Optyczne oczyszczanie ośrodkowego układu nerwowego myszy za pomocą pasywnego CLARITY
30 czerwca 2016
Techniki optycznego oczyszczania rewolucjonizują sposób wizualizacji tkanek. W tym raporcie opisujemy modyfikacje oryginalnego protokołu CLARITY (Clear, Lipid-exchanged, Engineerized Rigid Imaging-compatible Tissue-hYdrogel), który zapewnia bardziej spójne i tańsze wyniki.
Ogólnym celem niniejszego protokołu jest zaprezentowanie modyfikacji oryginalnego protokołu CLARITY, które pozwalają na uzyskanie bardziej spójnych i ekonomicznie korzystnych wyników. Metoda ta może pomóc w udzieleniu odpowiedzi na kluczowe pytania z zakresu neuronauki, takie jak morfologia 3D oraz łączność w ośrodkowym układzie nerwowym. Główną zaletą tej techniki jest poprawa powtarzalności procesu utrwalania optycznego oraz obrazowania mikroskopowego w ośrodkowym układzie nerwowym myszy.
W sposób kosztowo efektywny i powtarzalny. Wizualna demonstracja tej metody jest kluczowa, ponieważ konstrukcja komory obrazowania jest skomplikowana i nie wynika bezpośrednio z opisu pisemnego.
Należy pozyskać utrwalone w paraformaldehydzie tkanki mózgu i rdzenia kręgowego myszy wykazujących ekspresję białek fluorescencyjnych. Mózg należy podzielić na dwie połowy, umieszczając go w plastikowej matrycy do mózgu mysiego i wykonując cięcie wzdłuż linii środkowej za pomocą ostrza matrycy. Każdą półkulę oraz rdzeń kręgowy należy umieścić w oddzielnych probówkach wirówkowych o pojemności 50 ml.
Każda z nich zawiera 40 mililitrów roztworu hydrożelu. Przykryć probówki folią aluminiową, aby chronić fluorofory. Następnie inkubować probówki z próbkami i hydrożelem w temperaturze czterech stopni Celsjusza przy łagodnym wstrząsaniu przez siedem dni.
Po okresie inkubacji odlej 25 mililitrów hydrożelu, pozostawiając próbkę oraz około 25 mililitrów hydrożelu w probówce wirówkowej. Następnie odgazuj próbkę, zdejmując zakrętkę, umieszczając probówkę wirówkową w naczyniu desykatora i podłączając naczynie do pompy próżniowej. Stosuj próżnię przez co najmniej 10 minut.
Delikatnie wstrząśnij, aby usunąć pęcherzyki wydzielonego tlenu. Po 10 minutach, w ciągu dwóch do trzech minut, zastąp próżnię w naczyniu deskrykatora 100% azotem. Po wyrównaniu ciśnienia i uzyskaniu możliwości otwarcia góry naczynia deskrykatora, szybko załóż korek na probówkę, aby zapobiec ponownemu dostaniu się tlenu.
Następnie spolimeryzuj hydrożel, umieszczając probówkę z próbką w kąpieli wodnej o temperaturze 37 °C przez trzy godziny, aż do całkowitego przeprowadzenia polimeryzacji. Po trzech godzinach spolimeryzowany hydrożel uzyska konsystencję żelu. Użyj szpatułki, aby wyjąć spolimeryzowaną próbkę z probówki do wirowania, a następnie odetnij nadmiar hydrożelu z próbki.
Na koniec usuń pozostały hydrożel, kładąc próbkę na chusteczce beztkaninowej i delikatnie pocierając oraz przetaczając na niej tkankę, tak aby na próbce pozostała jedynie cienka warstwa spolimeryzowanego hydrożelu. Aby rozpocząć proces usuwania lipidów, przenieś spolimeryzowaną próbkę do czystej probówki wirówkowej o pojemności 50 milliliter zawierającej 45 milliliters buforu przejrzystego i inkubuj w temperaturze 45 degrees celsius przy delikatnym wstrząsaniu przez siedem dni. Wymieniaj bufor codziennie podczas tego początkowego siedmiodniowego okresu, wylewając zużyty bufor przejrzysty do pojemnika na odpady chemiczne.
Następnie dodaje się 45 mililitrów świeżego buforu do przejrzystania. Gdy wszystkie lipidy zostaną solubilizowane, a tkanka stanie się przejrzysta, próbkę przenosi się do nowej probówki do wirowania o pojemności 50 mililitrów wypełnionej 45 mililitrami PBST i przemywa czterokrotnie w temperaturze 40 °C przy delikatnym wstrząsaniu w ciągu kolejnych 24 godzin, aby usunąć pozostałości SDS. Po ostatnim przemyciu w PBST próbkę przenosi się do czystej probówki do wirowania o pojemności 15 mililitrów wypełnionej roztworem DAPI o stężeniu 1 µg/mL w 1xPBST.
