Indukcja i zróżnicowane wskaźniki oceny eksperymentalnego autoimmunologicznego zapalenia mózgu i rdzenia kręgowego
9 września 2022
Niniejszy protokół opisuje indukcję eksperymentalnego autoimmunologicznego zapalenia mózgu i rdzenia w modelu mysim przy użyciu glikoproteiny oligodendrocytów mieliny i monitorowanie procesu chorobowego za pomocą systemu punktacji klinicznej. Eksperymentalne objawy związane z autoimmunologicznym zapaleniem mózgu i rdzenia kręgowego są analizowane za pomocą analizy mikrotomografii komputerowej kości udowej myszy i testu terenowego w celu kompleksowej oceny procesu chorobowego.
Obecnie nie ma całkowitego lekarstwa na stwardnienie rozsiane. Nasz protokół pozwala na skuteczną budowę eksperymentalnego modelu autoimmunologicznego zapalenia mózgu i rdzenia kręgowego, aby pomóc w badaniu terapii choroby stwardnienia rozsianego. Główną zaletą naszego protokołu jest bardziej kompleksowa ocena leczenia eksperymentalnego autoimmunologicznego zapalenia mózgu i rdzenia z wielu perspektyw.
Najpierw przygotuj emulsję peptydową glikoproteiny oligodendrocytów mielinowych, rozpuszczając liofilizowany peptyd i sterylny, wstępnie schłodzony PBS bez jonów wapnia i magnezu o pH 7,4. Dodaj jedną wysterylizowaną pięciomilimetrową stalową kulkę do czystej dwumililitrowej mikroprobówki wirówkowej. Następnie dodaj do probówki 500 mikrolitrów kompletnego adiuwantu Freuda zawierającego pięć miligramów na mililitr liofilizowanej gruźlicy mikrobakterii i 500 mikrolitrów emulsji peptydowej glikoproteiny oligodendrocytów mielinowych.
Teraz oscyluj probówką na lizerze tkankowym przez 10 minut. Następnie schłodzić rurki na lodzie przez 10 minut. Powtórz proces cztery razy, aż powstanie biały lepki roztwór.
Następnie rozcieńczyć roztwór łodygi toksyny krztuścowej 50 razy w sterylnym PBS o pH 7,4 bez jonów wapnia i magnezu, aby osiągnąć końcowe stężenie 200 nanogramów na 100 mikrolitrów. Aby wytrącić całą wstępnie przygotowaną emulsję peptydową glikoproteiny oligodendrocytów mielinowych na dnie probówki, należy odwirować probówkę w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez dwie do trzech sekund, naciskając przycisk impulsu na urządzeniu. Odessać emulsję peptydową glikoproteiny oligodendrocytów mielinowych za pomocą strzykawki o pojemności jednego mililitra wyposażonej w igłę o rozmiarze 22 i przenieść emulsję do nowego cylindra strzykawki o pojemności 1 mililitra.
Przymocuj igłę o rozmiarze 26 do lufy i zabezpiecz połączenie folią uszczelniającą. Wstrzyknąć 100 mikrolitrów emulsji peptydowej glikoproteiny oligodendrocytów mielinowych podskórnie po każdej stronie grzbietowego kręgosłupa myszy. Po wstrzyknięciu należy obserwować automatyczne tworzenie się bulwiastych mas pod skórą i grzbietem.
Następnie dootrzewnowo wstrzyknąć 100 mikrolitrów toksyny krztuścowej tej samej myszy. Przygotuj otwartą komorę reakcyjną i skonfiguruj system analizy wideo do rejestrowania lokomocji myszy. Aby oczyścić komorę reakcyjną przed eksperymentem, spryskaj 70% etanolem całą powierzchnię i wytrzyj czystym ręcznikiem papierowym.
Następnie umieść mysz w rogu komory reakcyjnej. Aby rozpocząć fotografowanie, kliknij przycisk rozpoczęcia przechwytywania na pasku menu systemu nagrywania wideo i nagraj czas. Zachowując ciszę w pokoju testowym, pozwól myszy poruszać się swobodnie przez pięć minut.
Następnie zatrzymaj nagrywanie i zapisz wideo. Umieść mysz z powrotem w klatce. Następnie oczyść obszar testowy 70% etanolem i przejdź do następnej myszy.
Trzymaj uśpioną mysz płasko na tacy preparacyjnej i napraw kończyny. Przytrzymaj skórę kończyn tylnych myszy za pomocą kleszczy i otwórz skórę i mięśnie nożyczkami. Następnie ostrożnie oddziel kość udową od kości piszczelowej i biodrowej, używając nożyczek.
