Wysokoprzepustowa konstrukcja wektora CRISPR i charakterystyka modyfikacji DNA przez generowanie owłosionych korzeni pomidora

Ogólnym celem tej procedury klonowania i transformacji jest efektywne generowanie wektorów CRISPR i wyeliminowanie zmutowanych korzeni pomidorów, które można wykorzystać w funkcjonalnych badaniach genomicznych. Metoda ta jest użytecznym narzędziem w dziedzinie genomiki roślin, ponieważ może generować dużą liczbę mutantów nokautujących, które można wykorzystać w różnych procesach korzeniowych. Główną zaletą tej techniki jest to, że procedurę klonowania można przeprowadzić w jednym kroku, co umacnia fakt, że materiały grupowe można uzyskać w ciągu zaledwie kilku tygodni.

Po pierwsze, zaprojektuj przewodniki RNA lub oligonukleotydy gRNA, aby uwzględnić część GN19 motywów docelowych otoczonych pięcioma pierwszymi i trzema pierwszymi sekwencjami nukleotydowymi 20 wymaganymi do złożenia DNA. Trawić od jednego do pięciu mikrogramów plazmidu kazniny P201N za pomocą enzymu restrykcyjnego Spe1 w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez dwie godziny. Po oczyszczeniu roztworu zgodnie z instrukcjami producenta, zawiesić ponownie w 15 mikrolitrach 10 milimolowy Trs HCL.

Określ ilościowo ilość DNA za pomocą spektrofotometrii UV. Wykonaj drugie trawienie enzymem restrykcyjnym Swa1 w temperaturze 25 stopni Celsjusza przez dwie godziny. Sprawdź od 100 do 200 nanogramów w ośmioprocentowym żelu agarozowym w punkcie zerowym, aby potwierdzić całkowite trawienie.

Prawidłowo strawiony plazmid będzie miał pojedyncze prążki na 14 313 parach zasad. Do PCR amplifikacji truncatuli medicago użyj sześciu DNA promotora i rusztowania z plazmidu wahadłowego krążka gRNA. Użyj startera Swa1 i Mtu6F oraz MTU6R i rusztowania F w rusztowaniu Spe1 R, w polimerazie o wysokiej wierności.

Wizualizuj trzy mikrolitrowe aliquats produktów PCR na jednoprocentowym żelu agarozowym, aby potwierdzić amplifikację. Amplikon MTU6 ma 377 par zasad, a amplikon rusztowania ma 106 par zasad. Kolumnę oczyścić z pozostałych produktów PCR zgodnie z instrukcjami producenta.

Określić ilościowo za pomocą spektrofotometrii UV jak poprzednio i przechowywać w temperaturze ujemnej 20 stopni Celsjusza. Następnie ponownie zawiesić całą rurkę oligonukleotydów gRNA do 100 mikromolów w wodzie o jakości laboratoryjnej. Dodaj jeden mikrolitr oligonukleotydów do 500 mikrolitrów buforu 1xNEB dwa punkty jeden i dobrze wymieszaj.

Zaprogramuj termocykler z podgrzewaną pokrywą, aby utrzymywał temperaturę 50 stopni Celsjusza. Połącz 100 nanogramów zlinearyzowanego wektora, 50 nanogramów promotora MtU6, 12 nanogramów rusztowania i jeden mikrolitr rozcieńczonego oligo gRNA w wodzie do końcowej objętości pięciu mikrolitrów. Dodaj pięć mikrolitrów 2X High Fidelity DNA Assembly Mastermix.

Dobrze wymieszaj i odwiruj. Inkubować reakcję przez 60 minut w termocyklerze o temperaturze 50 stopni Celsjusza. Po godzinie w temperaturze 50 stopni Celsjusza umieść reakcję na lodzie, a następnie użyj dwóch mikrolitrów do przekształcenia kompetentnych komórek E.Coli przy użyciu standardowych technik.

Umieść przemianę na agarze LB uzupełnionym 50 miligramami na mililitr Kanamycyny i inkubuj w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez noc. Przesiewać kolonie za pomocą PCR ze starterem StUb3p, 218R i 1Sce1R. Rozcieńczyć alekwat pozostałej reakcji składania DNA wodą od jednego do pięciu i użyć jednego mikrolitra jako kontroli pozytywnej dla badania przesiewowego kolonii.

Dołącz również jeden nanogram kolistego plazmidu kasyniny P201N jako kontrolę bez wkładki. Po amplifikacji PCR przy użyciu parametrów zawartych w zapisanej części protokołu, zobrazuj produkt PCR na jednoprocentowym żelu agarozowym. Poprawne insercje mają pasmo 725 par zasad, a wektory bez wstawek będą miały pasmo 310 par zasad.

Hoduj dodatnie kolonie w płynnych kulturach LB Can50 przez noc w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Następnego dnia oczyść plazmidy za pomocą zestawu do oczyszczania plazmidu zgodnie z instrukcjami producenta. Po sekwencjonowaniu przez Sangera oczyszczonych plazmidów za pomocą startera StuB3P218R, dopasuj chromatogramy do sekwencji promotora MtU6, celu i rusztowania, aby upewnić się, że podczas klonowania nie wprowadzono żadnych błędów.

Wykonaj trawienie diagnostyczne, trawiąc jeden mikrogram plazmidu z EcoR5 i Sti1. Po wizualizacji na żelu agarozowym o punkcie zerowym osiem, ten wzór pasma powinien być widoczny. Na koniec przekształć plazmidy w szczep Agrobacterium rhizogenes ARqua1, dodając jeden mikrolitr preparatu plazmidowego do 50 mikrolitrów elektrokompetentnych komórek i elektropostując w kuwecie o pojemności jednego milimetra.

