Name: Multipleksowe wykrywanie ekspresji genów w nienaruszonym mózgu Drosophila przy użyciu iteracyjnej fluorescencji in situ wspomaganej ekspansją (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-05-02T13:05:00.000+00:00
Duration: 9 min 5 s
Description: Poznaj metodę EASI-FISH do wielokrotnego wykrywania ekspresji genów w nienaruszonym mózgu Drosophila. Technika łączy mikroskopię ekspansji z hybrydyzacją in situ, umożliwiając precyzyjną analizę wzorców ekspresji w komórkach nerwowych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy Paulowi Tillbergowi za porady dotyczące dynamiki mikroskopii ekspansyjnej, Christinie Christoforou za pomoc w sekcjach mózgu i Geoffreyowi Meissnerowi za krytyczne opinie. Ponadto dziękujemy Tanyi Wolff i Gerry'emu Rubinowi, a także Geoffreyowi Meissnerowi i Wyattowi Korffowi za umożliwienie nam uwzględnienia wyników, które zostały wygenerowane w ramach dwóch większych badań. Wszystkie prace zostały wykonane w Kampusie Badawczym Janelia i wspierane przez Instytut Medyczny Howarda Hughesa poprzez fundusze dla Zespołów Projektowych MultiFISH i Fly-eFISH, Gerry'ego Rubina oraz Zasobów Technicznych Projektu.

