Name: Optyczne oczyszczanie ośrodkowego układu nerwowego myszy za pomocą pasywnego CLARITY (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-06-30T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 28 s
Description: Poznaj zmodyfikowaną metodę CLARITY do optycznego oczyszczania ośrodkowego układu nerwowego myszy. Technika zapewnia spójne, opłacalne wyniki dla badań nad morfologią 3D i łącznością neuronalną.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Ta praca była hojnie wspierana przez National Institutes of Health/National Institute of Neurological Disorders and Stroke (NIH/NINDS) grant 1R01NS086981 oraz Fundację Conrada N. Hiltona. Dziękujemy dr Laurentowi Bentolili i dr Matthew Schiblerowi za ich nieocenioną pomoc w mikroskopii konfokalnej. Dziękujemy tym, którzy przyczynili się do powstania forum CLARITY (http://forum.claritytechniques.org). Szczególnie dziękujemy dr Karlowi Deisserothowi za otwarcie swojego laboratorium, w którym można uczyć tej fascynującej techniki. Autorzy są wdzięczni za hojne wsparcie ze strony Brain Mapping Medical Research Organization, Brain Mapping Support Foundation, Pierson-Lovelace Foundation, The Ahmanson Foundation, Capital Group Companies Charitable Foundation, William M. and Linda R. Dietel Philanthropic Fund oraz Northstar Fund. Badania przedstawione w tej publikacji były również częściowo wspierane przez National Center for Research Resources oraz przez Biuro Dyrektora National Institutes of Health pod numerami nagród C06RR012169, C06RR015431 i S10OD011939. Wyłączną odpowiedzialność za treść ponoszą autorzy i nie muszą one reprezentować oficjalnych poglądów National Institutes of Health.

