Name: Wysokoprzepustowa konstrukcja wektora CRISPR i charakterystyka modyfikacji DNA przez generowanie owłosionych korzeni pomidora (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-04-30T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 59 s
Description: Poznaj metodę konstrukcji wektorów CRISPR i generowania mutacyjnych korzeni pomidora w jednym kroku klonowania. Technika ta usprawnia badania genomiki funkcjonalnej roślin.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

To badanie było wspierane przez grant Narodowej Fundacji Nauki IOS-1025642 (GBM). Dziękujemy Marii Harrison za dostarczenie szczepu ARqua1.

1. Projektowanie RNA i konstruowanie wektorów
<ol>
	<li>Zidentyfikuj sekwencje docelowe dla genów będących przedmiotem zainteresowania. Istnieje wiele internetowych programów do wyszukiwania celów CRISPR odpowiednich do tego kroku13,14. 
	UWAGA: Tutaj używamy motywu docelowego GN20GG, ale inne projekty mogą być odpowiednie w zależności od zastosowanej aplikacji lub systemu wektorowego.</li>
	<li>Zaprojektuj 60-merowe oligonukleotydy gRNA tak, aby zawierały część GN19 docelowych motywów otoczonych sekwencjami 5' i 3' 20-nt, które są wymagane do złożenia DNA. Końcowy motyw 60-merowy to: 5'-TCAAGCGAACCAGTAGGCTT-GN 19-GTTTTAGAGCTAGAAATAGC-3'. 
	UWAGA: Standardowe, odsolone podkłady działają bez zarzutu.</li>
	<li>Przygotuj cztery DNA do złożenia (ryc. 1). Zobacz plik uzupełniający dla sekwencji DNA.
	<ol>
		<li>Trawić 1 - 5 μg plazmidu p201N:Cas910 z enzymem restrykcyjnym SpeI w 1x buforze 4 w temperaturze 37 °C przez 2 godziny. Oczyszczać traw w kolumnie zgodnie z instrukcjami producenta. Zawiesić w ~15 μl 10 mM Tris-HCl i określić ilościowo za pomocą spektrofotometrii UV.</li>
		<li>Wykonaj drugie trawienie enzymem restrykcyjnym SwaI w 1x buforze 3,1 w temperaturze 25 °C przez 2 godziny. Sprawdź 100 - 200 ng na 0,8% żelu agarozowym, aby potwierdzić całkowite trawienie. 
		UWAGA: Prawidłowo strawiony plazmid będzie miał pojedyncze pasmo przy 14 313 pz. Uwaga: Inaktywacja termiczna enzymu i defosforylacja nie są wymagane. Strawiony plazmid może być przechowywany w temperaturze -20 °C.</li>
		<li>PCR amplifikuje promotor Medicago truncatula (Mt) U6 i rusztowanie DNA z plazmidu pUC gRNA Shuttle10 przy użyciu odpowiednio starterów SwaI_MtU6F / MtU6R i ScaffoldF / SpeI_ScaffoldR. Użyj polimerazy o wysokiej wierności w warunkach PCR: 95 °C przez 3 min; 31 cykli (98 °C przez 20 sekund, 60 °C przez 15 sekund, 72 °C przez 30 sekund); i 72 °C przez 5 min.
		<ol>
			<li>Wizualizuj ~ 3 μl porcji produktów PCR na 1% żelu agarozowym, aby potwierdzić amplifikację. Amplikon MtU6 wynosi 377 pz, a amplikon rusztowania 106 pz. Pozostałe produkty PCR należy oczyścić kolumnowo zgodnie z instrukcjami producenta, określić ilościowo za pomocą spektrofotometrii UV i przechowywać w temperaturze -20 °C.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Zawiesić całą probówkę oligonukleotydów gRNA do 100 μM w wodzie o jakości laboratoryjnej. Dodać 1 μl 100 μM oligo do 500 μl 1x bufor 2.1. Dobrze wymieszaj. W przypadku łączenia wielu oligonukleotydów, dodaj 1 μl każdego oligonukleotydu o wielkości 100 μM do probówki 1x Buffer 2.1. Rozcieńczone oligonukleotydy można przechowywać w temperaturze -20 °C.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Zaprogramować termocykler tak, aby utrzymywał temperaturę 50 °C za pomocą podgrzewanej pokrywy. Połączyć 100 ng (0,011 pmol) zlinearyzowanego wektora, 50 ng (0,2 pmol) promotora MtU6, 12 ng (0,2 pmol) rusztowania, 1 μl (0,2 pmol) rozcieńczonego oligonukleotydy gRNA i wodę do objętości 5 μl. Dodaj 5 μl 2x wysokiej jakości mieszanki głównej do montażu DNA, dobrze wymieszaj i odwiruj. Inkubować reakcję przez 60 minut w termocyklerze o temperaturze 50 °C. Następnie umieść reakcję na lodzie. 
	Uwaga: Objętości reakcji można zwiększyć, aby dostosować się do niskiej wydajności DNA.</li>
