Wysokoprzepustowe badania przesiewowe enzymów rozkładających węglowodany przy użyciu nowatorskich zestawów do oznaczania nierozpuszczalnych substratów chromogennych

Ogólnym celem tego testu chromogenicznego jest badanie przesiewowe różnych enzymów w formacie wysokoprzepustowym w stosunku do wybranych różnych substratów chromogennych. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie odkrywania enzymów, takie jak znajdowanie nowych aktywności enzymatycznych do degradacji masy biologicznej. Główną zaletą tej techniki jest to, że podłoża chromogeniczne są dostępne w czterech różnych kolorach, co sprawia, że technika ta jest wysoce przepustowa, niezwykle niezawodna i opłacalna.

Aby rozpocząć, aktywuj 96-dołkową płytkę zestawu do oznaczania filtrów, dodając 200 mikrolitrów roztworu aktywacyjnego do każdej studzienki. Inkubować w temperaturze pokojowej bez mieszania przez 10 minut. Do zbierania należy użyć wirówki i dowolnej standardowej płytki 96-dołkowej.

Aby odwirować istniejący roztwór aktywacyjny, dodaj 100 mikrolitrów sterylnej wody do substratów chromogennego polimeru, hydrożelu lub CPH i zastosuj próżnię lub wirowanie w celu usunięcia stabilizatora. Powtórz pranie jeszcze dwa razy. Aby przygotować reakcję enzymatyczną, dodać 150 mikrolitrów 100 mM buforu octanu sodu o pH 4,5 i 5 mikrolitrów roztworu endocelulazy o trzech różnych stężeniach do każdego dołka płytki zestawu testowego.

Umieść płytkę produktu pod płytką zestawu testowego, aby zebrać wszelkie potencjalne wycieki z płytki reakcyjnej podczas wytrząsania. Następnie inkubować płytkę zestawu do oznaczania w temperaturze pokojowej w wytrząsarce poziomej z prędkością 100 obr./min przez 30 minut. Aby uzyskać wiarygodne dane, konieczne jest mieszanie mieszaniny reakcyjnej podczas inkubacji.

Umieścić w wirówce płytkę z zestawem do oznaczania wraz z tabliczką produktu znajdującą się pod nią i odwirowywać przy 2 700 x g przez 10 minut. Aby przenieść produkt reakcji do dołków płytki produktu. Po wirowaniu sprawdź wzrokowo tabliczkę produktu, aby sprawdzić, czy objętość cieczy w każdej studzience jest w przybliżeniu taka sama.

Za pomocą czytnika płytek odczytać absorbancję płytki zbiorczej przy długości fali 630 nm dla różnych zielonych podłoży CPH. Analizuj i wykreślaj dane zgodnie z protokołem tekstowym. Aby przeprowadzić test chromogeniczny z czerwoną nierozpuszczalną biomasą chromogenną lub słomą pszenną ICB, należy rozpocząć od dodania 200 mikrolitrów roztworu aktywacyjnego do każdego dołka płytki testowej.

Następnie inkubować płytkę w temperaturze pokojowej bez mieszania przez 10 minut. Usuń stabilizator, używając 100 mikrolitrów sterylnej wody, aby trzykrotnie umyć studzienki. Następnie dodaj 150 mikrolitrów 100 mM buforu octanu sodu o pH 4,5 i 5 mikrolitrów po 10 jednostek na mililitr innego roztworu endo-ksylanazy.

Umieść płytkę produktu pod płytą podłoża, aby zebrać wszelkie potencjalne wycieki z płyty podłoża podczas wytrząsania. Inkubować reakcję w temperaturze pokojowej przy 100 obr./min przez dwie godziny. Po inkubacji umieścić w wirówce płytkę zestawu do oznaczania z płytką produktu znajdującą się pod nią i odwirować przy 2,700 x g przez 10 minut, aby przenieść produkt reakcji do dołków płytki produktu.

Sprawdź, czy objętość cieczy w każdej studzience jest w przybliżeniu taka sama. Następnie, za pomocą czytnika płytek, odczytaj absorbancję płytki zbiorczej przy 517 nm dla czerwonej słomy pszennej ICB. Przeprowadź analizę danych zgodnie z protokołem tekstowym.

Pokazano tutaj przykład reakcji na dawkę CPH-arabinoksylanu na ksylanazę przy różnych stężeniach enzymu, przy czym zmniejszające się stężenie enzymu można zaobserwować wizualnie. Bardziej szczegółową spektrofotometryczną oznaczanie ilościowe stosuje się do wykreślenia absorbancji w stosunku do stężenia enzymu. Z intensywnością sygnału odpowiada aktywność enzymu.

W tym przykładzie testu użytego do badania przesiewowego enzymów endocelulazę przetestowano w trzech stężeniach w stosunku do różnych substratów CPH. Jak widać tutaj, aktywność dodatkową w stosunku do celulazy wykazano w przypadku CPH-glukanu, CPH-ksylanu, CPH-ksylanu, a niską aktywność zaobserwowano w stosunku do CPH-galaktomannanu. Te same substraty CPH trawiono dostępnymi na rynku enzymami stosowanymi jako kontrola pozytywna w tych samych warunkach.

Wyniki pokazują, że wszystkie substraty uległy degradacji na poziomach, które wzrosły wraz ze wzrostem stężenia enzymów. W tym eksperymencie pięć substratów ICB zostało włączonych do 19 substratów CPH w celu analizy wydzielanych enzymów Phanerochaete chrysosporium w trzech różnych warunkach pH. Enzymy P.chrysosporium rozkładały różne glukany, skrobie i ksylany.

Niższe sygnały można było wykryć dla hemiceluloz arabinanu i pektyki galaktanu, a także dla RGI. Wytworzone enzymy były bardziej aktywne w warunkach kwaśnych niż w obojętnych lub lekko zasadowych. Po opanowaniu tej techniki można ją wykonać w mniej niż godzinę, jeśli zostanie wykonana prawidłowo.

Próbując wykonać tę procedurę, należy pamiętać o wymieszaniu reakcji podczas inkubacji. Po jej opracowaniu, technika ta toruje drogę naukowcom zajmującym się wysokoprzepustowymi badaniami przesiewowymi do zbadania nowych aktywności enzymów dla biotechnologii. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak korzystać z zestawu do badań przesiewowych.