Name: Mikroskopia fluorescencyjna oparta na arkuszach świetlnych żywych lub utrwalonych i barwionych zarodków Tribolium castaneum (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-04-28T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 15 s
Description: Poznaj mikroskopię fluorescencyjną opartą na arkuszach świetlnych do obserwacji embriogenezy u Tribolium castaneum. Ta metoda umożliwia długoterminowe, nieinwazyjne badanie migracji i proliferacji komórek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy Svenowi Plath za wsparcie techniczne. Linia transgeniczna Glia-blue była miłym prezentem od Gregora Buchera (Getynga, Niemcy). Badania zostały sfinansowane przez Klaster Doskonałości Frankfurt nad Menem ds. Kompleksów Makromolekularnych (CEF-MC, EXC 115, prelegent Volker Dötsch) przyznany częściowo EHKS w Instytucie Molekularnych Nauk Przyrodniczych im. Buchmanna (BMLS, dyrektor Enrico Schleiff) na Uniwersytecie Goethego we Frankfurcie nad Menem przez Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG).

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.
Wkład autora
FS i EHKS są pomysłodawcami badań. FS wygenerował transgeniczne linie AGOC. Obrazowanie fluorescencyjne oparte na arkuszach świetlnych zostało wykonane przez FS i SK. FS i EHKS napisały manuskrypt przy udziale SK.

Kontrola jakości
W badaniach obrazowania na żywo procedura przygotowania i rejestrowania musi być nieinwazyjna, tj. ani mechaniczna i chemiczna obróbka (pobranie, dechorionacja, montaż na uchwycie próbki), ani zintegrowane obciążenie energią podczas obserwacji nie powinny wpływać na żywotność próbki. W przypadku badań charakteryzujących rozwój WT zaleca się stosowanie wyłącznie danych z eksperymentów, w których zarodek przeżywa proces rejestracji, jest pomyślnie pobie...