	<li>Przekształć 2 μl reakcji w właściwe komórki E. coli przy użyciu standardowych technik i płytkę na LB uzupełnioną 50 mg L-1 kanamycyny (Kan50). Hodować platerowane komórki w temperaturze 37 °C przez noc. Pozostałą reakcję składania DNA należy zachować w temperaturze -20 °C.</li>
	<li>Badanie kolonii metodą PCR przy użyciu starterów StUbi3P218R i ISceIR. Rozcieńczyć podwielokrotność pozostałej reakcji składania DNA wodą w stosunku 1:5. Użyj 1 μl jako kontroli pozytywnej dla ekranu kolonii i 1 ng okrągłego plazmidu p201N: Cas9 jako kontroli bez wstawiania.
	<ol>
		<li>PCR amplifikować w zależności od warunków; 95 °C przez 3 min; 31 cykli (95 °C przez 30 sekund, 58 °C przez 30 sekund, 72 °C przez 30 sekund); i w temperaturze 72 °C przez 5 minut. Wizualizacja produktów PCR na 1% żelu agarozowym. Upewnij się, że prawidłowe wstawienia mają pasmo 725 pz, a wektory bez wstawień (np. wektor nieobcięty) będą miały pasmo 310 pz.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Hodować dodatnie kolonie w płynnych kulturach LB Kan50 przez noc w temperaturze 37 °C i oczyszczać plazmidy zgodnie z instrukcjami producenta. Sekwencjonuj plazmidy Sangera za pomocą startera StUbi3P218R i dopasuj chromatogramy do sekwencji promotora, celu i rusztowania MtU6, aby upewnić się, że podczas klonowania nie wprowadzono żadnych błędów.</li>
	<li>Wykonaj diagnostyczne trawienie, trawiąc ~1 μg plazmidu za pomocą EcoRV i StyI. Wizualizuj na 0,8% żelu agarozowym. Fragmenty (w bp) to: 4192, 2001, 1743, 1544, 1381, 995, 831, 702, 460, 423, 318 i 174.</li>
	<li>Użyj złożenia DNA do budowy wektorów z wieloma gRNA.
	<ol>
		<li>Aby skonstruować wektor z dwiema kasetami gRNA, PCR amplifikuje gRNA pierwszej pozycji za pomocą starterów SwaI_MtU6F / UNS1_ScaffoldR, a gRNA drugiej pozycji za pomocą starterów UNS1_MtU6F / SpeI_ScaffoldR od 1 ng każdego z odpowiednich plazmidów skonstruowanych w krokach 1.1 - 1.8. Użyj warunków PCR w kroku 1.3.3. Wizualizuj ~ 3 μl porcji produktów PCR na 1% żelu agarozowym, aby potwierdzić amplifikację. Amplikony wynoszą ~500 pz.</li>
		<li>Połącz i wymieszaj w przybliżeniu równe ilości nieoczyszczonych produktów PCR w probówce o pojemności 200 μl (zwykle 3-4 μl każdej). Do montażu dodaj 1 μl połączonych produktów PCR, 50 ng zlinearyzowanych P201N:Cas9 SwaI i SpeI, wodę klasy laboratoryjnej do 2,5 μl i 2,5 μl 2x wysokiej jakości mieszanki wzorcowej do montażu DNA. Inkubować w termocyklerze o temperaturze 50 °C przez 15 min. 
		Uwaga: Instrukcja montażu DNA zaleca 15-minutową inkubację dla 2 - 3 fragmentów.</li>
		<li>Przekształć 1 - 2 μl w kompetentne komórki E. coli i umieść na płytce LB Kan50. Hodować posiane komórki w temperaturze 37 °C przez noc. Zachować pozostałą reakcję w temperaturze -20 °C.</li>
		<li>Badanie kolonii metodą PCR ze starterami StUbi3P218R i ISceIR w takich samych warunkach, jak w kroku 1.6. Prawidłowe klony będą miały amplikon 1,200 pz. Hoduj dodatnie kolonie w płynnych kulturach LB Kan50 przez noc i oczyszczaj plazmidy.</li>
		<li>Plazmidy sekwencji Sangera ze starterami StUbi3P218R (obejmuje gRNA pierwszej pozycji) i p201R (obejmuje gRNA drugiej pozycji). Dopasuj chromatogramy do sekwencji promotora, celu i rusztowania MtU6. Przegląd diagnostyczny z EcoRV i StyI da wynik w postaci następujących fragmentów (w bp): 4192, 2476, 1743, 1544, 1381, 995, 831, 702, 460, 423, 318, 174. Pogrubiony fragment zawiera drugie gRNA.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Po spełnieniu wszystkich oczekiwań związanych z kontrolą jakości, przekształć plazmidy w Agrobacterium rhizogenes szczep ARqua115. Dodać 1 μl preparatu plazmidowego do 50 μl ogniw elektrokompetentnych i elektroporować w kuwecie 1 mm z ustawieniami: 2,4 kV, 25 μF i 200 Ω. Odzyskaj komórki w ~500 μl SOC i wstrząsaj w temperaturze 28 °C przez 2 godziny. Talerz na LB Kan50 i rosnąć w temperaturze 28 °C przez 2 dni. Przeprowadzić badanie przesiewowe kolonii przy użyciu tych samych starterów i warunków PCR, co w ppkt 1.3.3. Wytwarzaj zapasy glicerolu z dodatnich klonów.</li>
</ol>
2. Transformacja owłosionego korzenia