Wszystkie eksperymenty zostały przeprowadzone zgodnie z wytycznymi Instytucjonalnego Komitetu ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt (IACUC). Do tych eksperymentów wykorzystano myszy THY1-YFP, PLP-EGFP i PV-TdTomato, ale wszystkie myszy wykazujące ekspresję białek fluorescencyjnych można z powodzeniem oczyścić i zobrazować.
1. Przygotowanie tkanek
Uwaga: Paraformaldehyd (PFA) i akrylamid są toksyczne i drażniące. Wykonuj eksperymenty z użyciem tych odczynników w dygestoriach i przy użyciu odpowiedniego sprzętu ochrony osobistej (fartuch laboratoryjny, rękawice i ochrona oczu).
<ol>
	<li>Zwierzę należy złożyć w ofierze w komorze eutanazyjnej z ~1 ml izofluranu do momentu ustania oddychania (~2 - 3 min).</li>
	<li>Użyć pompy perystaltycznej ustawionej na ~5 ml/min, aby wykonać dosercową perfuzję myszy roztworem perfuzyjnym (Tabela 1) w temperaturze 4 °C, aż krew zostanie usunięta z tkanek (5 - 10 min).</li>
	<li>Zmienić perfuzat na roztwór utrwalający (Tabela 1) w temperaturze 4 °C, aż szyja i ogon znacznie usztywnieją (5-10 min).</li>
	<li>Zakończ perfuzję i odetnij głowę zwierzęciu. Ostrożnie wypreparuj mózg z czaszki, najpierw usuwając tkankę łączną otaczającą czaszkę, a następnie usuwając kość z brzusznej powierzchni czaszki i podnosząc mózg (ryc. 1a), jak opisano w 20. 
	Uwaga: Szczególną uwagę należy zwrócić na usunięcie kości otaczającej płaty kłaczkowate móżdżku i opuszki węchowe.
	<ol>
		<li>Wypreparuj rdzeń kręgowy od kręgosłupa, delikatnie wkładając końcówkę cienkich, ostrych nożyczek między rdzeń kręgowy a kręgosłup i odcinając poszczególne segmenty kręgosłupa, jak opisano w 21.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Hemisekcję mózgu, umieszczając go w plastikowej matrycy mózgu myszy i przecinając wzdłuż linii środkowej za pomocą ostrza matrycy.</li>
	<li>Dodać każdą półkulę i rdzeń kręgowy do oddzielnych probówek wirówkowych o pojemności 50 ml z ~40 ml roztworu hydrożelu (Tabela 1). Od tego momentu przykryj probówki folią aluminiową, aby chronić fluorofory podczas wszystkich kolejnych kroków.</li>
	<li>Inkubować probówkę zawierającą próbkę w hydrożelu w temperaturze 4 °C, delikatnie wstrząsając (~30 obr./min) przez 7 dni.</li>
</ol>
2. Polimeryzacja
<ol>
	<li>Wyrzucić ~25 ml hydrożelu, zachowując próbkę i ~25 ml hydrożelu w probówce wirówkowej.</li>
	<li>Odtlenić próbkę, zdejmując nakrętkę i umieszczając probówkę wirówkową w słoiku eksykatora i podłączając słoik do próżni. Stosować próżnię przez co najmniej 10 minut, aby rozpuszczone gazy wydostały się z roztworu i utworzyły pęcherzyki. Delikatnie wstrząśnij, aby usunąć bąbelki.</li>
	<li>Wymień próżnię w słoiku eksykatora na 100% azot gazowy w ciągu 2 - 3 minut. Gdy ciśnienie się wyrówna (po otwarciu górnej części słoika eksykatora), szybko zakryj rurkę, aby zapobiec ponownemu wprowadzeniu tlenu.</li>
	<li>Polimeryzować hydrożel, umieszczając probówkę z próbką w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C na 3 godziny, aż do zakończenia polimeryzacji. Spolimeryzowany hydrożel przyjmie konsystencję przypominającą żel (ryc. 1b). Uwaga: Dopuszczalna jest niewielka ilość niespolimeryzowanego hydrożelu na górze.</li>
	<li>Za pomocą szpatułki usuń spolimeryzowaną próbkę z probówki wirówkowej, a następnie odetnij nadmiar hydrożelu z próbki.</li>
	<li>Usuń pozostały hydrożel, umieszczając próbkę na niestrzępiącej się chusteczce i delikatnie pocierając i tocząc po niej tkankę, pozostawiając na próbce tylko cienką warstwę spolimeryzowanego hydrożelu.</li>
</ol>
3. Usuwanie lipidów
Uwaga: Tkanka oczyszczona z lipidów jest delikatna, należy obchodzić się z nią ostrożnie. Podczas opróżniania probówki należy użyć sitka do komórek, aby uniknąć utraty próbki. Ponadto próbka będzie pęcznieć przez cały proces oczyszczania, jednak pęcznienie można odwrócić podczas procesu dopasowywania współczynnika załamania.
Uwaga: Dodecylosiarczan sodu (SDS) i kwas borowy są drażniące. Przeprowadzaj eksperymenty z ich użyciem w dygestorium i przy użyciu odpowiedniego sprzętu ochrony osobistej (fartuch laboratoryjny, rękawice i ochrona oczu).
<ol>
	<li>Przenieść spolimeryzowaną próbkę do czystej probówki wirówkowej o pojemności 50 ml i dodać 45 ml buforu klarującego (tabela 1). Inkubować w temperaturze 45 °C z delikatnym wstrząsaniem (~30 obr./min). Zmieniaj bufor codziennie przez pierwsze 7 dni, wylewając zużyty bufor czyszczący do odpadów chemicznych i dodając ~45 ml świeżego buforu czyszczącego. Probówki wirówkowe zawierające próbki należy przechowywać przykryte folią aluminiową w celu ochrony fluoroforów.</li>
	<li>Po upływie pierwszych 7 dni inkubować próbkę w temperaturze 40 °C i wymieniać bufor czyszczący co 2-3 dni. Kontynuuj oczyszczanie, aż wszystkie lipidy zostaną rozpuszczone, a tkanka osiągnie przezroczystość (ryc. 1c). Będzie to 4 - 6 tygodni dla półkuli mózgu myszy i 2 - 4 tygodnie dla rdzenia kręgowego.</li>
	<li>Po oczyszczeniu tkanki przenieść próbkę do nowej probówki wirówkowej o pojemności 50 ml i przemyć 4 razy w PBST (Tabela 1) w temperaturze 40 °C z delikatnym wstrząsaniem (~30 obr./min) przez 24 godziny w celu usunięcia pozostałości SDS.</li>
</ol>
4. Barwienie molekularne
Uwaga: Dichlorowodorek 4',6-Diamidino-2-Fenyloindolu (DAPI) jest substancją drażniącą i wszelkie eksperymenty z jego użyciem powinny być przeprowadzane w dygestoriach i przy użyciu odpowiedniego sprzętu ochrony osobistej (fartuch laboratoryjny, rękawice i ochrona oczu).
<ol>
	<li>Przenieść próbkę do czystej probówki wirówkowej o pojemności 15 ml i napełnić 1 μg/ml DAPI w 1x PBST, pH 7,5. Inkubować w temperaturze pokojowej (RT) przez 24 godziny. Probówki wirówkowe zawierające próbki należy przechowywać przykryte folią aluminiową w celu ochrony fluoroforów.</li>
	<li>Prać 3 razy w PBST w temperaturze pokojowej przez co najmniej 6 godzin/pranie.</li>