Dodaj około 500 mikrolitrów pożywki SOC i wstrząsaj w temperaturze 28 stopni Celsjusza przez dwie godziny. Następnie ułóż płytkę na płytkach LB Can50 i rosnij w temperaturze 28 stopni Celsjusza przez dwa dni. Rozpocznij tę część procedury od sterylizacji nasion pomidorów w 20-procentowym wybielaczu domowym przez 15 minut przy ciągłym mieszaniu.

Następnie przenieś nasiona do okapu z przepływem laminarnym. Usuń wybielacz i umyj trzykrotnie w sterylnej wodzie laboratoryjnej. Umieść 30 nasion w pudełku GA7 zawierającym połowę MS Media.

Pozostawić do kiełkowania na około dwa dni w ciemności. Gdy nasiona wykiełkują, przenieś pudełka GA7 na światło Dzień przed transformacją rozprowadź kultury A.rhizogenes na stałym LB zawierającym Can50 i rosły w temperaturze 28 stopni Celsjusza przez noc. W dniu przemiany pracuj w okapie z przepływem laminarnym, aby dodać 25 mikrolitrów Acetosyringonu do 50 mililitrów połowy MS i wlej sześć mililitrów do każdej probówki hodowlanej.

Użyj wygiętej końcówki o pojemności 200 mikrolitrów, aby zeskrobać komórki A.rhizogenes z płytki i ponownie zawiesić w sześciu mililitrach połowy płynu MS. Odwiruj rurkę, aby całkowicie zawiesić komórki. Po ponownym wyparciu komórek z każdego wektora weź jeden mililitr komórek i zmierz gęstość optyczną przy stałej długości fali 600 nanometrów.

Dodaj dwa mililitry połowy płynu MS na szalkę Petriego ze sterylną bibułą filtracyjną. Wyciąć liścienie z sadzonek i umieścić na zwilżonej bibule filtracyjnej. Po zebraniu wszystkich liścieni odetnij najbardziej dystalną o jeden centymetr od liścieni, w wyniku czego otrzymasz kawałki liścienia z dwoma odciętymi końcami.

Dodaj byłe rośliny do roztworów A. rhizogenes i wymieszaj. Inkubować przez 20 minut z okazjonalnym odwracaniem. Podczas inkubacji A. rhizogenes dodaj kawałek bibuły filtracyjnej do szalki Petriego dla każdej transformacji konstruktu.

Umieść również połowę pożywki stałej MS bez antybiotyków w okapie z przepływem laminarnym do wyschnięcia. Użyj sterylnych kleszczy, aby nabrać liścienie z roztworu A.rhizogenes i umieścić na suchej bibule filtracyjnej. Przykryj pokrywką na szalce Petriego, aby upewnić się, że tkanki nie wyschną podczas przechodzenia do następnej przemiany.

Następnie osuszyć liścienie na bibule filtracyjnej i przenieść stronę aosiową do połowy pożywki MS. Owiń płytki taśmą chirurgiczną i współuprawiaj w ciemności w temperaturze pokojowej przez dwa dni. Po kohodowli przenieść liścienie stroną odtłuszczającą do góry na uzupełnioną jedną połówkę pożywki MS.

Owinąć taśmą chirurgiczną. Utrzymuj kultury pod lampami fluorescencyjnymi w temperaturze pokojowej z 16-godzinnym okresem fotografowania. Po upływie jednego punktu, pięciu do dwóch tygodni, użyj sterylnych kleszczy i skalpela, aby wyciąć korzenie o długości co najmniej dwóch centymetrów z liścieni i przenieść do pożywki z kwasem tikarcellonowym/klawulanianowym i kanamycyną uzupełnioną połową MS.

Przenieś od dziesięciu do 15 korzeni na jedną płytkę. Zaznacz położenie końcówek korzeni markerem. Owinąć taśmą chirurgiczną i przechowywać w pomieszczeniu hodowlanym.

Po tygodniu na selektywnych podłożach obserwuje się wzrost korzeni transformacji. Zbierz podpróbkę przekształconych korzeni do ekstrakcji DNA przy użyciu preferowanej metody ekstrakcji DNA. Owłosione korzenie można zobaczyć wyłaniające się z liścieni 11 dni po transformacji.

Korzenie są selekcjonowane za pomocą kwasu Tikarcellon/Clavulanate i Kanamycyny uzupełnionej połową pożywki MS przez około tydzień. Szare paski oznaczają położenie wierzchołków korzeni w momencie poszycia. Jest to przykład klonowania i sekwencjonowania produktów PCR w celu określenia mutacji DNA z dwoma różnymi celami genowymi w czterech różnych zdarzeniach związanych z korzeniami owłosionymi.

Szare pole oznacza sekwencję docelową GN20 GG, a delta wskazuje typ mutacji. Liczba klonów ze wskazaną mutacją jest pokazana po prawej stronie. Jest to przykład żelu poliakrylamidowego do określania mutacji DNA.

Duże delecje i prążki heterduplex wskazują na obecność mutacji DNA w sekwencjach docelowych. Sześć z 12 niezależnych wydarzeń zostało ocenionych jako mutanty, na co wskazuje symbol delta. WT wskazuje kontrolkę typu dzikiego, a NT kontrolkę bez szablonu.

Po opanowaniu można wyprodukować dziesiątki do setek wektorów CRISPR w ciągu jednego tygodnia, a materiały grupowe trendów można uzyskać w ciągu kilku tygodni. Podczas próby wykonania tej procedury ważne jest, aby usunąć i zahamować wzrost wszelkich pozostałości Agrobacterium. Przerost Agrobacterium zahamuje i zabije wszelki materiał korzeniowy.

Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak generować wektory CRISPR za pomocą składania DNA i jak testować te wektory za pomocą systemu owłosionych modeli korzeniowych i pomidora.