Czerwony chrząszcz mączny Tribolium castaneum, który należy do dużej rodziny ciemników (Tenebrionidae), ma długą historię w naukach rolniczych i przyrodniczych i jest drugim najlepiej zbadanym modelowym organizmem owadów po muszce owocowej Drosophila melanogaster. W ciągu ostatnich czterech dekad stał się potężnym i popularnym modelowym organizmem owada w genetyce rozwojowej, w ewolucyjnej biologii rozwoju, a w ciągu ostatnich dwudziestu lat w morfogenezie embrionalnej z różnych powodów:
Drosophila i Tribolium należą do Holometabola, ale rozdzieliły się około 300 milionów lat temu1,2,3,4. Podczas gdy rozwój embrionalny Drosophila jest powszechnie uważany za wysoce pochodny, Tribolium wykazuje bardziej rodowy sposób rozwoju, który występuje u znacznie większej części gatunków owadów5,6,7,8,9. Po pierwsze, Tribolium wykazuje nieewolucyjny rozwój głowy, tzn. jego aparat gębowy i czułki wyłaniają się już podczas embriogenezy10,11,12,13,14,15. Po drugie, Tribolium jest zgodne z zasadami rozwoju krótkich zarodków, tj. segmenty brzuszne są dodawane sekwencyjnie z tylnej strefy wzrostu podczas wydłużania pasma zarodkowego16,17,18,19. Po trzecie, Tribolium rozwija się, a następnie degraduje dwie błony pozaembrionalne, tj. owodnię, która pokrywa zarodek tylko brzusznie, oraz błonę surowiczą, która całkowicie otacza zarodek20,21,22. Obie membrany odgrywają kluczową rolę morfogenetyczną23, a także ochronną przed mikroorganizmami24,25 i desiccation26. Po czwarte, zarodkowo rozwijające się nogi są w pełni funkcjonalne w stadium życia larwalnego i służą jako zawiązki dla dorosłych nóg podczas metamorfozy poczwarki27,28,29,30,31.
Ze względu na ich mały rozmiar i skromne wymagania, uprawa Tribolium w laboratorium jest dość prosta. Kultury szczepów typu dzikiego (WT) lub linii transgenicznych zazwyczaj składają się z około 100-300 dorosłych osobników i mogą być przechowywane w jednolitrowych szklanych butelkach (ślad 80 cm2) wypełnionych o wysokości od trzech do czterech centymetrów (około 50 g) pożywką wzrostową, która składa się z pełnoziarnistej mąki pszennej uzupełnionej nieaktywnymi suchymi drożdżami. Zaopatrzenie w wodę nie jest konieczne. Dzięki temu nawet małe laboratoria mogą przechowywać dziesiątki kultur chrząszczy w małych i średnich inkubatorach dostępnych na rynku. Późniejsze stadia rozwojowe Tribolium (larwy po około czwartym stadium rozwojowym, poczwarki i dorosłe osobniki) można łatwo oddzielić od podłoża wzrostowego przez przesiewanie. Zsynchronizowane zarodki uzyskuje się przez inkubację dorosłych osobników przez krótki czas na pożywce do składania jaj. W celu szybkiego rozwoju kultury chrząszczy są utrzymywane w temperaturze 32 °C (około czterech tygodni na pokolenie), podczas gdy hodowla jest zwykle prowadzona w temperaturze 22-25 °C (około dziesięciu tygodni na pokolenie).
W ciągu ostatniej dekady, wiele standardowych technik zostało stopniowo dostosowanych i zoptymalizowanych dla Tribolium, jak podsumowano w książkach o nowych organizmach modelowych32. Ogromne znaczenie mają zaawansowane metody genetyczne, takie jak embryonic33, larval34,35 lub parental36,37 Knockdown genu oparty na interferencji RNA, transformacja linii zarodkowej za pomocą piggyBac<sup class="xref">38,39 lub Minos40 system transpozazy i inżynieria genomu oparta na CRISPR/Cas941. Co więcej, genom Tribolium został zsekwencjonowany około dekady temu42, a obecnie jest w trzeciej rundzie edycji składania genomu43, co pozwala na efektywną i obejmującą cały genom identyfikację oraz systematyczną analizę genów44 lub innych elementów genetycznych45,46. Dodatkowo, genomy czterech innych gatunków chrząszczy (Coleoptera) są dostępne dla porównawczych podejść genetycznych47,48,49,50. W związku ze zsekwencjonowanym genomem przeprowadzono dwie analizy genetyczne na dużą skalę, tj. badanie przesiewowe mutagenezy insercyjnej51 oraz systematyczny ekran knockdown genu oparty na interferencji RNA52,53.