Owiń folią i inkubuj w temperaturze pokojowej przez 24 godziny. Następnego dnia przemyj trzy razy w PBST w temperaturze pokojowej, przez co najmniej sześć godzin na każde mycie. Następnie przejdź do dopasowania współczynnika załamania światła.
Aby rozpocząć tę część procedury, przenieś próbkę do czystej probówki wirówkowej o pojemności 15 mililitrów wypełnionej 2-2 thiodiethanol oraz 1xPBS o pH 7,5 i inkubuj zgodnie z instrukcją wyświetloną na ekranie. Pod koniec drugiej inkubacji przygotuj komorę obrazowania, zwijając kawałek wielorazowej taśmy klejącej w cylinder o jednorodnej średnicy nieco większej niż grubość próbki. Umieść cylinder w formie otwartego okręgu na szkiełku przedmiotowym o średnicy 40 mililitrów z dnem szklanym.
Następnie za pomocą końcówki pipety P1000 należy stworzyć uszczelnienie między wielorazowym klejem a szkłem, przesuwając ją wzdłuż zewnętrznej krawędzi cylindra. Nanieść około 100 µL 63% TDE na szalkę szklaną i rozprowadzić płyn tak, aby pokrył powierzchnię szkła wewnątrz okręgu z wielorazowego kleju. Następnie za pomocą szpatułki ostrożnie umieścić próbkę na środku okręgu, dbając o to, aby nie powstały pęcherzyki powietrza.
Następnie nanieś pipetą kolejne 100 µL 63% TDE bezpośrednio na próbkę i niezwłocznie połóż 40 mm okrągłe szkiełko nakrywkowe na wielorazowym kleju. Używając palca wskazującego, środkowego i pierścieniegowej obu rąk, ostrożnie dociśnij krawędź koła, aż szkiełko nakrywkowe zetknie się z próbką. Teraz powoli ustaw naczynie z szklanego dna w pozycji pionowej, opierając je o powierzchnię, a następnie dodaj pipetą 63% TDE, aż roztwór osiągnie niewielki otwór na górze.
Użyj ściereczki niepozostawiającej włókien, aby osuszyć końcówkę pipety, tak aby roztwór nie kapał na szkło. Na koniec dodaj elastomer silikonowy do niewielkiego otworu, aby zamknąć okrąg i stworzyć zamkniętą komorę. Odczekaj pięć minut do wyschnięcia, a następnie przystąp do obrazowania.
Umieść komorę obrazującą z próbką na stoliku skaningowego konfokalnego mikroskopu laserowego. Otwórz oprogramowanie do obrazowania; aby włączyć argonowy laser wzbudzający, kliknij kartę konfiguracji (configuration) w górnej części programu, a następnie ikonę lasera. Zaznacz pole obok napisu argon, aby zasilić laser, i przesuń suwak do wartości 30%. Powróć do karty akwizycji (acquire) w górnej części ekranu.
W polu ustawień ścieżki wiązki przejdź do sekcji ładowania i zapisywania ustawień, a następnie rozwiń menu, aby wybrać odpowiedni kanał długości fali do emisji YFP. W polu ustawień kanału wybierz odpowiednie obiektywy do obrazowania, klikając czerwony hiperłącze z etykietą objective current object. Używaj obiektywów o dystansie roboczym większym niż grubość tkanki.
oraz duża apertura numeryczna, aby zmaksymalizować rozdzielczość obrazu w płaszczyźnie i zminimalizować grubość przekroju optycznego. W lewej kolumnie menu rozwijanego otwórz okno rozdzielczości XY, aby ustawić macierz akwizycji, zwaną formatem, na 1024x1024 lub wartość odpowiednią dla granicy rozdzielczości bocznej obiektywu. Ustaw współczynnik powiększenia (zoom) na możliwie najniższą wartość.
Użyto wartości 1,7. W tym samym oknie, rozwijając odpowiednio poszczególne menu, ustawiono parametry średniej z ośmiu linii oraz średniej z jednej klatki. Zlokalizowano próbkę za pomocą sterowników stolika.
Po uzyskaniu widocznego, reprezentatywnego pola widzenia, ustaw wzmocnienie (gain) w zakresie od 760 do 780 oraz offset w zakresie od 1,0 do 1,5 dla YFP. Wybierz skanowanie kafelkowe (tile scan), a następnie ustaw górną i dolną granicę zakresu stosu Z, który ma zostać zarejestrowany.