<ol>
	<li>Sterylizuj nasiona pomidorów w 20% domowym wybielaczu przez 15 minut, stale mieszając. W okapie z przepływem laminarnym usuń wybielacz i umyj 3 razy w sterylnej wodzie laboratoryjnej.</li>
	<li>Umieść 30 nasion w pudełku GA-7 zawierającym 1/2 MS pożywki (2,22 g soli L-1 MS + witaminy Gamborg, 10 g sacharozy L-1, 3 g gumy L-1 gellan, pH 5,8). Kiełkuj przez ~ 2 dni w ciemności, a następnie przenieś pudełka GA-7 do światła. Hoduj sadzonki jeszcze przez ~ 4 dni w świetle.</li>
	<li>Dzień przed przemianą rozsiać kultury A. rhizogenes na stałym LB Kan50 i hodować w temperaturze 28 °C przez noc.</li>
	<li>W dniu przemiany, w okapie z przepływem laminarnym zbierz sterylne materiały: 12 ml probówek hodowlanych, 50 ml probówki stożkowej, 1/2 MS płynu (bez gumy gellan), 200 μM acetosyringonu, bibułę filtracyjną, szalki Petriego, kleszcze i skalpel, pipety i końcówki do pipet. Dodać 25 μl acetosyringonu do 50 ml 1/2 MS i wlać ~ 6 ml do każdej probówki hodowlanej.</li>
	<li>Za pomocą wygiętej końcówki o objętości 200 μl zeskrobać komórki A. rhizogenes z płytki i ponownie zawiesić w 6 ml 1/2 MS płynu. Odwiruj rurkę, aby całkowicie zawiesić komórki. Po ponownym zawieszeniu komórek z każdego wektora zmierz gęstość optyczną (OD) 1 ml komórek o stałej długości fali 600 nM. Upewnij się, że średnica zewnętrzna wynosi od 0,2 do 0,4; W razie potrzeby rozcieńczyć lub dodać więcej komórek. Powtórz te czynności dla każdej konstrukcji.</li>
	<li>Dodać ~ 2 ml 1/2 MS płynu na szalkę Petriego za pomocą sterylnej bibuły filtracyjnej. Wyciąć liścienie z sadzonek i umieścić na zwilżonej bibule filtracyjnej. Po zebraniu wszystkich liścieni odetnij dystalną warstwę o ~ 1 cm od liścieni, w wyniku czego otrzymasz kawałki liścienia z dwoma odciętymi końcami. Dodaj eksplantaty do roztworów A. rhizogenes, wymieszaj i inkubuj przez 20 minut, od czasu do czasu odwracając. 
	Uwaga: Rutynowo stosuje się około 12 eksplantatów na konstrukt, chociaż aż 80 eksplantatów zaszczepiono w 6 ml roztworu A. rhizogenes.</li>
	<li>Podczas inkubacji A. rhizogenes dodać bibułę filtracyjną do szalek Petriego, po jednej na przekształcony konstrukt. Ustaw również 1/2 MS pożywki stałej, bez antybiotyków, w okapie z przepływem laminarnym do wyschnięcia.</li>
	<li>Wyciągnij liścienie z roztworu A. rhizogenes za pomocą sterylnych kleszczyków i umieść na suchej bibule filtracyjnej. Przykryj pokrywką Petriego, aby upewnić się, że tkanki nie wyschną podczas przechodzenia do następnej przemiany. Osuszyć liścienie na bibule filtracyjnej i przenieś, stroną odtłuszczoną do góry, do pożywki 1/2 MS. Owiń talerze taśmą chirurgiczną i współuprawiaj w ciemności w temperaturze pokojowej przez 2 dni.</li>
	<li>Po wspólnej hodowli przenieść liścienie, stroną odtłuszczającą do góry, na 1/2 pożywki MS uzupełnionej 300 mg L-1 tikarcyliny/kwasu klawulanowego (Tim300, aby zapobiec wzrostowi resztkowych A. rhizogenes) i Kan50 (do selekcji roślin) i owinąć taśmą chirurgiczną. Utrzymuj kultury pod lampami fluorescencyjnymi w temperaturze pokojowej z 16-godzinnym fotoperiodem.</li>
	<li>Po ~1,5 - 2 tygodniach korzenie o długości co najmniej 2 cm wycina się z liścieni za pomocą sterylnych kleszczy i skalpela i przenosi na pożywkę 1/2 MS Kan50 Tim300. Przenieś od 10 do 15 korzeni na jedną płytkę. Zaznacz położenie końcówek korzeni markerem, owiń taśmą chirurgiczną i utrzymuj w pomieszczeniu hodowlanym.</li>
	<li>Po tygodniu na selektywnych podłożach widać rosnące przekształcone korzenie. Zbierz podpróbkę przekształconych korzeni w celu ekstrakcji DNA przy użyciu preferowanej metody ekstrakcji DNA. Uwaga: Talerze z liścieniami można przechowywać przez 2-3 tygodniowe zbiory, po czym korzenie zamieniają się w splątany bałagan i są trudne do odizolowania. Niepobrane tkanki korzeniowe mogą być utrzymywane w nieskończoność. Na wyizolowanych próbkach DNA można przeprowadzić różne testy w celu określenia częstotliwości i typu mutacji DNA. Wyniki kilku takich testów opisano poniżej.</li>
</ol>