Usuń nożyczkami mięśnie przylegające do kości udowej. Następnie umieść kość udową w 70% etanolu o temperaturze pokojowej. W tym badaniu oceniono zdolność peptydu pochodzącego z glikoproteiny oligodendrocytów mieliny do indukowania EAE.
Myszy, którym wstrzyknięto peptyd, doświadczyły postępującej utraty wagi. Po sześciu do dziewięciu dniach od wstrzyknięcia pojawiły się objawy EAE, które osiągnęły szczyt po 14 do 16 dniach. Wykresy śladowe z testu w otwartym terenie wykazały, że EAE zmienia normalne zachowanie eksploracyjne myszy.
W porównaniu z normalnymi myszami, myszy z EAE przebyły znacznie mniejszą odległość we wczesnej fazie początku, szczytu i remisji. Myszy z EAE miały również znacznie skrócony czas trwania aktywności w fazach szczytu i remisji choroby. Co więcej, we wszystkich trzech fazach myszy EAE miały znacznie krótszą odległość podróży i czas spędzony w centrum.
Tomografia mikrokomputerowa kości udowych myszy EAE ujawniła architekturę beleczkową inną niż u normalnych myszy. Kości udowe myszy EAE miały znacznie mniejszą gęstość mineralną kości i stosunek objętości kości do objętości tkanek niż te od normalnych myszy. Co więcej, kości udowe myszy z EAE miały mniejszą gęstość połączeń beleczkowych, liczbę beleczkowatych i grubość beleczkowania niż te od normalnych myszy.
W porównaniu z normalnymi myszami, odstępy beleczkowe uległy poprawie, a grubość kości korowej została zmniejszona u myszy EAE. Możemy również wyizolować mózg i kod rdzeniowy myszy EAE w szczycie choroby i przeanalizować produkcję komórek odpornościowych i cytokin za pomocą cytometrii grypy.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejsze badanie przedstawia protokół indukcji eksperymentalnego autoimmunologicznego zapalenia mielnowodociągowego (EAE) u myszy z wykorzystaniem glikoproteiny mieliny oligodendrocytów (MOG). Oferuje ono kompleksową ocenę przebiegu choroby poprzez punktację kliniczną, mikrotomografię komputerową oraz testy behawioralne.
Kluczowe elementy badania
Obszar badawczy
- Neuroimmunologia
- Badania nad stwardnieniem rozsianym
- Modelowanie chorób autoimmunologicznych
Wstęp
- Istnienie różnych modeli eksperymentalnych do badania stwardnienia rozsianego.
- Znaczenie wiarygodnego modelu w ocenie metod leczenia.
- MOG jest kluczowym komponentem w patogenezie stwardnienia rozsianego.
Zastosowane metody
- Indukcja EAE z wykorzystaniem emulsji peptydu MOG oraz toksyny krztuśca.
- Model mysi
- Mikrotomografia komputerowa oraz testy otwartego pola w celu oceny.
Główne wyniki
- Myszy wykazały postępującą utratę masy ciała i rozwinęły objawy EAE w ciągu dwóch tygodni od iniekcji MOG.
- Analiza behawioralna wykazała upośledzenie zachowań eksploracyjnych i ograniczoną lokomocję u myszy z EAE.
- Mikrotomografia komputerowa wykazała obniżoną gęstość kości i zmienioną architekturę beleczkową u myszy z EAE.
Wnioski
- Badanie z sukcesem ustanawia kompleksowy model EAE do dalszej eksploracji terapii stwardnienia rozsianego.
- Wyniki mają istotne znaczenie dla zrozumienia mechanizmu choroby oraz potencjalnych interwencji terapeutycznych.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Modele eksperymentalnego autoimmunologicznego zapalenia mózgu i rdzenia (EAE) stanowią istotną translacyjnie platformę do oceny hipotez terapeutycznych oraz ograniczania ryzyka mechanistycznego w procesie odkrywania leków na stwardnienie rozsiane (MS). Integracja wskaźników oceny behawioralnej, szkieletowej i immunologicznej zwiększa pewność prognostyczną i wspiera decyzje dotyczące portfela projektów z uwzględnieniem ryzyka na wczesnych etapach odkrywania oraz w punktach zwrotnych fazy przedklinicznej. Kompleksowe fenotypowanie w modelu EAE umożliwia bardziej rzetelną walidację celu oraz dostarcza informacji niezbędnych do podjęcia decyzji o kontynuacji lub przerwaniu prac nad kandydatami na leki w terapii MS.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Umożliwia weryfikację hipotez terapeutycznych w modelu autoimmunologicznego neurozapalenia istotnym z punktu widzenia choroby.
