Name: Metoda oczyszczania tkanek do obrazowania neuronów ze skal mezoskopowych do mikroskopowych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-05-10T16:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 20 s
Description: Poznaj metodę ScaleSF do oczyszczania tkanek mózgu myszy w celu obrazowania struktur neuronowych z zachowaniem fluorescencji. Technika umożliwia szczegółową wizualizację obwodów i komponentów nerwowych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy dziękują Yoko Ishida (Uniwersytet Juntendo) za produkcję wektorów AAV oraz Kisara Hoshino (Uniwersytet Juntendo) za pomoc techniczną. Badanie to było wspierane przez JSPS KAKENHI (JP20K07231 do K.Y.; JP21H03529 do T.F.; JP20K07743 do M.K.; JP21H02592 do Jego Wysokości) oraz Badania Naukowe w Obszarze Innowacyjnym "Resonance Bio" (JP18H04743 do H.H.). Badanie to było również wspierane przez Japońską Agencję Badań i Rozwoju Medycznego (AMED) (JP21dm0207112 do TF i H.H.), Moonshot R&D z Japońskiej Agencji Nauki i Technologii (JST) (JPMJMS2024 do H.H.), Fusion Oriented Research for disruptive Science and Technology (FOREST) z JST (JPMJFR204D do H.H.), Grants-in-Aid z Instytutu Badawczego Chorób Wieku Podeszłego w Juntendo University School of Medicine (X2016 do K.Y.; X2001 do H.H.) oraz Private School Branding Project.