<ol><li>Jinek, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+programmable+dual-RNA-guided+DNA+endonuclease+in+adaptive+bacterial+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity.</a> Science. 337 (6096), 816-821 (2012).</li>
<li>Shalem, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-scale+CRISPR-Cas9+knockout+screening+in+human+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Genome-scale CRISPR-Cas9 knockout screening in human cells.</a> Science. 343 (6166), 84-87 (2014).</li>
<li>Zhou, Y. X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+screening+of+a+CRISPR%2FCas9+library+for+functional+genomics+in+human+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">High-throughput screening of a CRISPR/Cas9 library for functional genomics in human cells.</a> Nature. 509 (509), 487-491 (2014).</li>
<li>Doudna, J. A., Charpentier, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+new+frontier+of+genome+engineering+with+CRISPR-Cas9%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">The new frontier of genome engineering with CRISPR-Cas9.</a> Science. 346 (6213), (2014).</li>
<li>Belhaj, K., Chaparro-Garcia, A., Kamoun, S., Patron, N. J., Nekrasov, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Editing+plant+genomes+with+CRISPR%2FCas9%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Editing plant genomes with CRISPR/Cas9.</a> Current Opinion in Biotechnology. 32, 76-84 (2015).</li>
<li>Bortesi, L., Fischer, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+CRISPR%2FCas9+system+for+plant+genome+editing+and+beyond%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnology+Advances%22%5BJournal%5D)">The CRISPR/Cas9 system for plant genome editing and beyond.</a> Biotechnology Advances. 33 (1), 41-52 (2015).</li>
<li>Jia, H. G., Wang, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+genome+editing+of+sweet+orange+using+Cas9%2FsgRNA%5BTitle%5D)+AND+%22Plos+One%22%5BJournal%5D)">Targeted genome editing of sweet orange using Cas9/sgRNA.</a> Plos One. 9, (2014).</li>
<li>Upadhyay, S. K., Kumar, J., Alok, A., Tuli, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA-Guided+Genome+Editing+for+Target+Gene+Mutations+in+Wheat%5BTitle%5D)+AND+%22G3-Genes+Genomes+Genetics%22%5BJournal%5D)">RNA-Guided Genome Editing for Target Gene Mutations in Wheat.</a> G3-Genes Genomes Genetics. 3 (12), 2233-2238 (2013).</li>
<li>Ron, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hairy+root+transformation+using+Agrobacterium+rhizogenes.+as+a+tool+for+exploring+cell+type-specific+gene+expression+and+function+using+tomato+as+a+model%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiology%22%5BJournal%5D)">Hairy root transformation using Agrobacterium rhizogenes. as a tool for exploring cell type-specific gene expression and function using tomato as a model.</a> Plant Physiology. 166 (2), 455-U4442 (2014).</li>
<li>Jacobs, T. B., LaFayette, P. R., Schmitz, R. J., Parrott, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+genome+modifications+in+soybean+with+CRISPR%2FCas9%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Targeted genome modifications in soybean with CRISPR/Cas9.</a> BMC Biotechnology. 15, (2015).</li>
<li>Gibson, D. G., Smith, H. O., Hutchison, C. A., Venter, J. C., Merryman, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemical+synthesis+of+the+mouse+mitochondrial+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Chemical synthesis of the mouse mitochondrial genome.</a> Nature Methods. 7 (11), 901-903 (2010).</li>
<li>Zhou, X., Jacobs, T. B., Xue, L. J., Harding, S. A., Tsai, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exploiting+SNPs+for+biallelic+CRISPR+mutations+in+the+outcrossing+woody+perennial+Populus+reveals+4-coumarate%3ACoA+ligase+specificity+and+redundancy%5BTitle%5D)+AND+%22New+Phytologist%22%5BJournal%5D)">Exploiting SNPs for biallelic CRISPR mutations in the outcrossing woody perennial Populus reveals 4-coumarate:CoA ligase specificity and redundancy.</a> New Phytologist. , (2015).</li>
<li>Stemmer, M., Thumberger, T., Keyer, M. D., Wittbrodt, J., Mateo, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CCTop%3A+An+Intuitive%2C+Flexible+and+Reliable+CRISPR%2FCas9+Target+Prediction+Tool%5BTitle%5D)+AND+%22Plos+One%22%5BJournal%5D)">CCTop: An Intuitive, Flexible and Reliable CRISPR/Cas9 Target Prediction Tool.</a> Plos One. 10, (2015).</li>
<li>Lei, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR-P%3A+A+Web+Tool+for+Synthetic+Single-Guide+RNA+Design+of+CRISPR-System+in+Plants%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Plant%22%5BJournal%5D)">CRISPR-P: A Web Tool for Synthetic Single-Guide RNA Design of CRISPR-System in Plants.</a> Molecular Plant. 7 (9), 1494-1496 (2014).</li>
<li>Quandt, H. J., Puhler, A., Broer, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TRANSGENIC+ROOT-NODULES+OF+VICIA-HIRSUTA+-+A+FAST+AND+EFFICIENT+SYSTEM+FOR+THE+STUDY+OF+GENE-EXPRESSION+IN+INDETERMINATE-TYPE+NODULES%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Plant-Microbe+Interactions%22%5BJournal%5D)">TRANSGENIC ROOT-NODULES OF VICIA-HIRSUTA - A FAST AND EFFICIENT SYSTEM FOR THE STUDY OF GENE-EXPRESSION IN INDETERMINATE-TYPE NODULES.</a> Molecular Plant-Microbe Interactions. 6, 699-706 (1993).</li>
<li>Zhu, X. X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+efficient+genotyping+method+for+genome-modified+animals+and+human+cells+generated+with+CRISPR%2FCas9+system%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">An efficient genotyping method for genome-modified animals and human cells generated with CRISPR/Cas9 system.</a> Scientific Reports. 4 (8), (2014).</li>
<li>Belhaj, K., Chaparro-Garcia, A., Kamoun, S., Nekrasov, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plant+genome+editing+made+easy%3A+targeted+mutagenesis+in+model+and+crop+plants+using+the+CRISPR%2FCas+system%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Methods%22%5BJournal%5D)">Plant genome editing made easy: targeted mutagenesis in model and crop plants using the CRISPR/Cas system.</a> Plant Methods. 9 (1), 39(2013).</li>
<li>Cong, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiplex+genome+engineering+using+CRISPR%2FCas+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems.</a> Science. 339 (6121), 819-823 (2013).</li>
<li>Li, J. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiplex+and+homologous+recombination-mediated+genome+editing+in+Arabidopsis+and+Nicotiana+benthamiana+using+guide+RNA+and+Cas9%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotech%22%5BJournal%5D)">Multiplex and homologous recombination-mediated genome editing in Arabidopsis and Nicotiana benthamiana using guide RNA and Cas9.</a> Nat Biotech. 31 (8), 688-691 (2013).</li>
<li>Fu, Y. F., Sander, J. D., Reyon, D., Cascio, V. M., Joung, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improving+CRISPR-Cas+nuclease+specificity+using+truncated+guide+RNAs%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Improving CRISPR-Cas nuclease specificity using truncated guide RNAs.</a> Nature Biotechnology. 32 (3), 279-284 (2014).</li>
<li>Torella, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unique+nucleotide+sequence-guided+assembly+of+repetitive+DNA+parts+for+synthetic+biology+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Unique nucleotide sequence-guided assembly of repetitive DNA parts for synthetic biology applications.</a> Nat Protoc. 9 (9), 2075-2089 (2014).</li>
<li>Ono, N. N., Tian, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+multiplicity+of+hairy+root+cultures%3A+Prolific+possibilities%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Science%22%5BJournal%5D)">The multiplicity of hairy root cultures: Prolific possibilities.</a> Plant Science. 180 (3), 439-446 (2011).</li>
<li>Tepfer, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transformation+of+several+species+of+higher+plants+by+Agrobacterium+rhizogenes.%3A+sexual+transmission+of+the+transformed+genotype+and+phenotype%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Transformation of several species of higher plants by Agrobacterium rhizogenes.: sexual transmission of the transformed genotype and phenotype.</a> Cell. 37 (3), 959-967 (1984).</li>
<li>Li, H., Deng, Y., Wu, T. L., Subramanian, S., Yu, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Misexpression+of+miR482%2C+miR1512%2C+and+miR1515+Increases+Soybean+Nodulation%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiology%22%5BJournal%5D)">Misexpression of miR482, miR1512, and miR1515 Increases Soybean Nodulation.</a> Plant Physiology. 153 (4), 1759-1770 (2010).</li>
<li>Boisson-Dernier, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Agrobacterium+rhizogenes-transformed+roots+of+Medicago+truncatula+for+the+study+of+nitrogen-fixing+and+endomycorrhizal+symbiotic+associations%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Plant-Microbe+Interactions%22%5BJournal%5D)">Agrobacterium rhizogenes-transformed roots of Medicago truncatula for the study of nitrogen-fixing and endomycorrhizal symbiotic associations.</a> Molecular Plant-Microbe Interactions. 14 (6), 695-700 (2001).</li>
<li>Collier, R., Fuchs, B., Walter, N., Kevin Lutke, W., Taylor, C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ex+vitro.+composite+plants%3A+an+inexpensive%2C+rapid+method+for+root+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Journal%22%5BJournal%5D)">Ex vitro. composite plants: an inexpensive, rapid method for root biology.</a> Plant Journal. 43 (3), 449-457 (2005).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Ponieważ składanie DNA służy do rekombinacji wszelkich nakładających się na siebie sekwencji DNA, ta metoda klonowania może być zastosowana do dowolnej konstrukcji wektora CRISPR. Większość schematów klonowania CRISPR wykorzystuje syntezę genów gRNA, enzymy restrykcyjne typu IIS17,18 lub PCR z rozszerzeniem nakładaniasię 19. Każda z tych technik ma nieodłączne zalety i wady, ale zazwyczaj wymagają one wielu praktycznych kroków klonowania. Podstawową zaletą przedstawionej tutaj metody klonowania jest...

