Określanie supresji układu odpornościowego w porównaniu z ochroną OUN dla interwencji farmakologicznych w demielinizacji autoimmunologicznej

Ogólnym celem tej metody koncepcyjnej jest ustalenie, czy farmakologiczne leczenie eksperymentalnego autoimmunologicznego zapalenia mózgu i rdzenia wykazuje ochronę ośrodkowego układu nerwowego podczas ataku infiltracji komórek odpornościowych, czy w wyniku supresji infiltracji komórek odpornościowych. Ta metoda może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie immunologii neuronalnej. Na przykład, w jaki sposób manipulowanie czasem leczenia EAE różnicuje wpływ na infiltrację komórek odpornościowych i ochronę.

Implikacje tej techniki rozciągają się również na terapię stwardnienia rozsianego, ponieważ obecnie nie ma neuronowych metod leczenia ochronnego tej choroby. Po raz pierwszy wpadliśmy na pomysł tej metody, gdy odkryliśmy, że leczenie myszy EAE inhibitorem transportera Xc było zarówno neuroprotekcyjne, jak i immunomodulujące. Chociaż metoda ta może być stosowana do badania leczenia farmakologicznego, może być również stosowana do badań z wykorzystaniem myszy z genetycznym nokautem poddanych EAE lub innym manipulacjom.

Zacznij od użycia sterylnych nożyczek, aby zmielić mózgi i rdzenie kręgowe poszczególnych zwierząt na małe kawałki. Następnie użyj jednego trzymililitrowego tłoka strzykawki na tkankę, aby rozgnieść każdą próbkę na pojedynczych sitkach komórkowych o wielkości 70 mikronów do pojedynczych stożkowych probówek o pojemności 50 mililitrów, jednocześnie spłukując sitka pożywką. Gdy wszystkie kawałki zostaną zmacerowane, doprowadzić końcową objętość w probówkach do 50 mililitrów świeżą pożywką, a następnie odwirować zawiesiny komórek.

Ponownie zawiesić każdą granulkę w czterech mililitrach roztworu gradientu gęstości 40%. Następnie ostrożnie ułóż komórkę powoli po ściankach pojedynczych 15-mililitrowych stożkowych probówek na dwóch mililitrach roztworu gradientu o gęstości 70% na probówkę. Oddziel komórki przez odwirowanie i użyj jednomililitrowych pipet transferowych, aby ostrożnie wyrzucić górne warstwy mieliny.

Następnie przenieś żywe komórki z interfejsów próbki do nowych 15-mililitrowych stożkowych probówek i umyj komórki w końcowej objętości 15 mililitrów świeżej pożywki na probówkę. Zawiesić granulki w 200 mikrolitrach świeżej pożywki i przenieść zawiesiny komórek do indywidualnych dołków 96-dołkowej okrągłej płytki dennej. Odwirować płytkę i strzepnąć supernatanty.

Następnie ponownie zawieś granulki w 200 mikrolitrach pożywki restymulacyjnej i inkubuj komórki w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez cztery godziny. Pod koniec inkubacji ponownie odwirować płytkę i usunąć supernatanty. Następnie umyj komórki w 200 mikrolitrach PBS uzupełnionych 2% FCS i ponownie zawieś komórki w 200 mikrolitrach PBS uzupełnionych 2% FCS i FC-block na 10 do 15 minut na lodzie.

Pod koniec inkubacji umyj komórki, jak właśnie pokazano, i ponownie zawieś granulki w 15 mikrolitrach koktajlu barwiącego na powierzchni komórek na 15 minut na lodzie. Następnie odwiruj komórki i umyj próbki dwa razy w 200 mikrolitrach PBS. Następnie ponownie zawieś komórki w odczynnikach barwiących czynnik transkrypcyjny FOXP3 zgodnie z instrukcjami producenta na 30 minut do nocy w temperaturze 4 stopni Celsjusza.

Pod koniec inkubacji umyć komórki w 150 mikrolitrach buforu przepuszczalnego. Następnie odwirować komórki i ponownie zawiesić granulki w interesujących nas przeciwciałach wewnątrzkomórkowych w 15 mikrolitrach buforu permeabilizacji na lodzie. Po 30 minutach odwirować komórki, a następnie trzykrotnie przepłukać je w 200 mikrolitrach buforu przepuszczalnego.

Po ostatnim płukaniu ponownie zawiesić granulki w 200 mikrolitrach PBS i przeanalizować próbki za pomocą cytometrii przepływowej, bramkując na żywych komórkach CD4-dodatnich, TCR beta-dodatnich. Ważne jest również, aby ocenić proliferację obwodowych limfocytów T, ponieważ zmiany na obrzeżach mogą wpływać na infiltrację komórek odpornościowych do OUN. Aby określić ilościowo liczbę astrocytów i komórek glejowych obecnych w próbkach tkanki rdzenia kręgowego po indukcji EAE, uzyskaj obrazy każdej sekcji w 4-krotnym powiększeniu i zapisz obrazy jako pliki TIFF.