Wszystkie eksperymenty zostały zatwierdzone przez Instytucjonalne Komitety ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt Uniwersytetu Juntendo (Zatwierdzenie nr 2021245, 2021246) i przeprowadzone zgodnie z Podstawowymi Wytycznymi Prawidłowego Prowadzenia Eksperymentów na Zwierzętach przez Radę Naukową Japonii (2006). W tym przypadku użyto samców myszy C57BL / 6J, którym wstrzyknięto wektor AAV przenoszący gen wzmocnionego białka zielonej fluorescencji (EGFP) i parwalbuminy (PV) / mirystoylacji-EGFP-receptora lipoproteiny o niskiej gęstości C-końcowy sztuczny chromosom bakteryjny (BAC) myszy transgeniczne (myszy PV-FGL)<klasa sup = "xref">9. Myszy PV-FGL utrzymywano w tle C57BL/6J. W odniesieniu do tego badania nie stwierdzono różnic ze względu na płeć.
1. Przygotowanie tkanek
<ol>
	<li>Utrwalanie perfuzji 
	UWAGA: Wykonaj kroki od 1.1.1 do 1.1.3 pod wyciągiem, aby ograniczyć narażenie na paraformaldehyd (PFA).
	<ol>
		<li>Znieczulenie dorosłych samców myszy (w wieku 8–16 tygodni) przez dootrzewnowe wstrzyknięcie przedawkowania pentobarbitalu sodu (200 mg/kg). Potwierdź adekwatność znieczulenia poprzez brak wycofania szczypania palców u nóg i odruchów mrugania oczami.</li>
		<li>Otwórz klatkę piersiową i odetnij prawy uszek przedsionkowy nożyczkami chirurgicznymi. Przeprowadź fuzję myszy z 20 ml lodowatego buforu fosforanowego soli fizjologicznej (PBS) za pomocą igły 23 G przymocowanej do strzykawki o pojemności 20 ml, a następnie perfuzję 20 ml lodowatego 4% PFA w 0,1 M buforze fosforanowym (PB) za pomocą innej strzykawki o pojemności 20 ml. 
		UWAGA: PFA jest toksyczny i teratogenny. Unikać wdychania lub kontaktu ze skórą, oczami i błonami śluzowymi.</li>
		<li>Usuń tkanki mózgowe z czaszki za pomocą pęsety. Przenieś tkanki mózgowe do probówki o pojemności 15 ml zawierającej 4% PFA w 0,1 M PB, chroń próbki przed światłem i delikatnie kołysz przez noc w temperaturze 4 °C na wytrząsarce z prędkością 50–100 obr./min.</li>
		<li>UWAGA: Pobrane tkanki mózgowe mogą być przechowywane przez kilka tygodni w 0,02% azydku sodu (NaN3) w PBS w temperaturze 4 °C. 
		UWAGA: NaN3 jest toksyczny. Unikać wdychania lub kontaktu ze skórą, oczami i błonami śluzowymi. Przenoś go w dygestorium.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotowanie plastra mózgu
	<ol>
		<li>Przygotuj 4% agar w PBS, dodając 2 g agaru do 50 ml PBS. Podgrzewaj mieszaninę w kuchence mikrofalowej, aż agar całkowicie się rozpuści. Pozostawić roztwór do ostygnięcia do temperatury 40-45 °C. 
		UWAGA: Lepkość zapewniana przez agaropektynę, główny składnik agaru, ułatwia krojenie plastrów tkanki.</li>
		<li>Dodaj 10 ml roztworu agaru do 6-dołkowej płytki hodowlanej. Zanurz tkankę mózgową w roztworze agaru za pomocą kleszczy. Niech agar zastygnie na lodzie.</li>
		<li>Usuń osadzoną tkankę mózgową ze studzienki i przytnij agar żyletką. Przymocuj blok agaru do dna kąpieli wibratomicznej za pomocą kleju superglue i wlej 0,1 M PB do tacki buforowej.</li>
		<li>Wyczyść inną żyletkę za pomocą niestrzępiącej się bibułki nasączonej etanolem i przymocuj ostrze do uchwytu ostrza wibrującej krajalnicy do chusteczek.</li>
		<li>Ustaw prędkość cięcia na 0,14 mm/s o amplitudzie 1,4 mm i częstotliwości na 75–77 Hz. Pokrój tkankę mózgową na plastry o grubości 1 mm i zbierz je na 6-dołkowej płytce do hodowli komórkowej zawierającej PBS. 
		UWAGA: Plastry mózgu można przechowywać przez kilka tygodni w 0,02% NaN3 w PBS w temperaturze 4 °C.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Oczyszczanie tkanek
UWAGA: Składy stosowanych rozwiązań ScaleS są wymienione w Tabeli 1. Próbki należy chronić przed światłem poprzez przykrycie folią. Kroki czyszczenia pokazano na rysunku 1A.
<ol>
	<li>Dodać 8 ml roztworu ScaleS0 do jednego dołka 6-dołkowej płytki do hodowli komórkowej i dodać 8 ml roztworu ScaleS4 do innego dołka na płytce i wstępnie ogrzać do 37 °C w inkubatorze.</li>
	<li>Przenieść wycinki mózgu do wstępnie ogrzanego roztworu ScaleS0 za pomocą szpatułki i inkubować przez 2 godziny w temperaturze 37 °C w inkubatorze z wytrząsaniem przy 90 obr./min.</li>
	<li>Przenieś przepuszczalne plastry mózgu w 8 ml PBS(–) na 6-dołkową płytkę do hodowli komórkowej za pomocą szpatułki i myj przez 15 minut, trzymając w wytrząsarce orbitalnej przy 40–60 obr./min. Powtórz to dwa razy.</li>
	<li>Przenieść wycinki mózgu do wstępnie ogrzanych 8 ml roztworu ScaleS4 za pomocą szpatułki i oczyścić je przez inkubację w inkubatorze z wytrząsaniem przy 90 obr./min przez 8–12 godzin w temperaturze 37 °C. Oczyszczone wycinki mózgu można zobaczyć na rycinie 1.</li>
</ol>
3. Montaż plasterków mózgu
UWAGA: Konfigurowalna komora obrazowania służy do niezawodnego montażu oczyszczonych wycinków mózgu (Rysunek 2)6. Komora składa się z ramy komory i dolnego szkiełka nakrywkowego. Adaptery stolików mikroskopowych są również przeznaczone do bezpośredniego montażu komory obrazowania na stolikach mikroskopu (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 2A, B). Rama komory i adaptery stolików mikroskopowych mogą być drukowane w 3D przy użyciu własnych lub zewnętrznych usług druku 3D. Dane 3D projektowania wspomaganego komputerowo (CAD) komory obrazowania są dostępne w Furuta et al. 20226.
<ol>
	<li>W celu przygotowania studzienki przymocuj ramę studzienki do szkiełka nakrywkowego za pomocą kleju samoprzylepnego.</li>
	<li>Przygotować 1,5% agarozy w roztworze ScaleS4D25(0) (żel ScaleS4), dodając 1,5 g agarozy do 100 ml roztworu w butelce. Dobrze wymieszaj roztwór, mieszając i podgrzewaj roztwór w kuchence mikrofalowej, aż agaroza całkowicie się rozpuści. Po zakończeniu odczekać, aż roztwór ostygnie do temperatury 37 °C.</li>
	<li>Zamontuj oczyszczony wycinek mózgu na dolnym szkiełku nakrywkowym komory obrazowania za pomocą szpatułki. Zetrzyj nadmiar roztworu z oczyszczonego plastra za pomocą czystej, niestrzępiącej się bibuły.</li>
	<li>Nałóż żel ScaleS4 na wycinek mózgu za pomocą mikropipety, aby napełnić komorę obrazowania. Umieść kolejne szkiełko nakrywkowe na wierzchu za pomocą kleszczy i umieść kawałek niestrzępiącej się bibuły i szkiełko na szkiełku nakrywkowym w tej kolejności.</li>
	<li>Przenieść komorę obrazowania do lodówki o temperaturze 4 °C. Umieścić metalowe ciężarki na szkiełku podstawowym i pozostawić je na 30 minut.</li>
	<li>Wyjmij metalowe ciężarki, szkiełko podstawowe, niestrzępiącą się bibułkę i szkiełko nakrywkowe z komory obrazowania i zetrzyj nadmiar żelu (Rysunek 2A,B).</li>
	<li>Umieścić komorę obrazowania na szklanej szalce Petriego o średnicy 60 mm i przymocować krawędź komory obrazowania do naczynia za pomocą kleju samoprzylepnego przypominającego szpachlę. Przymocuj komorę w wielu punktach do szalki Petriego.</li>
	<li>Wlać roztwór ScaleS4 do naczynia i delikatnie wstrząsać przez 1 godzinę w temperaturze 20-25 °C na wytrząsarce orbitalnej z prędkością 40-60 obr./min. Zastąp świeżym roztworem i usuń pęcherzyki powietrza z powierzchni żelu, delikatnie zeskrobując powierzchnię za pomocą końcówki do pipety o pojemności 200 μl. Zamontuj zanurzoną komorę obrazowania na stoliku mikroskopu (<silna klasa = "xfig" > Rysunek 2C).</li>
</ol>
4. Obrazowanie CLSM
<ol>
	<li>Uzyskuj obrazy za pomocą CLSM wyposażonego w soczewkę obiektywową z wieloma zanurzeniami o dużej odległości roboczej (WD) (apertura numeryczna 16x/0,60 [NA], WD = 2,5 mm). 
	UWAGA: Soczewki obiektywowe o wysokiej NA mogą zapewniać wysoką rozdzielczość ograniczoną dyfrakcją.</li>
	<li>Włącz wszystkie odpowiednie urządzenia do obrazowania (stację roboczą, mikroskop, skaner, lasery i lampę rtęciową) i uruchom oprogramowanie do obrazowania CLSM.</li>
	<li>Ustaw kołnierz korekcyjny soczewki obiektywu multiimmersyjnego na 1,47. Roztwór ScaleS4 ma współczynnik załamania światła (RI) około 1,475,7. Aberracje wywołane niedopasowaniem RI mogą zakłócać tworzenie się obrazu (<silna klasa="xfig">Rysunek 3).</li>
	<li>Zanurz soczewkę obiektywu w roztworze i pozwól jej powoli zbliżać się do plasterka. Usuń wszelkie pęcherzyki powietrza uwięzione na końcówce soczewki obiektywu. Znajdź obszary zainteresowania (ROI) w oczyszczonych tkankach za pomocą epifluorescencji.</li>
	<li>Ustaw parametry akwizycji obrazu, testując odpowiednie ustawienia.
	<ol>
		<li>Określ głębię bitową dla akwizycji obrazu. Rozmiar danych obrazu zwiększa się wraz z głębią bitową.</li>
		<li>Ustaw długość fali wykrywania. Dostosuj odpowiednią bramkę dla detektora zgodnie z widmem emisji. Upewnij się, że długość fali wykrywania nie obejmuje żadnych linii laserowych.</li>
		<li>Ustaw rozdzielczość xy. Większe formaty zapewniają lepsze rozdzielczości xy, ale zbieranie obrazów zajmuje więcej czasu.</li>
		<li>Ustaw szybkość skanowania. Wolniejsza prędkość skanowania zapewnia wysoki stosunek sygnału do szumu. Zwiększa to jednak również czas przebywania pikseli i ryzyko fotowybielania. Wybierz odpowiednio.</li>
		<li>Dostosuj rozmiar otworu. Rozmiar otworka kontroluje grubość przekroju optycznego. Mniejszy rozmiar otworka tworzy cieńszy przekrój optyczny, a tym samym lepszą rozdzielczość z, ale zmniejsza sygnał fluorescencji. Zwiększenie rozmiaru otworka zapewnia grubszy przekrój optyczny z silniejszym sygnałem fluorescencyjnym.</li>
		<li>Ustaw moc lasera, wzmocnienie detektora/wzmacniacza i przesunięcie. Stopniowo zwiększaj moc lasera i wzmocnienie detektora/wzmacniacza, aż do uzyskania odpowiedniego obrazu. Duża moc lasera niesie ze sobą ryzyko fotowybielania. Dostosuj odpowiednio przesunięcie (kontrast), aby uzyskać wysoki stosunek sygnału do szumu.</li>
		<li>Określ wymagany obszar uprawy na podstawie wielkości zwrotu z inwestycji. Upewnij się, że przechwycono całą długość i szerokość zwrotu z inwestycji.</li>
		<li>Poruszaj się po oczyszczonych tkankach we wszystkich płaszczyznach i ustaw punkt początkowy i końcowy stosu. Ustaw rozmiar kroku Z zgodnie z żądaną rozdzielczością Z.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Zbieraj obrazy, gdy są zadowolone z ustawień akwizycji obrazu, i rejestruj przechwycone obrazy. Przetwarzaj obrazy za pomocą oprogramowania do analizy obrazu.</li>
</ol>