Ten protokół został przeprowadzony na dorosłych (5-6 dniowych) samicach Drosophila melanogaster, ale każda płeć lub gatunek Drosophila ma zastosowanie. Receptury kotwy żelowej znajdują się w tabeli uzupełniającej 1; dla receptury żelu, tabela uzupełniająca 2; oraz dla innych odczynników EASI-FISH, tabela uzupełniająca 3. Przewodnik po codziennych materiałach i odczynnikach znajduje się w Tabeli Uzupełniającej 4. Uchwyt żelu do mikroskopu z lekkim arkuszem znajduje się w pliku uzupełniającym 1. <silna klasa="xfig">Rysunek 1A-C przedstawia schematyczne przedstawienie osadzania mózgów w żelach przed ekspansją i hybrydyzacją sondy (kroki od 2.1 do 3.8). Rysunek 1D to fotografia osadzonych mózgów, Rysunek 1E pokazuje uchwyt żelowy do mikroskopii z użyciem lekkiego arkusza, a Rysunek 1F przedstawia oś czasu typowego eksperymentu. Szczegóły handlowe dotyczące odczynników i używanego sprzętu są wymienione w Tabeli Materiałów.
1. Sekcja i fiksacja mózgu muchy
<ol>
	<li>Wypreparuj mózgi much lub OUN w zimnym podłożu S2 (aby uzyskać więcej szczegółów na temat sekcji, zobacz odniesienie21)</li>
	<li>Aby naprawić mózgi, dodaj do 20 mózgów lub 10 OUN do 2 ml zimnego 4% PFA/PBS i inkubuj przez noc na nutatorze w temperaturze 4°C. 
	UWAGA: PFA jest szkodliwy w przypadku połknięcia lub wdychania, działa drażniąco na skórę i oczy oraz może być rakotwórczy.</li>
	<li>Przepłukać próbkę (1x) 2 ml zimnego PBT (0,5%, patrz Tabela Uzupełniająca 4), a następnie przepłukać próbkę 2 ml zimnego PBT (4x) przez 15 minut na nutatorze w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Przepłukać próbkę (1x) 2 ml zimnego 70% EtOH. Przechowuj mózgi w 2 ml 70% EtOH w temperaturze 4 °C przez okres do 6 miesięcy.</li>
</ol>
2. Montowanie mózgów i dodawanie łączników RNA i białek (Dzień 1)
UWAGA: Noś rękawice przez cały czas i konsekwentnie wycieraj sprzęt i miejsce pracy za pomocą RNase Away. Rękawice są wymagane (1) w celu utrzymania RNaz z dala od próbek i (2) jako ochrona przed kilkoma odczynnikami, które stanowią zagrożenie dla zdrowia.
<ol>
	<li>Przygotuj komory żelowe, przecierając nienaładowany szkiełko odczynnikiem do odkażania RNazy. Usuń nieprzezroczystą folię chroniącą klej z uszczelki silikonowej, przyklej uszczelkę (z maksymalnie 4 komorami) do szkiełka i pokryj każdą powierzchnię komory 1 μl polilizyny za pomocą końcówki do pipety P20. Wysuszyć na powietrzu i powtórzyć proces. 
	UWAGA: Krok 2.1 można wykonać dzień wcześniej.</li>
	<li>Przenieś mózgi do probówki PCR o pojemności 0,2 ml (do 4 mózgów na probówkę) i nawadniaj przez (2x) 5 minut w 150 μl PBT (0,1%) i (2x) przez 5 minut w PBS.</li>
	<li>Aby zamontować mózgi, dodaj 40 μl PBS na komorę, a następnie delikatnie przyklej mózgi w rzędzie na środku komory za pomocą cienkiej pęsety, pozostawiając trochę miejsca między mózgami (patrz <silna klasa="xfig">Rysunek 1D). Możliwy jest montaż do 6 mózgów lub 2 CNS na komorę.</li>
	<li>Usuń PBS i natychmiast dodaj 50 μl bufora MOPS o pojemności 20 mM. Inkubować przez 30 minut w temperaturze pokojowej (RT).</li>
	<li>Podczas gdy mózgi równoważą się w buforze MOPS, rozmrozić roztwory podstawowe Melphalan-X i Ac-X i przygotować 75 μl roztworu Melphalan-X/Ac-X na komorę (rozcieńczyć Melphalan-X w stosunku 1:1 buforem MOPS i dodać Ac-X w stosunku 1:100). Wiruj i krępuj krótko, aby zebrać roztwór; Czas przygotowania tak, aby roztwór był gotowy pod koniec 30-minutowego czasu inkubacji, nie wcześniej. 
	UWAGA: Melphalan-X jest szkodliwy po połknięciu lub wdychaniu działa drażniąco na skórę i oczy oraz może być rakotwórczy.</li>
	<li>Usunąć cały bufor MOPS i dodać 50 μl roztworu Melphalan-X/Ac-X.</li>
	<li>Przykryj komorę, umieszczając szkiełko nakrywkowe na górze, ale nie używaj kleju do uszczelek do uszczelniania. Umieść komorę w nawilżonym pudełku i inkubuj chroniony przed światłem przez noc w temperaturze pokojowej.</li>
</ol>
3. Żelowanie i trawienie proteinazy K (Dzień 2)
<ol>
	<li>Ostrożnie zdjąć szkiełko nakrywkowe i Melphalan-X/Ac-X i umyć założone mózgi (2x) przez 2 minuty 100 μl PBT (0,1%) i (1x) przez 2 minuty 100 μl PBS.</li>
	<li>Rozmrozić roztwór TREx-1000, 4HT, TEMED i APS i przechowywać na lodzie. 
	UWAGA: TREx-1000 może wytrącać się w temperaturze -20 °C; dobrze wirować, aby całkowicie się rozpuścić po rozmrożeniu. 
	UWAGA: Odczynniki te są szkodliwe lub toksyczne po połknięciu lub wdychaniu, a także działają drażniąco na skórę i oczy.</li>
	<li>Przygotować roztwór żelu, mieszając TREx-1000 z 4HT, TEMED i APS w stosunku 94:2:2:2. Wiruj i trzymaj na lodzie. Dla każdej komory przygotuj 150 μl roztworu żelu.</li>
	<li>Wyjmij PBS z komory za pomocą końcówki pipety i ostrożnie usuń pozostały PBS za pomocą niestrzępiącej się ściereczki. Do każdej komory natychmiast dodaj 40 μl roztworu żelu na wierzch mózgu. Inkubować w temperaturze 4 °C przez 10 minut.</li>
	<li>Usunąć roztwór żelu i dodać 40 μl świeżego roztworu żelu, inkubując w temperaturze 4 °C przez kolejne 10 minut. 
	UWAGA: Zebrać roztwór odpadowy żelu w probówce mikrowirówki i spolimeryzować przed wyrzuceniem.</li>
	<li>Usuń roztwór żelu i zdejmij przezroczystą folię ochronną z kleju powierzchniowego uszczelki. Dodaj ostatnie 45 μl świeżego roztworu żelu, delikatnie umieść szkiełko nakrywkowe na komorze i unikaj uwięzienia pęcherzyków powietrza. Ścisnąć szkiełko nakrywkowe, aby uszczelnić komorę i inkubować w temperaturze 4 °C przez 10 minut (w sumie 30 minut równowagi w temperaturze 4 °C).</li>
	<li>Polimeryzować żel w temperaturze 37 °C przez 1,5 godziny.</li>
