Analiza cytometryczna przepływowa nacieku limfocytów w ośrodkowym układzie nerwowym podczas eksperymentalnego autoimmunologicznego zapalenia mózgu i rdzenia kręgowego

Protokół, który tutaj prezentujemy, będzie dla nas pomocny w zrozumieniu, w jaki sposób limfocyty biorą udział w rozwoju choroby autoimmunologicznej ośrodkowego układu nerwowego. Dzięki tej metodzie limfocyty w mózgu mogą być badane na podstawie komórki po komórce. Protokół ten można również zastosować do innych modeli i chorób ośrodkowego układu nerwowego, które wymagały analizy cech i funkcji komórek odpornościowych.

W tym filmie protokół może łatwo zademonstrować, jak indukować, modelować i izolować pojedyncze komórki w mózgu. Po potwierdzeniu braku reakcji na odruch pedałowania, użyj jednomililitrowej strzykawki, aby wstrzyknąć podskórnie znieczulone myszy C57BL/6 ze 100 mikrogramami zemulgowanego MOG 35-55 w 100 mikrolitrach kompletnego adiuwantu Freunda w dwa różne miejsca pleców w pobliżu szyi. Tego samego dnia i drugiego dnia po szczepieniu należy wstrzyknąć myszom dootrzewnowo 200 mikrolitrów jednego nanograma na mikrolitr roztworu roboczego toksyny krztuścowej.

Po drugim wstrzyknięciu przenieś myszy z powrotem do ich domowej klatki z podkładką rozgrzewającą i monitoruj aż do pełnego leżenia. Następnego dnia i przez cały przebieg choroby należy zbadać i ocenić wszystkie myszy w sposób zaślepiony pod kątem objawów neurologicznych przedstawionych w tabeli oraz wszelkich zmian masy ciała. W odpowiednim punkcie końcowym doświadczenia ostrożnie przeciąć czaszkę od nosa do szyi i przenieść mózg każdego zwierzęcia z pudełka czaszkowego do indywidualnych 50-mililitrowych probówek zawierających 10 mililitrów pożywki RPMI.

Dobrze wymieszaj probówki, aby usunąć przylegające czerwone krwinki i usunąć pożywkę przez aspirację. Dodaj 10 mililitrów świeżej pożywki do każdej probówki i przenieś mózgi do pojedynczych 100-milimetrowych szalek. Na koniec posiekaj każdy mózg brzytwą i użyj plastikowej pipety, aby przenieść jak najwięcej tkanki z jednego naczynia na raz i sześć mililitrów pożywki do lodowatego homogenizatora ze szkła o średnicy siedmiu mililitrów.

Zmielić mózg za pomocą luźnego tłoka tłuczka, a następnie użyć ciasnego tłoka, aby doprowadzić tkankę do uzyskania jednorodnej konsystencji. Następnie wlej powstałą zawiesinę tkanki do wstępnie schłodzonej stożkowej rurki o pojemności 15 mililitrów na lodzie. Gdy wszystkie próbki zostaną zhomogenizowane, dostosuj objętość w każdej probówce do siedmiu mililitrów ze świeżą pożywką, przed dodaniem każdej zawiesiny tkankowej do nowej schłodzonej 15-mililitrowej probówki zawierającej trzy mililitry 100% macierzy membrany podstawnej na probówkę.

Wymieszaj kilka razy przez odwrócenie i użyj trzymililitrowej pipety, aby ostrożnie i powoli dodać jeden mililitr roztworu gradientu gęstości 70 procent pod każdą próbkę roztworu tkankowego. Oddziel komórki przez wirowanie w gradiacji gęstości i usuń prawie całą górną warstwę, uważając, aby całkowicie usunąć całą mielinę. Przenieś interfejs do nowej 15-mililitrowej rurki i dostosuj objętość do 10 mililitrów za pomocą świeżego podłoża.