Następnie w ImageJ wybierz interesujący Cię obraz i użyj narzędzia do zaznaczania wielokątów, aby prześledzić cały przekrój tkanki kręgosłupa. W menu obrazu wybierz typ i 16-bitowy, aby przekonwertować obraz na 16-bitowy. Następnie otwórz menu procesu i wybierz tło tematu, aby ustawić promień toczącej się piłki na co najmniej rozmiar największego obiektu, który nie jest częścią tła.

Sprawdź przesuwającą się paraboloidę i kliknij przycisk OK. Następnie w obszarze obrazu wybierz opcję Dostosuj i próg, a następnie użyj suwaków, aby ustawić dolny poziom progu. Aby uzyskać procent obszaru progowego w wybranym regionie, w obszarze Analizuj i ustaw pomiary wybierz opcję Ułamek obszaru. Upewnij się, że limit do progu nie jest zaznaczony, a etykieta wyświetlania jest zaznaczona, a następnie kliknij przycisk OK.To uzyskać pomiary, w obszarze Analizuj wybierz miarę.

Pojawi się wyskakujące okienko wyników. Zapisz te dane i porównaj wartości frakcji powierzchniowej między grupami leczonymi. Aby określić ilościowo podstawowe barwienie mieliny za pomocą gęstości optycznej, otwórz interesujący Cię obraz i użyj narzędzia przekrojów wielokątów, aby narysować obszar zainteresowania w próbce.

W obszarze Analizuj i ustaw pomiary wybierz średnią wartość szarości i upewnij się, że opcja Granica do progu nie jest zaznaczona, a opcja Wyświetlaj etykietę jest zaznaczona. Kliknij przycisk OK. Następnie w menu analizy wybierz pozycję miara. Pojawi się nowe wyskakujące okienko wyników z danymi o średniej wartości szarości białka zasadowego mieliny.

Usunięcie rdzenia kręgowego i analiza cytometrii przepływowej pozwala na ocenę naciekania komórek odpornościowych ośrodkowego układu nerwowego, gdzie infiltracja komórek odpornościowych jest maksymalna w szczycie choroby. Analiza statystyczna liczby komórek CD4-dodatnich, interferonu gamma-dodatnich, IL-17-dodatnich i FOXP3-dodatnich może ujawnić znaczenie zmian obserwowanych w liczbie naciekających limfocytów T CD4-dodatnich u zwierząt leczonych lekiem w porównaniu ze zwierzętami kontrolnymi, z dogłębną analizą koekspresji niezbędną do wykluczenia pochylenia jako czynnika zakłócającego w ogólnym zmniejszeniu liczby naciekających limfocytów T CD4-dodatnich. Aby wyeliminować możliwość, że zmniejszenie naciekających limfocyty T ośrodkowego układu nerwowego jest konsekwencją hamowania proliferacji, aktywacji i różnicowania na obrzeżach, można ocenić liczbę aktywnie proliferujących limfocytów T i proporcję podtypów limfocytów T.

W celu ilościowej oceny integralności mieliny można przeprowadzić analizę statystyczną gęstości optycznej barwienia zasadowego białka mieliny, ujawniając na przykład znaczną demielinizację tkanki rdzenia kręgowego u nieokreślonych zwierząt z nokautem genetycznym w porównaniu z rodzeństwem z miotu typu dzikiego. Aby dodatkowo uzasadnić, że zapalenie nerwów jest podtrzymywane lub zmniejszane przez interwencje terapeutyczne, glejozę reaktywną można również ocenić, mierząc średnią powierzchnię frakcji dla glejozy reaktywnej, jak właśnie pokazano. Po opanowaniu technikę cytometrii przepływowej można wykonać w ciągu dwóch dni, jeśli zostanie wykonana prawidłowo, podczas gdy kwantyfikacja barwienia tkanek może być wykonana w ciągu około dwóch godzin na barwienie.

Immunomodulację można ocenić, wprowadzając leczenie przed infiltracją komórek odpornościowych w celu ilościowego określenia zmian migracyjnych i proliferacyjnych w limfocytach T. Ochronę OUN można ocenić, wprowadzając leczenie w szczycie choroby, kiedy komórki odpornościowe już przeniknęły do OUN. Próbując wykonać tę procedurę, należy pamiętać o ocenie optymalnych ustawień progowych w ImageJ tylko dla konkretnego podświetlenia barwienia komórkowego.

Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak oceniać wpływ określonych metod leczenia na ośrodkowy układ nerwowy, proliferację limfocytów T i reakcje migracyjne. Zmieniając czas leczenia przed i po infiltracji komórek odpornościowych.