</ol>
5. Dopasowanie współczynnika załamania światła
Uwaga: 2,2′-tiodieetanol (TDE) jest substancją drażniącą i wszelkie eksperymenty z jego użyciem powinny być przeprowadzane pod wyciągiem i przy użyciu odpowiedniego sprzętu ochrony osobistej (fartuch laboratoryjny, rękawice i ochrona oczu).
<ol>
	<li>Przenieść próbkę do czystej probówki wirówkowej o pojemności 15 ml i napełnić 30% (v/v) TDE w 1x PBS, pH 7,5. Inkubować w temperaturze 40 °C z delikatnym wstrząsaniem (~30 obr./min) przez 24 godziny.</li>
	<li>Zamień 30% TDE na 63% (v/v) TDE w 1x PBS, pH 7,5. Inkubować w temperaturze 40 °C z delikatnym wstrząsaniem przez 24 godziny 
	Uwaga: Próbka zmniejszy się z powrotem do mniej więcej oryginalnego rozmiaru.</li>
	<li>Na płaskiej, czystej powierzchni rozwałkuj kawałek kleju wielokrotnego użytku do cylindra o jednolitej średnicy nieco większej niż grubość próbki.</li>
	<li>Połóż samoprzylepny cylinder wielokrotnego użytku w otwartym okręgu (średnica wewnętrzna ~25 mm z małym otworem u góry) na szklanym naczyniu o średnicy 40 mm. Jeśli konieczne jest wprowadzenie poprawek, wyjmij cylinder ze szkła i przetnij żyletką.</li>
	<li>Użyj końcówki do pipety p1000, aby utworzyć uszczelnienie między klejem wielokrotnego użytku a szkłem, owijając go wokół zewnętrznej krawędzi cylindra.</li>
	<li>Umieść ~100 μl 63% TDE na szklanym naczyniu i rozprowadź dookoła, aby pokryć szklaną powierzchnię w kręgu kleju wielokrotnego użytku.</li>
	<li>Za pomocą szpatułki ostrożnie umieść próbkę na środku koła, uważając, aby nie tworzyć pęcherzyków.</li>
	<li>Odpipetować kolejne 100 μl 63% TDE bezpośrednio na próbkę, a następnie natychmiast umieścić okrągłe szkło nakrywkowe o średnicy 40 mm na kleju wielokrotnego użytku.</li>
	<li>Używając palca wskazującego, środkowego i serdecznego obu rąk, ostrożnie dociśnij obwód koła, aż szkło nakrywkowe zetknie się z próbką.</li>
	<li>Powoli ustaw naczynie ze szklanym dnem w pozycji pionowej, opierając się o powierzchnię, a następnie dodaj 63% TDE za pomocą pipety, aż roztwór dotrze do małego otworu u góry. Użyj niestrzępiącej się chusteczki, aby osuszyć końcówkę pipety, aby roztwór nie kapał na szkło. Aby uniknąć pęcherzyków w komorze, nigdy nie opróżniaj pipety do końca.</li>
	<li>Do małego otworu dodaj elastomer silikonowy, aby zamknąć okrąg i stworzyć zamkniętą komorę. Odczekaj 5 minut, aż wyschnie przed obrazowaniem.</li>
</ol>
6. Mikroskopia
Uwaga: Lasery używane w konfokalnej, jednopłaszczyznowej oświetleniu i mikroskopii świetlnej są bardzo silne i mogą powodować ślepotę. Wszelkie eksperymenty z użyciem laserów powinny być wykonywane po intensywnym szkoleniu oraz z dużą ostrożnością i odpowiednią ochroną oczu.
<ol>
	<li>Umieść komorę obrazowania z próbką w środku na stoliku laserowego skaningowego mikroskopu konfokalnego.</li>
	<li>Otwórz oprogramowanie do obrazowania (patrz Tabela materiałów). Aby włączyć laser wzbudzenia argonem, kliknij zakładkę konfiguracji u góry programu, a następnie ikonę lasera. Zaznacz pole obok argonu, aby zasilić laser i przesuń skalę slajdów do 30%. Obserwuj, jak wskazówka powoli rozgrzewa się do wybranej pozycji.
	<ol>
		<li>Wróć do zakładki pobierania u góry. W dużym polu "Ustawienia ścieżki wiązki" przejdź do pola ustawień ładowania/zapisywania i wybierz menu rozwijane, aby wybrać odpowiedni kanał długości fali do obrazowania YFP (527 nm).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wybierz odpowiednie cele do obrazowania, znajdując czerwone hiperłącze oznaczone "cel: bieżący obiekt" w polu ustawień kanału. Kliknięcie na zakładkę otworzy wszystkie dostępne cele, a wybrany wybór automatycznie obróci wieżyczkę.
	<ol>
		<li>Używaj obiektywów (np. 10X) o dużej odległości roboczej (większej niż grubość obrazowanej tkanki, np. 11 mm) i dużej aperturze numerycznej (np. 0,3), aby zmaksymalizować rozdzielczość obrazu w płaszczyźnie i zminimalizować grubość przekroju optycznego.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>W lewej kolumnie menu rozwijanych otwórz okno "XY: rozdzielczość", aby ustawić macierz akwizycji, zwaną "formatem", na 1,024 x 1,024 lub wartość odpowiednią dla limitu rozdzielczości bocznej celu. Ustaw współczynnik powiększenia tak niski, jak to możliwe (np. 1.7).</li>
	<li>W tym samym oknie ustaw parametry średniej z 8 wierszy i średnią z 1 klatki, odpowiednio rozwijając indywidualnie oznaczone menu. Używaj dużych wartości dla wysokiego stosunku sygnału do szumu i małych wartości dla szybkiej akwizycji. 
	Uwaga: Średnia z 8 linii i średnia z 1 klatki pozwolą uzyskać wysokiej jakości obrazy półkuli mózgu myszy w ciągu około 4 godzin.</li>
	<li>Zlokalizuj próbkę za pomocą elementów sterujących stolika. Gdy reprezentatywne pole jest widoczne, ustaw wzmocnienie i offset. 
	Uwaga: Wzmocnienie i przesunięcie będą się znacznie różnić w zależności od typu tkanki, fluoroforów i/lub obrazowanych cech anatomicznych. W przypadku YFP ustaw wartości od 760 do 780 dla wzmocnienia i od -1,0 do -1,5 dla przesunięcia.</li>
	<li>Wybierz "skanowanie kafelków" i wybierz granice interesującego Cię regionu. Ustaw górny i dolny limit stosu z, który ma zostać pobrany. Ustaw grubość przekroju optycznego w oparciu o limit rozdzielczości przekroju optycznego obiektywu. 
	Uwaga: Limit rozdzielczości przekroju optycznego obiektywu jest określany przede wszystkim przez jego aperturę numeryczną. Większość programów do sterowania mikroskopem automatycznie oblicza wartość odpowiednią dla używanego obiektywu. W przypadku obiektywu 10X z aperturą numeryczną 0,3 byłoby to około 11 μm.</li>
	<li>Rozpocznij pobieranie. 
	Uwaga: Może to potrwać kilka godzin.</li>
	<li>Zbieraj obrazy o wyższej rozdzielczości przy użyciu obiektywów o większym powiększeniu z określonych obszarów zainteresowania.</li>
</ol>