Obrazowanie na żywo fluorescencji za pomocą mikroskopii szerokokątnej, konfokalnej lub opartej na arkuszach świetlnych (LSFM) pozwala obserwować morfologię embrionalną Tribolium jako funkcję czasu (tj. morfogenezy) w wielowymiarowym kontekście (Tabela 1). W szerokokątnej i konfokalnej mikroskopii fluorescencyjnej światło wzbudzenia i emisji jest kierowane przez tę samą soczewkę obiektywu. W obu podejściach cała próbka jest oświetlona dla każdej zarejestrowanej płaszczyzny dwuwymiarowej. W związku z tym próbki są poddawane bardzo wysokim poziomom energii. W LSFM tylko fluorofory w płaszczyźnie ogniskowej są wzbudzane w wyniku rozłączenia oświetlenia i detekcji za pomocą dwóch prostopadle ułożonych soczewek obiektywowych (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 1). LSFM występuje w dwóch kanonicznych implementacjach – mikroskopie oświetlenia jednopłaszczyznowego (SPIM) i mikroskopie fluorescencyjnym opartym na arkuszach cyfrowego skanowania laserowego (DSLM, <silna klasa = "xfig">Rysunek 2) – i oferuje kilka kluczowych zalet w porównaniu z tradycyjnymi podejściami: (i) wewnętrzna zdolność do cięcia optycznego, (ii) dobra rozdzielczość osiowa, (iii) znacznie obniżony poziom fotowybielania, (iv) bardzo niska fototoksyczność, (v) wysoki stosunek sygnału do szumu, (vi) stosunkowo wysoka szybkość akwizycji, (vii) obrazowanie w wielu kierunkach oraz (viii) głębsza penetracja tkanek dzięki zastosowaniu soczewek obiektywowych o niskim oświetleniu numerycznym<klasa sup="xref">54,<klasa sup="xref">55,<klasa sup="xref">56.
LSFM został już z powodzeniem zastosowany w Tribolium do udokumentowania prawie całej morfogenezy embrionalnej57 oraz do analizy zasad pękania błony pozaembrionalnej na początku zamknięcia grzbietowego23. Aby zwiększyć atrakcyjność LSFM w społeczności Tribolium i ogólnie dla nauki o owadach, ogromne znaczenie ma ustanowienie standardowych procedur operacyjnych oraz ulepszenie metod, protokołów i puli zasobów do poziomu, w którym mikroskop stanie się łatwym w użyciu standardowym narzędziem w laboratoriach biologii rozwojowej, a kwestie biologiczne pozostaną w centrum uwagi.
Ten protokół zaczyna się od podstaw uprawy Tribolium, tj. utrzymania, reprodukcji i pobierania zarodków. Następnie zilustrowano dwie strategie eksperymentalne: (i) obrazowanie na żywo niestandardowych linii transgenicznych oraz (ii) obrazowanie utrwalonych zarodków, które zostały wybarwione barwnikami fluorescencyjnymi (Tabela 2). Następnie szczegółowo wyjaśniono trzy techniki montażu o nieco różnych celach (<silna klasa="xfig">Rysunek 3 i Tabela 3): (i) kolumna agarozy, (ii) półkula agarozy i (iii) nowy uchwyt pajęczyny. Następnie protokół wyjaśnia procedurę pozyskiwania danych za pomocą LSFM. Przedstawiono metody obrazowania i kluczowe kwestie, które należy wziąć pod uwagę. Na koniec wyjaśniono proces pobierania zarodków i przedstawiono sugestie dotyczące podstawowego przetwarzania danych. W reprezentatywnych wynikach pokazano dane obrazowania na żywo z dwóch nowatorskich, niestandardowych linii i linii transgenicznych Glia-blue58, a odpowiednie zestawy danych obrazowania są udostępniane jako zasób do pobrania. Dodatkowo przedstawiono dane obrazowe utrwalonych zarodków, które zostały wybarwione różnymi barwnikami fluorescencyjnymi. Dyskusja skupia się na kontroli jakości, obecnych ograniczeniach podejścia do obrazowania na żywo oraz dostosowaniu protokołu do innych gatunków.
Protokół jest napisany dla mikroskopów fluorescencyjnych opartych na arkuszach świetlnych, które są wyposażone w komorę na próbki i obrotowy mechanizm zaciskowy dla standardowych uchwytów na próbki54,59,60, które są zazwyczaj elementami w kształcie walca wykonanymi z metalu, plastiku lub szkła o średnicy w zakresie milimetrów. Protokół nadaje się również zarówno do implementacji kanonicznych, tj. SPIM i DSLM, jak i do konfiguracji z dwoma lub więcej ramionami oświetlenia i detekcji61,62,63. Reprezentatywne wyniki pokazują dane w dwóch kanałach spektralnych, zielonym (oświetlenie laserem 488 nm, detekcja przez filtr pasmowo-przepustowy 525/50) i czerwonym (oświetlenie laserem 561 nm, detekcja przez filtr pasmowo-przepustowy 607/70), ale protokół można rozszerzyć do trzech lub czterech kanałów spektralnych.

