Name: Analiza cytometryczna przepływowa nacieku limfocytów w ośrodkowym układzie nerwowym podczas eksperymentalnego autoimmunologicznego zapalenia mózgu i rdzenia kręgowego (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-11-17T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 1 s
Description: Poznaj metodę izolacji limfocytów z OUN u myszy z EAE w celu badania autoimmunologicznych chorób układu nerwowego. Protokół umożliwia analizę cytometryczną komórek odpornościowych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

To badanie było wspierane przez grant Narodowej Fundacji Nauk Przyrodniczych Chin (31570921 dla ZJ, 81571533 dla LS), Miejską Komisję Zdrowia i Planowania Rodziny w Szanghaju (201540206 dla ZJ), grant badawczy dla Szpitala Ruijin North (2017ZX01 dla ZJ).

Wszystkie opisane tutaj metody zostały zatwierdzone przez komitet ds. zwierząt Szkoły Podstawowych Nauk Medycznych, Uniwersytetu Jiao Tong w Szanghaju.
1. Przygotowanie materiałów
<ol>
	<li>Użyj sekwencji MEVGWYRSPFSRVHLYRNGK MOG35-55, aby uzyskać liofilizowany peptyd ze źródeł komercyjnych. Upewnij się, że czystość peptydu wynosi >95%. Przygotować 10 mg/ml roztworu podstawowego MOG w roztworze soli fizjologicznej buforowanym fosforanami (PBS) i przechowywać w temperaturze -20 °C.</li>
	<li>Przygotować roztwór podstawowy M. tuberculosis H37 Ra o stężeniu 4 mg/ml, umieszczając jedną probówkę 100 mg M. tuberculosis H37 Ra w 25 ml kompletnego adiuwantu Freunda (CFA) i mieszając. Przechowywać roztwór podstawowy w temperaturze -20 °C.</li>
	<li>Przygotuj 1 ng/μl roztworu roboczego toksyny krztuścowej (PTX), dodając 50 μg PTX do 50 ml PBS. Przechowywać roztwór roboczy w temperaturze -20 °C.</li>
	<li>Przechowuj wszystkie przeciwciała (tj. FITC anty-mysie CD3, PE/Cy7 anty-mysie CD4, PerCP/Cy5.5 anty-mysie CD11b, Alexa Fluor700 anty-mysie CD45.2, PE anty-mysie IL-17A i APC anty-mysie IFN-γ) w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Przygotuj bufor do barwienia cytometrią przepływową (FCS), dodając 2 mM kwasu etylenodiaminotetraoctowego (EDTA) i 1% płodowej surowicy bydlęcej (FBS) do 500 ml PBS.</li>
</ol>
2. Obudowa myszy C57BL/6
<ol>
	<li>Użyj samic myszy C57BL/6 w wieku 8–12 tygodni.</li>
	<li>Myszy C57BL/6J należy aklimatyzować przez co najmniej 7 dni przed wstrzyknięciem.</li>
	<li>Myszy trzymane w pomieszczeniach dla zwierząt w warunkach wolnych od patogenów w stałej temperaturze i wilgotności w 12-godzinnym cyklu światło/ciemność oraz zapewniają swobodny dostęp do wody i standardowego pokarmu w postaci granulek.</li>
</ol>
3. Immunizacja myszy C57BL/6
<ol>
	<li>Pozostaw wszystkie roztwory podstawowe na 15 minut w temperaturze pokojowej (RT), aby zapewnić całkowite nawodnienie.</li>
	<li>Rozcieńczyć 300 μl roztworu podstawowego peptydu MOG z 700 μl PBS w celu przygotowania roztworu roboczego o stężeniu 3 mg/ml.</li>
	<li>Umieścić 1 ml roztworu podstawowego M. tuberculosis H37 Ra i 1 ml roztworu roboczego peptydów MOG35–55 do oddzielnych strzykawek o pojemności 10 ml, a następnie użyć czterokierunkowego kurka zatrzymującego do emulgowania przez co najmniej 10 minut. Przed wstrzyknięciem należy zapewnić pełną emulgację.</li>
	<li>Znieczulenie myszy w szczycie EAE za pomocą dootrzewnowego wstrzyknięcia 1% pentobarbitalu sodu (50 mg / kg).</li>
	<li>Za pomocą strzykawki o pojemności 1 ml wstrzyknij podskórnie myszom 100 μl emulsji MOG 35–55/CFA (300 μg/200 μl) w dwóch miejscach, oba z tyłu w pobliżu szyi. Podskórnie wstrzyknąć myszom kontrolnym 200 μl PBS.</li>
	<li>Tego samego dnia (dzień 0) i w 2 dniu po szczepieniu (PI) myszom wstrzykuje się dootrzewnowo 200 μl roztworu roboczego PTX o stężeniu 1 ng/μl. Myszy kontrolne wstrzyknąć dootrzewnowo za pomocą 200 μl PBS.</li>
	<li>Przenieś myszy do ich domowej klatki za pomocą podkładki rozgrzewającej.</li>
	<li>Badaj i oceniaj wszystkie myszy codziennie po wstrzyknięciu w sposób zaślepiony pod kątem objawów neurologicznych pokazanych w Tabeli 111,13. Poddaj zwierzęta eutanazji, jeśli wyniki są gorsze niż stopień 4.</li>
	<li>Rejestruj zmiany masy ciała w trakcie przebiegu choroby. Jest to cenna dodatkowa miara aktywności choroby w modelu EAE11,13.</li>
	<li>Dodaj pierwszy dzień objawów klinicznych dla poszczególnych myszy i podziel przez liczbę myszy w grupie; wynikiem jest początek. Dodaj pierwszy dzień maksymalnego wyniku EAE dla poszczególnych myszy i podziel przez liczbę myszy w grupie; Rezultatem jest szczyt.</li>
</ol>
4. Przygotowanie zawiesiny jednokomórkowej z mózgu
<ol>
	<li>Rozcieńczyć podłoże o gradiencie gęstości w stosunku 9:1 z PBS w stożkowej probówce o pojemności 15 ml, aby uzyskać końcowy 100% roztwór.</li>
	<li>Znieczulenie myszy w szczycie EAE za pomocą dootrzewnowego wstrzyknięcia 1% pentobarbitalu sodu (50 mg / kg) i perfuzji dosercowej za pomocą 20 ml sterylnego, lodowatego PBS. Osiągnij to, powoli i równomiernie wstrzykując PBS do lewej komory serca za pomocą strzykawki o pojemności 20 ml i otwierając prawy przedsionek.</li>
	<li>Ostrożnie przeciąć czaszkę od nosa do szyi, a następnie wyjąć mózg z pudełka czaszkowego do 10 ml RPMI w stożkowych probówkach o pojemności 50 ml. Dobrze wymieszaj, aby usunąć przylegające czerwone krwinki. Następnie usuń pożywkę przez aspirację i dodaj 10 ml RPMI.</li>
	<li>Umieść mózgi i podłoże w naczyniu o średnicy 100 mm. Drobno posiekaj żyletką.</li>