<ol><li>Susaki, E. A., Ueda, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole-body+and+whole-organ+clearing+and+imaging+techniques+with+single-cell+resolution%3A+Toward+organism-level+systems+biology+in+mammals%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">Whole-body and whole-organ clearing and imaging techniques with single-cell resolution: Toward organism-level systems biology in mammals.</a> Cell Chemical Biology. 23 (1), 137-157 (2016).</li>
<li>Tainaka, K., Kuno, A., Kubota, S. I., Murakami, T., Ueda, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemical+principles+in+tissue+clearing+and+staining+protocols+for+whole-body+cell+profiling%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Reviews+of+Cell+and+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Chemical principles in tissue clearing and staining protocols for whole-body cell profiling.</a> Annual Reviews of Cell and Developmental Biology. 32, 713-741 (2016).</li>
<li>Ueda, H. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole-brain+profiling+of+cells+and+circuits+in+mammals+by+tissue+clearing+and+light-sheet+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Whole-brain profiling of cells and circuits in mammals by tissue clearing and light-sheet microscopy.</a> Neuron. 106 (3), 369-387 (2020).</li>
<li>Ueda, H. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+clearing+and+its+applications+in+neuroscience%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews.+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Tissue clearing and its applications in neuroscience.</a> Nature Reviews. Neuroscience. 21 (2), 61-79 (2020).</li>
<li>Hama, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ScaleS%3A+an+optical+clearing+palette+for+biological+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">ScaleS: an optical clearing palette for biological imaging.</a> Nature Neuroscience. 18 (10), 1518-1529 (2015).</li>
<li>Furuta, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multi-scale+light+microscopy%2Felectron+microscopy+neuronal+imaging+from+brain+to+synapse+with+a+tissue+clearing+method%2C+ScaleSF%5BTitle%5D)+AND+%22iScience%22%5BJournal%5D)">Multi-scale light microscopy/electron microscopy neuronal imaging from brain to synapse with a tissue clearing method, ScaleSF.</a> iScience. 25 (1), 103601(2022).</li>
<li>Miyawaki, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deep+imaging+of+cleared+brain+by+confocal+laser-scanning+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Protocol+Exchange%22%5BJournal%5D)">Deep imaging of cleared brain by confocal laser-scanning microscopy.</a> Protocol Exchange. , (2016).</li>
<li>Okamoto, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exclusive+labeling+of+direct+and+indirect+pathway+neurons+in+the+mouse+neostriatum+by+an+adeno-associated+virus+vector+with+Cre%2Flox+system%5BTitle%5D)+AND+%22STAR+Protocols%22%5BJournal%5D)">Exclusive labeling of direct and indirect pathway neurons in the mouse neostriatum by an adeno-associated virus vector with Cre/lox system.</a> STAR Protocols. 2 (1), 100230(2021).</li>
<li>Kameda, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Parvalbumin-producing+cortical+interneurons+receive+inhibitory+inputs+on+proximal+portions+and+cortical+excitatory+inputs+on+distal+dendrites%5BTitle%5D)+AND+%22The+European+Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Parvalbumin-producing cortical interneurons receive inhibitory inputs on proximal portions and cortical excitatory inputs on distal dendrites.</a> The European Journal of Neuroscience. 35 (6), 838-854 (2012).</li>
<li>Sohn, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+single+vector+platform+for+high-level+gene+transduction+of+central+neurons%3A+Adeno-associated+virus+vector+equipped+with+the+Tet-off+system%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">A single vector platform for high-level gene transduction of central neurons: Adeno-associated virus vector equipped with the Tet-off system.</a> PLoS One. 12 (1), 0169611(2017).</li>
<li>Hama, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Scale%3A+a+chemical+approach+for+fluorescence+imaging+and+reconstruction+of+transparent+mouse+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Scale: a chemical approach for fluorescence imaging and reconstruction of transparent mouse brain.</a> Nature Neuroscience. 14 (11), 1481-1488 (2011).</li>
<li>Stepanyants, A., Martinez, L. M., Ferecsko, A. S., Kisvarday, Z. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+fractions+of+short-+and+long-range+connections+in+the+visual+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">The fractions of short- and long-range connections in the visual cortex.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (9), 3555-3560 (2009).</li>
<li>Kuramoto, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two+types+of+thalamocortical+projections+from+the+motor+thalamic+nuclei+of+the+rat%3A+a+single+neuron-tracing+study+using+viral+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Cerebral+Cortex%22%5BJournal%5D)">Two types of thalamocortical projections from the motor thalamic nuclei of the rat: a single neuron-tracing study using viral vectors.</a> Cerebral Cortex. 19 (9), New York, N.Y. 2065-2077 (2009).</li>
<li>Matsuda, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+nigrostriatal+dopaminergic+neurons+form+widely+spread+and+highly+dense+axonal+arborizations+in+the+neostriatum%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Neuroscience%3A+The+Official+Journal+of+the+Society+for+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Single nigrostriatal dopaminergic neurons form widely spread and highly dense axonal arborizations in the neostriatum.</a> The Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society for Neuroscience. 29 (2), 444-453 (2009).</li>
<li>Lin, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-type-specific+and+projection-specific+brain-wide+reconstruction+of+single+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Cell-type-specific and projection-specific brain-wide reconstruction of single neurons.</a> Nature Methods. 15 (12), 1033-1036 (2018).</li>
<li>Winnubst, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reconstruction+of+1%2C000+projection+neurons+reveals+new+cell+types+and+organization+of+long-range+connectivity+in+the+mouse+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Reconstruction of 1,000 projection neurons reveals new cell types and organization of long-range connectivity in the mouse brain.</a> Cell. 179 (1), 268-281 (2019).</li>
<li>Neckel, P. H., Mattheus, U., Hirt, B., Just, L., Mack, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Large-scale+tissue+clearing+%28PACT%29%3A+Technical+evaluation+and+new+perspectives+in+immunofluorescence%2C+histology%2C+and+ultrastructure%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Large-scale tissue clearing (PACT): Technical evaluation and new perspectives in immunofluorescence, histology, and ultrastructure.</a> Scientific Reports. 6, 34331(2016).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Krytyczne kroki w ramach protokołu W protokole jest kilka krytycznych kroków, które należy przeprowadzić z najwyższą ostrożnością, aby uzyskać znaczące wyniki. Równomierne utrwalanie próbek jest niezbędne do obrazowania 3D w tkankach na dużą skalę. Soczewka obiektywu, próbka i płyn zanurzeniowy powinny mieć pasujący RI. Niedopasowanie RI między nimi doprowadzi do wysoce zaburzonego obrazowania komórek wyrażających ekspresję EGFP w oczyszczonych wycinkach mózgu (Figura 3). Kołnierz k...