<table><tbody><tr><td>mąka pszenna pełnoziarnista</td><td>Demeter e.V.</td><td>1.13E+08</td><td>USA: mąka pełnoziarnista, Wielka Brytania: mąka pełnoziarnista</td></tr><tr><td>405 drobna mąka pszenna</td><td>Demeter e.V.</td><td>1.13E+08</td><td>USA: mąka cukiernicza, Wielka Brytania: miękka mąka</td></tr><tr><td>nieaktywne suche drożdże</td><td>Flystuff / Genesee Scientific</td><td>62-106</td><td></td></tr><tr><td>Saine buforowana fosforanami (PBS), pH 7,4</td> Podchloryn sodu <td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10010-023</td><td></td></tr>, <tr><td>~12% aktywny Cl</td><td>Sigma Aldrich</td><td>425044-250ML</td><td>Uwaga: podchloryn sodu jest</td></tr>, <tr><td>niskotopliwym agarozą</td><td>Carl Roth</td><td>6351.2</td><td></td></tr><tr><td>Płytka 6-dołkowa</td><td>Orange Scientific</td><td>4430500</td><td></td></tr><tr><td>Płytka 24-dołkowa</td><td>Orange</td><td>Scientific 4430300</td><td></td></tr><tr><td>kapilary szklane, wewnętrzne & Oslash; 0,46 mm</td><td>Marka GmbH + Co KG</td><td>7087 09</td><td></td></tr><tr><td>SYTOX Green</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>57020</td><td>Przygotowanie roztworu barwiącego wyjaśniono w Tabeli 2</td></tr><tr><td>Jodek</td> <td>YOYO-1Thermo Fisher Scientific</td><td>Y3601</td><td>Przygotowanie roztworu barwiącego wyjaśniono w Tabeli 2</td></tr><tr><td>BOBO-3 Jodek</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>B3586</td><td>Przygotowanie roztworu barwiącego wyjaśniono w Tabeli 2</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 Phalloidin</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A12379</td><td>Przygotowanie roztworu barwiącego wyjaśniono w Tabeli 2</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 546 Phalloidin</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A22283</td><td>Przygotowanie roztworu barwiącego wyjaśniono w tabeli 2</td></tr><tr><td>sito, 800 &mikro; m rozmiar oczek</td><td>VWR International</td><td>200.025.222-051</td><td></td></tr><tr><td>sito, 710 &mikro; m rozmiar oczek</td><td>VWR International</td><td>200.025.222-050</td><td>do przygotowania podłoża wzrostowego (krok 1.1)</td></tr> <tr><td>sito, 300 i mikro; m rozmiar oczek</td><td>VWR International</td><td>200.025.222-040</td><td></td></tr><tr><td>sito, 250 &mikro; m rozmiar oczek</td><td>VWR International</td><td>200.025.222-038</td><td>do przygotowania podłoża do składania jaj (krok 1.2)</td></tr><tr><td>naczynie szklane, & Oslash; 100 mm & razy; 20 mm</td><td>Sitko komórkowe Sigma Aldrich</td><td>CLS70165102</td><td></td></tr><tr><td>, 100 &mikro; m rozmiar oczek</td><td>BD Biosciences</td><td>352360</td><td></td></tr><tr><td>pędzel, głowica i Oslash; 2 mm</td> Strzykawka <td>VWR International</td><td>149-2121</td><td></td></tr><tr><td>, 1,0 ml</td><td>B. Braun Medical AG</td><td>9166017V</td><td></td></tr><tr><td>fiolki scyntylacyjne</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M1152-1000EA</td><td></td></tr><tr><td>paraformaldehyd (PFA)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>158127</td><td>Uwaga: paraformaldehyd jest toksyczny i</td></tr><tr><td>n-heptan &ge; 99%</td><td>Carl Roth</td><td>8654.1</td><td>Uwaga: n-heptan jest łatwopalny i toksyczny</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma Aldrich</td><td>X100-100ML</td><td>Uwaga: Trition X-100 jest</td></tr></tbody></table>