Następnie ponownie odwirować próbki i usunąć supernatant przed ponownym zawieszeniem granulek w około 100 mikrolitrach pożywki na probówkę. Do analizy cytometrii przepływowej pobranych komórek mózgowych, przydziel około dwa razy 10 do sześciu komórek w 100 mikrolitrach pożywki do indywidualnych dołków 96-dołkowej płytki. Gdy wszystkie komórki zostaną posiaczone, dodaj 100 mikrolitrów koktajlu stymulacji komórek 500X oraz inhibitorów transportu białek do studzienek i umieść płytkę w inkubatorze hodowli komórkowej na cztery godziny.

Pod koniec inkubacji zebrać komórki na dnie studzienek przez odwirowanie i ponownie zawiesić granulki w 100 mikrolitrach buforu cytometrii przepływowej na studzienkę. Wstępnie inkubować komórki z trzema mikrolitrami bloku Anti-Mouse CD16 / CD32 Fc przez 10 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza przed barwieniem. Aby zablokować wszelkie niespecyficzne interakcje, w których pośredniczy Fc.

Pod koniec inkubacji dodaj do każdej studzienki interesujący Cię koktajl przeciwciał i umieść płytkę w temperaturze czterech stopni Celsjusza, chroniąc ją przed światłem. Po 30 minutach przemyć studzienki 100 mikrolitrami buforu cytometrii przepływowej na studzienkę i osadzać komórki przez odwirowanie. Po odrzuceniu supernatantów dodać 200 mikrolitrów wewnątrzkomórkowego buforu utrwalającego do każdej studzienki.

Po 30 do 60 minutowej inkubacji w temperaturze pokojowej zebrać próbki przez odwirowanie i ponownie zawiesić granulki w 200 mikrolitrach buforu o przepuszczalności 1X na studzienkę. Ponownie odwirować próbki, a po odrzuceniu supernatantu ponownie zawiesić granulki w 100 mikrolitrach ze świeżym buforem przepuszczalnym. Następnie dodaj odpowiednie przeciwciała do wykrywania wszelkich interesujących antygenów wewnątrzkomórkowych przez 30 minut inkubacji w temperaturze czterech stopni Celsjusza, chronionej przed światłem.

Pod koniec inkubacji dodać 100 mikrolitrów 1X buforu przepuszczalnego do każdej studzienki i odwirować próbki przez odwirowanie. Następnie ponownie zawieś komórki barwiące w 200 mikrolitrach buforu barwiącego cytometrię przepływową i przeanalizuj komórki za pomocą cytometrii przepływowej zgodnie ze standardowymi protokołami. Typowy przebieg kliniczny EAE powinien skutkować krzywą chorobową i zmianą masy ciała, jak pokazano na ilustracji.

Myszy C57BL/6 zaszczepione MOG 35-55 zwykle zaczynają rozwijać objawy choroby około 10 do 12 dnia i osiągają szczyt choroby około 15 do 21 dnia. Przed wystąpieniem choroby masa ciała uodpornionych myszy stopniowo wzrasta, zanim zmniejszy się w korelacji z nasilającymi się objawami choroby Myszy wykazują najniższą masę ciała w szczycie EAE, przy czym masa ciała nieznacznie wzrasta wraz ze spadkiem objawów klinicznych. Myszy zwykle nie wracają w pełni do zdrowia i zazwyczaj rozwijają monofazową patologię choroby przewlekłej.

Jak pokazuje ta reprezentatywna analiza przepływu, komórki Th1 wytwarzające interferon gamma i komórki Th17 wytwarzające IL17 są znacznie zwiększone u myszy EAE. Najważniejszym krokiem jest 3.10. Operator powinien przenieść środkową warstwę i światło, zachowując ostrożność, wziąć jak najmniej innych warstw.

Postępując zgodnie z tym protokołem, możemy dalej limfocyty T do dalszej analizy transkrypcji w celu zbadania