	<li>Przenieś 6 ml z naczynia do lodowatego homogenizatora ze szkła spiekanego o pojemności 7 ml za pomocą czystej pipety. Unikaj pozostawiania dużych ilości tkanki w pipecie. Niewielka ilość jest nieunikniona.</li>
	<li>Najpierw zmielić mózg za pomocą "luźnego" tłoka tłuczka, następnie użyć "ciasnego" tłoka, aż zawiesina stanie się jednorodna, a następnie przelać do wstępnie schłodzonej stożkowej probówki o pojemności 15 ml i trzymać na lodzie.</li>
	<li>Po homogenizacji wszystkich próbek oszacuj objętość. Dostosuj głośność za pomocą RPMI do 7 ml. Następnie umieść 3 ml lodowatej 100% macierzy membranowej w schłodzonej stożkowej probówce wirówkowej o pojemności 15 ml i dodaj 7 ml homogenatu mózgu, aby uzyskać końcowe podłoże o gradiencie gęstości 30%. Wymieszaj kilka razy przez odwrócenie. Nie wirować.</li>
	<li>Aby zapewnić ostre interfejsy, ostrożnie i powoli dodawaj 1 ml podłoża o gradicynie gęstości podkładu o 70% w RPMI za pomocą pipety o pojemności 3 ml.</li>
	<li>Wirować przy 800 x g tylko przez 20 minut w temperaturze 4 °C. Ustawić przyspieszenie na 1, a opóźnienie na 0. Po odwirowaniu należy odessać prawie całą górną fazę, uważając, aby całkowicie usunąć mielinę na górze (<silna klasa="xfig">Rysunek 1).</li>
	<li>Wyjmij interfejs do nowej probówki wirówkowej 15. Dostosuj objętość do 10 ml za pomocą RPMI.</li>
	<li>Wirować przy 500 x g przez 10 min. Po odwirowaniu odessać supernatant. Zawiesić osad w ~200 μL buforu do barwienia cytometrią przepływową (FSC). Granulki są następnie gotowe do barwienia dla FACS.</li>
</ol>
5. Analiza cytometryczna przepływu pojedynczych komórek z mózgu
<ol>
	<li>Użyj hemocytometru i mikroskopu, aby policzyć komórki. Dodaj 10 μl komórek do 10 μl błękitu trypanowego, dobrze wymieszaj i umieść 10 μl na hemocytometrze, aby policzyć komórki. Następnie oblicz liczbę żywych komórek na mikrolitr pod mikroskopem odwróconym (np. Mikroskop odwrócony Olympus).</li>
	<li>Podwielokrotność około 2 x 106 komórek w RPMI do pojedynczego dołka na 96-dołkowej płytce.</li>
	<li>Dodaj do studzienek 500-krotny koktajl stymulacji komórkowej oraz inhibitory transportu białek.</li>
	<li>Inkubować płytkę w inkubatorze w temperaturze 37 °C przez 4 godziny.</li>
	<li>Odwirować komórki przy 400 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej. Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić komórki w 100 μl buforu FCS.</li>
	<li>Wstępnie inkubować komórki z anty-mysim blokiem Fc CD16/CD32 (1:33) przez 10 minut w temperaturze 4 °C przed barwieniem w celu zablokowania niespecyficznych oddziaływań, w których pośredniczy Fc.</li>
	<li>Markery powierzchniowe do barwienia bez mycia. Dodaj przeciwciała anty-mysie CD45.2 (1:200), anty-mysie CD11b (1:200), anty-mysie CD3 (1:200) i anty-mysie CD4 (1:200). 
	UWAGA: Aby określić bramki dodatnie i ujemne, należy wybarwić fluorescencję minus jeden (FMO) dla każdego koloru i przeciwciało kontrolne izotypu.</li>
	<li>Inkubować płytkę przez co najmniej 30 minut w temperaturze 4 °C lub na lodzie. Chronić przed światłem.</li>
	<li>Umyj komórki, dodając bufor FCS. Użyj 200 μl/dołek do płytek do mikromiareczkowania. Wirować przy 400 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej. Odrzucić supernatant.</li>
	<li>Dodaj 200 μl wewnątrzkomórkowego buforu utrwalającego (IC) do każdej studzienki, aby utrwalić komórki. Upewnij się, że komórki są całkowicie ponownie zawieszone w roztworze.</li>
	<li>Inkubować 30–60 minut w temperaturze pokojowej. Chronić przed światłem.</li>
	<li>Odwirować próbki o masie 400 x g w temperaturze pokojowej przez 5 minut. Odrzucić supernatant.</li>
	<li>Dodać 200 μl 1x buforu permeabilizacyjnego do każdej studzienki i odwirować próbki przy 400 x g w temperaturze pokojowej przez 5 minut. Odrzucić supernatant.</li>
	<li>Zawiesić osad w pozostałej objętości i dostosować objętość do około 100 μl za pomocą 1x buforu permeabilizacyjnego.</li>
	<li>Dodać przeciwciała anty-mysie IL-17A (1:200) i anty-mysie IFN-g (1:200) w celu wykrycia wewnątrzkomórkowych antygenów komórek.</li>
	<li>Inkubować przez co najmniej 30 minut w temperaturze 4 °C. Chronić przed światłem.</li>
	<li>Dodać 100 μl 1x buforu permeabilizacyjnego do każdej studzienki i odwirować próbki przy 400 x g w temperaturze pokojowej przez 5 minut. Odrzucić supernatant.</li>
	<li>Ponownie zawiesić wybarwione komórki w 100 μl buforu barwiącego do cytometrii przepływowej.</li>
	<li>Analiza metodą cytometrii przepływowej. 
	UWAGA: Ustawienia lasera i kompensacji w cytometrze przepływowym są dostosowywane, próbki są umieszczane na cytometrze, a wszystkie zdarzenia są rejestrowane zgodnie z zaleceniami producenta.</li>
</ol>
6. Analiza danych
<ol>
	<li>Podkoszulki bramek wykorzystujące FSC-A vs. FSC-H i SSC-A vs. SSC-H.</li>
	<li>Bramkowanie komórek na żywo za pomocą FSC-A i SSC-A w zależności od rozmiaru.</li>
	<li>Następnie zidentyfikuj leukocyty, z wyłączeniem monocytów, poprzez bramkowanie na komórkach CD45 + CD11b.</li>
	<li>Następnie zidentyfikuj limfocyty T CD4 poprzez bramkowanie na komórkach CD3 + CD4 +.</li>
	<li>Na koniec zidentyfikuj podzbiory Th1 i Th17 poprzez bramkowanie na komórkach IFN-γ+ i komórkach IL-17+ osobno, a następnie określ populacje dodatnie i ujemne za pomocą kontroli izotypów i FMO.</li>
</ol>