	<li>Gdy żele stężeją, pozwól im ostygnąć na ławce przez kilka minut. Ostrożnie zdejmij szkiełko nakrywkowe i usuń silikonową uszczelkę za pomocą nowej żyletki. Następnie przytnij żel do prostokąta i wytnij prawy górny róg, aby śledzić orientację próbki.</li>
	<li>Usunąć żele ze szkiełka za pomocą cienkiego pędzla zwilżonego niewielką ilością buforu ProK i przenieść je pojedynczo do probówek mikrowirówek o pojemności 2 ml.</li>
	<li>Inkubować każdy żel z 500 μl buforu ProK i 5 μl enzymu ProK (1:100) w temperaturze 37 °C przez noc.</li>
</ol>
4. Trawienie DNA i hybrydyzacja sondy (Dzień 3)
<ol>
	<li>Myj żele (3x) przez 10 minut 1 ml PBS w RT. 
	UWAGA: Używaj pipet transferowych z cienką końcówką, aby uniknąć uszkodzenia żelu podczas wymiany roztworów.</li>
	<li>Inkubować żele przez 30 minut w 1 ml buforu DNazy1 w temperaturze 37 °C.</li>
	<li>Dodać 50 μl enzymu DNazy1 do 450 μl buforu DNazy. Delikatnie wymieszaj, ale nie wiruj. Inkubować każdy żel w 500 μl DNazy1 przez 2 godziny 37 °C. Myć (4x) 15 min 1 ml PBS w temperaturze RT. 
	UWAGA: Żele mogą być przechowywane w 5x SSC w temperaturze 4 °C przed lub po trawieniu/płukaniu DNazy przez kilka tygodni.</li>
	<li>Rozmrażanie hybrydyzacji (hyb) i bufor do płukania sondy. Inkubować żele w 500 μl buforu hyb bez sond przez 30 minut w temperaturze 37 °C. 
	UWAGA: Bufor do płukania hybu i sondy zawiera formamid, który podejrzewa się o powodowanie raka.</li>
	<li>Rozcieńczyć sondy w stosunku 1:100 w buforze hyb (10 nM), przygotowując 300 μl na żel. Inkubować żele z buforem hyb i sondami przez noc w temperaturze 37 °C. Utrzymywać bufor do płukania sondy i PBS w temperaturze 37 °C.</li>
</ol>
5. Mycie sondy (Dzień 4)
<ol>
	<li>Myć żele (3x) przez 30 minut w 750 μl buforu do przemywania sondy w temperaturze 37 °C.</li>
	<li>Myć żele (3x) przez 30 min, a następnie (3x) przez 1 godzinę 1 ml PBS w temperaturze 37 °C.</li>
	<li>Umyj żele w 2 ml PBS w temperaturze pokojowej przez noc lub w temperaturze 4°C przez weekend.</li>
</ol>
6. Hybrydyzacja Reakcja Łańcuchowa (HCR) z fluorescencyjnymi spinkami do włosów (Dzień 5)
UWAGA: Aby zapoznać się z zasadą HCR, zobacz reference22.
<ol>
	<li>Inkubować żele w 500 μl buforu do amplifikacji (amp) przez 30 minut w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Podgrzej fluorescencyjne spinki do włosów w temperaturze 95°C przez 90 sekund w maszynie do PCR i szybko schładzaj do 25°C przez 30 minut.</li>
	<li>Dla każdej sondy rozcieńczyć pasujące pary spinek do włosów (h1 i h2) w stosunku 1:50 w buforze amperowym, przygotowując 300 μl na żel i wir.</li>
	<li>Inkubować żele z mieszanką spinek do włosów przez 3 godziny w temperaturze pokojowej w ciemności.</li>
	<li>Myć żele (2x) przez 15 minut 750 μL 5x SSCT i (2x) przez 30 minut 1 ml 0,5x SSCT w RT.</li>
	<li>Jeśli mózg wykazuje ekspresję GFP, wybarwić 500 μl przeciwciała anty-GFP-AF488 (1:500) w PBT (0,1%) zawierającego 5 mg/ml ultraczystego BSA i inkubować przez noc (lub w weekend) w temperaturze 4 °C.</li>
</ol>
7. Montaż żeli i obrazowanie (Dzień 6)
<ol>
	<li>Po inkubacji przeciwciał raz przepłukać żele i myć (1x) przez 30 minut 1 ml PBT (0,1%), a następnie (3x) przez 30 minut 1 ml PBS. 
	UWAGA: Mycie w PBS spowoduje 2-krotne rozszerzenie; dla 3-krotnej ekspansji, umyć 0,05x SSC.</li>
	<li>Podczas prania należy dwukrotnie pokryć powierzchnię mocowania żelu uchwytu żelowego mikroskopu z użyciem cienkiego arkusza 1 μl polilizyny, pozostawiając do wyschnięcia w temperaturze 37 °C między warstwami. Podobnie, w przypadku obrazowania konfokalnego, pokryj obszar mocowania żelu naczynia ze szklanym dnem wielokrotnymi aplikacjami polilizyny.</li>
	<li>Żele należy barwić przez 30 minut w temperaturze pokojowej w 1 ml 5 μg/mL DAPI/PBS lub DAPI/0,05x SSC lub alternatywnie barwić przez noc w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Aby zamontować żel na uchwycie żelu (mikroskop z lekkim arkuszem) lub szklanym naczyniu dolnym (mikroskop konfokalny), umieść żel na szkiełku nakrywkowym i ostrożnie osusz krawędzie niestrzępiącą się chusteczką. Upewnij się, że żel jest zorientowany tak, aby tkanka znajdowała się najbliżej celu. Za pomocą pędzla delikatnie nałóż żel na powierzchnię polilizyny jednym ruchem. Do obrazowania wykąp żel w PBS (lub 0,05x SSC, jeśli rozszerza się do 3x). 
	UWAGA: Po zobrazowaniu żele można delikatnie usunąć z powierzchni polilizyny za pomocą mokrego pędzla i przenieść do probówki mikrowirówkowej o pojemności 2 ml.</li>
	<li>W celu natychmiastowego ponownego sondowania przejdź do dnia 7. W przypadku dłuższego przechowywania (od 1 tygodnia do 6 miesięcy) należy przechowywać żele w 1 ml 5x SSC w temperaturze 4 °C. Gotowe do użycia myj żele (3x) przez 10 minut 1 ml PBS przed kontynuacją. 
	UWAGA: Zakres rozbudowy jest ogólnie spójny w opisanych (~2x w PBS i ~3x w 0,05x SSC). Aby sprawdzić współczynnik ekspansji, zmierz rozmiar mózgu przed i po ekspansji na obrazach wykonanych pod fluorescencyjnym mikroskopem stereoskopowym. Aby uwidocznić mózg po ekspansji, krótko zabarwić go DAPI. Przybliżony współczynnik ekspansji to rozmiar po ekspansji podzielony przez rozmiar przed rozszerzeniem.</li>
</ol>
8. Sondy do zdejmowania izolacji i spinki do włosów do multipleksowania (Dzień 7)
<ol>
	<li>Inkubować żele przez 30 minut w 1 ml buforu DNazy1 w temperaturze 37°C.</li>
	<li>Dodać 50 μl DNazy1 do 450 μl buforu DNazy. Delikatnie wymieszaj, ale nie wiruj. Inkubować żele w 500 μl DNazy1 przez 2 godziny w temperaturze 37 °C.</li>
	<li>Myć (4x) przez 15 minut 1 ml PBS w RT. Żele są teraz gotowe do następnej rundy hybrydyzacji (dzień 3, krok 6).</li>
</ol>