Możliwość generowania ukierunkowanych modyfikacji DNA za pomocą CRISPR/Cas9 ma ogromny potencjał dla badań genomiki funkcjonalnej. System CRISPR/Cas9 składa się z dwóch elementów; nukleaza Cas9, pochodząca ze Staphylococcus pyogenes i cząsteczki przewodnika RNA (gRNA) o objętości około 100-nt, która kieruje Cas9 do docelowego miejsca (miejsc) DNA1. Rozpoznawanie celu jest zapewnione przez pierwsze ~20-nt gRNA, co pozwala na wysokoprzepustową produkcję wektorów docelowych2,3. Większość organizmów, które można zmodyfikować, została już wyposażona w technologię CRISPR/Cas94,5.
W roślinach, konstytutywne promotory, takie jak promotor CaMV 35S, są powszechnie używane do napędzania ekspresji nukleazy Cas96. GRNA są wyrażane przy użyciu promotorów polimerazy RNA III, U6 lub U3, która ogranicza pierwszą zasadę gRNA do G dla U6 lub A dla U3 w celu wydajnej transkrypcji. Jednak promotory polimerazy RNA II, które są wolne od tych ograniczeń, zostały również wykorzystane7,8.
Różne gRNA wywołują mutacje DNA z różną skutecznością, dlatego ważne może być najpierw zweryfikowanie wektorów CRISPR przed zainwestowaniem w transformacje całej rośliny lub utworzeniem rozległych badań fenotypowych. Przejściowa ekspresja konstruktów CRISPR w roślinach, na przykład za pomocą agroinfiltracji, na ogół skutkuje niższą częstotliwością modyfikacji DNA w porównaniu ze stabilnymi roślinami6, co utrudnia wykrywanie mutacji, a testy fenotypowe są niepraktyczne przy takich podejściach. Tak zwane owłosione korzenie są wygodnym, alternatywnym systemem, ponieważ duża liczba niezależnych, stabilnie przekształconych materiałów może zostać wygenerowana w ciągu kilku tygodni, a nie miesięcy w przypadku stabilnych roślin. Wektory CRISPR są bardzo skuteczne w indukowaniu mutacji DNA w owłosionych korzeniach9,10.
Metody składania DNA skutecznie ligatują fragmenty DNA zawierające nakładające się na siebie końce11. Główną zaletą niektórych metod składania DNA jest możliwość włączenia ssDNA (tj. oligonukleotydów) do złożonych produktów. Ponieważ gRNA mają tylko ~20-nt długości, a nowe cele można tworzyć za pomocą zsyntetyzowanych oligonukleukleotów, te metody składania DNA dobrze nadają się do klonowania CRISPR. Opisane tutaj protokoły oparte są na serii wektorów CRISPR p201, która została z powodzeniem zastosowana w soi10, topoli12, a teraz pomidorach. Przedstawiona procedura klonowania ma kilka zalet w porównaniu z obecną metodą klonowania10. Mianowicie, w pełni funkcjonalne wektory mogą być generowane w jednej reakcji klonowania w ciągu jednego dnia. Konstrukcja wektorowa może być również łączona w celu równoległego generowania wielu wektorów CRISPR, co jeszcze bardziej skraca czas pracy i koszty materiałów. Przedstawiamy również protokół generowania owłosionych korzeni pomidora jako skuteczną metodę wytwarzania materiałów transgenicznych z celowanymi delecjami genów. Owłosione korzenie są wykorzystywane do walidacji wektorów CRISPR i dostarczają materiału do kolejnych eksperymentów.