<ol><li>Milo, R., Kahana, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple+sclerosis%3A+geoepidemiology%2C+genetics+and+the+environment%5BTitle%5D)+AND+%22Autoimmunity+Reviews%22%5BJournal%5D)">Multiple sclerosis: geoepidemiology, genetics and the environment.</a> Autoimmunity Reviews. 9, 387-394 (2010).</li>
<li>Gold, R., Linington, C., Lassmann, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Understanding+pathogenesis+and+therapy+of+multiple+sclerosis+via+animal+models%3A+70+years+of+merits+and+culprits+in+experimental+autoimmune+encephalomyelitis+research%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+%3A+A+Journal+of+Neurology%22%5BJournal%5D)">Understanding pathogenesis and therapy of multiple sclerosis via animal models: 70 years of merits and culprits in experimental autoimmune encephalomyelitis research.</a> Brain : A Journal of Neurology. 129, 1953-1971 (2006).</li>
<li>Simmons, S. B., Pierson, E. R., Lee, S. Y., Goverman, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modeling+the+heterogeneity+of+multiple+sclerosis+in+animals%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Modeling the heterogeneity of multiple sclerosis in animals.</a> Trends in Immunology. 34 (8), 410-422 (2013).</li>
<li>Lassmann, H., Wisniewski, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chronic+relapsing+experimental+allergic+encephalomyelitis%3A+clinicopathological+comparison+with+multiple+sclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Archives+of+Neurology%22%5BJournal%5D)">Chronic relapsing experimental allergic encephalomyelitis: clinicopathological comparison with multiple sclerosis.</a> Archives of Neurology. 36, 490-497 (1979).</li>
<li>Bernard, C. C., Leydon, J., Mackay, I. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((T+cell+necessity+in+the+pathogenesis+of+experimental+autoimmune+encephalomyelitis+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">T cell necessity in the pathogenesis of experimental autoimmune encephalomyelitis in mice.</a> European Journal of Immunology. 6, 655-660 (1976).</li>
<li>Yasuda, T., Tsumita, T., Nagai, Y., Mitsuzawa, E., Ohtani, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Experimental+allergic+encephalomyelitis+%28EAE%29+in+mice.+I.+Induction+of+EAE+with+mouse+spinal+cord+homogenate+and+myelin+basic+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Japanese+Journal+of+Experimental+Medicine%22%5BJournal%5D)">Experimental allergic encephalomyelitis (EAE) in mice. I. Induction of EAE with mouse spinal cord homogenate and myelin basic protein.</a> Japanese Journal of Experimental Medicine. 45, 423-427 (1975).</li>
<li>Mendel, I., Kerlero de Rosbo, N., Ben-Nun, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+myelin+oligodendrocyte+glycoprotein+peptide+induces+typical+chronic+experimental+autoimmune+encephalomyelitis+in+H-2b+mice%3A+fine+specificity+and+T+cell+receptor+V+beta+expression+of+encephalitogenic+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">A myelin oligodendrocyte glycoprotein peptide induces typical chronic experimental autoimmune encephalomyelitis in H-2b mice: fine specificity and T cell receptor V beta expression of encephalitogenic T cells.</a> European Journal of Immunology. 25, 1951-1959 (1995).</li>
<li>Bramow, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Demyelination+versus+remyelination+in+progressive+multiple+sclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Brain%22%5BJournal%5D)">Demyelination versus remyelination in progressive multiple sclerosis.</a> Brain. 133, 2983-2998 (2010).</li>
<li>Sospedra, M., Martin, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunology+of+multiple+sclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Reviews+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Immunology of multiple sclerosis.</a> Annual Reviews in Immunology. 23, 683-747 (2005).</li>
<li>McGinley, A. M., Edwards, S. C., Raverdeau, M., Mills, K. H. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Th17+cells%2C+gammadelta+T+cells+and+their+interplay+in+EAE+and+multiple+sclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Autoimmunity%22%5BJournal%5D)">Th17 cells, gammadelta T cells and their interplay in EAE and multiple sclerosis.</a> Journal of Autoimmunity. 20 (14), 3394(2018).</li>
<li>Ji, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thiamine+deficiency+promotes+T+cell+infiltration+in+experimental+autoimmune+encephalomyelitis%3A+the+involvement+of+CCL2%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Thiamine deficiency promotes T cell infiltration in experimental autoimmune encephalomyelitis: the involvement of CCL2.</a> Journal of Immunology. 193, 2157-2167 (2014).</li>
<li>Manglani, M., Gossa, S., McGavern, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Leukocyte+Isolation+from+Brain%2C+Spinal+Cord%2C+and+Meninges+for+Flow+Cytometric+Analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Leukocyte Isolation from Brain, Spinal Cord, and Meninges for Flow Cytometric Analysis.</a> Current Protocols in Immunology. 121, 44(2018).</li>
<li>Ji, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Obesity+promotes+EAE+through+IL-6+and+MCP-1-mediated+T+cells+infiltration%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Obesity promotes EAE through IL-6 and MCP-1-mediated T cells infiltration.</a> Frontiers in Immunology. 10, 1881(2019).</li>
<li>Reiseter, B. S., Miller, G. T., Happ, M. P., Kasaian, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Treatment+of+murine+experimental+autoimmune+encephalomyelitis+with+a+myelin+basic+protein+peptide+analog+alters+the+cellular+composition+of+leukocytes+infiltrating+the+cerebrospinal+fluid%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroimmunology%22%5BJournal%5D)">Treatment of murine experimental autoimmune encephalomyelitis with a myelin basic protein peptide analog alters the cellular composition of leukocytes infiltrating the cerebrospinal fluid.</a> Journal of Neuroimmunology. 91, 156-170 (1998).</li>
<li>Bittner, S., Afzali, A. M., Wiendl, H., Meuth, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myelin+oligodendrocyte+glycoprotein+%28MOG35-55%29+induced+experimental+autoimmune+encephalomyelitis+%28EAE%29+in+C57BL%2F6+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Myelin oligodendrocyte glycoprotein (MOG35-55) induced experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) in C57BL/6 mice.</a> Journal of Visualized Experiments. (86), e51275(2014).</li>
<li>Miller, S. D., Karpus, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Experimental+autoimmune+encephalomyelitis+in+the+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Experimental autoimmune encephalomyelitis in the mouse.</a> Current Protocols in Immunology. , Chapter 15, Unit 15 11(2007).</li>
<li>Tietz, S. M., Engelhardt, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualizing+Impairment+of+the+Endothelial+and+Glial+Barriers+of+the+Neurovascular+Unit+during+Experimental+Autoimmune+Encephalomyelitis+In+Vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Visualizing Impairment of the Endothelial and Glial Barriers of the Neurovascular Unit during Experimental Autoimmune Encephalomyelitis In Vivo.</a> Journal of Visualized Experiments. (145), e59249(2019).</li>
</ol>

