Optyczne oczyszczanie ośrodkowego układu nerwowego myszy za pomocą pasywnego CLARITY

Ogólnym celem tego protokołu jest zademonstrowanie modyfikacji oryginalnego protokołu CLARITY, które dają bardziej spójne i opłacalne wyniki. Ta metoda może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w neurobiologii, takie jak morfologia 3D i łączność w ośrodkowym układzie nerwowym. Główną zaletą tej techniki jest to, że poprawia ona spójność oczyszczania optycznego i mikroskopii w ośrodkowym układzie nerwowym myszy.

W sposób opłacalny i powtarzalny. Wizualna demonstracja tej metody ma kluczowe znaczenie. Ponieważ konstrukcja komory obrazowania jest skomplikowana i nie jest łatwo oczywista z pisemnego opisu.

Uzyskaj tkankę mózgu i rdzenia kręgowego utrwaloną paraformaldehydem od myszy wykazujących ekspresję białek fluorescencyjnych. Hemisekcję mózgu, umieszczając go w plastikowej matrycy mózgu myszy i przecinając wzdłuż linii środkowej za pomocą ostrza matrycy. Dodaj każdą półkulę i rdzeń kręgowy do oddzielnych 50-mililitrowych probówek wirówkowych.

Każdy zawiera 40 mililitrów roztworu hydrożelu. Przykryj probówki folią aluminiową, aby chronić fluorofory. I inkubować probówki zawierające próbki i hydrożel w temperaturze czterech stopni Celsjusza, delikatnie wstrząsając przez siedem dni.

Po okresie inkubacji wyrzucić 25 mililitrów hydrożelu pozostawiając próbkę i około 25 mililitrów hydrożelu w probówce wirówkowej. Następnie odtlenić próbkę, zdejmując nakrętkę, umieszczając probówkę wirówkową w słoiku eksykatora i podłączając słoik do próżni. Zastosuj próżnię na co najmniej 10 minut.

Delikatnie wstrząśnij, aby usunąć pęcherzyki emitowanego tlenu. Po 10 minutach wymień próżnię w słoiku eksykatora na 100% azot w ciągu dwóch do trzech minut. Gdy ciśnienie się wyrówna i będzie można otworzyć górną część słoika eksykatora, szybko zakryj rurkę, aby zapobiec ponownemu wprowadzeniu tlenu.

Następnie polimeryzuj hydrożel, umieszczając probówkę z próbką w łaźni wodnej o temperaturze 37 stopni Celsjusza na trzy godziny, aż do zakończenia polimeryzacji. Po trzech godzinach spolimeryzowany hydrożel nabierze konsystencji przypominającej żel. Za pomocą szpatułki usuń spolimeryzowaną próbkę z probówki wirówkowej, a następnie odetnij nadmiar hydrożelu z próbki.

Na koniec usuń pozostały hydrożel, umieszczając próbkę na niestrzępiącej się chusteczce i delikatnie pocierając i tocząc po niej chusteczkę, pozostawiając na próbce tylko cienką warstwę spolimeryzowanego hydrożelu. Aby rozpocząć proces usuwania lipidów, przenieś spolimeryzowaną próbkę do czystej 50-mililitrowej probówki wirówkowej z 45 mililitrami buforu klarującego i inkubuj w temperaturze 45 stopni Celsjusza z delikatnym wstrząsaniem przez siedem dni. Zmieniaj bufor codziennie w ciągu tego początkowego siedmiodniowego okresu, wylewając zużyty bufor czyszczący do pojemnika na odpady chemiczne.

I dodanie 45 mililitrów świeżego buforu czyszczącego. Gdy wszystkie lipidy zostaną rozpuszczone, a tkanka osiągnie przezroczystość, przenieś próbkę do nowej 50-mililitrowej probówki wirówkowej wypełnionej 45 mililitrami PBST i przemyj cztery razy w temperaturze 40 stopni Celsjusza z delikatnym wstrząsem przez następne 24 godziny, aby usunąć pozostałości SDS. Po końcowym płukaniu PBST przenieść próbkę do czystej 15-mililitrowej probówki wirówkowej wypełnionej jednym mikrogramem na mililitr DAPI i 1xPBST.

Owinąć folią i inkubować w temperaturze pokojowej przez 24 godziny. Następnego dnia umyj trzy razy w PBST w temperaturze pokojowej przez co najmniej sześć godzin na pranie. A następnie przejdź do dopasowania współczynnika załamania światła.

Aby rozpocząć tę część procedury, przenieś próbkę do czystej 15-mililitrowej probówki wirówkowej wypełnionej 2-2 tiodieetanolem i 1xPBS o pH 7,5 i inkubuj, jak pokazano na ekranie. Pod koniec drugiej inkubacji należy utworzyć komorę obrazowania, zwijając kawałek kleju wielokrotnego użytku do cylindra o jednolitej średnicy nieco większej niż grubość próbki. Połóż cylinder w otwartym okręgu na 40-milimetrowym szklanym naczyniu.

