Indukcja eksperymentalnego autoimmunologicznego zapalenia mózgu i rdzenia kręgowego u myszy i ocena zależnej od choroby dystrybucji komórek odpornościowych w różnych tkankach

Ogólnym celem eksperymentalnego autoimmunologicznego zapalenia mózgu i rdzenia kręgowego (EAE) jest ułatwienie badania potencjalnych mechanizmów molekularnych leżących u podstaw rozwoju stwardnienia rozsianego. Ta metoda może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie stwardnienia rozsianego, takie jak: na jakim etapie choroby komórki odpornościowe infiltrują ośrodkowy układ nerwowy? Główną zaletą tej techniki jest to, że model EAE naśladuje wiele głównych cech stwardnienia rozsianego, takich jak demienizacja i infiltracja komórek odpornościowych.

Implikacje tej techniki rozciągają się na terapię stwardnienia rozsianego, ponieważ leki testowane tą metodą zostały już zatwierdzone do stosowania w tej chorobie. Ogólnie rzecz biorąc, osoby nowe w tej metodzie będą miały trudności, ponieważ istnieją dokładne warunki, które należy wziąć pod uwagę podczas wywoływania EAE. Myszy muszą być trzymane w bezstresowym środowisku, a toksyna krztuścowa powinna być świeżo przygotowana.

Oficjalne zademonstrowanie tej metody ma kluczowe znaczenie, ponieważ izolacja węzłów chłonnych i ekstrakcja rdzenia kręgowego są trudne do nauczenia się na podstawie samego opisu. Zacznij od podskórnego wstrzyknięcia 10 do 13 tygodniowym samicom myszy 200 mikrogramów glikoproteiny oligodendrocytów mielinowych. Emulgowany w 200 mikrolitrach kompletnego adiuwantu Freunda, zawierającego 400 mikrogramów prątków gruźlicy.

Natychmiast i 24 godziny później wstrzyknąć myszom dootrzewnowo 0,2 mikrograma toksyny krztuścowej w 200 mikrolitrach PBS. Istotne jest, aby myszy zostały przystosowane zarówno do obsługi, jak i środowiska eksperymentalnego przed indukcją EAE w kierunku wywoływania stresu, który może zapobiec rozwojowi objawów klinicznych. Tydzień po wstrzyknięciu należy codziennie badać myszy pod kątem objawów klinicznych, jak opisano w tabeli.

Aby ocenić populację komórek odpornościowych węzłów chłonnych indukowanych przez EAE, w odpowiednim momencie po indukcji zwilż obszar nacięcia 80% izopropanolem i ostrożnie usuń skórę z okolicy biodra. Za pomocą kleszczy ostrożnie usuń pachwinowy węzeł chłonny z tkanki tłuszczowej. Następnie zważyć węzeł i umieścić próbkę w PBS na lodzie.

Aby przeanalizować komórki rdzenia kręgowego, zwilż grzbiet zwierzęcia izopropanolem i użyj skalpela, aby wykonać podłużne cięcie kręgosłupa. Następnie usuń skórę i wypreparuj lędźwiową część kręgosłupa, unerwiając tylne kończyny. Przepłucz kręgosłup strzykawką wypełnioną PBS, aby usunąć rdzeń kręgowy.

Po usunięciu około 1/3 rdzenia lędźwiowego zważ fragment kręgosłupa i przechowuj tkankę w PBS na lodzie. Aby przeanalizować populację komórek odpornościowych śledziony, otwórz tkankę, aby uzyskać dostęp do dolnej części brzucha. Następnie usuń śledzionę i odetnij około 1/8 tkanki.

Zważ fragment śledziony i przechowuj tkankę w PBS na lodzie. Następnie użyj tłoka ze strzykawki o pojemności dwóch ml, aby zmacerować resztę tkanki przez sito o oczkach 70 mikronów na probówce o pojemności 50 mililitrów, a następnie przemyj sitko pięciomililitrowym PBS. Odwirować przefiltrowane komórki.