Metody oczyszczania tkanek poprawiły niezależne od głębokości obrazowanie próbek biologicznych i klinicznych za pomocą mikroskopii świetlnej, co pozwala na ekstrakcję informacji strukturalnych o nienaruszonych tkankach1,2. Techniki optycznego oczyszczania mogą również potencjalnie przyspieszyć i obniżyć koszty analizy histologicznej. Obecnie dostępne są trzy główne podejścia do oczyszczania: metody hydrofilowe, hydrofobowe i oparte na hydrożelu1,2. Podejścia hydrofilowe przewyższają zachowanie sygnałów fluorescencyjnych i integralności tkanek oraz są mniej toksyczne w porównaniu z pozostałymi dwoma podejściami3,4.
Hydrofilowa metoda oczyszczania, ScaleS, wyróżnia się zachowaniem integralności strukturalnej i molekularnej, a także silną zdolnością oczyszczania (spektrum clearing-save)5. W poprzednim badaniu opracowaliśmy protokół szybkiego i izometrycznego oczyszczania, ScaleSF, dla plastrów tkanek (grubość ~1 mm), modyfikując procedurę czyszczenia ScaleS6. Ten protokół oczyszczania wymaga sekwencyjnej inkubacji wycinków mózgu w trzech roztworach przez 10,5-14,5 godziny. Metoda charakteryzuje się wysokim spektrum klarująco-zachowawczym, które jest kompatybilne nawet z analizą mikroskopii elektronowej (EM) (rysunek uzupełniający 1), co pozwala na wieloskalowe obrazowanie trójwymiarowe (3D) o wysokiej rozdzielczości z dokładną rekonstrukcją sygnału6. Tak więc ScaleSF powinien być skuteczny zwłaszcza w mózgu, gdzie komórki neuronalne rozwijają wybujałe procesy o ogromnej długości i organizują wyspecjalizowane drobne struktury subkomórkowe do przesyłania i odbierania informacji. Wyodrębnianie informacji strukturalnych za pomocą skal od obwodów do poziomów subkomórkowych w komórkach neuronalnych jest bardzo przydatne w lepszym zrozumieniu funkcji mózgu.
Tutaj udostępniamy szczegółowy protokół wizualizacji struktur neuronalnych za pomocą skal od mezoskopowego/obwodu do poziomu mikroskopowego/subkomórkowego za pomocą ScaleSF. Protokół obejmuje przygotowanie tkanek, klarowanie tkanek, postępowanie z oczyszczonymi tkankami oraz obrazowanie oczyszczonych tkanek za pomocą konfokalnej laserowej mikroskopii skaningowej (CLSM). Nasz protokół koncentruje się na badaniu struktur neuronalnych od obwodu do skali komponentów subkomórkowych. Szczegółowa procedura przygotowania roztworów i stereotaktycznego wstrzykiwania wektorów wirusa związanego z adenowirusem (AAV) do mózgów myszy znajduje się odpowiednio w Miyawaki et al. 20167 i Okamoto et al. 20218.