<ol><li>Micheva, K. D., Smith, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Array+tomography%3A+a+new+tool+for+imaging+the+molecular+architecture+and+ultrastructure+of+neural+circuits%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Array tomography: a new tool for imaging the molecular architecture and ultrastructure of neural circuits.</a> Neuron. 55, 25-36 (2007).</li>
<li>Kleinfeld, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Large-scale+automated+histology+in+the+pursuit+of+connectomes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Large-scale automated histology in the pursuit of connectomes.</a> J Neurosci. 31, 16125-16138 (2011).</li>
<li>MacKenzie-Graham, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+multimodal%2C+multidimensional+atlas+of+the+C57BL%2F6J+mouse+brain%5BTitle%5D)+AND+%22J+Anat%22%5BJournal%5D)">A multimodal, multidimensional atlas of the C57BL/6J mouse brain.</a> J Anat. 204, 93-102 (2004).</li>
<li>Denk, W., Svoboda, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photon+upmanship%3A+why+multiphoton+imaging+is+more+than+a+gimmick%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Photon upmanship: why multiphoton imaging is more than a gimmick.</a> Neuron. 18, 351-357 (1997).</li>
<li>Denk, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anatomical+and+functional+imaging+of+neurons+using+2-photon+laser+scanning+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Methods%22%5BJournal%5D)">Anatomical and functional imaging of neurons using 2-photon laser scanning microscopy.</a> J Neurosci Methods. 54, 151-162 (1994).</li>
<li>Zipfel, W. R., Williams, R. M., Webb, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nonlinear+magic%3A+multiphoton+microscopy+in+the+biosciences%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Nonlinear magic: multiphoton microscopy in the biosciences.</a> Nat Biotechnol. 21, 1369-1377 (2003).</li>
<li>Helmchen, F., Denk, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deep+tissue+two-photon+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Deep tissue two-photon microscopy.</a> Nat Methods. 2, 932-940 (2005).</li>
<li>Theer, P., Denk, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((On+the+fundamental+imaging-depth+limit+in+two-photon+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Opt+Soc+Am+A+Opt+Image+Sci.+Vis%22%5BJournal%5D)">On the fundamental imaging-depth limit in two-photon microscopy.</a> J Opt Soc Am A Opt Image Sci. Vis. 23, 3139-3149 (2006).</li>
<li>Dodt, H. U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultramicroscopy%3A+three-dimensional+visualization+of+neuronal+networks+in+the+whole+mouse+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Ultramicroscopy: three-dimensional visualization of neuronal networks in the whole mouse brain.</a> Nat Methods. 4, 331-336 (2007).</li>
<li>Erturk, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+imaging+of+solvent-cleared+organs+using+3DISCO%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional imaging of solvent-cleared organs using 3DISCO.</a> Nat Protoc. 7, 1983-1995 (2012).</li>
<li>Hama, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Scale%3A+a+chemical+approach+for+fluorescence+imaging+and+reconstruction+of+transparent+mouse+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Scale: a chemical approach for fluorescence imaging and reconstruction of transparent mouse brain.</a> Nat Neurosci. 14, 1481-1488 (2011).</li>
<li>Ke, M. T., Fujimoto, S., Imai, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SeeDB%3A+a+simple+and+morphology-preserving+optical+clearing+agent+for+neuronal+circuit+reconstruction%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">SeeDB: a simple and morphology-preserving optical clearing agent for neuronal circuit reconstruction.</a> Nat Neurosci. 16, 1154-1161 (2013).</li>
<li>Susaki, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole-brain+imaging+with+single-cell+resolution+using+chemical+cocktails+and+computational+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Whole-brain imaging with single-cell resolution using chemical cocktails and computational analysis.</a> Cell. 157, 726-739 (2014).</li>
<li>Chung, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+and+molecular+interrogation+of+intact+biological+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Structural and molecular interrogation of intact biological systems.</a> Nature. 497, 332-337 (2013).</li>
<li>Spence, R. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bringing+CLARITY+to+gray+matter+atrophy%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroimage%22%5BJournal%5D)">Bringing CLARITY to gray matter atrophy.</a> Neuroimage. 101, 625-632 (2014).</li>
<li>Tomer, R., Ye, L., Hsueh, B., Deisseroth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advanced+CLARITY+for+rapid+and+high-resolution+imaging+of+intact+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Advanced CLARITY for rapid and high-resolution imaging of intact tissues.</a> Nat Protoc. 9, 1682-1697 (2014).</li>
<li>Yang, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+phenotyping+within+transparent+intact+tissue+through+whole-body+clearing%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Single-cell phenotyping within transparent intact tissue through whole-body clearing.</a> Cell. 158, 945-958 (2014).</li>
<li>Costantini, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+versatile+clearing+agent+for+multi-modal+brain+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">A versatile clearing agent for multi-modal brain imaging.</a> Sci Rep. 5, 9808(2015).</li>
<li>Zheng, H., Rinaman, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simplified+CLARITY+for+visualizing+immunofluorescence+labeling+in+the+developing+rat+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Struct+Funct%22%5BJournal%5D)">Simplified CLARITY for visualizing immunofluorescence labeling in the developing rat brain.</a> Brain Struct Funct. , (2015).</li>
<li>Parra, S. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiphoton+microscopy+of+cleared+mouse+brain+expressing+YFP%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Multiphoton microscopy of cleared mouse brain expressing YFP.</a> J Vis Exp. (67), e3848(2012).</li>
<li>Weinger, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-photon+imaging+of+cellular+dynamics+in+the+mouse+spinal+cord%5BTitle%5D)+AND+%22J+Viz+Exp%22%5BJournal%5D)">Two-photon imaging of cellular dynamics in the mouse spinal cord.</a> J Viz Exp. (96), e52580(2015).</li>
<li>Hama, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ScaleS%3A+an+optical+clearing+palette+for+biological+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">ScaleS: an optical clearing palette for biological imaging.</a> Nat Neurosci. 18, 1518-1529 (2015).</li>
<li>Treweek, J. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole-body+tissue+stabilization+and+selective+extractions+via+tissue-hydrogel+hybrids+for+high-resolution+intact+circuit+mapping+and+phenotyping%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Whole-body tissue stabilization and selective extractions via tissue-hydrogel hybrids for high-resolution intact circuit mapping and phenotyping.</a> Nat Protoc. 10, 1860-1896 (2015).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Pasywne oczyszczanie tkanek zanurzonych w hydrożelu (pasywne CLARITY) jest prostą i niedrogą metodą usuwania dużych fragmentów tkanki. Takie podejście nie wymaga dedykowanego sprzętu i można je łatwo wykonać w wytrząsarce o kontrolowanej temperaturze. W ciągu kilku tygodni nawet duże, silnie zmielinizowane tkanki, takie jak cały mózg lub rdzeń kręgowy, staną się przezroczyste i będą nadawały się do mikroskopii. Mimo że raport ten koncentruje się na oczyszczaniu tkanek OUN, pasywna CLARITY może być stosowana do każdej tka...