Autorzy nie mają do zadeklarowania konfliktu interesów.

W badaniu tym przedstawiono protokół indukcji i monitorowania EAE przy użyciu MOG35-55 u myszy C57BL / 6, które są uważane za typowy neuroimmunologiczny eksperymentalny model zwierzęcy SM. EAE można indukować w zależności od szczepów myszy lub rodzaju białka użytego do indukcji w zależności od celu badania. Na przykład stosowanie peptydu PLP139-151 u myszy SJL może wywołać rzutowo-remisyjny przebieg choroby EAE, który jest szczególnie dobrze przystosowany do oceny efektów terapeutycznych w nawrotach15</...

Jako przewlekła choroba demielinizacyjna OUN, stwardnienie rozsiane dotyka około 2,5 miliona ludzi na całym świecie i nie ma leczenia 1. Jest również uważana za chorobę autoimmunologiczną, w której limfocyty T specyficzne dla antygenu mielinowego inicjują reakcję zapalną i prowadzą do demielinizacji i uszkodzenia aksonów w klasie CNS<sup="xref">2. Eksperymentalne autoimmunologiczne zapalenie mózgu i rdzenia kręgowego (EAE) jest szeroko stosowane do badania mechanizmów patogennych SM jako klasyczny model autoimmunologicznej choroby demielinizacyjnej w CNS3. Istnieją dwa sposoby indukcji EAE: jeden to aktywne wywoływanie EAE poprzez uodparnianie zwierząt składnikami mieliny, drugi to transfer adoptywny poprzez transfer encefalitogennych limfocytów T do receptora2,4,5. Podatność na EAE jest różna w różnych szczepach zwierząt6. U myszy C57BL/6 prowokacja glikoproteiny oligodendrocytów mieliny (MOG) 35-55 indukuje chorobę jednofazową z rozległą demielinizacją i stanem zapalnym w OUN, co jest często stosowane w eksperymentach na myszach ukierunkowanych na gen7.
Wytwarzanie reaktywnych limfocytów T specyficznych dla mieliny jest niezbędne do wystąpienia i rozwoju choroby w EAE i jest immunologicznym znakiem zarówno EAE, jak i MS. Aktywowane autoreaktywne limfocyty T przenikają przez barierę krew-mózg (BBB) do zdrowego OUN i inicjują chorobę EAE. W przypadku napotkania MOG 35–55 Ag te limfocyty T indukują stan zapalny i rekrutację komórek efektorowych do OUN, co prowadzi do demielinizacji i zniszczenia aksonów8,9. W modelu EAE istnieje wiele dowodów na to, że limfocyty T CD4 + specyficzne dla neuroantygenu mogą inicjować i podtrzymywać zapalenie i patologię nerwów3,10. W zależności od głównych wytwarzanych cytokin, limfocyty T CD4 + zostały sklasyfikowane w różnych podzbiorach: Th1 (charakteryzujący się wytwarzaniem interferonu-γ), Th2 (charakteryzujący się wytwarzaniem interleukiny 4) i Th17 (charakteryzujący się wytwarzaniem interleukiny 17). Uważa się, że aktywacja komórek Th1 i Th17 przyczynia się do indukcji, utrzymania i regulacji demielinizacji zapalnej w EAE i MS poprzez wydzielanie cytokin efektorowych IFN-γ i IL-17, które są zdolne do aktywacji makrofagów i rekrutacji neutrofili do miejsc zapalnych w celu przyspieszenia zmian chorobowych11.
Ponieważ autoreaktywne limfocyty T przenikają przez BBB do OUN i wywołują rozwój choroby w SM i EAE, bardzo ważne jest analizowanie limfocytów T w OUN. Istnieje jednak bardzo niewiele ustalonych protokołów izolacji limfocytów z klasy CNS<sup="xref">12. W związku z tym opracowano metodę zoptymalizowaną do izolowania komórek jednojądrzastych z mózgu i analizy limfocytów T z markerami CD45, CD11b, CD3, CD4, INF-g i IL-17 do cytometrii przepływowej. Metoda wykorzystuje adiuwant MOG35–55 Mycobacterium tuberculosis H37 Ra i roztwór roboczy toksyny krztuścowej (PTX) w celu wywołania aktywnego modelu immunizacji EAE u myszy. Następnie stosuje się metody separacji mechanicznej i wirowania w gradiacji gęstości do izolacji komórek jednojądrzastych OUN. Wreszcie, zoptymalizowana strategia bramkowania cytometrii przepływowej jest stosowana do identyfikacji limfocytów T i podzbiorów z mózgu poprzez barwienie wielu markerów.

<table><tbody><tr><td>Alexa Fluor700 przeciw myszom CD45.2</td><td>eBioscience</td><td>56-0454-82</td><td></td></tr><tr><td>Anty-mysi blok CD16/CD32 Fc</td><td>BioLegend</td><td>101302</td><td></td></tr><tr><td>APC przeciw myszom IFN-g</td><td>eBioscience</td><td>17-7311-82</td><td></td></tr><tr><td>BD LSRFortessa X-20</td><td>BD</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dounce homogenizator</td><td>Wheaton</td><td>353107542</td><td></td></tr><tr><td>eBioscience Koktajl stymulacji komórek (plus inhibitory transportu białek) (500X)</td><td>eBioscience</td><td>00-4975-03</td><td></td></tr><tr><td>eBioscience Wewnątrzkomórkowe utrwalanie i Zestaw permeabilacyjnych</td><td>eBioscience</td><td>88-8824-00</td><td></td></tr><tr><td>FITC anty-mysi CD3</td><td>BioLegend</td><td>100203</td><td></td></tr><tr><td>FITC Rat IgG2b i kappa; Isotype Ctrl Przeciwciało</td><td>BioLegend</td><td>400605</td><td></td></tr><tr><td>Kompletny adiuwant Freunda (CFA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F5881</td><td></td></tr><tr><td>Mysia kontrola izotypu IgG2a kappa (eBM2a), Alexa Fluor 700, eBioscience</td><td>eBioscience</td><td>56-4724-80</td><td></td></tr><tr><td>Mycobacterium tuberculosis H37 Ra</td><td>Difco Laboratories</td><td>231141</td><td></td></tr><tr><td>PE anty-mysie IL-17A</td><td>eBioscience</td><td>12-7177-81</td><td></td></tr><tr><td>PE/Cy7 anty-mysi CD4</td><td>BioLegend</td><td>100422</td><td></td></tr><tr><td>PE/Cy7 Szczur IgG2b, &kappa; Isotype Ctrl Przeciwciało</td><td>BioLegend</td><td>400617</td><td></td></tr><tr><td>Percoll</td><td>GE</td><td>17-0891-01</td><td></td></tr><tr><td>PerCP/Cy5.5 anty-mysie CD11b</td><td>BioLegend</td><td>101228</td><td></td></tr><tr><td>PerCP/Cy5.5 Rat IgG2b, &kappa; Isotype Ctrl Przeciwciało</td><td>BioLegend</td><td>400631</td><td></td></tr><tr><td>toksyna krztuścowa (PTX)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P-2980</td><td></td></tr><tr><td>Kontrola izotypu szczura IgG1 kappa (eBRG1), APC, eBioscience</td><td>eBioscience</td><td>17-4301-82</td><td></td></tr><tr><td>Kontrola izotypu szczura IgG2a kappa (eBR2a), PE, eBioscience</td><td>eBioscience</td><td>12-4321-80</td><td></td></tr><tr><td>Szczur MOG35&ndash; 55 peptydów</td><td>Biosynth International</td><td></td><td>MEVGWYRSPFSRVVHLYRNGK</td></tr></tbody></table>

analiza cytometryczna przepływowa nacieku limfocytów w ośrodkowym układzie nerwowym podczas eksperymentalnego autoimmunologicznego zapalenia mózgu i rdzenia kręgowego