mikroskopia fluorescencyjna oparta na arkuszach świetlnych żywych lub utrwalonych i barwionych zarodków tribolium castaneum

Light Sheet-based Fluorescence Microscopy of Living or Fixed and Stained Tribolium castaneum Embryos

Czerwony chrząszcz mączny Tribolium castaneum stał się ważnym modelowym organizmem owada w genetyce rozwojowej i ewolucyjnej biologii rozwoju. Obserwacja zarodków Tribolium za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej opartej na arkuszach świetlnych ma wiele zalet w porównaniu z konwencjonalną mikroskopią fluorescencyjną szerokokątną i konfokalną. Dzięki unikalnym właściwościom mikroskopu opartego na arkuszach świetlnych, trójwymiarowe obrazy żywych próbek mogą być rejestrowane z wysokim stosunkiem sygnału do szumu i znacznie zmniejszonym fotobieleniem, a także fototoksycznością w wielu kierunkach przez okresy trwające kilka dni. Biorąc pod uwagę ponad czteroletni rozwój metodologiczny i ciągły przyrost danych, wydaje się, że nadszedł czas, aby ustanowić standardowe procedury operacyjne dotyczące stosowania technologii arkuszy świetlnych w społeczności Tribolium, jak również w całej społeczności owadów. Protokół ten opisuje trzy techniki montażu odpowiednie do różnych celów, przedstawia dwie nowatorskie, wykonane na zamówienie transgeniczne linie tribolium odpowiednie do długoterminowego obrazowania na żywo, sugeruje pięć barwników fluorescencyjnych do oznaczania struktur wewnątrzkomórkowych utrwalonych zarodków i dostarcza informacji na temat przetwarzania końcowego danych w celu terminowej oceny zarejestrowanych danych. Reprezentatywne wyniki koncentrują się na długoterminowym obrazowaniu na żywo, sekcjach optycznych i obserwacji tego samego zarodka w wielu kierunkach. Odpowiednie zestawy danych są udostępniane jako zasób do pobrania. Wreszcie, w protokole omówiono kontrole jakości testów obrazowania na żywo, obecne ograniczenia oraz możliwość zastosowania przedstawionych procedur do innych gatunków owadów.
Ten protokół jest przeznaczony przede wszystkim dla biologów rozwojowych, którzy poszukują rozwiązań do obrazowania, które przewyższają standardowy sprzęt laboratoryjny. Promuje ona nieustanne dążenie do wypełnienia luki między laboratoriami/społecznościami zorientowanymi technicznie, które rozwijają i udoskonalają metodologię mikroskopii, a laboratoriami/społecznościami nauk przyrodniczych, które wymagają rozwiązań typu "plug-and-play" dla wyzwań technicznych. Co więcej, wspiera aksjomatyczne podejście, które przenosi pytania biologiczne w centrum uwagi.

Niniejszy protokół opisuje ramy eksperymentalne dla obrazowania fluorescencyjnego żywych lub utrwalonych i barwionych embrionów Tribolium przy użyciu LSFM. Dzięki niskiemu poziomowi fotoblaknięcia i fototoksyczności, będącym bezpośrednim następstwem możliwości sekcjonowania optycznego, LSFM jest szczególnie odpowiednie do długoterminowego obrazowania na żywo.
Nowa linia transgeniczna AGOC{ATub'H2B-mEmerald} #1 wykazuje ...

Obrazowanie morfogenezy zarodków owadów za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej opartej na arkuszach świetlnych stało się najnowocześniejszym rozwiązaniem. Protokół ten nakreśla i porównuje trzy techniki montażu odpowiednie dla zarodków Tribolium castaneum, wprowadza dwie nowatorskie, wykonane na zamówienie linie transgeniczne, dobrze nadające się do obrazowania na żywo, omawia podstawowe kontrole jakości i wskazuje obecne ograniczenia eksperymentalne.

Mikroskopia fluorescencyjna oparta na arkuszach świetlnych żywych lub utrwalonych i barwionych zarodków Tribolium castaneum

The red flour beetle Tribolium castaneum has become an important insect model organism in developmental genetics and evolutionary developmental biology. ...