<ol><li>Langer-Safer, P. R., Levine, M., Ward, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunological+method+for+mapping+genes+on+phila+polytene+chromosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Immunological method for mapping genes on phila polytene chromosomes.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 79 (14), 4381-4385 (1982).</li>
<li>Gall, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+origin+of+in+situ+hybridization+-+A+personal+history%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">The origin of in situ hybridization - A personal history.</a> Methods. 98, 4-9 (2016).</li>
<li>Kwon, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-molecule+fluorescence+in+situ+hybridization%3A+Quantitative+imaging+of+single+RNA+molecules%5BTitle%5D)+AND+%22BMB+Rep%22%5BJournal%5D)">Single-molecule fluorescence in situ hybridization: Quantitative imaging of single RNA molecules.</a> BMB Rep. 46 (2), 65-72 (2013).</li>
<li>Long, X., Colonell, J., Wong, A. M., Singer, R. H., Lionnet, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+mRNA+imaging+throughout+the+entire+Drosophila+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Quantitative mRNA imaging throughout the entire Drosophila brain.</a> Nat Methods. 14 (7), 703-706 (2017).</li>
<li>Yang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-molecule+fluorescence+in+situ+hybridization+for+quantitating+post-transcriptional+regulation+in+Drosophila+brains%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Single-molecule fluorescence in situ hybridization for quantitating post-transcriptional regulation in Drosophila brains.</a> Methods. 126, 166-176 (2017).</li>
<li>Meissner, G. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mapping+neurotransmitter+identity+in+the+whole-mount+Drosophila+brain+using+multiplex+high-throughput+fluorescence+in+situ+hybridization%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Mapping neurotransmitter identity in the whole-mount Drosophila brain using multiplex high-throughput fluorescence in situ hybridization.</a> Genetics. 211 (2), 473-482 (2019).</li>
<li>Duckhorn, C. J., Junker, I. P., Ding, Y., Shirangi, T. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combined+in+situ+hybridization+chain+reaction+and+immunostaining+to+visualize+gene+expression+in+whole-mount+Drosophila+central+nervous+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Behavioral+Neurogenetics%22%5BJournal%5D)">Combined in situ hybridization chain reaction and immunostaining to visualize gene expression in whole-mount Drosophila central nervous systems.</a> Behavioral Neurogenetics. 181, 1-14 (2022).</li>
<li>Eng, C. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptome-scale+super-resolved+imaging+in+tissues+by+RNA+seqFISH%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Transcriptome-scale super-resolved imaging in tissues by RNA seqFISH.</a> Nature. 568 (7751), 235-239 (2019).</li>
<li>Zhang, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatially+resolved+cell+atlas+of+the+mouse+primary+motor+cortex+by+MERFISH%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Spatially resolved cell atlas of the mouse primary motor cortex by MERFISH.</a> Nature. 598 (7879), 137-143 (2021).</li>
<li>Janssens, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatial+transcriptomics+in+adult+Drosophila+reveals+new+cell+types+in+the+brain+and+identifies+subcellular+mRNA+patterns+in+muscles%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Spatial transcriptomics in adult Drosophila reveals new cell types in the brain and identifies subcellular mRNA patterns in muscles.</a> eLife. 13, RP92618(2024).</li>
<li>Gandin, V., et al. Deep-tissue spatial omics: Imaging whole-embryo transcriptomics and subcellular structures at high spatial resolution. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aGandin%2C+V+%22bioRxiv%22">bioRxiv</a>. , (2024).</li>
<li>Fang, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+single-cell+transcriptome+imaging+of+thick+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional single-cell transcriptome imaging of thick tissues.</a> eLife. 12, RP90029(2023).</li>
<li>Moses, L., Pachter, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Museum+of+spatial+transcriptomics%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Museum of spatial transcriptomics.</a> Nat Methods. 19 (5), 534-546 (2022).</li>
<li>Chen, F., Tillberg, P. W., Boyden, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+imaging%3A+Expansion+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Optical imaging: Expansion microscopy.</a> Science. 347 (6221), 543-548 (2015).</li>
<li>Chen, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanoscale+imaging+of+RNA+with+expansion+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Nanoscale imaging of RNA with expansion microscopy.</a> Nat Methods. 13 (8), 679-684 (2016).</li>
<li>Schwarzkopf, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hybridization+chain+reaction+enables+a+unified+approach+to+multiplexed%2C+quantitative%2C+high-resolution+immunohistochemistry+and+in+situ+hybridization%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Hybridization chain reaction enables a unified approach to multiplexed, quantitative, high-resolution immunohistochemistry and in situ hybridization.</a> Development. 148 (22), 199847(2021).</li>
<li>Wang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((EASI-FISH+for+thick+tissue+defines+lateral+hypothalamus+spatio-molecular+organization%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">EASI-FISH for thick tissue defines lateral hypothalamus spatio-molecular organization.</a> Cell. 184, 6361-6377 (2021).</li>
<li>Eddison, M., Ihrke, G. Expansion-assisted iterative fluorescence in situ hybridization (EASI-FISH) in Drosophila CNS. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aEddison%2C+M+%22protocols.io%22">protocols.io</a>. , (2022).</li>
<li>Meissner, G., et al. A split-GAL4 driver line resource for Drosophila CNS cell types. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aMeissner%2C+G+%22bioRxiv%22">bioRxiv</a>. , (2024).</li>
<li>Nern, A., et al. Connectome-driven neural inventory of a complete visual system. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aNern%2C+A+%22bioRxiv%22">bioRxiv</a>. , (2024).</li>
<li>FlyLight Protocol. , HHMI Janelia Research Campus. Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.janelia.org/project-team/flylight/protocols">https://www.janelia.org/project-team/flylight/protocols</a> (2025).</li>
<li>HCR Amplification Technology. , HCR. Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.molecularinstruments.com/technology">https://www.molecularinstruments.com/technology</a> (2025).</li>
<li>Wolff, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-type-specific+driver+lines+targeting+the+Drosophila+central+complex+and+their+use+to+investigate+neuropeptide+expression+and+sleep+regulation%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Cell-type-specific driver lines targeting the Drosophila central complex and their use to investigate neuropeptide expression and sleep regulation.</a> eLife. 14, RP104764(2025).</li>
<li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fiji%3A+An+open-source+platform+for+biological-image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Fiji: An open-source platform for biological-image analysis.</a> Nat Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li>
<li>Watanabe, K., Chiu, H., Anderson, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole-brain+in+situ+mapping+of+neuronal+activation+in+Drosophila+during+social+behaviors+and+optogenetic+stimulation%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Whole-brain in situ mapping of neuronal activation in Drosophila during social behaviors and optogenetic stimulation.</a> eLife. 12, RP92380(2024).</li>
<li>Damstra, H. G. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualizing+cellular+and+tissue+ultrastructure+using+Ten-fold+Robust+Expansion+Microscopy+%28TREx%29%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Visualizing cellular and tissue ultrastructure using Ten-fold Robust Expansion Microscopy (TREx).</a> eLife. 11, e73775(2022).</li>
<li>Xu, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Behavioral+state+coding+by+molecularly+defined+paraventricular+hypothalamic+cell+type+ensembles%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Behavioral state coding by molecularly defined paraventricular hypothalamic cell type ensembles.</a> Science. 370 (6514), abb2494(2020).</li>
<li>Wang, Y., et al. EASI-FISH for thick tissue defines lateral hypothalamus spatio-molecular organization. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWang%2C+Y+%22GitHub%22">GitHub</a>. , (2021).</li>
<li>Park, G., et al. Using Amira to generate cell body masks in fluorescent light sheet microscopy images of EASI-FISH samples. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aPark%2C+G+%22protocols.io%22">protocols.io</a>. , (2023).</li>
<li>Bahry, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RS-FISH%3A+Precise%2C+interactive%2C+fast%2C+and+scalable+FISH+spot+detection%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">RS-FISH: Precise, interactive, fast, and scalable FISH spot detection.</a> Nat Methods. 19 (12), 1563-1567 (2022).</li>
<li>Managan, C., Ihrke, G. EASI-FISH spot counting in Drosophila brain using RS-FISH. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aManagan%2C+C+%22protocols.io%22">protocols.io</a>. , (2024).</li>
</ol>

