Multipleksowe wykrywanie ekspresji genów w nienaruszonym mózgu Drosophila przy użyciu iteracyjnej fluorescencji in situ wspomaganej ekspansją
May 2nd, 2025
Iteracyjna hybrydyzacja in situ wspomagana ekspansją (EASI-FISH) to solidna technika, która łączy mikroskopię ekspansywną z fluorescencyjną hybrydyzacją in situ (FISH) w celu wykrycia ekspresji wielu genów w grubej tkance. Protokół ten przedstawia ostatnie postępy w metodzie i jej adaptacji do znakowania nienaruszonego ośrodkowego układu nerwowego Drosophila.
Opracowaliśmy solidny protokół, w którym można przeprowadzić wiele rund hybrydyzacji in situ na tym samym mózgu drosophila, umożliwiając wizualizację wzorców ekspresji wielu różnych genów. Osadzenie mózgu muchy w hydrożelu zapewnia doskonałą integralność tkanek i stabilność mRNA w wielu rundach hybrydyzacji. Znacznie poprawia również przejrzystość optyczną podczas obrazowania.
EASI-FISH może zostać zaadoptowany przez każde laboratorium wyposażone w mikroskop konfokalny lub mikroskop z arkuszem świetlnym w celu zdefiniowania profili ekspresji genów typów komórek w mózgu muchy. Aby rozpocząć, przetrzyj nienaładowany szkiełko odczynnikiem do odkażania RNA. Usuń nieprzezroczystą folię chroniącą klej od silikonowej uszczelki.
Następnie przyklej uszczelkę zawierającą do czterech komór do suwaka. Za pomocą pipety P20 pokryj każdą powierzchnię komory jednym mikrolitrem polilizyny. Następnie przenieś do czterech mózgów drosophila na probówkę do 0,2 mililitra probówki PCR.
Nawodnij mózg w 150 mikrolitrach PBS zawierających 0,1% Triton X-100, a następnie PBS. Dodaj 40 mikrolitrów PBS do każdej komory. Za pomocą cienkiej pęsety delikatnie ustaw mózgi w rzędzie na środku komory, pozostawiając między nimi trochę miejsca.
Wyjmij PBS z komory i natychmiast dodaj 50 mikrolitrów 20-milimolowego buforu MOPS. Podczas gdy mózgi równoważą się w buforze MOPS, pipetuj równe objętości rozmrożonego Melphalan-X do probówki z buforem MOPS o równej objętości. Następnie dodać roztwór podstawowy Ac-X w stosunku jeden do 100.
Zwiruj roztwór i krótko go obróć, aby go zebrać. Usunąć cały bufor MOPS z komór i dodać 50 mikrolitrów roztworu Melphalan-X Ac-X. Umieść szkiełko nakrywkowe na górze każdej komory bez użycia kleju do uszczelek do uszczelniania.
Następnie umieść komorę w nawilżonym pudełku. Następnego dnia ostrożnie zdjąć szkiełko nakrywkowe i odessać roztwór Melphalan-X Ac-X. Umyj zamontowane mózgi dwukrotnie w 100 mikrolitrach 0,1% PBT, a następnie 100 mikrolitrów PBS.
Rozmrożone roztwory TREx-1000 4-Hydroxy-TEMPO, TEMED i nadsiarczanu amonu umieścić na lodzie. Spłukać roztwór TREx-1000, aby upewnić się, że nie ma osadu. Wymieszaj roztwory, aby przygotować roztwór żelu i zwiruj przed oblodzeniem.
Za pomocą końcówki do pipety wyjmij PBS z komory i usuń resztki płynu niestrzępiącą się ściereczką. Natychmiast dodaj 40 mikrolitrów roztworu żelu na mózgi w każdej komorze. Inkubuj komory w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez 10 minut.
Teraz wyjmij roztwór żelu z komory. Następnie odklej przezroczystą folię ochronną od kleju do powierzchni uszczelki. Dodaj ostatnie 45 mikrolitrów świeżego roztworu żelu.