Następnie użyj końcówki do pipety P1000, aby utworzyć uszczelnienie między klejem wielokrotnego użytku a szkłem, owijając go wokół zewnętrznej krawędzi cylindra. Odpipetuj około 100 mikrolitrów 63% TDE na szklane naczynie i rozprowadź je dookoła, aby pokryć szklaną powierzchnię w kręgu kleju wielokrotnego użytku. Następnie za pomocą szpatułki ostrożnie umieść próbkę na środku koła, uważając, aby nie tworzyć pęcherzyków.

Następnie odpipetuj kolejne 100 mikrolitrów 63% TDE bezpośrednio na próbkę i natychmiast umieść 40-milimetrową okrągłą szklankę pokrywową na kleju wielokrotnego użytku. Użyj palca wskazującego, środkowego i serdecznego obu rąk, aby ostrożnie docisnąć obwód koła, aż szkło nakrywkowe zetknie się z sample. Teraz powoli ustaw szklane naczynie dolne w pozycji pionowej, opierając się o powierzchnię, a następnie dodaj 63% TDE za pomocą pipety, aż roztwór dotrze do małego otworu u góry.

Użyj niestrzępiącej się chusteczki, aby osuszyć końcówkę pipety, aby roztwór nie kapał na szkło. Na koniec dodaj elastomer silikonowy do małego otworu, aby zamknąć okrąg i utworzyć zamkniętą komorę. Odczekaj pięć minut do wyschnięcia, a następnie przystąp do obrazowania.

Umieść komorę obrazowania z próbką w środku na stoliku laserowego skaningowego mikroskopu konfokalnego. Otwórz oprogramowanie do obrazowania, aby włączyć laser wzbudzający argon, kliknij zakładkę konfiguracji u góry programu, a następnie ikonę lasera. Zaznacz pole obok argonu, aby zasilić laser i przesuń skalę slajdów na 30%Wróć do zakładki pobierania u góry.

W polu ustawień ścieżki wiązki przejdź do pola ustawień oszczędzania obciążenia i wybierz menu rozwijane, aby wybrać odpowiedni kanał długości fali, który ma emitować YFP. W polu ustawień kanału wybierz odpowiednie cele do obrazowania, klikając czerwone hiperłącze oznaczone jako bieżący obiekt celu. Używaj obiektywów, w których odległość robocza jest większa niż grubość tkanki.

Duży otwór numeryczny zapewnia maksymalną rozdzielczość obrazu w płaszczyźnie i minimalizuje grubość przekroju optycznego. W lewej kolumnie rozwijanych menu otwórz okno Rozdzielczość XY, aby ustawić macierz akwizycji, zwaną formatem na 1024x1024 lub wartość odpowiednią dla limitu rozdzielczości bocznej celu. Ustaw współczynnik powiększenia tak nisko, jak to możliwe.

W tym miejscu używany jest 1.7. W tym samym oknie ustaw parametry średniej z ósmej linii i średniej z jednej klatki, odpowiednio rozwijając indywidualnie oznaczone menu. Zlokalizuj próbkę za pomocą elementów sterujących stolika.

Gdy reprezentatywne pole jest widoczne, ustaw wzmocnienie z zakresu od 760 do 780, a przesunięcie na zakres od 1,0 do 1,5 dla YFP. Wybierz opcję skanowania kafelków. A następnie ustaw górne i dolne limity stosu Z, który ma zostać uzyskany.

Ustaw grubość przekroju optycznego w oparciu o limit rozdzielczości przekroju optycznego obiektywu, a następnie rozpocznij akwizycję. Ten obraz pokazuje neurony YFP dodatnie w korze mózgowej i hipokampie, zobrazowane w 5-krotnym powiększeniu i zrekonstruowane w 3D. Pasek skali reprezentuje jeden milimetr.

Ta projekcja maksymalnej intensywności 10-krotnego stosu obrazów kory mózgowej demonstruje dendrytyczną aboryzację warstwy korowej pięciu neuronów piramidowych. Tutaj pasek skali reprezentuje 100 mikronów. Tutaj ekspresja THY-1YFP jest pokazana w nienaruszonym rdzeniu kręgowym w odcinku szyjnym i piersiowym, zobrazowanym w 5-krotnym powiększeniu i zrekonstruowanym w 3D.

Pasek skali reprezentuje dwa milimetry. Wreszcie ta projekcja maksymalnej intensywności 10-krotnie zobrazowanego stosu rdzenia kręgowego pokazuje poszczególne aksony, paski skali reprezentują 100 mikronów. Przy prawidłowym uformowaniu technikę tę można wykonać w ciągu dwóch do czterech tygodni w przypadku całych rdzeni kręgowych i od czterech do sześciu tygodni w przypadku mózgów poddanych hemisekcji.

Zgodnie z tą procedurą można zastosować inne metody, takie jak chemia immunologiczna, aby odpowiedzieć na pytania, które wymagają bardziej złożonego fenotypowania biochemicznego. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak optycznie oczyścić i zobrazować ośrodkowy układ nerwowy myszy. Korzystanie z pasywnej klarowności i laserowej mikroskopii konfokalnej.