<table><tbody><tr><td>NEBuilder&reg; (Mieszanka montażowa HiFi DNA)</td><td>New England Biolabs</td><td>E5520</td><td></td></tr><tr><td>p201N:Cas9</td><td>Addgene</td><td>59175</td><td>Plazmid p201H:Cas9 (59176) jest również zgodny z zgłoszonymi nakładkami i enzymami.</td></tr><tr><td>pUC gRNA Shuttle</td><td>Addgene</td><td>47024</td><td></td></tr><tr><td>SwaI</td><td>New England Biolabs</td><td>R0604S</td><td></td></tr><tr><td>SpeI</td><td>New England Biolabs</td><td>R0133S</td> Oczyszczanie w czystej i 5 kolumnach <td></td></tr><tr><td>Zymo</td><td>Research</td><td>D4003</td><td></td></tr><tr><td>Bufor NEB 2.1</td><td>New England Biolabs</td><td>B7202S</td><td></td></tr><tr><td>NEB CutSmart (bufor 4)</td><td>New England Biolabs</td><td>B7204S</td><td></td></tr><tr><td>NEB Buffer 3.1</td><td>New England Biolabs</td><td>B7203S</td> EconoSpin Mini wirowa kolumna <td></td></tr><tr><td>(przygotowanie plazmidu)</td><td>Epoka Nauki Przyrodnicze</td><td>1910-050/250</td><td></td></tr><tr><td>EcoRV-HF&reg;</td><td>New England Biolabs</td><td>R3195S</td><td></td></tr><tr><td>StyI-HF&reg;</td><td>New England Biolabs</td><td>R3500S</td><td></td></tr><tr><td>Sole MS + Gamborg Witaminy</td><td>Laboratoria fitotechnologiczne</td><td>M404</td><td></td></tr><tr><td>Fitagel i handel; (guma gellan)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P8169</td><td></td></tr><tr><td>GA-7 Pudełka</td><td>Sigma Aldrich</td><td>V8505</td><td></td></tr><tr><td>Taśma chirurgiczna Micropore&trade</td><td>3M</td><td>1535-0</td><td></td></tr><tr><td>Timentin&reg; (Tikarcylina/kwas klawulanowy)</td><td>Różne</td><td>0029-6571-26</td><td></td></tr><tr><td>Podkłady 5' &#8594; 3'SwaI_MtU6F</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td>GATATTAATCTCTTCGATGA AATTTATGCCTATCTTATAT GATCAATGAGG</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MtU6R&nbsp; &nbsp;</td><td>AAGCCTACTGGTTCGCTTG AAG</td><td></td><td></td></tr><tr><td>RusztowanieF&nbsp;</td><td>GTTTTAGAGCTAGAAATAGC AAGTT</td><td></td><td></td></tr><tr><td>SpeI_Scaffold R</td><td>GTCATGAATTGTAATACGACTC AAAAAAAAGCACCGACTCGGTG</td><td></td><td></td></tr><tr><td>StUbi3P218R&nbsp;</td><td>ACATGCACCTAATTTCACTA GATGT</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ISceIR</td><td>GTGATCGATTACCCTGTTAT CCCTAG</td><td>Nie może być używany do sekwencjonowania Sangera, ponieważ na plazmidzie</td><td></td>znajduje się drugie miejsce wiązania</tr><tr><td>UNS1_Scaffold R&nbsp;</td><td>GAGAATGGATGCGAGTAATGAA AAAAAGCACCGACTCGGTG</td><td></td><td></td></tr><tr><td>UNS1_MtU6 F&nbsp; &nbsp;</td><td>CATTACTCGCATCCATTCTCAT GCCTATCTTATATGATCAATGAGG</td><td></td><td></td></tr><tr><td>p201R&nbsp;</td><td>CGCGCCGAATTCTAGTGATCG</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pogrubione sekwencje oznaczają nakładanie się 20-nt ze zlinearyzowanymi p201N:Cas9.</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