Delikatnie umieść szkiełko nakrywkowe na komorze i dociśnij szkiełko nakrywkowe, aby uszczelnić komorę przed inkubacją w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez kolejne 10 minut. Inkubuj komorę w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 1,5 godziny, aby spolimeryzować żel. Po schłodzeniu żeli na ławce za pomocą żyletki ostrożnie usuń szkiełko nakrywkowe i silikonową uszczelkę.
Przytnij żel do prostokątnego kształtu i odetnij prawy górny róg, aby wskazać orientację próbki. Następnie za pomocą cienkiego pędzla zwilżonego niewielką ilością bufora Pro K ostrożnie zdejmij żele ze szkiełka. Przenieś każdy żel indywidualnie do dwumililitrowej probówki mikrowirówkowej.
Wymieszaj 500 mikrolitrów buforu Pro K i pięć mikrolitrów enzymu proteinazy K i dodaj mieszaninę do każdego żelu. Inkubować w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez noc. Następnego dnia usuń bufor za pomocą cienkiej, elastycznej pipety, a następnie umyj żele trzy razy w PBS przez 10 minut każdy.
Inkubować żele przez 30 minut w jednym mililitrze buforu DNASE1 w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Wymieszaj 50 mikrolitrów enzymu DNASE1 z 450 mikrolitrami buforu DNASE1. Delikatnie wymieszaj bez wirowania.
Inkubować każdy żel w 500 mikrolitrach roztworu DNASE1 przez dwie godziny w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Następnie umyj żele cztery razy przez 15 minut jednym mililitrem PBS w temperaturze pokojowej. Teraz inkubuj żele w 500 mikrolitrach rozmrożonego buforu hybrydyzacyjnego bez sond przez 30 minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza.
Rozcieńczyć sondy w buforze hybrydyzacyjnym w stosunku jeden do 100, przygotowując 300 mikrolitrów na żel. Inkubować żele z buforem hybrydyzacyjnym zawierającym sondy przez noc w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Następnego dnia umyj żele najpierw w buforze do płukania sondy, a następnie w PBS.
W przypadku reakcji łańcuchowej hybrydyzacji dodać 500 mikrolitrów buforu amplifikacyjnego do żelu i inkubować przez 30 minut w temperaturze pokojowej. Podgrzej fluorescencyjne spinki do włosów w temperaturze 95 stopni Celsjusza przez 90 sekund w maszynie do PCR i schładzaj roztwór do 25 stopni Celsjusza przez 30 minut. Dla każdej sondy rozcieńczyć pasujące pary spinek do włosów w stosunku od jednego do 50 w buforze wzmacniającym, przygotowując 300 mikrolitrów na żel.
Po zwirowaniu mieszaniny dodaj mieszaninę do żeli i inkubuj. Aby zamontować żel do obrazowania na lekkim arkuszu, pokryj powierzchnię mocowania żelu uchwytu żelowego dwukrotnie jednym mikrolitrem polilizyny, pozostawiając ją do wyschnięcia w temperaturze 37 stopni Celsjusza między warstwami. Następnie umieść żel na szkiełku nakrywkowym tak, aby nacięcie znajdowało się po lewej stronie.
Za pomocą pędzla jednym ruchem przenieś żel na obrabianą powierzchnię. Geny związane z neuroprzekaźnikami i geny neuropeptydowe wykazywały wyraźne wzorce ekspresji w mózgu dorosłej drosophila. VGluT i Gad1 wykryto jednocześnie w tej samej rundzie hybrydyzacji, wykazując nienakładające się wzorce ekspresji.
AstA wykazywała silną ekspresję w płacie wzrokowym i słabszą ekspresję w kompleksie centralnym. Crz wykazywał wysoką ekspresję w pars lateralis, podczas gdy niższe poziomy ekspresji obserwowano w neuronach płata wzrokowego. Tk wykryto w neuronach H delta D zidentyfikowanych z ekspresją Mer-GFP przy użyciu specyficznej podzielonej linii GAL4 za pomocą arkusza świetlnego lub mikroskopii konfokalnej.