Ogólnym celem niniejszego protokołu jest nieinwazyjna obserwacja rozwoju embrionów Tribolium castaneum przez bardzo długi czas. Mikroskopia fluorescencyjna oparta na arkuszu światła pomaga odpowiedzieć na pytania dotyczące morfogenezy w wyłaniającym się owadzim organizmie modelowym Tribolium castaneum, odnosząc się do wzorców migracji i proliferacji komórek od wczesnego blastodermu aż do rozpoczęcia ruchów mięśniowych. Główną zaletą tej metody jest sprowadzenie do minimum czynników krytycznych, takich jak fotoblaknięcie i fototoksyczność, nawet podczas obserwacji embrionów przez kilka dni.Aby umieścić zarodek w komorze próbki przy użyciu kolumny agarozowej, najpierw należy napełnić strzykawkę o średnicy jednego milimetra wodą destylowaną i za pomocą małego gumowego wężyka podłączyć strzykawkę do szklanej kapilary. Napełnij kapilarę w połowie wodą destylowaną, a następnie za pomocą pędzla przenieś zarodek na wewnętrzną stronę otworu szklanej kapilary i powoli wprowadź kapilarę do ciekłej agarozy, zasysając kilka mikrolitrów agarozy wraz z zarodkiem do wnętrza kapilary. Gdy zarodek znajdzie się na miejscu, nad nim i pod nim powinno znajdować się po kilka mikrolitrów agarozy.Po zestaleniu się agarozy należy skrócić kapilarę do długości około pięciu milimetrów. Pozostały fragment powinien być całkowicie wypełniony agarozą, a embrion powinien znajdować się w drugim kwartyle. Następnie należy włożyć stalowy cylinder z pinem do komory z próbką i przytwierdzić fragment kapilary na szczycie pinu; kolumna agarozy powinna wystawać o kilka milimetrów poza obszar fragmentu kapilary zawierający embrion.Aby zamocować embrion w komorze z próbką za pomocą półkuli agarozowej, należy najpierw pobrać 200 µL ciekłej agarozy do strzykawki o średnicy 1 mm, a następnie za pomocą strzykawki wypełnić stalową rurkę z komorą z próbką agarozą od góry, aż do momentu utworzenia się półkuli w dolnym otworze. Po zastygnięciu agarozy należy pobrać embrion końcem pędzla i ułożyć go tak, aby koniec przedni był dostępny. Zanurz półkulę agarozową w ciekłej agarozie, aby pokryć ją cienką warstwą, a następnie umieść embrion końcem przednim skierowanym do góry na biegunie półkuli agarozowej.Obróć stalową rurkę i za pomocą pędzla skoryguj w razie potrzeby pozycję zarodka. Idealnie mniej niż połowa powierzchni zarodka powinna być pokryta agarozą, a boki powinny być jak najstromo dostępne. Zbyt duża ilość agarozy na powierzchni zarodka prowadzi do ucisku mechanicznego oraz ograniczenia wymiany gazowej i jonowej, co ma dramatyczny wpływ na przeżywalność zarodka.Następnie powoli włóż stalową rurkę do komory z próbką. Aby zamocować embrion w komorze z próbką za pomocą uchwytu typu Cobweb Holder, najpierw wybierz embrion pędzlem, a następnie odłóż pędzel na bok. Następnie wypełnij otwór z nacięciem uchwytu Cobweb Holder od pięciu do ośmiu µL ciekłego agarozu, po czym usuń większość agarozu, aż pozostanie jedynie cienka warstwa filmu agarozowego.Umieść embrion na błonie agarozowej i ostrożnie skoryguj jego pozycję, przesuwając go do centrum osi x otworu szczelinowego i wyrównując jego wydłużoną oś przednio-tylną z osią podłużną otworu szczelinowego. Należy upewnić się, że embrion zostanie umieszczony na błonie agarozowej w ciągu 10-15 sekund po jej naniesieniu, czyli dopóki agaroza jest jeszcze w stanie ciekłym, w przeciwnym razie nie przywrze on prawidłowo. Następnie powoli wsuń uchwyt Cobweb do komory z próbką, pozycjonując go w taki sposób, aby nie zakłócał on światła wzbudzenia i emisji.W przypadku analiz obrazowania na żywo najpierw skonfiguruj odstępy czasowe (time-lapse), a następnie w trybie światła transmitowanego ustaw zarodek wzdłuż osi X i Y w centrum pola widzenia, nie