wysokoprzepustowa konstrukcja wektora crispr i charakterystyka modyfikacji dna przez generowanie owłosionych korzeni pomidora

High-throughput CRISPR Vector Construction and Characterization of DNA Modifications by Generation of Tomato Hairy Roots

Ukierunkowane mutacje DNA generowane przez wektory z technologią CRISPR/Cas9 (clustered regularly interspaced short palindromic repeats)/Cas9 okazały się przydatne w badaniach genomiki funkcjonalnej. Chociaż większość strategii klonowania jest prosta do wykonania, zazwyczaj wykorzystują one wiele kroków i mogą wymagać kilku dni, aby wygenerować ostateczne konstrukty. Przedstawiona tutaj metoda opiera się na składaniu DNA i może wytworzyć w pełni funkcjonalne wektory CRISPR w jednej reakcji klonowania. Konstrukcja wektorowa może być również łączona, co dodatkowo zwiększa wydajność i użyteczność procesu. Modyfikacja metody służy do tworzenia wektorów CRISPR z wieloma celami genowymi. Wektory CRISPR są następnie przekształcane w owłosione korzenie pomidorów w celu wygenerowania materiałów transgenicznych z ukierunkowanymi modyfikacjami DNA. Owłosione korzenie są użytecznym systemem do testowania funkcjonalności wektorów, ponieważ są technicznie proste do wygenerowania i nadają się do produkcji na dużą skalę. Przedstawione tutaj metody będą miały szerokie zastosowanie, ponieważ mogą być wykorzystywane do generowania różnorodnych wektorów CRISPR i mogą być stosowane w szerokim zakresie gatunków roślin.

Konstrukcja wektorów CRISPR z wykorzystaniem asamblacji DNA zazwyczaj prowadzi do uzyskania od kilkunastu do kilkuset niezależnych klonów. Przesiew kolonii za pomocą metody PCR pozwala na łatwą identyfikację poprawnych klonów oraz rozróżnienie plazmidów z insertami od tych, które ich nie zawierają (Rycina 2A), co jest przydatne podczas rozwiązywania problemów. Zazwyczaj wszystkie klony zawierają wstawkę, więc użytkownik może zdecydować się na całkowite pominięcie etapów p...

Korzystając z montażu DNA, wiele wektorów CRISPR może być konstruowanych równolegle w jednej reakcji klonowania, co sprawia, że budowa dużej liczby wektorów CRISPR jest prostym zadaniem. Owłosione korzenie pomidora są doskonałym systemem modelowym do walidacji wektorów CRISPR i generowania zmutowanych materiałów.

Wysokoprzepustowa konstrukcja wektora CRISPR i charakterystyka modyfikacji DNA przez generowanie owłosionych korzeni pomidora

Targeted DNA mutations generated by vectors with clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR)/Cas9 technology have proven useful for ...

Ogólnym celem tej procedury klonowania i transformacji jest efektywne generowanie wektorów CRISPR oraz korzeni pomidora z mutacjami typu knockout, które mogą być wykorzystane w badaniach genomiki funkcjonalnej. Metoda ta stanowi użyteczne narzędzie w dziedzinie genomiki roślin, ponieważ pozwala na wytworzenie dużej liczby mutantów knockout, które można wykorzystać w badaniu różnych procesów zachodzących w korzeniach. Główną zaletą tej techniki jest możliwość przeprowadzenia procedury klonowania w jednym etapie, co zapewnia uzyskanie materiałów badawczych w ciągu zaledwie kilku tygodni.W pierwszej kolejności zaprojektuj oligosy przewodniego RNA (gRNA), tak aby zawierały fragment GN19 motywów docelowych, flankowany przez 20-nukleotydowe sekwencje na końcach 5' i 3', niezbędne do asemblacji DNA. Przetraw od 1 do 5 µg plazmidu P201N caznine za pomocą enzymu restrykcyjnego Spe1 w temperaturze 37 °C przez dwie godziny. Po oczyszczeniu produktu trawienia na kolumience zgodnie z instrukcją producenta, zawieś go ponownie w 15 µL 10 mM Tris-HCl.Oznacz ilość DNA za pomocą spektrofotometrii UV. Przeprowadź drugie trawienie enzymem restrykcyjnym Swa1 w temperaturze 25 °C przez dwie godziny. Naż