Zdolność do obrazowania kompletnych struktur neuroanatomicznych jest niezwykle cenna dla zrozumienia mózgu w zdrowiu i chorobie. Tradycyjnie, obrazowanie 3D wymagało przekroju tkanek w celu zapewnienia rozdzielczości osiowej i wizualizacji głębokich struktur anatomicznych. Takie podejście może generować zestawy danych o wysokiej rozdzielczości, ale wymaga zaawansowanych technik rekonstrukcji obrazu i jest bardzo pracochłonne. W związku z tym ograniczono ją do obrazowania małych objętości tkanek1-3. Z drugiej strony sekcje optyczne dobrze nadają się do tworzenia obrazów 3D o wysokiej rozdzielczości tkanek znakowanych fluorescencyjnie. Ponieważ przekrój optyczny jest z natury trójwymiarowy, nie wymaga rozległych obliczeń, aby uzyskać objętość obrazu 3D. Jednak rozpraszanie światła i zmętnienie tkanek ograniczają głębokość, na której można optycznie przeciąć tkanki. Głębokość obrazowania jest ograniczona do około 150 μm w laserowej skaningowej mikroskopii konfokalnej i do mniej niż 800 μm przy użyciu dwufotonowej mikroskopii wzbudzenia4-8.
Aby przezwyciężyć te ograniczenia, ostatnio opracowano kilka technik optycznego oczyszczania, a następnie udoskonalono je, aby umożliwić głębokie obrazowanie mikroskopowe nienaruszonych tkanek. Użycie alkoholu benzylowego i benzoesanu benzylu (BABB) w celu utrwalenia tkanek stało się przezroczyste było jednym z najwcześniejszych podejść9. Podejście to było jednak ograniczone przez wygaszanie fluorescencji w próbkach i niepełne oczyszczanie silnie zmielinizowanych struktur10. Udoskonalenia tej techniki, takie jak obrazowanie 3D narządów oczyszczonych rozpuszczalnikiem (3DISCO), doprowadziły do bardzo szybkiego i całkowitego oczyszczenia tkanek, ale nadal cierpią z powodu szybkiej utraty sygnałów fluorescencyjnych, zwłaszcza żółtego białka fluorescencyjnego (YFP)10. Roztwory czyszczące na bazie wody, takie jak Sca/e11 i SeeDB12, zachowują sygnały fluorescencyjne, ale nie usuwają całkowicie silnie zmielinizowanych tkanek. Clear, Untracted Brain Imaging Cocktails and Computational analysis (CUBIC) to obiecująca nowa technologia oczyszczania optycznego, która wydaje się przezwyciężać ograniczenia wcześniej opracowanych rozwiązań oczyszczania na bazie wody13. W przeciwieństwie do innych technik oczyszczania optycznego, Clear Lipid-exchanged Hybridized Rigid Imaging-compatible Tissue-hYdrogel (CLARITY)14 osadza mózg w porowatej matrycy, która zapewnia integralność strukturalną białek, kwasów nukleinowych i małych cząsteczek, pozostawiając lipidy niezwiązane. Lipidy są następnie usuwane elektroforetycznie, czego kulminacją jest optycznie oczyszczony mózg, który można łatwo zobrazować i równie łatwo zbadać przy użyciu powszechnie dostępnych technik.
Elektroforetyczne oczyszczanie tkanek (ETC) służy do usuwania lipidów z tkanek zanurzonych w hydrożelu w CLARITY, jednak ETC może być trudne do konsekwentnego wdrażania, a tkanki poddawane elektroforezie mogą wykazywać zniekształcenia tkanek, brązowienie, utratę fluorescencji i reaktywność przeciwciał. Pasywne oczyszczanie lipidów pozwala uniknąć tych ograniczeń, ale wymaga wydłużenia czasu usuwania15-17. Oczyszczanie pasywne pozwala również na równoległe oczyszczanie dużej liczby próbek, ponieważ nie jest ograniczone liczbą dostępnych aparatów ETC. Zmniejszenie stężenia paraformaldehydu i wykluczenie bis-akrylamidu z hydrożelu doprowadziło do znacznego wzrostu szybkości usuwania kosztem większej ekspansji tkanek16. Opracowano tańsze alternatywy dla rozwiązania do dopasowywania indeksu refrakcji stosowanego w oryginalnej technice CLARITY17-19. 2,2'-tiodieetanol (TDE) jest niedrogim i szybkim środkiem oczyszczającym mózg, który odwraca część ekspansji tkanki, która zachodzi podczas usuwania lipidów18. W raporcie uwzględniono pasywne oczyszczanie tkanki osadzonej w hydrożelu oraz zastosowanie TDE jako rozwiązania dopasowującego współczynnik załamania światła do oryginalnej techniki CLARITY w celu uzyskania wysoce powtarzalnego i niedrogiego protokołu optycznego oczyszczania ośrodkowego układu nerwowego myszy.