Flow Cytometric Analysis of Lymphocyte Infiltration in Central Nervous System during Experimental Autoimmune Encephalomyelitis

Stwardnienie rozsiane (MS) jest chorobą autoimmunologiczną ośrodkowego układu nerwowego (OUN) spowodowaną kombinacją czynników środowiskowych i podatnego podłoża genetycznego. Eksperymentalne autoimmunologiczne zapalenie mózgu i rdzenia kręgowego (EAE) jest typowym modelem chorobowym stwardnienia rozsianego, szeroko stosowanym do badania patogenezy, w której limfocyty T specyficzne dla antygenów mielinowych inicjują reakcję zapalną w OUN. Bardzo ważna jest ocena, w jaki sposób limfocyty w OUN regulują rozwój choroby. Jednak podejście do pomiaru ilości i jakości naciekanych limfocytów w OUN jest bardzo ograniczone ze względu na trudności w izolowaniu i wykrywaniu naciekanych limfocytów z mózgu. Niniejszy manuskrypt przedstawia protokół, który jest przydatny do izolacji, identyfikacji i charakterystyki naciekających limfocytów z OUN i będzie pomocny w zrozumieniu, w jaki sposób limfocyty są zaangażowane w rozwój choroby autoimmunologicznej OUN.

Po immunizacji myszy C57BL/6 wszystkie zwierzęta były codziennie ważone, badane i oceniane pod kątem objawów neurologicznych. Reprezentatywny przebieg kliniczny EAE powinien skutkować krzywą zachorowania przedstawioną na Rysunku 2A oraz zmianą masy ciała myszy przedstawioną na Rysunku 2B. Myszy C57BL/6 immunizowane MOG35-55 zazwyczaj zaczynały wykazywać objawy choroby około 10–12 dnia i osiągały szczyt zachorowania około 15–21 dnia po aktywnej immunizacji (<stro...

Ten manuskrypt przedstawia protokół indukcji aktywnego eksperymentalnego autoimmunologicznego zapalenia mózgu i rdzenia (EAE) u myszy. Przedstawiono również metodę izolacji i charakterystyki naciekających limfocytów w ośrodkowym układzie nerwowym (OUN), aby pokazać, w jaki sposób limfocyty są zaangażowane w rozwój choroby autoimmunologicznej OUN.

Analiza cytometryczna przepływowa nacieku limfocytów w ośrodkowym układzie nerwowym podczas eksperymentalnego autoimmunologicznego zapalenia mózgu i rdzenia kręgowego

Multiple sclerosis (MS) is an autoimmune disease of the central nervous system (CNS) caused by the combination of environmental factors and susceptible ...