wystawiając go na działanie lasera. Obróć zarodek o 360 stopni w krokach co 90 stopni, aby sprawdzić, czy tkanka nie została uszkodzona podczas procesu montowania. W trybie fluorescencji zdefiniuj stos Z (Z-Stack) dla każdego kierunku, dodając bufor przestrzenny od 25 do 50 mikrometrów przed i za zarodkiem, a następnie określ odstępy w osi Z.W przypadku obrazowania długoterminowego należy upewnić się, że komora z próbką jest wypełniona odpowiednią ilością buforu do obrazowania, a następnie przykryć otwór komory. Następnie należy rozpocząć proces obrazowania, monitorując poprawność akwizycji we wszystkich kierunkach i kanałach dla wszystkich embrionów. Po zakończeniu okresu obrazowania należy wyjąć uchwyt z komory i przenieść embrion na szkiełko przedmiotowe.W przypadku użycia kolumny agarozowej należy użyć ostrego ostrza, aby wyciągnąć zarodki z otaczającej ich agarozy. W przypadku użycia półsfery agarozowej należy przenieść półsferę płaską stroną na przedmiotnik. W metodzie z uchwytem typu „pajęczyna” należy użyć pędzla, aby delikatnie zdjąć zarodek z błony agarozowej.Następnie inkubować preparat z zarodkiem w małym szklanym naczyniu w atmosferze nasyconej wilgocią w standardowych warunkach aż do wyklucia się larw. Aby przetworzyć dane z obserwowanego zarodka, należy otworzyć odpowiednie pliki w właściwym oprogramowaniu do analizy obrazowania i w razie potrzeby obrócić stosy Z (Z-Stacks), aby wyrównać oś przednio-tylną zarodka z osią Y. Przyciąć stosy Z wzdłuż osi X i Y tak, aby pozostało jedynie minimalne tło, a następnie obliczyć maksymalną projekcję Z (Z Maximum Projection) dla każdego stosu Z.Następnie, w zależności od linii transgenicznej i zastosowanych metod obrazowania, należy wprowadzić odpowiednie dynamiczne korekty intensywności stosów czasowych, aby skorygować ewentualne fotobielenie lub wahania ekspresji. Przy użyciu linii transgenicznej wykazującej ekspresję białka fuzyjnego Histone 2B M-Emerald pod kontrolą promotora alpha-tubublin 1, zarejestrowano 66 godzin rozwoju zarodkowego w temperaturze pokojowej, od momentu retrakcji pasma zarodkowego do zamknięcia grzbietowego. Tę linię z pułapką wzmacniacza można wykorzystać do wizualizacji skupisk neuronów w wyrostkach głowy oraz dynamiki migracji cirrosa podczas zamknięcia grzbietowego.Obrazowanie podobnej linii transgenicznej, która posiada ten sam transgen, ale w innym miejscu genomu, pozwala na uzyskanie przekrojów optycznych przejścia z gastrulacji do elongacji pasma zarodkowego, ukazujących wewnętrzny układ komórek wyłaniającego się pasma zarodkowego. Wykorzystanie linii transgenicznej glia-blue i pozyskiwanie stosów Z (Z-Stacks) w wielu kierunkach poprzez obrót próbki umożliwia obserwację reorganizacji komórek glejowych wzdłuż i wokół brzusznego sznura nerwowego, a także dynamiki ich proliferacji na stronie grzbietowej płatów głowowych w tym samym embrionie. Małe barwniki fluorescencyjne mogą być również stosowane do specyficznego znakowania struktur międzykomórkowych w celu wyróżnienia określonych cech embrionalnych, takich jak cirrhosis gar, tylne brzuszne komórki cirrhosis lub trójwarstwowa tkanka pasma zarodkowego serosa amnion, która pojawia się podczas zamykania okna serosy.Dwukolorowe barwienie fluorochromami umożliwia dodatkową wizualizację dwóch struktur wewnątrzkomórkowych w tym samym embrionie. Przykładem mogą być cytoszkielet aktynowy oraz otoczka jądrowa. Po zakończeniu rejestracji, w celu kontroli jakości eksperymentu, istotne jest odzyskanie embrionów i ich doprowadzenie do stadium zdrowych, płodnych osobników dorosłych.Niniejszą procedurę można połączyć z innymi technikami, takimi jak Parental RNA Difference, w celu analizy fenotypów po wyciszeniu genów.