<table><tbody><tr><td>16-krotny obiektyw z wieloma zanurzeniami</td><td>Leica Microsystems</td><td>HC FLUOTAR 16x/0.60 IMM CORR VISIR</td><td></td></tr><tr><td>Agar</td><td>Nacalai Tesque</td><td>01028-85</td><td></td></tr><tr><td>Agaroza</td><td>TaKaRa Bio</td><td>L03</td><td></td></tr><tr><td>Dimetylosulfotlenek</td><td>Nacalai Tesque</td><td>13407-45</td><td></td></tr><tr><td>D-Sorbitol</td><td>Nacalai Tesque</td><td>06286-55</td><td></td></tr><tr><td>&gamma;- cyklodekstryna</td><td>Wako Pure Chemical Industries</td><td>037-10643</td><td></td></tr><tr><td>Glycerol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G9012</td><td></td></tr><tr><td>Huygens Essential</td><td>Scientific Volume Imaging</td><td>ver. 18.10.0p8/21.10.1p0 64b</td><td></td></tr><tr><td>Imaris</td><td>Bitplane</td><td>ver. 9.0.0</td><td></td></tr><tr><td>Leica Application Suite X</td><td>Leica Microsystems</td><td>LAS X, ver. 3.5.5.19976</td><td></td></tr><tr><td>Metylo-&beta;-cyklodekstryna</td><td>Tokio Przemysł chemiczny</td><td>M1356</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyd</td><td>Merck Millipore</td><td>1.04005.1000</td><td></td></tr><tr><td>Sól fizjologiczna buforowana fosforanami (10x; pH 7,4)</td><td>Nacalai Tesque</td><td>27575-31</td><td>10x PBS(&ndash;)</td></tr><tr><td>Azydek sodu</td><td>Nacalai Tesque</td><td>31233-55</td><td></td></tr><tr><td>Pentobarbital sodu</td><td>Kyoritsu Seiyaku</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>TCS SP8</td><td>Leica Microsystems</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Nacalai Tesque</td><td>35501-15</td><td></td></tr><tr><td>Mocznik</td><td>Nacalai Tesque</td><td>35940-65</td><td></td></tr><tr><td>Wibracyjna krajalnica do tkanek</td><td>Dosaka EM</td><td>PRO7N</td><td></td></tr></tbody></table>

metoda oczyszczania tkanek do obrazowania neuronów ze skal mezoskopowych do mikroskopowych

A Tissue Clearing Method for Neuronal Imaging from Mesoscopic to Microscopic Scales