<table><tbody><tr><td>10x sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS)</td><td>Fisher</td><td>BP399-1</td><td></td></tr><tr><td>32% paraformaldehyd (PFA)</td><td>Mikroskopia elektronowa</td><td>Sciences 15714-5</td><td>perfuzja i hydrożel</td></tr><tr><td>2,2'-tiodieetanol (TDE)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>166782-500G</td><td>roztwór dopasowujący współczynnik załamania światła</td></tr><tr><td>40% akryloamid</td><td>Bio-Rad</td><td>161-0140</td><td>hydrożel</td></tr><tr><td>2% bis-akryloamid</td><td>Bio-Rad</td><td>161-0142</td><td>hydrożel</td></tr><tr><td>VA-044 inicjator</td><td>Wako Pure Chemical Industries, Ltd.</td><td>VA044</td><td></td></tr><tr><td>hydrożel Kwas borowy</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B7901</td><td>bufor oczyszczający</td></tr><tr><td>Dodecylosiarczan sodu (SDS)</td><td>Bufor oczyszczający</td> <td>Fisher</td><td>BP166-5</td></tr><tr><td>Wodorotlenek sodu</td><td>Fisher</td><td>55255-1</td><td></td></tr><tr><td>Azydek sodu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>52002-100G</td><td>Konserwant</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>X100-500G</td><td></td></tr><tr><td>Heparyna</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3393-50KU</td><td>perfuzja</td></tr><tr><td>Azotan sodu</td><td>Fisher</td><td>BP360-500</td><td>perfuzja</td></tr><tr><td>Sondy molekularne</td><td>DAPI</td><td>D1306</td><td>barwienie jądrowe</td></tr><tr><td>99,9% izofluran</td><td>Phoenix</td><td>57319-559-06</td><td>znieczulający</td></tr><tr><td>kwas hydrocholorowy</td><td></td><td></td> <td>Fisher A1445-500</td></tr><tr><td>Naczynie ze szklanym dnem</td><td>Willco</td><td>HBSB-5040</td><td>Naczynia Willco</td></tr><tr><td>Klej wielokrotnego użytku</td><td>Bostick</td><td>371351</td><td>Blu-Tack</td></tr><tr><td>Elastomer silikonowy</td><td>World Precision</td><td>Instruments KWIK-CAST Kwik-Cast</td><td></td></tr><tr><td>Niestrzępiąca się chusteczka</td><td>Kimberly-Clark</td><td>34120</td><td>KimWipe</td></tr><tr><td>Matryca mózgu myszy</td><td>Roboz</td><td>SA-2175</td><td>tkanka</td></tr> <tr><td>do cięciaOstrza matrycy</td><td>Roboz</td><td>RS-9887</td><td>sekcja tkanki</td></tr><tr><td>Pompa perystaltyczna</td><td>Cole-Parmer</td><td>77122-24</td><td>pefuzja</td></tr><tr><td>Laserowy skaningowy mikroskop konfokalny</td><td>Mikroskopia Leica</td><td>SP5</td><td></td></tr><tr><td>Oprogramowanie do obrazowania</td><td>Mikroskopia Leica</td><td>LAS AF</td><td></td></tr></tbody></table>