- Wspiera funkcjonalną walidację celu poprzez powiązanie interwencji molekularnych z fenotypami klinicznymi, behawioralnymi i szkieletowymi.
- Ułatwia ograniczanie ryzyka mechanistycznego dzięki wielowymiarowym odczytom wykraczającym poza tradycyjną ocenę kliniczną.
- Zwiększa pewność prognostyczną w procesie selekcji portfolio poprzez rejestrację różnorodnych punktów końcowych istotnych dla SM.
Przesiewanie i opracowanie testu
- Przygotowuje zwalidowane układy in vivo do dalszego przesiewu skuteczności i mechanizmów działania potencjalnych leków na stwardnienie rozsiane.
- Standaryzuje ocenę za pomocą powtarzalnych punktacji klinicznych, analizy behawioralnej oraz wyników mikro-CT.
- Umożliwia ilościową ocenę wpływu związków na neurozapalenie, zachowanie oraz zdrowie kości.
- Wspiera skalowalne i wielokrotnego użytku platformy do porównawczego profilowania związków.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Dostosowuje przedkliniczne punkty końcowe do objawów występujących u pacjentów z SM, w tym zachowań przypominających lęk oraz osteoporozy.
- Zapewnia ciągłość od etapu odkrycia po walidację przedkliniczną poprzez integrację biomarkerów immunologicznych i fenotypowych.
- Minimalizuje ryzyko decyzji dotyczących dalszego rozwoju poprzez dostarczenie wieloparametrycznych dowodów skuteczności i bezpieczeństwa.
- Wzmacnia relewancję translacyjną w procesie selekcji kandydatów i strategii doboru biomarkerów.
Integracja potoków i przepływów pracy
Ten model EAE łączy wczesną fazę odkryć, identyfikację związków wiodących oraz walidację przedkliniczną terapeutyków w stwardnieniu rozsianym, umożliwiając testowanie hipotez, wyjaśnianie szlaków sygnałowych oraz ilościową ocenę efektów interwencji.
- Biologia odkrywcza: Wspiera testowanie hipotezy zerowej oraz badanie mechanizmów szlaków neuroimmunologicznych w stwardnieniu rozsianym (MS).
- Przesiewanie: Zapewnia zestandaryzowane, powtarzalne i ilościowe wyniki do oceny związków chemicznych.
- Analityka: Dostarcza pomiary wielomodalne — oceny kliniczne, wskaźniki behawioralne i mikroarchitekturę kości — w celu rzetelnego porównania stanów chorobowych.
- Badania translacyjne: Umożliwia powiązanie wyników przedklinicznych z fenotypami istotnymi dla pacjentów oraz punktami końcowymi biomarkerów.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Tworzy wielokrotnego użytku platformę in vivo do iteracyjnego odkrywania leków i biomarkerów w stwardnieniu rozsianym (MS).
Wpływ operacyjny i przedsiębiorczy
- Wartość naukowa: zwiększa pewność prognostyczną i redukuje niejednoznaczność mechanistyczną w walidacji celu w MS.
- Wartość operacyjna: poprawia standaryzację, powtarzalność i skalowalność badań skuteczności in vivo.
- Wartość strategiczna: dostarcza informacji niezbędnych do podejmowania decyzji go/no-go i zwiększa efektywność kapitałową poprzez integrację zróżnicowanych wskaźników oceny.
- Wpływ na portfolio: umożliwia priorytetyzację skorygowaną o ryzyko oraz dalszy rozwój kandydatów na leki w terapii MS.
Kwestie implementacyjne
- Wymaga wiedzy specjalistycznej z zakresu neuroimmunologii, analizy behawioralnej i obrazowania kości.
- Wymaga dostępu do infrastruktury mikro-CT, śledzenia wideo oraz cytometrii przepływowej.
- Konieczna jest standaryzacja ocen klinicznych i protokołów behawioralnych pomiędzy zespołami.
- Może być wymagana adaptacja dla różnych szczepów myszy lub interwencji związanych z SM.
- Złożoność oceny wzrasta przy zastosowaniu wieloparametrycznych punktów końcowych i integracji danych.
Najczęściej zadawane pytania dotyczące biofarmacji
Chapters in this video
0:04
Introduction
0:44
Preparation of Myelin Oligodendrocyte Glycoprotein Peptide (MOG35-55) Emulsion and Pertussis Toxin
1:55
Establishment of Experimental Autoimmune Encephalomyelitis (EAE) Animal Model
2:55
Open Field Test
3:42
Analysis of Bone Phenotype
4:16
Results: Induction of EAE by MOG35-55 Treatment
5:49
Conclusion
