Indukcja i zróżnicowane wskaźniki oceny eksperymentalnego autoimmunologicznego zapalenia mózgu i rdzenia kręgowego

Obecnie nie ma całkowitego lekarstwa na stwardnienie rozsiane. Nasz protokół pozwala na skuteczną budowę eksperymentalnego modelu autoimmunologicznego zapalenia mózgu i rdzenia kręgowego, aby pomóc w badaniu terapii choroby stwardnienia rozsianego. Główną zaletą naszego protokołu jest bardziej kompleksowa ocena leczenia eksperymentalnego autoimmunologicznego zapalenia mózgu i rdzenia z wielu perspektyw.

Najpierw przygotuj emulsję peptydową glikoproteiny oligodendrocytów mielinowych, rozpuszczając liofilizowany peptyd i sterylny, wstępnie schłodzony PBS bez jonów wapnia i magnezu o pH 7,4. Dodaj jedną wysterylizowaną pięciomilimetrową stalową kulkę do czystej dwumililitrowej mikroprobówki wirówkowej. Następnie dodaj do probówki 500 mikrolitrów kompletnego adiuwantu Freuda zawierającego pięć miligramów na mililitr liofilizowanej gruźlicy mikrobakterii i 500 mikrolitrów emulsji peptydowej glikoproteiny oligodendrocytów mielinowych.

Teraz oscyluj probówką na lizerze tkankowym przez 10 minut. Następnie schłodzić rurki na lodzie przez 10 minut. Powtórz proces cztery razy, aż powstanie biały lepki roztwór.

Następnie rozcieńczyć roztwór łodygi toksyny krztuścowej 50 razy w sterylnym PBS o pH 7,4 bez jonów wapnia i magnezu, aby osiągnąć końcowe stężenie 200 nanogramów na 100 mikrolitrów. Aby wytrącić całą wstępnie przygotowaną emulsję peptydową glikoproteiny oligodendrocytów mielinowych na dnie probówki, należy odwirować probówkę w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez dwie do trzech sekund, naciskając przycisk impulsu na urządzeniu. Odessać emulsję peptydową glikoproteiny oligodendrocytów mielinowych za pomocą strzykawki o pojemności jednego mililitra wyposażonej w igłę o rozmiarze 22 i przenieść emulsję do nowego cylindra strzykawki o pojemności 1 mililitra.

Przymocuj igłę o rozmiarze 26 do lufy i zabezpiecz połączenie folią uszczelniającą. Wstrzyknąć 100 mikrolitrów emulsji peptydowej glikoproteiny oligodendrocytów mielinowych podskórnie po każdej stronie grzbietowego kręgosłupa myszy. Po wstrzyknięciu należy obserwować automatyczne tworzenie się bulwiastych mas pod skórą i grzbietem.

Następnie dootrzewnowo wstrzyknąć 100 mikrolitrów toksyny krztuścowej tej samej myszy. Przygotuj otwartą komorę reakcyjną i skonfiguruj system analizy wideo do rejestrowania lokomocji myszy. Aby oczyścić komorę reakcyjną przed eksperymentem, spryskaj 70% etanolem całą powierzchnię i wytrzyj czystym ręcznikiem papierowym.

Następnie umieść mysz w rogu komory reakcyjnej. Aby rozpocząć fotografowanie, kliknij przycisk rozpoczęcia przechwytywania na pasku menu systemu nagrywania wideo i nagraj czas. Zachowując ciszę w pokoju testowym, pozwól myszy poruszać się swobodnie przez pięć minut.

Następnie zatrzymaj nagrywanie i zapisz wideo. Umieść mysz z powrotem w klatce. Następnie oczyść obszar testowy 70% etanolem i przejdź do następnej myszy.

Trzymaj uśpioną mysz płasko na tacy preparacyjnej i napraw kończyny. Przytrzymaj skórę kończyn tylnych myszy za pomocą kleszczy i otwórz skórę i mięśnie nożyczkami. Następnie ostrożnie oddziel kość udową od kości piszczelowej i biodrowej, używając nożyczek.

Usuń nożyczkami mięśnie przylegające do kości udowej. Następnie umieść kość udową w 70% etanolu o temperaturze pokojowej. W tym badaniu oceniono zdolność peptydu pochodzącego z glikoproteiny oligodendrocytów mieliny do indukowania EAE.

Myszy, którym wstrzyknięto peptyd, doświadczyły postępującej utraty wagi. Po sześciu do dziewięciu dniach od wstrzyknięcia pojawiły się objawy EAE, które osiągnęły szczyt po 14 do 16 dniach. Wykresy śladowe z testu w otwartym terenie wykazały, że EAE zmienia normalne zachowanie eksploracyjne myszy.

W porównaniu z normalnymi myszami, myszy z EAE przebyły znacznie mniejszą odległość we wczesnej fazie początku, szczytu i remisji. Myszy z EAE miały również znacznie skrócony czas trwania aktywności w fazach szczytu i remisji choroby. Co więcej, we wszystkich trzech fazach myszy EAE miały znacznie krótszą odległość podróży i czas spędzony w centrum.

Tomografia mikrokomputerowa kości udowych myszy EAE ujawniła architekturę beleczkową inną niż u normalnych myszy. Kości udowe myszy EAE miały znacznie mniejszą gęstość mineralną kości i stosunek objętości kości do objętości tkanek niż te od normalnych myszy. Co więcej, kości udowe myszy z EAE miały mniejszą gęstość połączeń beleczkowych, liczbę beleczkowatych i grubość beleczkowania niż te od normalnych myszy.

W porównaniu z normalnymi myszami, odstępy beleczkowe uległy poprawie, a grubość kości korowej została zmniejszona u myszy EAE. Możemy również wyizolować mózg i kod rdzeniowy myszy EAE w szczycie choroby i przeanalizować produkcję komórek odpornościowych i cytokin za pomocą cytometrii grypy.