Protokół, który tutaj prezentujemy, będzie dla nas pomocny w zrozumieniu, w jaki sposób limfocyty biorą udział w rozwoju choroby autoimmunologicznej ośrodkowego układu nerwowego. Dzięki tej metodzie limfocyty w mózgu mogą być badane na podstawie komórki po komórce. Protokół ten można również zastosować do innych modeli i chorób ośrodkowego układu nerwowego, które wymagały analizy cech i funkcji komórek odpornościowych.W tym filmie protokół może łatwo zademonstrować, jak indukować, modelować i izolować pojedyncze komórki w mózgu. Po potwierdzeniu braku reakcji na odruch pedałowania, użyj jednomililitrowej strzykawki, aby wstrzyknąć podskórnie znieczulone myszy C57BL/6 ze 100 mikrogramami zemulgowanego MOG 35-55 w 100 mikrolitrach kompletnego adiuwantu Freunda w dwa różne miejsca pleców w pobliżu szyi. Tego samego dnia i drugiego dnia po szczepieniu należy wstrzyknąć myszom dootrzewnowo 200 mikrolitrów jednego nanograma na mikrolitr roztworu roboczego toksyny krztuścowej.Po drugim wstrzyknięciu przenieś myszy z powrotem do ich domowej klatki z podkładką rozgrzewającą i monitoruj aż do pełnego leżenia. Następnego dnia i przez cały przebieg choroby należy zbadać i ocenić wszystkie myszy w sposób zaślepiony pod kątem objawów neurologicznych przedstawionych w tabeli oraz wszelkich zmian masy ciała. W odpowiednim punkcie końcowym doświadczenia ostrożnie przeciąć czaszkę od nosa do szyi i przenieść mózg każdego zwierzęcia z pudełka czaszkowego do indywidualnych 50-mililitrowych probówek zawierających 10 mililitrów pożywki RPMI.Dobrze wymieszaj probówki, aby usunąć przylegające czerwone krwinki i usunąć pożywkę przez aspirację. Dodaj 10 mililitrów świeżej pożywki do każdej probówki i przenieś mózgi do pojedynczych 100-milimetrowych szalek. Na koniec posiekaj każdy mózg brzytwą i użyj plastikowej pipety, aby przenieść jak najwięcej tkanki z jednego naczynia na raz i sześć mililitrów pożywki do lodowatego homogenizatora ze szkła o średnicy siedmiu mililitrów.Zmielić mózg za pomocą luźnego tłoka tłuczka, a następnie użyć ciasnego tłoka, aby doprowadzić tkankę do uzyskania jednorodnej konsystencji. Następnie wlej powstałą zawiesinę tkanki do wstępnie schłodzonej stożkowej rurki o pojemności 15 mililitrów na lodzie. Gdy wszystkie próbki zostaną zhomogenizowane, dostosuj objętość w każdej probówce do siedmiu mililitrów ze świeżą pożywką, przed dodaniem każdej zawiesiny tkankowej do nowej schłodzonej 15-mililitrowej probówki zawierającej trzy mililitry 100% macierzy membrany podstawnej na probówkę.Wymieszaj kilka razy przez odwrócenie i użyj trzymililitrowej pipety, aby ostrożnie i powoli dodać jeden mililitr roztworu gradientu gęstości 70 procent pod każdą próbkę roztworu tkankowego. Oddziel komórki przez wirowanie w gradiacji gęstości i usuń prawie całą górną warstwę, uważając, aby całkowicie usunąć całą mielinę. Przenieś interfejs do nowej 15-mililitrowej rurki i dostosuj objętość do 10 mililitrów za pomocą świeżego podłoża.Następnie ponownie odwirować próbki i usunąć supernatant przed ponownym zawieszeniem granulek w około 100 mikrolitrach pożywki na probówkę. Do analizy cytometrii przepływowej pobranych komórek mózgowych, przydziel około dwa razy 10 do sześciu komórek w 100 mikrolitrach pożywki do indywidualnych dołków 96-dołkowej płytki. Gdy wszystkie komórki zostaną posiaczone, dodaj 100 mikrolitrów koktajlu stymulacji komórek 500X oraz inhibitorów transportu białek do studzienek i umieść płytkę w inkubatorze hodowli komórkowej na cztery godziny.Pod koniec inkubacji zebrać komórki na dnie studzienek przez odwirowanie i ponownie zawiesić