Nie stwierdzono konfliktu interesów.

Opisany protokół EASI-FISH dla nienaruszonego układu nerwowego Drosophila umożliwia wykrycie dziesiątek transkryptów w tym samym mózgu lub OUN. Jest solidny, prosty i czuły i można go połączyć z wykrywaniem GFP w celu identyfikacji podzbiorów neuronów lub gleju. Ponieważ metoda ta jest łatwa do wdrożenia, powinna ułatwić badania prowadzone przez laboratoria Drosophila zainteresowane mapowaniem i ilościowym określaniem ekspresji genów w nienaruszonym mózgu muchy.
EASI-FISH ma ...

FISH został po raz pierwszy użyty u Drosophila ponad 40 lat temu do mapowania genów na chromosomach politenowych1,2. Obecnie jednocząsteczkowe FISH jest złotym standardem w przestrzennej lokalizacji i ilościowym określaniu transkryptów mRNA w nienaruszonej tkance3. Jednak ze względu na problemy z integralnością próbki i utratą RNA, techniki FISH z pojedynczą cząsteczką w całym montażu u Drosophila zostały ograniczone tylko do kilku genów, które można analizować w tej samej próbce4,5,6,7. Podczas gdy niedawny rozwój kodów kreskowych (np. 8,9,10) zwiększa liczbę transkryptów, które można wykryć do kilkuset nawet w grubej tkance11,12, ustanowienie takich protokołów wymaga znacznych inwestycji zasobów, co może stanowić przeszkodę w wdrożeniu. Rzeczywiście, wiele nowatorskich technik transkryptomicznej przestrzeni nigdy nie rozprzestrzeniło się poza swoje instytucje pochodzenia13. W związku z tym prosta i stosunkowo niedroga metoda wykrywania ekspresji dziesiątek genów w tym samym nienaruszonym mózgu ułatwiłaby osiągnięcie różnych celów badawczych: walidacji danych sekwencyjnych RNA i atlasu komórkowego, mapowania typów komórek molekularnych w OUN, ilościowego określania różnic w ekspresji genów specyficznych dla rozwoju, płci lub gatunku lub pomiaru zmian w ekspresji genów wywołanych przez dużą różnorodność zaburzeń genetycznych lub środowiskowych dostępnych u Drosophila. 
Mikroskopia ekspansywacyjna to technika, która pozwala badaczom obserwować tkanki w wyższej rozdzielczości poprzez rozszerzanie ich w pęczniejącym hydrożelu14. EASI-FISH łączy w sobie mikroskopię ekspansywną i RNA FISH15, który wykorzystuje reakcję łańcuchową hybrydyzacji (HCR), nieenzymatyczną technikę wykrywania wiązania sondy oligogologicznej16. EASI-FISH został po raz pierwszy opracowany jako alternatywne podejście do cienkich tkanek FISH do mapowania wzorców ekspresji dziesiątek genów w grubych (300 μm) warstwach tkanek bocznego podwzgórza myszy 17. Metoda ta jest idealna do zastosowania na mózgach dorosłych much, biorąc pod uwagę, że tkanka ta ma grubość mniejszą niż 300 μm, a prototypowy protokół EASI-FISH dla much został niedawno opisany 18. W tym przypadku wypreparowane i utrwalone mózgi Drosophila są osadzone w pęczniejącym hydrożelu, w którym mRNA i białka są kowalencyjnie zakotwiczone w polimerze żelowym za pomocą odpowiednio środków alkilujących Melphalan-X i Acryloyl-X (Ac-X). Po trawieniu białek, które pozwala na izotropową ekspansję mózgu, specyficzne dla genu sondy oligonukleologiczne DNA są hybrydyzowane z mRNA w tkance w celu zlokalizowania interesujących transkryptów. Fluorescencyjnie znakowane spinki do włosów DNA są następnie dodawane w drugim etapie hybrydyzacji. Wiele cząsteczek spinki do włosów polimeryzuje w reakcji HCR, tworząc metastabilne polimery DNA. Prowadzi to do wzmocnienia sygnału dla poszczególnych transkryptów, które można wykryć jako jasne punkty za pomocą arkusza świetlnego lub mikroskopii konfokalnej.
Kowalencyjne zakotwiczenie mRNA i białka w matrycy żelowej oraz proteolityczne trawienie białek po utworzeniu żelu tworzy środowisko, w którym transkrypty mRNA są względnie stabilne i potencjalnie bardziej dostępne do wiązania sondy. Stabilność mRNA i żelu pozwala na wiele rund ponownego sondowania i obrazowania, z usuwaniem sond DNA i produktu HCR przez inkubację z enzymem DNase1 między rundami15,17. Co więcej, rozszerzanie próbki zmniejsza autofluorescencję i rozpraszanie światła poprzez molekularne usuwanie stłoczeń i skutecznie zwiększa rozdzielczość obrazu14. W związku z tym poszczególne transkrypty mRNA mogą być łatwiej rozdzielone.
GFP podtrzymuje procedurę na tyle, aby pozostać wykrywalnym przez fluorescencję lub wiązanie przeciwciał po ekspansji. W związku z tym ten reporter może być używany do oznaczania i segmentowania typów komórek będących przedmiotem zainteresowania. W połączeniu z wieloma specyficznymi dla neuronów liniami sterownika split-GAL4 (np. 19,20), otwiera to możliwość uzyskania dalszego wglądu w tożsamość molekularną typu neuronu lub identyfikacji podtypów molekularnych, których nie można łatwo odróżnić na podstawie ich anatomii.
Opisana tutaj jest zaktualizowana wersja prototypu protokołu EASI-FISH dla much18, która charakteryzuje się doskonałym zatrzymywaniem mRNA, usuwaniem problemów technicznych i większą wytrzymałością żelu. Modyfikacje obejmują zwiększenie stężenia PFA, obniżenie temperatury wiązania i ułatwienie przygotowania próbki poprzez zamontowanie mózgów przed inkubacją z Melphalan-X i Ac-X. Protokół ten zawiera również nową recepturę żelu w celu zwiększenia jego wytrzymałości, co skutecznie zmniejsza uszkodzenia żelu podczas wykonywania wielu rund FISH i obrazowania. Modyfikacje te sprawiają, że protokół jest prostszy do wykonania, skracając zarówno czas przetwarzania, jak i zużycie odczynników, a także zwiększając pewność spójnych wyników. Co ważne, możliwości multipleksowania są zwiększone w taki sposób, że dziesiątki genów mogą być badane w tym samym mózgu przez okres kilku miesięcy. Ilustrują to wzorce ekspresji kilku genów neuronalnych w mózgu dorosłego Drosophila na różnych poziomach ekspresji.