high-throughput-crispr-vector-construction-characterization-dna

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Przedstawiamy sposób wykorzystania kompozytowych roślin z korzeniami włochatymi do badania interakcji między roślinami a ryzobiami oraz procesu nodulacji u gatunku Medicago truncatula, który jest trudny do transformacji.

Generowanie roślin kompozytowych u Medicago truncatula wykorzystywanych w testach nodulacji

Rośliny oferują nowatorski system do produkcji białek farmaceutycznych na skalę komercyjną, który jest bardziej skalowalny, opłacalny i bezpieczny niż obecne paradygmaty ekspresji. W tym badaniu przedstawiamy proste i wygodne, a jednocześnie skalowalne podejście do wprowadzenia genu docelowego zawierającego Agrobacterium tumefaciens do roślin w celu przejściowej ekspresji białka.

Efektywna agroinfiltracja roślin w celu uzyskania przejściowej ekspresji białek rekombinowanych na wysokim poziomie

Agroinfiltracja i agroinfekcja PVX to rutynowe testy funkcjonalne dla przejściowej ektopowej ekspresji genów w roślinach. Metody te są skutecznymi testami w strategiach efektoromicznych (szybkie odkrywanie genów oporności i wirulencji) i mają kluczowe znaczenie dla nowoczesnych badań w zakresie molekularnej patologii roślin. Spełniają one zapotrzebowanie na solidną, wysokowydajną analizę funkcjonalną w zakładach.

Agroinfiltracja i agroinfekcja PVX u ziemniaka i Nicotiana benthamiana

Analizy ekspresji promotorów są kluczowe dla lepszego zrozumienia regulacji genów i czasoprzestrzennej ekspresji docelowych genów. W niniejszym artykule przedstawiamy protokół identyfikacji, izolacji i klonowania promotora roślin. Ponadto opisujemy charakterystykę promotora specyficznego dla guzków w owłosionych korzeniach fasoli zwyczajnej.

Analiza promotora roślin: identyfikacja i charakterystyka promotora specyficznego dla brodawek korzeniowych w fasoli zwyczajnej

Przejściowa heterologiczna ekspresja enzymów biosyntetycznych w liściach Nicotiana benthamiana może przekierować endogenne dostawy 2,3-oksydoskwalenu na produkcję nowych produktów triterpenowych o wysokiej wartości. W niniejszym dokumencie opisano szczegółowy protokół szybkiej (5 dni) produkcji triterpenów i analogów na skalę preparatywną z wykorzystaniem tej potężnej platformy roślinnej.

Przejściowa ekspresja w liściach Nicotiana benthamiana do produkcji triterpenów w skali preparatywnej

Tutaj prezentujemy wszechstronną metodę transformacji korzenia pomidora, a następnie inokulacji Ralstonia solanacearum, aby przeprowadzić prostą analizę genetyczną do badania bakteryjnej choroby więdnięcia.

Transformacja korzenia pomidora, a następnie inokulacja Ralstonia solanacearum w celu prostej analizy genetycznej bakteryjnej choroby więdnięcia

Ten protokół opisuje mikroiniekcję i elektroporację in vivo dla regionalnie ograniczonej edycji genomu za pośrednictwem CRISPR w jajowodzie myszy.

Somatyczne modele myszy z inżynierią genomu przy użyciu mikroiniekcji in vivo i elektroporacji

Tutaj prezentujemy protokół do wysokowydajnej produkcji transgenicznych korzeni owłosionych soi.

Transformacja owłosionych korzeni soi w celu analizy funkcji genów

Tutaj przedstawiamy szczegółowy protokół jednoetapowej metody transformacji, w której pośredniczy Agrobacterium tumefaciens, w celu produkcji roślin kompozytowych.

Wydajna i powtarzalna metoda wytwarzania roślin złożonych metodą transformacji owłosionych korzeni na bazie Agrobacterium rhizogenes

Protokół opisuje indukcję owłosionych korzeni za pomocą łodyg kwiatostanu Arabidopsis i hipokotyli Brassica napus. Owłosione korzenie mogą być hodowane i wykorzystywane jako eksplantaty do regeneracji roślin transgenicznych.

Transformacja i regeneracja korzeni owłosionych u Arabidopsis thaliana i Brassica napus

Poznaj metodę konstrukcji wektorów CRISPR i generowania mutacyjnych korzeni pomidora w jednym kroku klonowania. Technika ta usprawnia badania genomiki funkcjonalnej roślin.

Wysokoprzepustowa konstrukcja wektora CRISPR i charakterystyka modyfikacji DNA przez generowanie owłosionych korzeni pomidora

Przeglądaj więcej filmów