granulki w 100 mikrolitrach buforu cytometrii przepływowej na studzienkę. Wstępnie inkubować komórki z trzema mikrolitrami bloku Anti-Mouse CD16 / CD32 Fc przez 10 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza przed barwieniem. Aby zablokować wszelkie niespecyficzne interakcje, w których pośredniczy Fc.Pod koniec inkubacji dodaj do każdej studzienki interesujący Cię koktajl przeciwciał i umieść płytkę w temperaturze czterech stopni Celsjusza, chroniąc ją przed światłem. Po 30 minutach przemyć studzienki 100 mikrolitrami buforu cytometrii przepływowej na studzienkę i osadzać komórki przez odwirowanie. Po odrzuceniu supernatantów dodać 200 mikrolitrów wewnątrzkomórkowego buforu utrwalającego do każdej studzienki.Po 30 do 60 minutowej inkubacji w temperaturze pokojowej zebrać próbki przez odwirowanie i ponownie zawiesić granulki w 200 mikrolitrach buforu o przepuszczalności 1X na studzienkę. Ponownie odwirować próbki, a po odrzuceniu supernatantu ponownie zawiesić granulki w 100 mikrolitrach ze świeżym buforem przepuszczalnym. Następnie dodaj odpowiednie przeciwciała do wykrywania wszelkich interesujących antygenów wewnątrzkomórkowych przez 30 minut inkubacji w temperaturze czterech stopni Celsjusza, chronionej przed światłem.Pod koniec inkubacji dodać 100 mikrolitrów 1X buforu przepuszczalnego do każdej studzienki i odwirować próbki przez odwirowanie. Następnie ponownie zawieś komórki barwiące w 200 mikrolitrach buforu barwiącego cytometrię przepływową i przeanalizuj komórki za pomocą cytometrii przepływowej zgodnie ze standardowymi protokołami. Typowy przebieg kliniczny EAE powinien skutkować krzywą chorobową i zmianą masy ciała, jak pokazano na ilustracji.Myszy C57BL/6 zaszczepione MOG 35-55 zwykle zaczynają rozwijać objawy choroby około 10 do 12 dnia i osiągają szczyt choroby około 15 do 21 dnia. Przed wystąpieniem choroby masa ciała uodpornionych myszy stopniowo wzrasta, zanim zmniejszy się w korelacji z nasilającymi się objawami choroby Myszy wykazują najniższą masę ciała w szczycie EAE, przy czym masa ciała nieznacznie wzrasta wraz ze spadkiem objawów klinicznych. Myszy zwykle nie wracają w pełni do zdrowia i zazwyczaj rozwijają monofazową patologię choroby przewlekłej.Jak pokazuje ta reprezentatywna analiza przepływu, komórki Th1 wytwarzające interferon gamma i komórki Th17 wytwarzające IL17 są znacznie zwiększone u myszy EAE. Najważniejszym krokiem jest 3.10. Operator powinien przenieść środkową warstwę i światło, zachowując ostrożność, wziąć jak najmniej innych warstw.Postępując zgodnie z tym protokołem, możemy dalej limfocyty T do dalszej analizy transkrypcji w celu zbadania

flow-cytometric-analysis-lymphocyte-infiltration-central-nervous

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Mikroglią są rezydentne makrofagi, które stanowią pierwszą linię obrony i nadzoru immunologicznego ośrodkowego układu nerwowego. MikroRNA to cząsteczki regulacyjne, które odgrywają istotną rolę w wielu procesach fizjologicznych, w tym w aktywacji i różnicowaniu makrofagów. W niniejszym artykule opisujemy metodę pomiaru mikroRNA w mikroglii.

Wykrywanie mikroRNA w mikrogleju za pomocą PCR w czasie rzeczywistym w prawidłowym OUN oraz podczas neurostanu zapalnego

Ten manuskrypt opisuje metody indukcji i oceny eksperymentalnego modelu autoimmunologicznego zapalenia mózgu i rdzenia kręgowego (EAE), wraz z oceną rozmieszczenia komórek odpornościowych i poziomów cytokin mRNA w węzłach chłonnych, śledzionie, krwi i rdzeniu kręgowym za pomocą cytometrii przepływowej i ilościowego PCR, odpowiednio, w różnych fazach choroby.