<table><tbody><tr><td>Probówki do PCR 0,2 ml&nbsp;</td><td>Amerykański Naukowiec&nbsp;</td><td>1402-4700</td><td></td></tr><tr><td>Probówki wirówkowe z nakrętką 0,5 ml, Amber</td><td>USA Scientific&nbsp;</td><td>1405-9707</td><td></td></tr><tr><td>0,5 M EDTA, pH 8, bez RNaz</td><td>Invitrogen</td><td>AM9260G</td><td></td></tr><tr><td>10M NaOH</td><td>Sigma</td><td>72068</td><td></td></tr><tr><td>10x PBS&nbsp;</td><td>Fisher</td><td>BP 3994</td><td></td></tr><tr><td>20x SSC</td><td>ThermoFisher</td><td>AM 9763</td><td></td></tr><tr><td>40% Akrylamid&nbsp;</td><td>Bio-Rad</td><td>1610140</td><td></td></tr><tr><td>4-Hydroxy-TEMPO (4HT)</td><td>Sigma</td><td>176141</td><td></td></tr><tr><td>5 M NaCl bez RNaz&nbsp;</td><td>Pipeta transferowa Thermofisher</td><td></td> AM97060G <td></td></tr><tr><td>5 ml - cienka końcówka</td><td>Global Scientific&nbsp;</td><td>134070-S20</td><td></td></tr><tr><td>6-dołkowa szklana płyta dolna&nbsp;</td><td>Cellvis</td><td>P06-1.5H-N</td><td></td></tr><tr><td>Acetonitryl, bezwodny&nbsp;</td><td>ThermoFisher</td><td>042311-K7</td><td></td></tr><tr><td>Kwas</td><td>akrylowy TCI</td><td>A0141</td><td></td></tr><tr><td>Akryl-X&nbsp;</td><td>ThermoFisher</td><td>A20770</td><td></td></tr><tr><td>Nadsiarczan amonu (APS)</td><td>Sigma</td><td>A3678</td><td></td></tr><tr><td>Bufor wzmacniający&nbsp;</td><td>Instrumenty molekularne</td><td>https://store.molecularinstruments.com/new-bundle/rna-fish</td><td></td></tr><tr><td>bezwodny DMSO</td><td>Invitrogen</td><td>D12345</td><td></td></tr><tr><td>AstA_B2</td><td>Instrumenty molekularne</td><td>PRR477</td><td></td></tr><tr><td>ChAT_B1</td><td>Instrumenty molekularne</td><td>PRG115</td><td></td></tr><tr><td>Crz_B5</td><td>Instrumenty molekularne</td><td>PRR480</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Sigma</td><td>D9542</td><td></td></tr><tr><td>FIJI</td><td>Instrumenty</td><td></td> molekularne https://imagej.net/software/fiji/ <td></td></tr><tr><td>FMRFa_B2</td><td></td> open source <td>PRR487</td><td></td></tr><tr><td>GAD1_B5</td><td>Instrumenty molekularne</td><td>RTE581</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało poliklonalne GFP, Alexa Fluor 488</td><td>ThermoFisher</td><td>A-21311</td><td></td></tr><tr><td>Bufor do hybrydyzacji</td><td>Instrumenty</td> <td>molekularne</td><td></td>https://store.molecularinstruments.com/new-bundle/rna-fish</tr><tr><td>Imaris Stitcher</td><td>Oxford Instruments</td><td>https://imaris.oxinst.com/products/imaris-stitcher</td><td></td></tr><tr><td>Imaris viewer</td><td>Oxford Instruments</td><td>https://imaris.oxinst.com/imaris-viewer</td><td></td></tr><tr><td>JF-669, SE&nbsp;</td><td>Tocris</td><td>6420</td><td></td></tr><tr><td>Melphalan</td><td>Caymen Chemicals</td><td>16665</td><td></td></tr><tr><td>Bufor MOP</td><td>Fisher</td><td>BP308-100</td><td></td></tr><tr><td>N,N Metyleno-bis-akrylamid&nbsp;</td><td>Bio-Rad</td><td>1610142</td><td></td></tr><tr><td>N,N,N',N'-tetrametyloetylenodiamina (TEMED)</td><td>Sigma</td><td>T22500</td><td></td></tr><tr><td>Woda wolna od nukleaz&nbsp;</td><td>Sondy oligo Ambion</td><td>AM9932</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td>Instrumenty molekularne</td><td>https://store.molecularinstruments.com/new-bundle/rna-fish</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyd (PFA)</td><td>EMS</td><td>15710</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Fisher&nbsp;</td><td></td><td></td>BP24384</tr><tr><td>Fotoflo-200&nbsp;</td><td>EMS</td><td>74257</td><td></td></tr><tr><td>Bromowodorek poli-L-lizyny (polilizyna)</td><td>Sigma</td><td>P1524</td><td></td></tr><tr><td>Bufor do płukania sondy</td><td>Przyrządy molekularne</td><td>https://store.molecularinstruments.com/new-bundle/rna-fish</td><td></td></tr><tr><td>Proteinaza K&nbsp;</td><td>NEB</td><td>P8107S</td><td></td></tr><tr><td>QIAquick Zestaw do usuwania nukleotydów</td><td>Qiagen</td><td>28306</td><td></td></tr><tr><td>RNase Away&nbsp;</td><td>ThermoFisher</td><td>7003, odczynnik</td><td></td>do odkażania</tr><tr><td>bez RNaz DNase1</td><td>Qiagen</td><td>79254</td><td></td></tr><tr><td>S2 Medium</td><td>ThermoFisher</td><td>21720024</td><td></td></tr><tr><td>Uszczelki silikonowe&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>P24743</td><td></td></tr><tr><td>Tdc2_B5</td><td>Instrumenty molekularne</td><td>RTE880</td><td></td></tr><tr><td>Tk_B5</td><td>Instrumenty molekularne</td><td>PRR484</td><td></td></tr><tr><td>UltaPure 10% SDS</td><td>Thermofisher</td><td>15553027</td><td></td></tr><tr><td>Ultrapure BSA</td><td>ThermoFisher</td><td>AM2616</td><td></td></tr><tr><td>Niesprzężone i Alexa Spinki do włosów sprzężone z fluorem</td><td>Instrumenty</td> <td>molekularne</td><td></td>https://store.molecularinstruments.com/new-bundle/rna-fish</tr><tr><td>VAChT_B1</td><td>Instrumenty molekularne</td><td>RTA904</td><td></td></tr><tr><td>vGLUT_B2</td><td>Instrumenty molekularne Uchwyt</td> na żel <td>RTB212</td><td></td></tr><tr><td>Zeis Z7&nbsp;</td><td>Janelia&nbsp;</td><td>Pliki CAD dostępne na życzenie</td><td></td></tr><tr><td>Zeiss LSM 980 konfokalny Mikroskop odwrócony</td><td>Zeiss</td><td>https://www.janelia.org/node/46947/#lsm980</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop arkuszowy Zeiss Z7</td><td>Zeiss</td><td>https://www.zeiss.com/microscopy/us/products/light-microscopes/light-sheet-microscopes/lightsheet-7.html</td><td></td></tr></tbody></table>

multipleksowe wykrywanie ekspresji genów w nienaruszonym mózgu drosophila przy użyciu iteracyjnej fluorescencji in situ wspomaganej ekspansją

Multiplex Detection of Gene Expression in the Intact Drosophila Brain Using Expansion-Assisted Iterative Fluorescence In Situ Hybridization

Zrozumienie ekspresji genów jest niezbędne do rozszyfrowania funkcji komórkowych. Jednak metody analizy ekspresji wielu genów in situ w danej tkance pozostają ograniczone. Opisany tutaj protokół EASI-FISH został przystosowany do wykrywania ekspresji kilkudziesięciu genów w nienaruszonym ośrodkowym układzie nerwowym (OUN) dorosłego dorosłego Drosophila przy użyciu dostępnych na rynku odczynników. Protokół ten obejmuje nową formułę żelu, która zwiększa odporność żelu, umożliwiając wiele rund hybrydyzacji i umożliwiając osadzenie wielu mózgów w jednym żelu. To ulepszenie zwiększa przepustowość, ułatwia optymalne porównanie warunków eksperymentalnych i zmniejsza koszty odczynników. Dodatkowo, dzięki zastosowaniu systemu GAL4-UAS do jednoczesnego wykrywania białka zielonej fluorescencji (GFP), ekspresja genów może być wizualizowana w określonych typach komórek neuronalnych lub glejowych. Warto zauważyć, że wysoka rozdzielczość uzyskana dzięki mikroskopii ekspansywnej, w połączeniu z czułością metody, pozwala na wykrycie pojedynczych transkryptów RNA. Takie podejście skutecznie integruje wysoką jakość obrazu z wysoką przepustowością, co czyni go potężnym narzędziem do badania ekspresji genów w nienaruszonym mózgu muchy.

Skuteczność tego zmodyfikowanego protokołu EASI-FISH została zademonstrowana poprzez wykrywanie ekspresji kilku różnych genów związanych z neuroprzekaźnikami i neuropeptydami w mózgu dorosłej Drosophila w wielu rundach. Zazwyczaj żelowe i ekspandowane mózgi poddawano hybrydyzacji z dwiema lub trzema sondami w jednej rundzie, a następnie przeprowadzano HCR z parami spinek sprzężonych z Alexa Fluor (AF) 488 (chyba że ekspresjonowano GFP), AF546 i AF647 lub Janelia Fluor (JF) 669. Obrazowanie wykonywano głównie za ...

Iteracyjna hybrydyzacja in situ wspomagana ekspansją (EASI-FISH) to solidna technika, która łączy mikroskopię ekspansywną z fluorescencyjną hybrydyzacją in situ (FISH) w celu wykrycia ekspresji wielu genów w grubej tkance. Protokół ten przedstawia ostatnie postępy w metodzie i jej adaptacji do znakowania nienaruszonego ośrodkowego układu nerwowego Drosophila.

