Metoda oczyszczania tkanek do obrazowania neuronów ze skal mezoskopowych do mikroskopowych

Nasz protokół ułatwiłby badanie struktur neuronalnych od obwodów do skal składowych, co jest niezbędne do lepszego zrozumienia funkcji mózgu. Nasza technika oczyszczania, ScaleSF, wywiera silną zdolność oczyszczania, a także wysoki poziom zachowania tkanek, który jest wymagany do jednoczesnej wizualizacji zarówno dużych, jak i małych struktur. Nasz protokół jest szczególnie skuteczny w mózgu, gdzie komórki neuronalne wykazują skomplikowane procesy, ogromne połączenia i układają wyspecjalizowane drobne struktury subkomórkowe.

Przed rozpoczęciem eksperymentu należy przygotować roztwory Sca/eS zgodnie z poniższą tabelą i przykryć próbki folią. Rozpocznij procedurę od dodania po osiem mililitrów roztworów ScaleS0 i ScaleS4 do dwóch oddzielnych dołków sześciodołkowej płytki do hodowli komórkowej i wstępnie podgrzej płytkę do 37 stopni Celsjusza w inkubatorze. Przenieś plastry mózgu do wstępnie podgrzanego roztworu ScaleS0 za pomocą szpatułki i inkubuj plastry przez dwie godziny w temperaturze 37 stopni Celsjusza w inkubatorze z wytrząsaniem przy 90 obr./min.

Następnie przenieś przepuszczalne wycinki mózgu w ośmiu mililitrach PBS minus na sześciodołkowej płytce do hodowli komórkowej i myj przez 15 minut, trzymając w wytrząsarce orbitalnej z prędkością od 40 do 60 obr./min. Powtórz ten krok dwukrotnie. Następnie przenieś plastry mózgu do ośmiu mililitrów wstępnie podgrzanego roztworu ScaleS4 i inkubuj przez osiem do 12 godzin przy 90 obr./min w 37 stopniach Celsjusza.

Aby przygotować komorę, wydrukuj w 3D ramę komory i adaptery stolika mikroskopu. Przymocuj ramę studzienki do szkiełka nakrywkowego za pomocą kleju samoprzylepnego. Przygotuj 1,5% agarozę w roztworze ScaleS4D25(0).

Wymieszaj roztwór i podgrzewaj w kuchence mikrofalowej, aż agaroza całkowicie się rozpuści. Następnie pozwól roztworowi ostygnąć do 37 stopni Celsjusza. Zamontuj oczyszczony wycinek mózgu na dolnym szkiełku nakrywkowym komory obrazowania za pomocą szpatułki.

Usuń nadmiar roztworu z oczyszczonego plastra za pomocą czystej chusteczki. Dodaj żel ScaleS4 do wycinka mózgu za pomocą mikropipety, aby wypełnić komorę obrazowania. Umieść kolejne szkiełko nakrywkowe na wierzchu za pomocą kleszczy, a następnie kawałek bibuły i szkiełko podstawowe.

Przenieś komorę obrazowania do lodówki w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Umieść metalowe ciężarki na szkiełku podstawowym i pozostaw je na 30 minut. Po inkubacji należy wyjąć materiał z komory obrazowania i zetrzeć nadmiar żelu.

Umieść komorę obrazowania na 60-milimetrowej szklanej szalce Petriego i przymocuj krawędź komory obrazowania w wielu punktach do naczynia za pomocą kleju samoprzylepnego. Wlej roztwór ScaleS4 do naczynia i delikatnie potrząsaj przez godzinę z prędkością od 40 do 60 obr./min w temperaturze od 20 do 25 stopni Celsjusza. Zastąp świeżym roztworem i usuń pęcherzyki powietrza z powierzchni żelu, delikatnie zeskrobując powierzchnię za pomocą końcówki pipety.

Zamontuj komorę obrazowania na stoliku mikroskopu. Przygotuj konfokalny laserowy mikroskop skaningowy wyposażony w soczewkę obiektywową z wieloma zanurzeniami o odległości roboczej 2,5 milimetra, powiększeniu 16x i aperturze numerycznej 0,60. Włącz wszystkie odpowiednie urządzenia do obrazowania, takie jak stacja robocza, mikroskop, skaner, lasery, lampa rtęciowa i uruchom oprogramowanie do obrazowania.

Ustaw kołnierz korekcyjny soczewki obiektywu multiimmersyjnego na 1,47. Zanurz soczewkę obiektywu w roztworze i pozwól jej powoli zbliżać się do plasterka. Usuń wszystkie pęcherzyki powietrza uwięzione na końcówce soczewki obiektywu.

Znajdź interesujące obszary w oczyszczonych tkankach za pomocą epifluorescencji. Aby ustawić parametry akwizycji obrazu, najpierw określ głębię bitową dla akwizycji obrazu, ponieważ rozmiar obrazu rośnie wraz z bitem. Następnie ustaw długość fali detekcji zgodnie z widmem emisyjnym.

Ustaw rozdzielczość XY, szybkość skanowania i rozmiar otworka. Dostosuj również moc lasera, wzmocnienie wzmacniacza detektora i przesunięcie, aż do uzyskania odpowiedniego obrazu. Określ rozmiar kafelków na podstawie rozmiaru ROI, upewniając się, że cała długość i szerokość ROI są przechwytywane.

Poruszaj się po tkance we wszystkich płaszczyznach i ustaw początek i koniec stosu. Ustaw rozmiar kroku Z zgodnie z żądaną rozdzielczością Z. Zbierz obrazy i przetwarzaj je za pomocą oprogramowania do analizy obrazu.

Korzystając z tego protokołu, udało się uzyskać optyczne oczyszczenie wycinka mózgu myszy o grubości jednego milimetra. Ekspresja EGFP w korze mózgowej myszy PV-FGL wykazała, że fluorescencja i integralność strukturalna tkanek została zachowana. Aberracje wywołane niedopasowaniem współczynnika załamania światła spowodowały zauważalną utratę jasności obrazu i rozdzielczości neuronów EGFP dodatnich.

Neurony te zostały wyraźnie uwidocznione za pomocą konfokalnego laserowego mikroskopu skaningowego, gdy kołnierz korekcyjny został dostosowany do tego ScaleS4 solution. 3D rekonstrukcja neuronów znakowanych EGFP w pierwotnej korze somatosensorycznej myszy została wykonana w wycinku mózgu o grubości jednego milimetra. Pojedyncze altany dendrytyczne ozdobione kolcami dendrytycznymi obserwowano w większym powiększeniu.

W warstwach zaobserwowano również arboryzację końcową aksonów i bulony aksonalne. Dopasowanie indeksu odbicia między płynem obrazowym a soczewką obiektu ma kluczowe znaczenie dla obrazowania 3D w oczyszczonych tkankach. Nasza technika ułatwiłaby integrację struktury neuronów od obwodu do skali składowych, dostarczając wglądu w mechanizmy neuronów, informacje o przetwarzaniu w mózgu.