Ustaw grubość przekroju optycznego w oparciu o granicę rozdzielczości przekroju optycznego obiektywu, a następnie rozpocznij akwizycję. Na tym obrazie przedstawiono neurony wykazujące pozytywną ekspresję YFP w korze mózgu i hipokampie, obrazowane przy 5-krotnym powiększeniu i zrekonstruowane w 3D. Pasek skali odpowiada jednemu milimetrowi.
Ta projekcja maksymalnej intensywności stosu 10 obrazów kory mózgowej obrazuje arboryzację dendrytyczną neuronów piramidowych piątej warstwy kory. Pasek skali reprezentuje tutaj 100 mikronów. Przedstawiono tutaj ekspresję THY-1YFP w nienarusznym rdzeniu kręgowym odcinka szyjnego i piersiowego, obrazowanym przy powiększeniu 5x i zrekonstruowanym w 3D.
Pasek skali reprezentuje dwa milimetry. Na koniec ta projekcja maksymalnej intensywności stosu obrazów rdzenia kręgowego wykonanych przy powiększeniu 10x obrazuje pojedyncze aksony, paski skali reprezentują 100 mikronów. Jeśli technika zostanie przeprowadzona prawidłowo, proces ten może potrwać od dwóch do czterech tygodni w przypadku całych rdzeni kręgowych oraz od czterech do sześciu tygodni w przypadku mózgów po hemisekcji.
Po zastosowaniu tej procedury można przeprowadzić inne metody, takie jak immunohistochemia, w celu udzielenia odpowiedzi na pytania wymagające bardziej złożonego fenotypowania biochemicznego. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze rozumieć sposób optycznego wyjaśniania i obrazowania ośrodkowego układu nerwowego myszy przy użyciu metody passive clarity oraz mikroskopii konfokalnej laserowej.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejszy raport omawia modyfikacje oryginalnego protokołu CLARITY, które zwiększają powtarzalność i efektywność kosztową technik utleniania optycznego. Udoskonalenia te są kluczowe dla wizualizacji tkanek w badaniach z zakresu neuronauki.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neuronauka
- Obrazowanie optyczne
- Techniki utrudniania tkanki
Wstęp
- Techniki utrwalania optycznego poprawiają wizualizację tkanek.
- Protokół CLARITY jest powszechnie stosowany w obrazowaniu w neuronauce.
- Modyfikacje mają na celu zwiększenie powtarzalności i obniżenie kosztów.
- Demonstracje wizualne są niezbędne do zrozumienia złożonych metod.
Cel badania
- W celu zademonstrowania modyfikacji protokołu CLARITY.
- W celu uzyskania bardziej spójnych wyników w procesie utrudniania optycznego.
- W celu zapewnienia kosztowo efektywnej metody dla badań z zakresu neuronauki.
Zastosowane metody
- Modyfikacje oryginalnego protokołu CLARITY.
- Pokazy wizualne konstrukcji komory obrazowania.
- Zastosowanie w ośrodkowym układzie nerwowym myszy.
- Koncentracja na analizie morfologii 3D i łączności.
Główne wyniki
- Poprawiona spójność procesu utrudniania optycznego.
- Kostektywna metodologia dla badaczy.
- Ulepszone możliwości obrazowania w neuronauce.
- Pomoce wizualne zapewnione dla złożonych procedur.
Wnioski
- Modyfikacje protokołu CLARITY są korzystne.
- Spójne wyniki mogą przyczynić się do rozwoju badań nad neuronauką.
- Demonstracje wizualne pomagają w zrozumieniu złożonych metod.
Najczęściej Zadawane Pytania
Znaczenie dla przemysłu
Techniki utrwalania optycznego, takie jak pasywna metoda CLARITY, umożliwiają trójwymiarową wizualizację nienaruszonej tkanki nerwowej, rozwiązując kluczowy problem w procesie walidacji celów w neuronauce, gdzie seryjne cięcie wprowadza artefakty utrudniające analizę morfologiczną i łączność synaptyczną. Dzięki poprawie spójności i redukcji kosztów, metoda ta wspiera wiarygodne modelowanie przedkliniczne zaburzeń OUN, zwiększając pewność prognostyczną we wczesnych etapach odkrywania leków. Podejście to ułatwia minimalizację ryzyka mechanistycznego, umożliwiając bezpośrednią obserwację fenotypów strukturalnych w systemach istotnych dla danej choroby bez artefaktów wynikających z deformacji tkanki.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Wartość naukowa: Umożliwia weryfikację hipotez terapeutycznych poprzez analizę nienaruszonej morfologii 3D i łączności w OUN myszy.
- Wartość operacyjna: Zmniejsza ryzyko biologiczne poprzez zachowanie integralności tkanki przy jednoczesnym usunięciu rozpraszających światło lipidów w celu uzyskania wyraźnych obrazów.