Multipleksowe wykrywanie ekspresji genów w nienaruszonym mózgu Drosophila przy użyciu iteracyjnej fluorescencji in situ wspomaganej ekspansją

Understanding gene expression is essential for deciphering cellular functions. However, methods for analyzing the expression of numerous genes in situ ...

Opracowaliśmy solidny protokół, w którym można przeprowadzić wiele rund hybrydyzacji in situ na tym samym mózgu drosophila, umożliwiając wizualizację wzorców ekspresji wielu różnych genów. Osadzenie mózgu muchy w hydrożelu zapewnia doskonałą integralność tkanek i stabilność mRNA w wielu rundach hybrydyzacji. Znacznie poprawia również przejrzystość optyczną podczas obrazowania.EASI-FISH może zostać zaadoptowany przez każde laboratorium wyposażone w mikroskop konfokalny lub mikroskop z arkuszem świetlnym w celu zdefiniowania profili ekspresji genów typów komórek w mózgu muchy. Aby rozpocząć, przetrzyj nienaładowany szkiełko odczynnikiem do odkażania RNA. Usuń nieprzezroczystą folię chroniącą klej od silikonowej uszczelki.Następnie przyklej uszczelkę zawierającą do czterech komór do suwaka. Za pomocą pipety P20 pokryj każdą powierzchnię komory jednym mikrolitrem polilizyny. Następnie przenieś do czterech mózgów drosophila na probówkę do 0,2 mililitra probówki PCR.Nawodnij mózg w 150 mikrolitrach PBS zawierających 0,1% Triton X-100, a następnie PBS. Dodaj 40 mikrolitrów PBS do każdej komory. Za pomocą cienkiej pęsety delikatnie ustaw mózgi w rzędzie na środku komory, pozostawiając między nimi trochę miejsca.Wyjmij PBS z komory i natychmiast dodaj 50 mikrolitrów 20-milimolowego buforu MOPS. Podczas gdy mózgi równoważą się w buforze MOPS, pipetuj równe objętości rozmrożonego Melphalan-X do probówki z buforem MOPS o równej objętości. Następnie dodać roztwór podstawowy Ac-X w stosunku jeden do 100.Zwiruj roztwór i krótko go obróć, aby go zebrać. Usunąć cały bufor MOPS z komór i dodać 50 mikrolitrów roztworu Melphalan-X Ac-X. Umieść szkiełko nakrywkowe na górze każdej komory bez użycia kleju do uszczelek do uszczelniania.Następnie umieść komorę w nawilżonym pudełku. Następnego dnia ostrożnie zdjąć szkiełko nakrywkowe i odessać roztwór Melphalan-X Ac-X. Umyj zamontowane mózgi dwukrotnie w 100 mikrolitrach 0,1% PBT, a następnie 100 mikrolitrów PBS.Rozmrożone roztwory TREx-1000 4-Hydroxy-TEMPO, TEMED i nadsiarczanu amonu umieścić na lodzie. Spłukać roztwór TREx-1000, aby upewnić się, że nie ma osadu. Wymieszaj roztwory, aby przygotować roztwór żelu i zwiruj przed oblodzeniem.Za pomocą końcówki do pipety wyjmij PBS z komory i usuń resztki płynu niestrzępiącą się ściereczką. Natychmiast dodaj 40 mikrolitrów roztworu żelu na mózgi w każdej komorze. Inkubuj komory w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez 10 minut.Teraz wyjmij roztwór żelu z komory. Następnie odklej przezroczystą folię ochronną od kleju do powierzchni uszczelki. Dodaj ostatnie 45 mikrolitrów świeżego roztworu żelu.Delikatnie umieść szkiełko nakrywkowe na komorze i dociśnij szkiełko nakrywkowe, aby uszczelnić komorę przed inkubacją w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez kolejne 10 minut. Inkubuj komorę w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 1,5 godziny, aby spolimeryzować żel. Po schłodzeniu żeli na ławce za pomocą żyletki ostrożnie usuń szkiełko nakrywkowe i silikonową uszczelkę.Przytnij żel do prostokątnego kształtu i odetnij prawy górny róg, aby wskazać orientację próbki. Następnie za pomocą cienkiego pędzla zwilżonego niewielką ilością bufora Pro K ostrożnie zdejmij żele ze szkiełka. Przenieś każdy żel indywidualnie do dwumililitrowej probówki mikrowirówkowej.Wymieszaj 500 mikrolitrów buforu Pro K i pięć mikrolitrów enzymu proteinazy K i dodaj mieszaninę do każdego żelu. Inkubować w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez noc. Następnego dnia usuń bufor za pomocą cienkiej, elastycznej pipety, a następnie umyj żele trzy razy w PBS przez 10 minut każdy.Inkubować żele przez 30 minut w jednym mililitrze buforu DNASE1 w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Wymieszaj 50 mikrolitrów enzymu DNASE1 z 450 mikrolitrami buforu DNASE1. Delikatnie wymieszaj bez wirowania.Inkubować każdy żel w 500 mikrolitrach roztworu DNASE1 przez dwie godziny w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Następnie umyj żele cztery razy przez 15 minut jednym mililitrem PBS w temperaturze pokojowej. Teraz inkubuj żele w 500 mikrolitrach rozmrożonego buforu hybrydyzacyjnego bez sond przez 30 minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza.Rozcieńczyć sondy w buforze hybrydyzacyjnym w stosunku jeden do 100, przygotowując 300 mikrolitrów na żel. Inkubować żele z buforem hybrydyzacyjnym zawierającym sondy przez noc w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Następnego dnia umyj żele najpierw w buforze do płukania sondy, a następnie w PBS.W przypadku reakcji łańcuchowej hybrydyzacji dodać 500 mikrolitrów buforu amplifikacyjnego do żelu i inkubować przez 30 minut w temperaturze pokojowej. Podgrzej fluorescencyjne spinki do włosów w temperaturze 95 stopni Celsjusza przez 90 sekund w maszynie do PCR i schładzaj roztwór do 25 stopni Celsjusza przez 30 minut. Dla każdej sondy rozcieńczyć pasujące pary spinek do włosów w stosunku od jednego do 50 w buforze wzmacniającym, przygotowując 300 mikrolitrów na żel.Po zwirowaniu mieszaniny dodaj mieszaninę do żeli i inkubuj. Aby zamontować żel do obrazowania na lekkim arkuszu, pokryj powierzchnię mocowania żelu uchwytu żelowego dwukrotnie jednym mikrolitrem polilizyny, pozostawiając ją do wyschnięcia w temperaturze 37 stopni Celsjusza między warstwami. Następnie umieść żel na szkiełku nakrywkowym tak, aby nacięcie znajdowało się po lewej stronie.Za pomocą pędzla jednym ruchem przenieś żel na obrabianą powierzchnię. Geny związane z neuroprzekaźnikami i geny neuropeptydowe wykazywały wyraźne wzorce ekspresji w mózgu dorosłej drosophila. VGluT i Gad1 wykryto jednocześnie w tej samej rundzie hybrydyzacji, wykazując nienakładające się wzorce ekspresji.AstA wykazywała silną ekspresję w płacie wzrokowym i słabszą ekspresję w kompleksie centralnym. Crz wykazywał wysoką ekspresję w pars lateralis, podczas gdy niższe poziomy ekspresji obserwowano w neuronach płata wzrokowego. Tk wykryto w neuronach H delta D zidentyfikowanych z ekspresją Mer-GFP przy użyciu specyficznej podzielonej linii GAL4 za pomocą arkusza świetlnego lub mikroskopii konfokalnej.FMRFamid był nieobecny w neuronach PFG oznaczonych Mer-GFP, ale wykryty w otaczających neuronach. Obrazowanie neuronów FB4K w wysokiej rozdzielczości potwierdziło przestrzenny rozkład transkryptów VGluT i ChAT/VAChT. Neuropeptydy, takie jak AstA i Crz, są tak wysoko eksprymowane w niektórych komórkach, że nie można już oddzielić pojedynczych plamek fluorescencyjnych reprezentujących pojedyncze transkrypty.