Szczegółowy protokół jest tutaj dostępny do wizualizacji struktur neuronalnych w tkankach mózgowych od mezoskopowych do mikroskopijnych. Struktury neuronalne, od obwodów nerwowych po subkomórkowe struktury neuronalne, są wizualizowane w wycinkach mózgu myszy optycznie oczyszczonych za pomocą ScaleSF. Ta metoda oczyszczania jest zmodyfikowaną wersją ScaleS i jest hydrofilową metodą oczyszczania tkanek dla wycinków tkanki, która osiąga silną zdolność oczyszczania, a także wysoki poziom zachowania sygnałów fluorescencyjnych i integralności strukturalnej. Konfigurowalna trójwymiarowa (3D) komora obrazowania została zaprojektowana z myślą o niezawodnym montażu oczyszczonych tkanek mózgowych. Mózgi myszy, którym wstrzyknięto wektor wirusa związanego z adenowirusem, przenoszący gen wzmocnionego białka zielonej fluorescencji, utrwalono za pomocą 4% paraformaldehydu i pokrojono na plastry o grubości 1 mm za pomocą wibrującego krajalnika do tkanek. Wycinki mózgu oczyszczono zgodnie z protokołem oczyszczania, który obejmuje sekwencyjne inkubacje w trzech roztworach, a mianowicie roztworze ScaleS0, roztworze soli fizjologicznej buforu fosforanowego (–) i roztworze ScaleS4, przez łącznie 10,5–14,5 godziny. Oczyszczone wycinki mózgu umieszczono w komorze obrazowania i zatopiono w 1,5% żelu agarozowym rozpuszczonym w roztworze ScaleS4D25(0). Akwizycja obrazu 3D plastrów została przeprowadzona za pomocą konfokalnego laserowego mikroskopu skaningowego wyposażonego w soczewkę obiektywową z wieloma zanurzeniami o dużej odległości roboczej. Zaczynając od mezoskopowego obrazowania neuronów, udało nam się uwidocznić drobne subkomórkowe struktury neuronalne, takie jak kolce dendrytyczne i guzki aksonalne, w optycznie oczyszczonych wycinkach mózgu. Protokół ten ułatwiłby zrozumienie struktur neuronalnych od obwodu do skali komponentów subkomórkowych.

Za pomocą niniejszego protokołu osiągnięto przejaśnienie optyczne przekroju mózgu myszy o grubości 1 mm. Rycina 1B przedstawia obrazy transmisyjne przekroju mózgu myszy przed i po zabiegu przejaśniania. Metoda przejaśniania tkanek uczyniła przezroczystym przekrój mózgu myszy o grubości 1 mm. Po 12-godzinnej inkubacji w roztworze przejaśniającym stwierdzono niewielkie zwiększenie końcowych rozmiarów przekrojów mózgu (ekspansja liniowa: 102,5% ± 1,3%). Zachowanie fluorescencji oraz integralności struktural...

Protokół dostarcza szczegółową metodę obrazowania neuronów w wycinku mózgu za pomocą metody oczyszczania tkanki, ScaleSF. Protokół obejmuje przygotowanie tkanki mózgowej, klarowanie tkanek, postępowanie z oczyszczonymi wycinkami oraz konfokalne obrazowanie struktur neuronalnych za pomocą laserowej mikroskopii skaningowej od poziomu mezoskopowego do mikroskopowego.

Metoda oczyszczania tkanek do obrazowania neuronów ze skal mezoskopowych do mikroskopowych

A detailed protocol is provided here to visualize neuronal structures from mesoscopic to microscopic levels in brain tissues. Neuronal structures ranging ...