Indukcja eksperymentalnego autoimmunologicznego zapalenia mózgu i rdzenia kręgowego u myszy i ocena zależnej od choroby dystrybucji komórek odpornościowych w różnych tkankach

Ten protokół opisuje, jak określić, czy farmakologiczne leczenie eksperymentalnego autoimmunologicznego zapalenia mózgu i rdzenia wykazuje ochronę OUN w wyniku tłumienia infiltracji komórek odpornościowych, czy też są neuroprotekcyjne podczas ataku infiltracji komórek odpornościowych.

Określanie supresji układu odpornościowego w porównaniu z ochroną OUN dla interwencji farmakologicznych w demielinizacji autoimmunologicznej

Tutaj prezentujemy protokoły do badania upośledzenia jednostki nerwowo-naczyniowej podczas eksperymentalnego autoimmunologicznego zapalenia mózgu i rdzenia in vivo. W szczególności zajmujemy się tym, jak określić przepuszczalność bariery krew-mózg i aktywność żelatynazy zaangażowaną w migrację leukocytów przez limity gleju.

Wizualizacja upośledzenia barier śródbłonkowych i glejowych jednostki nerwowo-naczyniowej podczas eksperymentalnego autoimmunologicznego zapalenia mózgu i rdzenia mięśniowego in vivo

Niniejszy protokół opisuje indukcję eksperymentalnego autoimmunologicznego zapalenia mózgu i rdzenia w modelu mysim przy użyciu glikoproteiny oligodendrocytów mieliny i monitorowanie procesu chorobowego za pomocą systemu punktacji klinicznej. Eksperymentalne objawy związane z autoimmunologicznym zapaleniem mózgu i rdzenia kręgowego są analizowane za pomocą analizy mikrotomografii komputerowej kości udowej myszy i testu terenowego w celu kompleksowej oceny procesu chorobowego.

Indukcja i zróżnicowane wskaźniki oceny eksperymentalnego autoimmunologicznego zapalenia mózgu i rdzenia kręgowego

Do tej pory, protokoły jednoczesnej izolacji wszystkich głównych typów komórek rezydujących w ośrodkowym układzie nerwowym od tej samej myszy są niezaspokojonym wymaganiem. Protokół przedstawia procedurę mającą zastosowanie u myszy z nieleczonym i eksperymentalnym autoimmunologicznym zapaleniem mózgu i rdzenia w celu zbadania złożonych sieci komórkowych podczas zapalenia nerwów i jednoczesnego zmniejszenia wymaganej liczby myszy.

Jednoczesna izolacja głównych typów komórek rezydujących w ośrodkowym układzie nerwowym od dorosłych myszy z autoimmunologicznym zapaleniem mózgu i rdzenia

Eksperymentalne autoimmunologiczne zapalenie mózgu i rdzenia (EAE) służy jako zwierzęcy model stwardnienia rozsianego. W tym artykule opisano podejście do oceny zapalenia rdzenia kręgowego, demielinizacji i uszkodzenia aksonów w EAE. Dodatkowo przedstawiono metodę ilościowego określania poziomu rozpuszczalnego światła neurofilamentów w surowicy myszy, ułatwiającą ocenę uszkodzenia aksonów u żywych myszy.

Ocena zapalenia ośrodkowego układu nerwowego, demielinizacji i uszkodzenia aksonów w eksperymentalnym autoimmunologicznym zapaleniu mózgu i rdzenia

Eksperymentalne autoimmunologiczne zapalenie mózgu i rdzenia (EAE) to zwierzęcy model stwardnienia rozsianego (MS), który dzieli z ludzką chorobą silną humoralną odpowiedź autoimmunologiczną. W tym miejscu przedstawiamy prosty i elastyczny protokół ELISA do ilościowego oznaczania autoprzeciwciał w surowicy myszy uodpornionych na EAE.

Kwantyfikacja przeciwciał autoreaktywnych u myszy po eksperymentalnym autoimmunologicznym zapaleniu mózgu i rdzenia kręgowego

Niektóre szczepy myszy są odporne na indukcję eksperymentalnego autoimmunologicznego zapalenia mielnowodnego (EAE) za pomocą podstawowego białka mieliny. Opisano tutaj prosty protokół immunizacji, który przełamuje tę brak reakcji i indukuje chorobę porażenną u kilku typowych szczepów myszy odpornych na EAE.

Przełamanie braku reakcji u szczepów myszy odpornych na eksperymentalne autoimmunologiczne zapalenie mózgu i rdzenia (EAE) poprzez transfer adopcyjny i stymulację antygenową

Przedstawiamy metody efektywnej i szybkiej izolacji/hodowli żywotnego mikrogleju z kory mózgowej noworodka i dorosłego rdzenia kręgowego.  Sekcja i posiew mikrogleju korowego może być przeprowadzona w ciągu 90 minut, a późniejsze zbieranie mikrogleju odbywa się ~ 10 dni po początkowym rozbiorze.

Hodowla mikrogleju z ośrodkowego układu nerwowego noworodków i dorosłych

Poznaj metodę izolacji limfocytów z OUN u myszy z EAE w celu badania autoimmunologicznych chorób układu nerwowego. Protokół umożliwia analizę cytometryczną komórek odpornościowych.

Analiza cytometryczna przepływowa nacieku limfocytów w ośrodkowym układzie nerwowym podczas eksperymentalnego autoimmunologicznego zapalenia mózgu i rdzenia kręgowego (Wideo) | JoVE Journal

Analiza cytometryczna przepływowa nacieku limfocytów w ośrodkowym układzie nerwowym podczas eksperymentalnego autoimmunologicznego zapalenia mózgu i rdzenia kręgowego

Przeglądaj więcej filmów