optyczne oczyszczanie ośrodkowego układu nerwowego myszy za pomocą pasywnego clarity

Optical Clearing of the Mouse Central Nervous System Using Passive CLARITY

Tradycyjnie, wizualizacja tkanek wymagała, aby tkanka będąca przedmiotem zainteresowania była seryjnie cięta i obrazowana, poddając każdą sekcję tkanki unikalnym nieliniowym deformacjom, co dramatycznie utrudniało zdolność do oceny morfologii, dystrybucji i łączności komórkowej w ośrodkowym układzie nerwowym (OUN). Jednak techniki oczyszczania optycznego zmieniają sposób wizualizacji tkanek. Podejścia te pozwalają na dogłębne zbadanie nienaruszonych preparatów narządowych, dostarczając ogromnego wglądu w strukturalną organizację tkanek w zdrowiu i chorobie. Techniki takie jak Clear Lipid-exchanged Acrylamide-hybridized Rigid Imaging-compatible Tissue-hYdrogel (CLARITY) osiągają ten cel poprzez zapewnienie matrycy, która wiąże ważne biomolekuły, jednocześnie umożliwiając swobodną dyfuzję lipidów rozpraszających światło. Usunięcie lipidów, a następnie dopasowanie współczynnika załamania światła, sprawia, że tkanka jest przezroczysta i łatwo obrazowana w 3 wymiarach (3D). Niemniej jednak elektroforetyczne oczyszczanie tkanek (ETC) zastosowane w pierwotnym protokole CLARITY może być trudne do skutecznego wdrożenia, a zastosowanie zastrzeżonego rozwiązania do dopasowywania współczynnika załamania światła sprawia, że rutynowe stosowanie tej techniki jest kosztowne. Raport ten demonstruje wdrożenie prostego i niedrogiego protokołu optycznego oczyszczania, który łączy pasywny CLARITY w celu poprawy integralności tkanek oraz 2,2′-tiodieetanol (TDE), wcześniej opisane rozwiązanie dopasowujące współczynnik załamania światła.

Wizualizacja organizacji strukturalnej mózgu jest kluczowa dla zrozumienia, w jaki sposób morfologia i łączność wpływają na funkcje mózgu w stanie zdrowia i choroby. Techniki utrudniania optycznego (optical clearing) umożliwiają obrazowanie populacji komórek w 3D w nienaruszonych tkankach, co pozwala na spójne badanie morfologii i łączności.
Myszy wykazujące ekspresję białek fluorescencyjnych sterowaną przez promotory specyficzn...

Techniki optycznego oczyszczania rewolucjonizują sposób wizualizacji tkanek. W tym raporcie opisujemy modyfikacje oryginalnego protokołu CLARITY (Clear, Lipid-exchanged, Engineerized Rigid Imaging-compatible Tissue-hYdrogel), który zapewnia bardziej spójne i tańsze wyniki.

Optyczne oczyszczanie ośrodkowego układu nerwowego myszy za pomocą pasywnego CLARITY

Traditionally, tissue visualization has required that the tissue of interest be serially sectioned and imaged, subjecting each tissue section to unique ...

Ogólnym celem niniejszego protokołu jest zaprezentowanie modyfikacji oryginalnego protokołu CLARITY, które pozwalają na uzyskanie bardziej spójnych i ekonomicznie korzystnych wyników. Metoda ta może pomóc w udzieleniu odpowiedzi na kluczowe pytania z zakresu neuronauki, takie jak morfologia 3D oraz łączność w ośrodkowym układzie nerwowym. Główną zaletą tej techniki jest poprawa powtarzalności procesu utrwalania optycznego oraz obrazowania mikroskopowego w ośrodkowym układzie nerwowym myszy.W sposób kosztowo efektywny i powtarzalny. Wizualna demonstracja tej metody jest kluczowa, ponieważ konstrukcja komory obrazowania jest skomplikowana i nie wynika bezpośrednio z opisu pisemnego.Należy pozyskać utrwalone w paraformaldehydzie tkanki mózgu i rdzenia kręgowego myszy wykazujących ekspresję białek fluorescencyjnych. Mózg należy podzielić na dwie połowy, umieszczając go w plastikowej matrycy do mózgu mysiego i wykonując cięcie wzdłuż linii środkowej za pomocą ostrza matrycy. Każdą półkulę oraz rdzeń kręgowy należy umieścić w oddzielnych probówkach wirówkowych o pojemności 50 ml.Każda z nich zawiera 40 mililitrów roztworu hydrożelu. Przykryć probówki folią aluminiową, aby chronić fluorof

optical-clearing-mouse-central-nervous-system-using-passive

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Mikroskopia wielofotonowa całych organów myszy jest możliwa dzięki optycznemu klarowaniu organu przed obrazowaniem, jednak nie wszystkie protokoły zachowują sygnał fluorescencyjny białek fluorescencyjnych. Stosując metodę klarowania optycznego z dehydratacją opartą na etanolu oraz klarowaniem za pomocą mieszaniny alkoholu benzylowego i benzojanu benzylowego, prezentujemy wysokorozdzielcze obrazy wielofotonowe całego mózgu myszy wykazującego ekspresję YFP.