Nasz protokół ułatwiłby badanie struktur neuronalnych od obwodów do skal składowych, co jest niezbędne do lepszego zrozumienia funkcji mózgu. Nasza technika oczyszczania, ScaleSF, wywiera silną zdolność oczyszczania, a także wysoki poziom zachowania tkanek, który jest wymagany do jednoczesnej wizualizacji zarówno dużych, jak i małych struktur. Nasz protokół jest szczególnie skuteczny w mózgu, gdzie komórki neuronalne wykazują skomplikowane procesy, ogromne połączenia i układają wyspecjalizowane drobne struktury subkomórkowe.Przed rozpoczęciem eksperymentu należy przygotować roztwory Sca/eS zgodnie z poniższą tabelą i przykryć próbki folią. Rozpocznij procedurę od dodania po osiem mililitrów roztworów ScaleS0 i ScaleS4 do dwóch oddzielnych dołków sześciodołkowej płytki do hodowli komórkowej i wstępnie podgrzej płytkę do 37 stopni Celsjusza w inkubatorze. Przenieś plastry mózgu do wstępnie podgrzanego roztworu ScaleS0 za pomocą szpatułki i inkubuj plastry przez dwie godziny w temperaturze 37 stopni Celsjusza w inkubatorze z wytrząsaniem przy 90 obr./min.Następnie przenieś przepuszczalne wycinki mózgu w ośmiu mililitrach PBS minus na sześciodołkowej płytce do hodowli komórkowej i myj przez 15 minut, trzymając w wytrząsarce orbitalnej z prędkością od 40 do 60 obr./min. Powtórz ten krok dwukrotnie. Następnie przenieś plastry mózgu do ośmiu mililitrów wstępnie podgrzanego roztworu ScaleS4 i inkubuj przez osiem do 12 godzin przy 90 obr./min w 37 stopniach Celsjusza.Aby przygotować komorę, wydrukuj w 3D ramę komory i adaptery stolika mikroskopu. Przymocuj ramę studzienki do szkiełka nakrywkowego za pomocą kleju samoprzylepnego. Przygotuj 1,5% agarozę w roztworze ScaleS4D25(0).Wymieszaj roztwór i podgrzewaj w kuchence mikrofalowej, aż agaroza całkowicie się rozpuści. Następnie pozwól roztworowi ostygnąć do 37 stopni Celsjusza. Zamontuj oczyszczony wycinek mózgu na dolnym szkiełku nakrywkowym komory obrazowania za pomocą szpatułki.Usuń nadmiar roztworu z oczyszczonego plastra za pomocą czystej chusteczki. Dodaj żel ScaleS4 do wycinka mózgu za pomocą mikropipety, aby wypełnić komorę obrazowania. Umieść kolejne szkiełko nakrywkowe na wierzchu za pomocą kleszczy, a następnie kawałek bibuły i szkiełko podstawowe.Przenieś komorę obrazowania do lodówki w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Umieść metalowe ciężarki na szkiełku podstawowym i pozostaw je na 30 minut. Po inkubacji należy wyjąć materiał z komory obrazowania i zetrzeć nadmiar żelu.Umieść komorę obrazowania na 60-milimetrowej szklanej szalce Petriego i przymocuj krawędź komory obrazowania w wielu punktach do naczynia za pomocą kleju samoprzylepnego. Wlej roztwór ScaleS4 do naczynia i delikatnie potrząsaj przez godzinę z prędkością od 40 do 60 obr./min w temperaturze od 20 do 25 stopni Celsjusza. Zastąp świeżym roztworem i usuń pęcherzyki powietrza z powierzchni żelu, delikatnie zeskrobując powierzchnię za pomocą końcówki pipety.Zamontuj komorę obrazowania na stoliku mikroskopu. Przygotuj konfokalny laserowy mikroskop skaningowy wyposażony w soczewkę obiektywową z wieloma zanurzeniami o odległości roboczej 2,5 milimetra, powiększeniu 16x i aperturze numerycznej 0,60. Włącz wszystkie odpowiednie urządzenia do obrazowania, takie jak stacja robocza, mikroskop, skaner, lasery, lampa rtęciowa i uruchom oprogramowanie do obrazowania.Ustaw kołnierz korekcyjny soczewki obiektywu multiimmersyjnego na 1,47. Zanurz soczewkę obiektywu w roztworze i pozwól jej powoli zbliżać się do plasterka. Usuń wszystkie pęcherzyki powietrza uwięzione na końcówce soczewki obiektywu.Znajdź interesujące obszary w oczyszczonych tkankach za pomocą epifluorescencji. Aby ustawić parametry akwizycji obrazu, najpierw określ głębię bitową dla akwizycji obrazu, ponieważ rozmiar obrazu rośnie wraz z bitem. Następnie ustaw długość fali detekcji zgodnie z widmem emisyjnym.Ustaw rozdzielczość XY, szybkość skanowania i rozmiar otworka. Dostosuj również moc lasera, wzmocnienie wzmacniacza detektora i przesunięcie, aż do uzyskania odpowiedniego obrazu. Określ rozmiar kafelków na podstawie rozmiaru ROI, upewniając się, że cała długość i szerokość ROI są przechwytywane.Poruszaj się po tkance we wszystkich płaszczyznach i ustaw początek i koniec stosu. Ustaw rozmiar kroku Z zgodnie z żądaną rozdzielczością Z. Zbierz obrazy i przetwarzaj je za pomocą oprogramowania do analizy obrazu.Korzystając z tego protokołu, udało się uzyskać optyczne oczyszczenie wycinka mózgu myszy o grubości jednego milimetra. Ekspresja EGFP w korze mózgowej myszy PV-FGL wykazała, że fluorescencja i integralność strukturalna tkanek została zachowana. Aberracje wywołane niedopasowaniem współczynnika załamania światła spowodowały zauważalną utratę jasności obrazu i rozdzielczości neuronów EGFP dodatnich.Neurony te zostały wyraźnie uwidocznione za pomocą konfokalnego laserowego mikroskopu skaningowego, gdy kołnierz korekcyjny został dostosowany do tego ScaleS4 solution. 3D rekonstrukcja neuronów znakowanych EGFP w pierwotnej korze somatosensorycznej myszy została wykonana w wycinku mózgu o grubości jednego milimetra. Pojedyncze altany dendrytyczne ozdobione kolcami dendrytycznymi obserwowano w większym powiększeniu.W warstwach zaobserwowano również arboryzację końcową aksonów i bulony aksonalne. Dopasowanie indeksu odbicia między płynem obrazowym a soczewką obiektu ma kluczowe znaczenie dla obrazowania 3D w oczyszczonych tkankach. Nasza technika ułatwiłaby integrację struktury neuronów od obwodu do skali składowych, dostarczając wglądu w mechanizmy neuronów, informacje o przetwarzaniu w mózgu.

a-tissue-clearing-method-for-neuronal-imaging-from-mesoscopic-to

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

W niniejszej pracy opisujemy szybką i prostą metodę obrazowania fluorescencyjnie znakowanych komórek w półgrubych skrawkach mózgu. Poprzez utrwalenie, pocięcie i optyczne klarowanie tkanki mózgowej opisujemy, w jaki sposób standardowe obrazowanie epifluorescencyjne lub konfokalne może być wykorzystane do wizualizacji poszczególnych komórek i sieci neuronalnych w obrębie nienaruszonej tkanki nerwowej.

Szybka metoda obrazowania fluorescencyjnego o wysokiej rozdzielczości w półgrubych przekrojach mózgu

Źródło: Pekarek, B. T., et. al., Obrazowanie i kwantyfikacja nienaruszonych dendrytów neuronalnych za pomocą oczyszczania tkanek CLARITY. J. Vis. Exp. (2021)W tym filmie pokazujemy przygotowanie, obrazowanie i analizę oczyszczonego mózgu myszy w celu zbadania dendrytycznych altan dendrytycznych, morfologii kręgosłupa i rozmieszczenia neuronów przy użyciu mikroskopii konfokalnej i technik rekonstrukcji 3D.