light-sheet-based-fluorescence-microscopy-living-or-fixed-stained

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia rozwojowa

Drosophila hemocyty rozprzestrzeniają się po całym rozwijającym się embrionie. Niniejszy protokół demonstruje sposób montowania i obrazowania tych migracji z wykorzystaniem embrionów z hemocytami znakowanymi fluorescencyjnie.

Obrazowanie na żywo migracji hemocytów embrionalnych Drosophila melanogaster

Ten artykuł opisuje przygotowanie próbki do mikroskopii fluorescencyjnej za pomocą arkuszy świetlnych. Zademonstrowano również metodę montowania żywych zarodków danio pręgowanego w celu długoterminowego obrazowania, co pozwala na nagrywanie długich filmów poklatkowych żywych zarodków w warunkach zbliżonych do fizjologicznych.

Przygotowanie próbki do mikroskopii świetlnej: montaż żywych zarodków danio pręgowanego do długoterminowego obrazowania

Source: &lt; style='text-decoration:none;' href='https://app.jove.com/v/57546/visualization-of-motor-axon-navigation-and-quantification-of-axon-arborization-in-mouse-embryos-using-light-sheet-fluorescence-microscopy'&gt;Liau, E. S. et al. Wizualizacja motorycznej nawigacji aksonów i kwantyfikacja arboryzacji aksonów w zarodkach myszy za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej za pomocą lekkiej mikroskopii fluorescencyjnej. J. Vis. Exp. (2018). Ten film demonstruje zastosowanie mikroskopii...

Wizualizacja projekcji neuronów ruchowych i rozgałęzień aksonów za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej arkusza świetlnego

Rozwój danio pręgowanego można obserwować przez wiele dni za pomocą mikroskopii z lekkim arkuszem, gdy zarodki są umieszczane w optycznie przezroczystych rurkach polimerowych z agarozą o niskim stężeniu.

Wielowarstwowe mocowanie do długotrwałej mikroskopii świetlnej danio pręgowanego

Ten protokół opisuje konfigurację mikroskopu z arkuszem świetlnym i jego implementację do obrazowania in vivo zarodków C. elegans.

Konfiguracja prostego mikroskopu z arkuszami świetlnymi do obrazowania in toto rozwoju C. elegans

Mikroskopia fluorescencyjna z lekkim arkuszem jest doskonałym narzędziem do obrazowania rozwoju embrionalnego. Pozwala na nagrywanie długich filmów poklatkowych żywych zarodków w warunkach zbliżonych do fizjologicznych. Demonstrujemy jego zastosowanie do obrazowania rozwoju oka danio pręgowanego w szerokich skalach czasoprzestrzennych i przedstawiamy potok do fuzji i dekonwolucji zestawów danych multiview.

Wykorzystanie mikroskopii fluorescencyjnej arkuszy świetlnych do obrazowania rozwoju oka danio pręgowanego

Tutaj opisujemy protokół wizualizacji projekcji neuronów ruchowych i arboryzacji aksonów w transgenicznych zarodkach myszy Hb9::GFP. Po barwieniu immunologicznym neuronów ruchowych użyliśmy mikroskopii fluorescencyjnej arkusza świetlnego do obrazowania zarodków do późniejszej analizy ilościowej. Protokół ten ma zastosowanie do innych procesów nawigacji neuronów w ośrodkowym układzie nerwowym.

Wizualizacja nawigacji aksonów ruchowych i kwantyfikacja arboryzacji aksonów w zarodkach myszy za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej arkusza światła

To badanie wykorzystuje technikę mikroskopii fluorescencyjnej z dwustronnym oświetleniem (LSFM) w połączeniu z oczyszczaniem optycznym do badania mysiego serca.

Mikroskopia fluorescencyjna z arkuszem świetlnym do badania mysiego serca

Mikroskopia fluorescencyjna oparta na arkuszach świetlnych jest najcenniejszym narzędziem w biologii rozwoju. Głównym problemem w badaniach porównawczych jest wariancja otoczenia. Nasz protokół opisuje eksperymentalne ramy do jednoczesnego obrazowania na żywo wielu próbek i dlatego aktywnie rozwiązuje ten problem.

Jednoczesne obrazowanie na żywo wielu zarodków owadów w mikroskopach fluorescencyjnych z arkuszami świetlnymi w komorze na próbki

Opisano strategię przygotowania próbki do obrazowania wczesnych zarodków danio pręgowanego w nienaruszonym kosmówce za pomocą mikroskopu z arkuszami świetlnymi. Analizuje różne orientacje, jakie zarodki nabywają w kosmówce na 70% etapie epibolii i pąków, a także szczegółowo opisuje strategie obrazowania w celu uzyskania rozdzielczości w skali komórkowej w całym zarodku przy użyciu systemu arkuszy świetlnych.

Obrazowanie w mikroskopii świetlnej i strategie montażu wczesnych zarodków danio pręgowanego

Poznaj mikroskopię fluorescencyjną opartą na arkuszach świetlnych do obserwacji embriogenezy u Tribolium castaneum. Ta metoda umożliwia długoterminowe, nieinwazyjne badanie migracji i proliferacji komórek.

Mikroskopia fluorescencyjna oparta na arkuszach świetlnych żywych lub utrwalonych i barwionych zarodków Tribolium castaneum

Przeglądaj więcej filmów