Mikroskopia wielofotonowa oczyszczonego mózgu mysiego z ekspresją YFP

Przewlekłe nadciśnienie oczne jest wywoływane za pomocą laserowej fotokoagulacji siatki beleczkowej w oczach myszy. Ciśnienie wewnątrzgałkowe (IOP) utrzymuje się podwyższone przez kilka miesięcy po leczeniu laserowym. Spadek ostrości wzroku i wrażliwości na kontrast u zwierząt doświadczalnych monitoruje się za pomocą testu optomotorycznego.

Mysi model przewlekłego nadciśnienia ocznego indukowany laserem w celu scharakteryzowania wad wzroku

W tym artykule opisujemy pełną procedurę eksperymentalną mającą na celu zrekonstrukcję, z wysoką rozdzielczością, anatomii mózgu fluorescencyjnie znakowanych myszy. Opisany protokół obejmuje przygotowanie i oczyszczanie próbki, montaż próbki do obrazowania, przetwarzanie końcowe danych oraz wizualizację wieloskalową.

Tomografia optyczna całych mózgów myszy z rozdzielczością mikronową z konfokalną mikroskopią arkuszową światła

Projekcje nadrdzeniowe są ważne dla percepcji bólu i innych zachowań, a włókna serotoninergiczne są jednym z tych systemów włókien. Niniejsze badanie koncentrowało się na zastosowaniu połączonego protokołu CLARITY/CUBIC do rdzenia kręgowego myszy w celu zbadania zakończenia tych włókien serotoninergicznych.

Obrazowanie włókien serotoninergicznych w rdzeniu kręgowym myszy techniką CLARITY/CUBIC

Tutaj prezentujemy adaptację metody pasywnej CLARITY i rekonstrukcji 3D do wizualizacji naczyń włosowatych jajników i naczyń włosowatych pęcherzyków w nienaruszonych jajnikach myszy.

Trójwymiarowa rekonstrukcja architektury naczyniowej jajnika myszy z pasywnym czyszczeniem CLARITY

Tutaj prezentujemy protokół wywoływania paraliżu i zapalenia wzrokowo-rdzeniowego poprzez transfer limfocytów T specyficznych dla akwaporyny-4 (AQP4) z myszy AQP4-/- do myszy WT. Ponadto pokazujemy, jak wykorzystać seryjną optyczną tomografię koherentną do monitorowania dysfunkcji układu wzrokowego.

Indukcja paraliżu i uszkodzenia układu wzrokowego u myszy przez limfocyty T specyficzne dla Neuromyelitis Optica Autoantigen Aquaporin-4

Tutaj prezentujemy dwie nowatorskie metodologie, psPACT i mPACT, do osiągnięcia maksymalnej przezroczystości optycznej i późniejszej mikroskopowej analizy unaczynienia tkanek w nienaruszonym całym OUN gryzonia.

Nowatorskie metody pasywnego oczyszczania do szybkiego wytwarzania przezroczystości optycznej w całej tkance OUN

Tutaj prezentujemy protokół adaptacji metody CLARITY tkanek mózgowych do całych siatkówek, aby poprawić jakość standardowego barwienia immunohistochemicznego i obrazowania w wysokiej rozdzielczości neuronów siatkówki i ich struktur subkomórkowych.

Barwienie immunologiczne całych siatkówek metodą CLARITY Tissue Clearing

Protokół dostarcza szczegółową metodę obrazowania neuronów w wycinku mózgu za pomocą metody oczyszczania tkanki, ScaleSF. Protokół obejmuje przygotowanie tkanki mózgowej, klarowanie tkanek, postępowanie z oczyszczonymi wycinkami oraz konfokalne obrazowanie struktur neuronalnych za pomocą laserowej mikroskopii skaningowej od poziomu mezoskopowego do mikroskopowego.

Metoda oczyszczania tkanek do obrazowania neuronów ze skal mezoskopowych do mikroskopowych

Techniki oczyszczania optycznego, takie jak roztwory cząsteczek absorpcyjnych, tymczasowo zmniejszają rozpraszanie światła w celu poprawy obrazowania biologicznego i oferują biokompatybilne, odwracalne strategie obrazowania in vivo dla głęboko osadzonych narządów. Protokół ten przedstawia szczegółowe procedury eksperymentalne, a także zaawansowane przetwarzanie obrazu w celu uzyskania wysokiej jakości, dynamicznego obrazowania dynamiki w czasie rzeczywistym u żywych zwierząt.

Przejściowe oczyszczanie optyczne z wykorzystaniem cząsteczek absorpcyjnych do obrazowania ex vivo i in vivo

Poznaj zmodyfikowaną metodę CLARITY do optycznego oczyszczania ośrodkowego układu nerwowego myszy. Technika zapewnia spójne, opłacalne wyniki dla badań nad morfologią 3D i łącznością neuronalną.

Optyczne oczyszczanie ośrodkowego układu nerwowego myszy za pomocą pasywnego CLARITY

Przeglądaj więcej filmów