Obrazowanie mikroskopem konfokalnym nienaruszonych altan dendrytycznych i morfologii kręgosłupa w oczyszczonym mózgu myszy

Aby uzyskać obrazy o wysokiej rozdzielczości fluorescencyjnie znakowanych komórek w dużych tkankach, najlepiej byłoby, gdyby próbki biologiczne były obrazowane bez dzielenia na sekcje. 3DISCO to prosta procedura oczyszczania tkanek oparta na sekwencyjnej inkubacji z rozpuszczalnikami organicznymi. Po oczyszczeniu narządy stają się przezroczyste, co pozwala na kompleksowe skanowanie laserowe próbki.

Obrazowanie oczyściło nienaruszone systemy biologiczne na poziomie komórkowym za pomocą 3DISCO

ACT-PRESTO (technika aktywnej przejrzystości - efektywny i stabilny transfer makrocząsteczek do organów związany z ciśnieniem) umożliwia szybkie, skuteczne, ale niedrogie oczyszczanie tkanek i szybką penetrację przeciwciał do oczyszczonych tkanek poprzez pasywną dyfuzję lub dostarczanie wspomagane ciśnieniem. Za pomocą tej metody można oczyścić szeroki zakres tkanek, znakować immunologicznie wieloma przeciwciałami i obrazować objętość.

ACT-PRESTO: Biologiczne metody oczyszczania tkanek i znakowania immunologicznego w obrazowaniu objętościowym

Ten protokół opisuje zakrojone na szeroką skalę rekonstrukcje selektywnych populacji neuronów, oznaczonych po wstecznym zakażeniu zmodyfikowanym wirusem wścieklizny wyrażającym markery fluorescencyjne, oraz niezależne, bezstronne analizy klastrów, które umożliwiają kompleksową charakterystykę wskaźników morfologicznych wśród różnych podklas neuronów.

Rekonstrukcje na dużą skalę i niezależne, bezstronne grupowanie oparte na wskaźnikach morfologicznych w celu klasyfikacji neuronów w selektywnych populacjach

Przedstawiamy protokół do użycia metody barwienia Golgiego-Coxa w grubych fragmentach mózgu, w celu wizualizacji neuronów z długimi drzewami dendrytycznymi zawartymi w pojedynczych próbkach tkanek. Przedstawiono również dwa warianty tego protokołu, które obejmują barwienie przeciwstawne fioletem krezylowym i zamrażanie nieprzetworzonych mózgów w celu długotrwałego przechowywania.

Obrazowanie neuronów w grubych sekcjach mózgu metodą Golgiego-Coxa

Tutaj opisujemy procedurę oczyszczania tkanek, znakowania fluorescencyjnego i wielkoskalowego obrazowania tkanki mózgowej myszy, która umożliwia wizualizację trójwymiarowej organizacji typów komórek w korze nowej.

Wielkoskalowe trójwymiarowe obrazowanie organizacji komórkowej w korze nowej myszy

Neuronalna morfologia dendrytyczna często leży u podstaw funkcji. Rzeczywiście, wiele procesów chorobowych, które wpływają na rozwój neuronów, objawia się fenotypem morfologicznym. Protokół ten opisuje prostą i potężną metodę analizy nienaruszonych altan dendrytycznych i związanych z nimi kolców.

Obrazowanie i kwantyfikacja nienaruszonych dendrytów neuronalnych za pomocą oczyszczania tkanek w ramach projektu CLARITY

Ten protokół opisuje metody przeprowadzania rezonansu magnetycznego, oczyszczania i znakowania immunologicznego nienaruszonych mózgów myszy za pomocą iDISCO+, a następnie szczegółowy opis obrazowania za pomocą mikroskopii świetlnej i dalszych analiz za pomocą NuMorph.

Obrazowanie i analiza pojedynczych komórek całego mózgu nienaruszonych mózgów noworodków myszy za pomocą rezonansu magnetycznego, oczyszczania tkanek i mikroskopii świetlnej

Obecny protokół zapewnia krok po kroku procedurę szybkiego i jednoczesnego oczyszczania optycznego, wieloetapowego znakowania i wolumetrycznej rekonstrukcji 3D dziesiątek pośmiertnych odcinków ludzkiego mózgu poprzez połączenie (SWITCH - H2O2 - Pozyskiwanie antygenu R- 2,2'-tiodieetanol [TDE]) KRÓTKA technika transformacji tkankowej z obrazowaniem mikroskopii fluorescencyjnej za pomocą arkusza świetlnego w rutynowym protokole wysokoprzepustowym.

Optyczne oczyszczanie i znakowanie w mikroskopii fluorescencyjnej arkuszy świetlnych w wielkoskalowym obrazowaniu ludzkiego mózgu

To badanie przedstawia protokół ekstrakcji i przygotowania oczyszczonych próbek całego mózgu i rdzenia kręgowego z zachowanymi sygnałami fluorescencyjnymi, zwiększając wydajność eksperymentu i integralność danych w celu przyspieszenia badań neurobiologicznych.

Ekstrakcja i oczyszczanie tkanek Przygotowanie próbek mysiego rdzenia kręgowego

Poznaj metodę ScaleSF do oczyszczania tkanek mózgu myszy w celu obrazowania struktur neuronowych z zachowaniem fluorescencji. Technika umożliwia szczegółową wizualizację obwodów i komponentów nerwowych.

Metoda oczyszczania tkanek do obrazowania neuronów ze skal mezoskopowych do mikroskopowych

Przeglądaj więcej filmów