multiplex-detection-gene-expression-intact-drosophila-brain-using

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Niniejszy protokół opisuje niepromienną procedurę hybrydyzacji in-situ, która umożliwia jednoczesną identyfikację dwóch gatunków transkryptów z rozdzielczością pojedynczych komórek w cienkich przekrojach mózgu kręgowców.

Podwójna fluorescencyjna hybrydyzacja in situ w świeżych przekrojach mózgu

Ten film demonstruje barwienie immunofluorescencyjne transgenicznego mózgu Drosophila do obrazowania pojedynczych komórek glejowych. Mózg wykazuje ekspresję białek ukierunkowanych na błonę, połączonych z różnymi kombinacjami epitopów antygenowych pod kontrolą specyficznego dla gleju systemu rekombinazy. Wyizolowane i utrwalone mózgi są barwione pierwszorzędowymi przeciwciałami specyficznymi dla epitopów antygenowych, a następnie przeciwciałami drugorzędowymi sprzężonymi z fluoroforem.

Barwienie immunofluorescencyjne mózgów Drosophila do obrazowania pojedynczych komórek glejowych

Źródło: Jolly, S., et.al. Połączenie podwójnej fluorescencji  hybrydyzacji in situ z immunoznakowaniem w celu wykrycia ekspresji trzech genów w sekcjach mózgu myszy. J. Vis. Exp. (2016). Ten film demonstruje zastosowanie hybrydyzacji in situ z podwójną fluorescencją do wizualizacji ekspresji dwóch celów RNA w sekcjach mózgu myszy. Protokół obejmuje sekwencyjne wykrywanie RNA za pomocą sond znakowanych izotiocyjanianem fluoresceiny i digoksygeniną, a następnie enzymatyczne wzmacnianie sygnału w...

 Wykonywanie podwójnej fluorescencji hybrydyzacji in situ w celu wykrycia ekspresji genów w skrawkach mózgu myszy

Tutaj opisujemy protokół hybrydyzacji in situ (FISH) do określania właściwości ekspresji i lokalizacji RNA wyrażanych podczas embriogenezy u muszki owocowej, Drosophila melanogaster.

Fluorescencyjna hybrydyzacja in situ zarodków Drosophila z całą górą RNA

Opisujemy wielozadaniową procedurę chromogenicznej hybrydyzacji in situ (MC-WISH) w nienaruszonych zarodkach Drosophila, pozwalającą na jednoczesne i specyficzne wykrywanie trzech różnych wzorców dystrybucji mRNA poprzez kontrastujące kolorowe osady.

Wielozadaniowa chromogenna hybrydyzacja in situ w całości do porównania domen ekspresji genów w zarodkach Drosophila

Lokalizacja ekspresji genów w określonych typach komórek może być trudna ze względu na brak specyficznych przeciwciał. W tym miejscu opisujemy protokół jednoczesnego potrójnego wykrywania ekspresji genów poprzez połączenie hybrydyzacji in situ RNA z podwójną fluorescencją z barwieniem immunologicznym.

Połączenie podwójnej fluorescencji hybrydyzacji in situ z immunoznakowaniem w celu wykrycia ekspresji trzech genów w wycinkach mózgu myszy

Komórki mają różne morfologie i nawiązują różnorodne interakcje ze swoimi sąsiadami. Protokół ten opisuje, w jaki sposób ujawnić morfologię pojedynczych komórek i zbadać interakcję komórka-komórka przy użyciu dobrze znanego systemu ekspresji Gal4 / UAS.

Zastosowanie techniki MultiColor FlpOut do badania wysokorozdzielczych morfologii pojedynczych komórek i interakcji komórkowych gleju u Drosophila

Opisany protokół hybrydyzacji RNA in situ pozwala na wykrycie RNA w całych zarodkach Drosophila lub wypreparowanych tkankach. Korzystając z 96-dołkowych płytek mikromiareczkowych i wzmocnienia sygnału tyramidu, transkrypty mogą być wykrywane z wysoką rozdzielczością, czułością i przepustowością oraz przy stosunkowo niskich kosztach.

Fluorescencyjna hybrydyzacja in situ o wysokiej rozdzielczości w zarodkach i tkankach Drosophila przy użyciu wzmocnienia sygnału tyramidowego

Prezentacja sposobu wykonania i zastosowania zewnątrzkomórkowej elektrody ssącej używanej do pomiarów elektrofizjologicznych w rdzonach kręgowych noworodków gryzoni in...

Elektrofizjologia rdzenia kręgowego II: Wytwarzanie przyssawkowych elektrod zewnątrzkomórkowych

W tym artykule demonstrujemy metodę manipulowania ekspresją genów w komórkach komorowych dorosłego kresomózgowia danio pręgowanego za pomocą antysensownych oligonukleotydów morfolino. Przedstawiamy tę metodę jako skuteczny i szybki protokół, który można wykorzystać do badań funkcjonalnych w mózgu dorosłego kręgowca.

Mikromanipulacja ekspresją genów w mózgu dorosłego danio pręgowanego za pomocą mikroiniekcji oligonukleotydów morfolino do komory mózgowej

Poznaj metodę EASI-FISH do wielokrotnego wykrywania ekspresji genów w nienaruszonym mózgu Drosophila. Technika łączy mikroskopię ekspansji z hybrydyzacją in situ, umożliwiając precyzyjną analizę wzorców ekspresji w komórkach nerwowych.

Multipleksowe wykrywanie ekspresji genów w nienaruszonym mózgu Drosophila przy użyciu iteracyjnej fluorescencji in situ wspomaganej ekspansją (Wideo) | JoVE Journal

Multipleksowe wykrywanie ekspresji genów w nienaruszonym mózgu Drosophila przy użyciu iteracyjnej fluorescencji in situ wspomaganej ekspansją

Przeglądaj więcej filmów