Ponownie zawiesić osad w 500 mikrolitrach buforu do lizy komórek i przenieść komórki do probówki o pojemności 1,5 mililitra. Po 10 minutach w temperaturze pokojowej umyj komórki dwa razy w 500 mikrolitrach PBS. Po drugim praniu ponownie zawieś osad w 100 mikrolitrach 0,2% BSA w PBS i dodaj dwa mikrolitry receptora Fc jednego buforu blokującego do komórek.

Po 15 minutach w ciemności w temperaturze pokojowej oznacz komórki 13 mikrolitrami koktajlu przeciwciał przez kolejne 15 minut w temperaturze pokojowej w ciemności. Pod koniec inkubacji umyć komórki co najmniej dwa razy w 500 mikrolitrach PBS i ponownie zawiesić końcowe osady w 500 mikrolitrach świeżego PBS. Następnie przenieś komórki do rurki do cytometrii przepływowej na lodzie.

Na koniec, aby przeanalizować próbki za pomocą cytometrii przepływowej, bezpośrednio przed pomiarem cytometrii przepływowej, dodaj 30 mikrolitrów wzorca liczby bezwzględnej cytometrii przepływowej do komórek w celu określenia bezwzględnej liczby komórek. Następnie przeanalizuj próbki na cytometrze przepływowym. Jak pokazuje ten rysunek, w ostrej fazie indukcji EAE obserwuje się przejściowy wzrost wszystkich populacji komórek odpornościowych w węzłach chłonnych.

Jednak w śledzionie tylko makrofagi, limfocyty B, limfocyty T i neutrofile wykazują zwiększony naciek. We krwi wszystkie populacje komórek odpornościowych wykazują przejściowy wzrost krążenia obwodowego w fazie przedklinicznej, który odpowiada podobnemu, zależnemu od choroby wzrostowi rdzenia kręgowego w odcinku lędźwiowym w ostrej fazie choroby, z wyłączeniem populacji monocytów, która prawdopodobnie różnicuje się w makrofagi po wejściu do rdzenia kręgowego. W tym miejscu pokazano strategię bramkowania do oceny różnych populacji komórek.

Liczba komórek jest związana z ilością analizowanej tkanki lub objętości krwi, odzwierciedlając bezwzględną liczbę komórek. W węzłach chłonnych ekspresja mRNA IL-23 jest zwiększona w fazie przedklinicznej, podczas gdy ekspresja IL-6 wzrasta w sposób zależny od choroby. W śledzionie ekspresja IL-6 i IL-23 wzrasta w fazie przedklinicznej, podczas gdy ekspresja mRNA IL-1 beta nie jest zaburzona do początku choroby.

We krwi ekspresja tylko mRNA TNF-alfa jest regulowana w górę i w sposób zależny od choroby. W odcinku lędźwiowym rdzeń kręgowy TNF-alfa, IL-1 beta i interferon gamma są indukowane w ostrej fazie, podczas gdy IL-6 jest regulowana w górę tylko w początkowej fazie choroby. Po opanowaniu, model EAE, późniejsza izolacja komórek i analiza efektów mogą zostać zakończone w ciągu ośmiu godzin dla dziesięciu myszy, jeśli zostaną wykonane prawidłowo.

Po tej procedurze można wykonać inne metody, takie jak Western Blot lub ELISA, aby potwierdzić wyniki analizy ekspresji mRNA. Po opracowaniu technika ta utorowała drogę naukowcom zajmującym się stwardnieniem rozsianym do zbadania mechanizmu demielinizacji w ośrodkowym układzie nerwowym. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak indukować model EAE i jak izolować komórki odpornościowe, aby uzyskać powtarzalne wyniki cytometrii przepływowej.

Nie zapominaj, że praca z kompletnym adiuwantem Freunda może być niezwykle niebezpieczna, dlatego podczas wykonywania tej procedury należy podjąć dodatkowe środki ostrożności, takie jak uniesienie skóry myszy i zapewnienie całkowitej penetracji skóry przez strzykawkę.