- Wartość prognostyczna: Wspiera selekcję projektów w portfolio poprzez generowanie ilościowych danych strukturalnych dotyczących sieci neuronalnych na potrzeby walidacji celu.
Przesiewanie i opracowywanie testów
- Gotowość do analizy: Przygotowuje zwalidowane systemy biologiczne do dalszych etapów pracy poprzez uczynienie tkanki przezroczystą i podatną na obrazowanie o wysokiej rozdzielczości.
- Powtarzalność: Rozwiązuje problem standaryzacji analizy dzięki pasywnym modyfikacjom metody CLARITY, które poprawiają spójność efektów utrudniania (clearing).
- Ponowne wykorzystanie platformy: Umożliwia skalowalną ocenę związków poprzez tworzenie wielokrotnego użytku komór obrazujących, kompatybilnych z konfokalną mikroskopią skaningową.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Znaczenie dla diagnostyki chorób: Wspiera dopasowanie biomarkerów translacyjnych, umożliwiając podłużne obrazowanie zmian strukturalnych w nienaruszonych modelach rdzenia kręgowego i mózgu.
- Ciągłość przedkliniczna: Łączy etap odkryć z walidacją przedkliniczną, dostarczając trójwymiarowych odczytów strukturalnych przydatnych w badaniach nad progresją choroby.
- Decyzje w oparciu o analizę ryzyka: Ułatwia podejmowanie decyzji o dalszym rozwoju badań poprzez dostarczanie jasnych danych dotyczących morfologii aksonów i dendrytów w celu redukcji ryzyka mechanistycznego.
Integracja rurociągu i przepływu pracy
Metoda ta integruje się z kontinuum badawczym od wczesnej fazy odkrywania (Early Discovery), poprzez identyfikację wiodących związków (Lead Identification), aż po prace przedkliniczne, wspierając w szczególności testowanie hipotez i wyjaśnianie szlaków w procesie walidacji celów w ośrodkowym układzie nerwowym (CNS).
- Biologia odkrywcza: Wspiera testowanie hipotez, umożliwiając obrazowanie 3D morfologii i łączności neuronalnej w nienaruszonych tkankach OUN myszy.
- Przesiewanie: Opisuje gotowość testu poprzez uzyskanie przejrzystości tkanki dzięki usuwaniu lipidów i dopasowaniu współczynnika załamania światła za pomocą TDE.
- Analityka: Wyróżnia wyniki ilościowe, takie jak rekonstrukcja 3D neuronów wykazujących pozytywną ekspresję YFP, arboryzacja dendrytów oraz śledzenie aksonów w celu analizy porównawczej warunków.
- Badania translacyjne: Łączy z ciągłością przedkliniczną, dostarczając strukturalnych biomarkerów w modelach OUN istotnych dla danej choroby, bez artefaktów związanych z sekcjonowaniem.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Przedstawia technikę jako możliwość wielokrotnego zastosowania dzięki konstrukcji trwałej komory obrazowania z wykorzystaniem wielorazowego kleju i naczyń z szklanym dnem.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorstwa
- Wartość naukowa: Zwiększenie pewności predykcyjnej dzięki ograniczeniu niejednoznaczności mechanistycznej w analizie strukturalnej OUN.
- Wartość operacyjna: Standaryzacja i powtarzalność dzięki modyfikacjom pasywnego protokołu CLARITY, które eliminują zmienność elektroforetyczną.
- Wartość strategiczna: Lepsze decyzje typu go/no-go dzięki dostarczeniu wiarygodnych danych strukturalnych 3D w celu redukcji ryzyka biologicznego na późnych etapach programów OUN.
- Wpływ na portfolio: Priorytetyzacja skorygowana o ryzyko poprzez ilościowe obrazowanie sieci neuronalnych w celu walidacji celów.
Wskazówki dotyczące wdrożenia
- Wymagana jest wiedza specjalistyczna z zakresu histologii, polimeryzacji hydrożeli oraz technik klarowania lipidów.
- Niezbędne jest oprzyrządowanie, w tym probówki do wirówek, łaźnie wodne, desykatory próżniowe oraz konfokalne mikroskopy skaningowe.
- Wymagana jest standaryzacja międzyzespołowa w zakresie wymiany buforu, etapów przemywania oraz procedur dopasowania współczynnika załamania światła.
- Należy uwzględnić kwestie adaptacyjne w zależności od systemów modelowych, ponieważ czas trwania procesu różni się i wynosi od 2-4 tygodni dla rdzeni kręgowych do 4-6 tygodni dla półprzeciętych mózgów.
- Ograniczenia praktyczne obejmują konieczność ekspresji białek fluorescencyjnych lub zastosowania immunobarwienia w celu wizualizacji oraz ostrożną manipulację, aby uniknąć powstawania pęcherzyków powietrza podczas przygotowania komory obrazowania.