FMRFamid był nieobecny w neuronach PFG oznaczonych Mer-GFP, ale wykryty w otaczających neuronach. Obrazowanie neuronów FB4K w wysokiej rozdzielczości potwierdziło przestrzenny rozkład transkryptów VGluT i ChAT/VAChT. Neuropeptydy, takie jak AstA i Crz, są tak wysoko eksprymowane w niektórych komórkach, że nie można już oddzielić pojedynczych plamek fluorescencyjnych reprezentujących pojedyncze transkrypty.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Przegląd
W tym artykule przedstawiona jest technika Expansion-Assisted Iterative Fluorescence In Situ Hybridization (EASI-FISH), nowatorska metoda integrująca mikroskopię ekspansyjną z hybrydyzacją in situ z wykorzystaniem fluorescencji w celu obserwacji ekspresji genów w grubych tkankach. Metoda jest dostosowana do centralnego układu nerwowego muchówki (Drosophila), umożliwiając naukowcom wizualizację wzorców ekspresji wielu genów w różnych typach komórek.
Kluczowe Elementy Badania
Dział Neurologii
- Neurobiologia
- Ekspresja genów
- Biologia komórkowa
Tło
- Mikroskopia ekspansyjna umożliwia poprawę przejrzystości optycznej i rozdzielczości podczas obrazowania grubych tkanek.
- Hybrydyzacja in situ z wykorzystaniem fluorescencji jest potężną metodą wykrywania ekspresji genów.
- Połączenie tych technik wzmacnia zdolność analizy złożonej architektury tkanki u organizmów modelowych.
- Muchówka (Drosophila) służy jako cenne narzędzie do zrozumienia rozwoju nerwowego i funkcji genów.
Cel Badania
- Szczegółowe opisanie solidnego protokołu, który ułatwia wielokrotne rundy hybrydyzacji in situ RNA.
- Umożliwienie kompleksowej wizualizacji ekspresji genów w mózgu Drosophila.
- Dostarczenie ramy, którą można łatwo zaadaptować przez różne laboratoria wyposażone w podstawowe narzędzia do mikroskopii.
Wykorzystane Metody
- Badanie wykorzystuje technikę osadzania w żelu hydrożelowym w celu zachowania integralności tkanki w mózgach Drosophila.
- Kluczowy model biologiczny obejmuje nienaruszony centralny układ nerwowy Drosophila, skupiając się na różnych ekspresjach genów neuronalnych.
- W artykule nie wspomina się o przepływach multiomicznych.
- Szczegółowe protokoły dotyczące przetwarzania tkanek, hybrydyzacji i obrazowania są zawarte.
- Wyniki są weryfikowane za pomocą porównawczych analiz przestrzennej ekspresji z wykorzystaniem mikroskopii konfokalnej lub mikroskopii arkuszowej.
Główne Wyniki
- Zaobserwowano wyraźne wzorce ekspresji genów związanych z neurotransmiterami i neuropeptydami w mózgach Drosophila.
- Przykładowe wyniki obejmują nieprzedstawiającą się ekspresję VGluT i Gad1, co sugeruje odmienne role w neurotransmisji.
- Neuropeptydy, takie jak AstA i Crz, wykazywały wysoki poziom ekspresji w określonych regionach nerwowych, korelujących z implikacjami funkcjonalnymi.
- Ta metoda umożliwia precyzyjne mapowanie ekspresji genów w warstwach komórkowych i przyczynia się do zrozumienia relacji struktura-funkcja neuronów.
Wnioski
- EASI-FISH stanowi znaczący postęp w wizualizacji ekspresji genów w złożonych tkankach.
- Badanie podkreśla komplementarne wykorzystanie różnych technik obrazowania w celu uzyskania wglądu w funkcję genów nerwowych.
- Implikacje obejmują wzmocnienie zrozumienia mechanizmów nerwowych, z potencjalnymi zastosowaniami w biologii rozwojowej i neurogenetyce.
