalność zarodka.

Następnie powoli włóż stalową rurkę do komory z próbką. Aby zamocować embrion w komorze z próbką za pomocą uchwytu typu Cobweb Holder, najpierw wybierz embrion pędzlem, a następnie odłóż pędzel na bok. Następnie wypełnij otwór z nacięciem uchwytu Cobweb Holder od pięciu do ośmiu µL ciekłego agarozu, po czym usuń większość agarozu, aż pozostanie jedynie cienka warstwa filmu agarozowego.

Umieść embrion na błonie agarozowej i ostrożnie skoryguj jego pozycję, przesuwając go do centrum osi x otworu szczelinowego i wyrównując jego wydłużoną oś przednio-tylną z osią podłużną otworu szczelinowego. Należy upewnić się, że embrion zostanie umieszczony na błonie agarozowej w ciągu 10-15 sekund po jej naniesieniu, czyli dopóki agaroza jest jeszcze w stanie ciekłym, w przeciwnym razie nie przywrze on prawidłowo. Następnie powoli wsuń uchwyt Cobweb do komory z próbką, pozycjonując go w taki sposób, aby nie zakłócał on światła wzbudzenia i emisji.

W przypadku analiz obrazowania na żywo najpierw skonfiguruj odstępy czasowe (time-lapse), a następnie w trybie światła transmitowanego ustaw zarodek wzdłuż osi X i Y w centrum pola widzenia, nie wystawiając go na działanie lasera. Obróć zarodek o 360 stopni w krokach co 90 stopni, aby sprawdzić, czy tkanka nie została uszkodzona podczas procesu montowania. W trybie fluorescencji zdefiniuj stos Z (Z-Stack) dla każdego kierunku, dodając bufor przestrzenny od 25 do 50 mikrometrów przed i za zarodkiem, a następnie określ odstępy w osi Z.

W przypadku obrazowania długoterminowego należy upewnić się, że komora z próbką jest wypełniona odpowiednią ilością buforu do obrazowania, a następnie przykryć otwór komory. Następnie należy rozpocząć proces obrazowania, monitorując poprawność akwizycji we wszystkich kierunkach i kanałach dla wszystkich embrionów. Po zakończeniu okresu obrazowania należy wyjąć uchwyt z komory i przenieść embrion na szkiełko przedmiotowe.

W przypadku użycia kolumny agarozowej należy użyć ostrego ostrza, aby wyciągnąć zarodki z otaczającej ich agarozy. W przypadku użycia półsfery agarozowej należy przenieść półsferę płaską stroną na przedmiotnik. W metodzie z uchwytem typu „pajęczyna” należy użyć pędzla, aby delikatnie zdjąć zarodek z błony agarozowej.

Następnie inkubować preparat z zarodkiem w małym szklanym naczyniu w atmosferze nasyconej wilgocią w standardowych warunkach aż do wyklucia się larw. Aby przetworzyć dane z obserwowanego zarodka, należy otworzyć odpowiednie pliki w właściwym oprogramowaniu do analizy obrazowania i w razie potrzeby obrócić stosy Z (Z-Stacks), aby wyrównać oś przednio-tylną zarodka z osią Y. Przyciąć stosy Z wzdłuż osi X i Y tak, aby pozostało jedynie minimalne tło, a następnie obliczyć maksymalną projekcję Z (Z Maximum Projection) dla każdego stosu Z.

Następnie, w zależności od linii transgenicznej i zastosowanych metod obrazowania, należy wprowadzić odpowiednie dynamiczne korekty intensywności stosów czasowych, aby skorygować ewentualne fotobielenie lub wahania ekspresji. Przy użyciu linii transgenicznej wykazującej ekspresję białka fuzyjnego Histone 2B M-Emerald pod kontrolą promotora alpha-tubublin 1, zarejestrowano 66 godzin rozwoju zarodkowego w temperaturze pokojowej, od momentu retrakcji pasma zarodkowego do zamknięcia grzbietowego. Tę linię z pułapką wzmacniacza można wykorzystać do wizualizacji skupisk neuronów w wyrostkach głowy oraz dynamiki migracji cirrosa podczas zamknięcia grzbietowego.

Obrazowanie podobnej linii transgenicznej, która posiada ten sam transgen, ale w innym miejscu genomu, pozwala na uzyskanie przekrojów optycznych przejścia z gastrulacji do elongacji pasma zarodkowego, ukazujących wewnętrzny układ komórek wyłaniającego się pasma zarodkowego. Wykorzystanie linii transgenicznej glia-blue i pozyskiwanie stosów Z (Z-Stacks) w wielu kierunkach poprzez obrót próbki umożliwia obserwację reorganizacji komórek glejowych wzdłuż i wokół brzusznego sznura nerwowego, a także dynamiki ich proliferacji na stronie grzbietowej płatów głowowych w tym samym embrionie. Małe barwniki fluorescencyjne mogą być również stosowane do specyficznego znakowania struktur międzykomórkowych w celu wyróżnienia określonych cech embrionalnych, takich jak cirrhosis gar, tylne brzuszne komórki cirrhosis lub trójwarstwowa tkanka pasma zarodkowego serosa amnion, która pojawia się podczas zamykania okna serosy.

Dwukolorowe barwienie fluorochromami umożliwia dodatkową wizualizację dwóch struktur wewnątrzkomórkowych w tym samym embrionie. Przykładem mogą być cytoszkielet aktynowy oraz otoczka jądrowa. Po zakończeniu rejestracji, w celu kontroli jakości eksperymentu, istotne jest odzyskanie embrionów i ich doprowadzenie do stadium zdrowych, płodnych osobników dorosłych.

Niniejszą procedurę można połączyć z innymi technikami, takimi jak Parental RNA Difference, w celu analizy fenotypów po wyciszeniu genów.